CN110655565A

CN110655565A - 中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法

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Publication number: CN110655565A
Application number: CN201911059553.3A
Authority: CN
Inventors: 周克夫; 孟坤; 龙敏
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2039-11-01
Also published as: CN110655565B

Abstract

中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，涉及融合蛋白表达纯化方法技术领域，提供一种基于中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因，克隆其部分基因并体外重组质粒，转入大肠杆菌进行原核表达，IPTG诱导温度为16℃条件下获得高效融合表达，并且表达目的蛋白以可溶性状态存在，目的蛋白占细菌可溶性蛋白总量25％以上。应用纯化技术获得融合蛋白MNP‑VTG，通过蔗糖酶酶切将标签MNP从融合蛋白中分离获得目的蛋白VTG单体。该方法表达高效纯化VTG简便，因是可溶性，分离比包涵体简单，无需复性。获得的重组VTG为后续应用提供了稳定均一的原料基础。给重组蛋白可以用于生物活性功能研究，亦可以制备相应抗体开展检测研究。

Description

中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法

技术领域

本发明涉及融合蛋白表达纯化方法技术领域，尤其是涉及中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白表达及纯化方法。

背景技术

卵黄蛋白原VTG是卵生动物卵发育中卵黄蛋白的前体，由肝脏细胞在雌激素诱导下基因进行表达，产生的蛋白提供血淋巴系统输入卵巢，进入卵子成熟为卵黄蛋白。为卵子的发育提供营养。作为一种生殖营养蛋白，VTG一般在卵黄发育期受到激素的诱导(1.Bownes M.The roles of juvenile hormone,ecdysone and the ovary in thecontrol of Drosophila vitellogenesis[J].J Insect Physiol,1989,35：409-413；2.C.M.Campbell DRI.Hormonal control of vitellogenesis inhypophysectomizedwinter flounder(Pseudopleuronectes americanusWalbaum)[J].Gen Comp Endocrinol,1976,28：143-150；3.Tufail M,Nagaba Y,Elgendy AM,et al.Regulation ofvitellogenin genes in insects[J].Entomological Science,2014,17(3)：269-282)，在昆虫雌性成虫的脂肪体、鱼类的肝脏或者其他的动物的特定组织中特异性地大量表达，并通过定位于卵巢的VTG受体(Vgreceptor，VgR)所介导的内吞作用入卵(4.Tufail M,TakedaM.Molecular characteristics of insect vitellogenins[J].J Insect Physiol,2008；54(12)：1447-1458；5.Sappington TW,Raikhel AS.Molecular characteristics ofinsect vitellogenins and vitellogenin receptors[J].Insect Biochemistry andMolecular Biology,1998,28：277-300；6.Tufail M,Takeda M.Insect vitellogenin/lipophorin receptors：molecular structures,role in oogenesis,and regulatorymechanisms[J].J Insect Physiol,2009,55(2)：87-103；7.Bai H,Qiao H,etal.Molecular characterization and developmental expression of vitellogenin inthe oriental river prawn Macrobrachium nipponense and the effects of RNAinterference and eyestalk ablation on ovarian maturation[J].Gene,2015,562(1)：22-31)。VTG准确的时空特异性表达决定了卵的正常发育(8.Veerana M,Kubera A,Ngernsiri L.Analysis of the vitellogenin gene of rice moth,Corcyracephalonica stainton[J].Archives ofInsect Biochemistry and hysiology,2014,87(3)：126-147)。

VTG一般只在雌鱼成熟时期高表达，幼鱼和雄鱼无表达或只有低表达，但是因为雄鱼肝脏中存在同样的基因，因此在雌激素或者类似物刺激下仍然能够高表达并输送到血淋巴中，只是用于雄鱼没有卵巢，无法及时灭活体内的VTG，因此被外界雌激素刺激的雄鱼血液，肝脏等组织保持长时间，高水平的VTG。所以幼鱼，雄鱼体内VTG水平的升高间接反应受到环境水体雌激素污染水平。鉴于此，雄鱼，幼鱼体内VTG水平可以作为环境雌激素污染的生物标记物。

VTG在从血淋巴向卵巢运输过程中，会与微生物发生多种形式的互作，通过直接或间接的免疫功能清除病原微生物，或通过与微生物的互作携带微生物进行垂直传播，或通过与微生物碎片的互作，将免疫信号传递给子代。例如，在VTG运输过程中，在血淋巴内，特定剪切形式的VTG被证明与病毒表面蛋白互作(9.Huo Y,Liu W,Zhang F,etal.Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin ofits insect vector[J].PLoS Pathogens,2014,10(3)：e1003949)，将病毒携带入卵实现其垂直传播的过程；对于病原微生物，VTG通过与病原蛋白的分子互作直接杀菌，或间接介导昆虫对微生物的免疫识别(10.Milutinovic B,Kurtz J.Immune memory ininvertebrates[J].Seminars in Immunology,2016,28(4)：328-342.11.Salmela H,AmdamGV,Freitak D.Transfer of immunity from mother to offspring is mediated viaegg-yolk protein vitellogenin[J].PLoS Pathogens,2015,11(7)：e1005015.12.RonoMK,Whitten MM,Oulad-Abdelghani M,et al.The major yolk protein vitellogenininterferes with the anti-plasmodium response)。表现出具备抗菌，抗真菌和病毒的非营养功能。

基于以上关于VTG的功能和应用价值，制备高纯度有生物活性的VTG显得尤为重要。以往医学生物学研究应用及食品行业，要获得有用的蛋白材料，主要包括从各种生物体分离纯化，从生物代谢产物分离纯化以及从体外培养细胞分离纯化目的蛋白，自从1972年Cohen等科学家发明了基因重组技术后，利用编码该蛋白的基因，体外重组质粒并转入载体中进行表达，再经过后续系列纯化技术即可获得高纯度，稳定均一的蛋白产品，应用到医药，食品以及科学研究等领域。目前在生命科学研究和生物制品的生产过程中，利用表达载体制备重组蛋白是当前最重要的技术之一，通过该项技术获得大量有活性的重组蛋白是进行生物制品研究和各种疾病治疗的药物的必要条件。构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求，同时也是影响基因表达水平及蛋白活性的重要因素。一般来说，非融合型表达载体虽然能较好的保持外源蛋白的一级结构，但其表达量较低、外源蛋白分离纯化困难，回收率低，分离纯化工艺复杂，工业上大规模生产的成本较高。而融合表达则能够克服前面的缺点，获得大量有活性的目的蛋白，同时在后续分离纯化中能够通过标签的特点快速获得。

关于鱼类卵黄蛋白原的获取多数采用从动物组织中提取纯化，所获得的蛋白纯度，稳定性和均一性受到条件影响，同时还有可能有病毒等杂质，从而影响蛋白功能及应用，而基因工程重组蛋白则能够克服这些不利因素，能够获得高纯度，稳定均一的重组蛋白。目前关于鱼类卵黄蛋白原基因的克隆表达有见报道，但多数是淡水鱼的报道，斑马鱼卵黄蛋白原-1基因调控序列-200510028154.2；一种检测环境内分泌干扰物的试剂盒与应用-03102118.2；淡水和海水环境是两个不同生态环境，所生存的鱼类生理结构也有一定差别，因此要反应海水环境变化基于海水鱼更能够精确反应。目前关于海水VTG只见弹涂鱼，如基于弹涂鱼多型卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法-201710163953.3；和同样生存环境的弹涂鱼相比，中华乌塘鳢还有一个优势，它属于肉食性，因此在食物链环节属于较高位置，食物链长。而弹涂鱼主要以底栖藻类，饶足类为食，食物链短。经过生物富集作用，中华乌塘鳢可能比弹涂鱼摄入更高浓度的污染物，环境对它的影响和反应会更明显。中华乌塘鳢作为近年来水产养殖的重要品种，如果作为一种生物标记物鱼类，所取得的研究成果可以直接用于近岸养殖和水体质量评估(李生,肖锦平,佘忠明.中华乌塘鳢的育苗技术[J].上海水产大学学报,1999,8(1):48-52.)。而且，目前所有报道的重组VTG均为包涵体存在，要获得有活性的重组蛋白还需要进行复性，复性率也无法达到100％，并且增加分离纯化的程序。而重组蛋白以可溶性形态存在则比包涵体形式更具有优越性，目前关于VTG重组表达以可溶性形式表达还未见报道。

目前还未见关于中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达，纯化方法的报道。

综上所述，克隆表达纯化获得大量均一稳定的VTG具有重要的理论和应用价值。所制备的重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原(VTG)可以用于制备相应抗体，建立检测VTG的方法；可以用于制备具有抗菌能力的相关蛋白药物应用在动物及人的抗感染疾病中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供具有表达量高、所获得的外源蛋白为可溶性蛋白，具备生物学功能，无需复性，分离纯化简单、回收率高、分离纯化工艺简便等优点的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法。

本发明包括以下步骤：

1)根据中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因(4738bp)设计表达蛋白引物克隆从全长基因的第201个碱基开始，设计如下引物：

vg3.1-SalI-F1:GGCGGCCGCGATATCGTCGACgttaagatcagtgctgccgcg

vg3.1-BamHI-R:ACCTGCAGGGAATTCGGATCCtcataggagcatcttcatgcac；

2)根据步骤1)设计的引物进行PCR反应及凝胶电泳：预变性，95℃3min；变性，95℃15s；退火，75℃15s；延伸，72℃300s；35次循环。延伸，72℃5min；

PCR结果产物通过凝胶电泳可以看到819bp左右有清晰明亮条带，切胶回收目的片段并纯化。

3)酶切载体；

选用PMAL-c5x载体重组，用salⅠ和BamHⅠ酶切37℃过夜；

加loading buffer点胶验证，顺序：质粒(未酶切)、系列酶切后载体、Marker，根据显示条带，未酶切的载体为环状结构在琼脂糖凝胶电泳中阻力小，跑在前面，酶切后成线状，在介质中阻力大，跑在后面，酶切结果符合设计预期，证明酶切成功；

4)切胶回收酶切成功的质粒，用于与目的片段连接；

载体和目的DNA片段的使用量根据以下两个公式计算：

载体使用量＝0.02×碱基数＝Xng，与浓度计算得体积；

目的DNA片段使用量＝0.04×碱基数＝Yng，与浓度计算得体积。

5)转化，细菌扩增，涂布平板，过夜培养，最后挑选菌落；

6)提取质粒；

在步骤6)中，所述提取质粒的具体方法可为：

(1)各管吸出1mL，剩余的4mL提取质粒；

(2)酶切：质粒15μL，SalⅠ酶、BamHⅠ酶各1μL，CutSmart 2μL，加水至50μL，酶切过夜；

(3)凝胶电泳：验证切出的条带为目的条带；

(4)选取菌落测序，测序结果与全长基因进行比对，完全一致，说明没有突变。

7)中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合表达；

在步骤7)中，所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合表达的具体方法可为：

(1)转化：取5μL重组的PMAL-c5x质粒转化BL21(DE3)菌株，42℃热击45s，冰上静置2min后涂平板(100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜；挑符合要求的菌落；

(2)选择诱导条件：经过应用16℃、20℃、28℃、37℃四种诱导条件进行诱导，比较最优效果后确定16℃为最好条件进行以下大量诱导；

(3)大量诱导：将培养的菌液200μL接种于1L的LB液体培养基中，添加100μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.5左右时，添加IPTG(0.1M)3mL，16℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体，放置-20℃冰箱保存；

(4)超声破碎菌体：解冻后的菌液置于Bioruptor超声破碎仪进行破碎，破碎条件：4℃，持续15s；暂停15s，连续20个循环；

(5)离心：条件：4℃，转速4000r，20min，分离上清和沉淀；

(6)融合蛋白的表达及定位，采用SDS-PAGE电泳鉴定表达情况。

8)重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白纯化和酶切；

在步骤8)中，所述重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白纯化和酶切的具体方法可为：

(1)纯化：将Amylase resin混匀倒入过滤柱中，待其中液体滴完加入ColumnBuffer冲洗，待液体全部滴完加入以上分离的上清液并关闭下部阀门，静置10min后打开阀门，使其中液体滴完，加入Column Buffer冲洗两次；

加入Column+10mM maltose静置，5min后打开阀门使液体滴入洁净的离心管中收集；

将收集的液体倒入50KD超滤管中，4℃，转速4000r，反复离心，至上层只剩下250μL左右完成离心纯化过程；

(2)融合蛋白酶切：将factor Xa稀释成酶浓度1mg/mL备用；融合蛋白和factor Xa按浓度比20︰1混合，在37℃条件下进行酶切，时间设置为2、8、20h；融合蛋白亲和层析纯化及factor Xa酶切后，进行SDS-PAGE分析；

9)蛋白浓度测定：用Qubit^TM Protein Assay Kit蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度：0.713mg/mL。

与现有技术相比，本发明突出的有益效果是：

本发明涉及的中华乌塘鳢卵黄蛋白原VTG基因融合蛋白表达纯化方法，利用MNP融合表达系统，尤其选定16°诱导条件决定了所表达的融合蛋白不仅表达量高，而且为可溶性蛋白，容易为亲和层析柱过柱纯化，经过factor Xa切并采用SDS-PAGE检测获得VTG单体蛋白，利用Qubit^TM Protein Assay Kit蛋白浓度测定试剂盒测定可以准确测得所获蛋白浓度。与其他同样表达VTG相比，本发明所表达的融合蛋白表达量高，并且为可溶性，因此无需尿素复性。对后续亲和纯化提供非常有利的条件。最终表达的蛋白具有表达量高(占可溶性蛋白25％以上)、外源蛋白分离纯化简单、回收率高、分离纯化工艺简便和成本低的优点。

附图说明

图1为本发明实施例的克隆中华乌塘鳢卵黄蛋白原VTG基因中的819bp PCR片段琼脂糖电泳图。

图2为本发明实施例的克隆载体的酶切图。

图3为本发明实施例的不同温度条件诱导表达样品进行SDS-PAGE分析结果图。在图3中，M：分子量marker；1：16℃条件下诱导；2：20℃条件下诱导；3：28℃条件下诱导；4：37℃条件下诱导。

图4为本发明实施例的纯化的融合蛋白再纯化sephadex层析谱图。在图4中，纵坐标吸光度值；横坐标出峰时间。

图5为融合蛋白纯化前，纯化后SDS-PAGE分析图。在图5中，M：蛋白分子量marker；1：16℃诱导下表达的融合蛋白纯化前；2：融合蛋白亲和柱纯化后；3：离心浓缩后；4：sephadex层析谱图中峰1结果。

图6为本发明的表达的融合蛋白过柱纯化产物酶切温度的选择SDS-PAGE分析图。在图6中，1：纯化蛋白直接上样；2：纯化蛋白室温放置30h后上样；3：酶切2h上样；4：酶切8h上样；5：酶切30h上样；M：蛋白分子量marker。

图7为本发明纯化的融合蛋白经过酶切去标签MBP后的SDS-PAGE分析结果图。图7中，Marker：标准分子量；1：37℃酶切20h；2：没有酶切的融合蛋白37℃放置20h；3：保存在-20℃的融合蛋白。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，具体实施方式如下：

中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化，配备以下实验用品：1μL重组的PMAL-c5x载体、BL21菌株、100μg/mL氨苄青霉素、0.5mM的IPTG、PBS缓冲液、1.0MMTris-HCL、300mMNaCl、0.5MEDTA、Amylmose亲和柱、Factor Xa和Qubit^TM Protein Assay Kit蛋白浓度测定试剂盒。

中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化，包括以下实验过程：

中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因序列表为：

1、根据中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因设计表达蛋白引物。

克隆从全长基因的第201个碱基开始，设计如下引物：

vg3.1-SalI-F1:GGCGGCCGCGATATCGTCGACgttaagatcagtgctgccgcg

vg3.1-BamHI-R:ACCTGCAGGGAATTCGGATCCtcataggagcatcttcatgcac

2、PCR反应及凝胶电泳：预变性，95℃3min；变性，95℃15s；退火，75℃15s；延伸，72℃300s；35次循环。延伸，72℃5min；

PCR结果产物通过凝胶电泳图可以看到819bp左右有清晰明亮条带(见图1)，切胶回收目的片段并纯化。

3、酶切载体

选用PMAL-c5x载体重组，用salⅠ和BamHⅠ酶切37℃过夜。

加loading buffer点胶验证，顺序为：质粒(未酶切)、系列酶切后载体、Marker，根据显示条带，未酶切的载体为环状结构在琼脂糖凝胶电泳中阻力小跑在前面，酶切后成线状，在介质中阻力大，跑在后面，酶切结果符合设计预期，说明酶切成功(见图2)。

4、切胶回收酶切成功的质粒，用于与目的片段连接。

载体和目的DNA片段的使用量根据以下两个公式计算：

载体使用量＝0.02×碱基数＝Xng，与浓度计算得体积；

目的DNA片段使用量＝0.04×碱基数＝Yng，与浓度计算得体积。

5、经转化，细菌扩增，涂布平板，过夜培养，最后挑选菌落。

6、提取质粒：

(1)各管吸出1mL，剩余的4mL提取质粒；

(2)酶切。质粒15μL，SalⅠ酶、BamHⅠ酶各1μL，CutSmart 2μL，加水至50μL，酶切过夜。

(3)凝胶电泳。验证切出来的条带为目的条带。

(4)选取菌落测序，看是否发生突变，测序结果见如下序列：

结果与全长基因进行比对，完全一致，说明没有突变。

其所对应的氨基酸序列如下：

7、中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合表达：

(1)：转化，取5μL重组的PMAL-c5x质粒转化BL21(DE3)菌株，42℃热击45s，冰上静置2min后涂平板(100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜；挑符合要求的菌落。

(2)：选择诱导条件：经过应用16℃，20℃，28℃，37℃四种诱导条件进行诱导，比较最优效果。最后确定16℃为最好条件进行以下大量诱导。具体实施步骤如下：

①.挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于含4mL LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素的试管中，37℃，220rpm过夜培养；

②.将培养的菌液按1：100比例分别接种于4mL的LB培养基中，添加100μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养；

③.当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，分别于16℃、20℃、28℃和37℃条件下诱导16h，另以未加IPTG诱导剂的作为阴性对照；

④.收集菌体并用PBS缓冲液悬浮；

⑤.SDS-PAGE电泳检测，分析获得最佳的蛋白表达诱导条件。

(3)：大量诱导，将培养的菌液200μL接种于1L的LB液体培养基中，添加100μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.5左右时，添加IPTG(0.1M)3mL，16℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体，放置-20℃冰箱保存。

(4)：超声破碎菌体，将收集的细菌菌体用20mL，1.0MTris-HCL，011.7gNaCl，2mLEDTA，pH＝7.4的破碎Buffer溶解，解冻后的菌液置于Bioruptor超声破碎仪进行破碎，破碎条件：4℃，持续15s；暂停15s。连续20个循环。

(5)：离心，条件：4℃，转速4000rcf 20min分离上清和沉淀。

(6)：融合蛋白的表达及定位，采用SDS-PAGE电泳鉴定表达情况，结果见图3。

8、重组中华乌塘鳢卵黄蛋白原融合蛋白纯化和酶切

(1)纯化：将Amylase resin混匀倒入过滤柱中，待其中液体滴完加入ColumnBuffer冲洗，待液体全部滴完加入以上分离的上清液并关闭下部阀门，静置10min.后打开阀门。使其中液体滴完，加入Column Buffer冲洗两次。

加入Column+10mM maltose静置，5min后打开阀门使液体滴入洁净的离心管中收集。

将收集的液体倒入50KD超滤管中，4℃，转速4000rcf，反复离心，至上层只剩下250μL左右完成离心纯化过程。纯化的融合蛋白再进一步经过sephadex层析过柱纯化，获得层析谱图。见图4。获得进一步纯化的产物取少量进行SDS-PAGE鉴定。SDS-PAGE结果见图5。

(2)融合蛋白单体酶切：

1)：融合蛋白的表达及定量，通过步骤(1)和(2)获得样品进行SDS-PAGE分析；

2)：融合蛋白的纯化，MBP融合蛋白经过Amylmose亲和柱纯化后，经SDS-PAGE分析；

3)：MBP融合蛋白采用Factor Xa酶切后，进行SDS-PAGE分析；

其中，酶切步骤具体是将factor Xa稀释成酶浓度：1mg/mL备用。融合蛋白和factor Xa按20：1(浓度比)混合，在37℃条件下进行酶切，时间设置为2、8、30h；取少量酶切样品进行SDS-PAGE分析，结果见图6，从图中可以看出没有酶切的融合蛋白在35KD中没有或者很少35KD的目的蛋白VTG，酶切后在35KD出现目的蛋白，并且随着酶切时间的延长，目的蛋白含量不断增加。

(3)确定酶切时间，从前面(2)中选择了20小时的酶切时间，发现经过20h factorX酶切后70KD融合蛋白剩余的量很少，而35KD目的蛋白含量增加。认为20h酶切时间比较合适，其SDS-PAGE分析结果见图7。

9、蛋白浓度测定

用Qubit^TM Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度，具体步骤如下：

①.将需要使用的试剂在常温下复苏30min；

②.加入800μL protein buffer；

③.加入4μL染液，并混匀；

④.分装成a，b，c，d四个500μL的管中，a、b、c管加入190μL混匀的试剂，d管加入197μL混匀的试剂；

⑤.在a中加入10μL 1#标准液，b中加入10μL 2#标准液，c中加入10μL 3#标准液，d中加入3μL待测蛋白样品，分别混匀；各标准液为不同Qubit^TM Protein Assay Kit试剂盒中配置的标准蛋白BSA(牛血清白蛋白)；

⑥.避光反应15min；

⑦.利用Qubit仪测a、b、c、d管，获得样品浓度。

用Qubit^TM Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度:0.713mg/mL，蛋白浓度测定结果参见表1。

表1

编号	a	b	c	d
					浓度(μg/mL)	201.2	12366.39	34241.78	713

本发明获得的单体具有抗真菌，抗细菌功能，并且具有蛋白免疫原性，用于制备相应抗体，建立免疫检测方法检测水生卵生生物的VTG，或用于间接测定水中环境雌激素污染水平。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明保护范围为准。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4738

<212> DNA

<213> 中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)

<400> 1

gccgccatgg cggccgcggg aattcgatta tgagagctgt tgtgcttgcc ctggctctgg 60

cccttgtggc tggacataat caaaacttgg ctccttattt tgcccccgga aatacctatg 120

tgtacaagta cgagactgag atcctgggtg gtctgcccga gcagggtctg gctagagctg 180

gatttaaact cgtcagccag gttaagatca gtgctgccgc aacaaacatg atcctgctgc 240

agcttgagaa ccctcagatc tttgagtaca gtgatgtttg gcctaaacag tcctttagcc 300

acacccgcct cactgcagcc ctggaagctc agctccaaat ccccatcaag tttgagtaca 360

acaatgggat tgtgagtaaa atccatgccc cagagagtgt cccaacactg gtgctcaaca 420

tccacagagg tgtcctcagc tttctccaaa tgaacatcaa gcaaacacag aacgtctatg 480

agctgcagga ggagggagcc cagggtgtgt gcaagaccca gtatgccatc acagaggacg 540

aaaaggctgg acgcatcctt ttgaccagga gcagaaatct aaaccactgc caggagaagg 600

tcattaagga catcgggttg gcatacacta ggacatgtat gaagtgccag gagatttcta 660

agagcctgag aggaaccaca ggatacaatt acaaactgaa ggaagttccc aatggcgtct 720

tgatcgagga ggcactcgga aatgaagtca ttcagtttac acctttccat gagctgaacg 780

gtgctgccat gatgaagact atgcaacgct tggttttcgt tcagattgct agggctccta 840

ttgtccccat taatgcagag taccgtcagc gtggttccct gaagtatgag ttctccaccg 900

agcttcttaa gacacctatc aggttcatgc agatgactga tgttagggaa cagattccag 960

aagtcctaac ccacctggtt acacacaatg aggaaagagt gcatgaagat gctcctatga 1020

attttttgaa gctgatagag ctgctgcgtg ctgccgactc tcatcaactg cgtacacagt 1080

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ttccccaagc aactcagctt ttgattggat ctcttcacct gttggagcct accagtgaca 1260

tgatcaggca ggtttggaac atcattcagc agaaggcaaa tctcgctgaa gaaacaatct 1320

ttaaacgagt tgtgcgcaag accctgctcc ttggctatgg cagtttgatc cactggcact 1380

gtgctggaag ggctgagtgc catgaagaag acattcggcg cattcaggtg tattttgaca 1440

aggcctatgc ggagaaaaac attgaggaaa ttgtcctgtt gaccaaagtt atggctaatg 1500

ctgcccatcc ttggagcttt aaaactatca caaagctctt gccaattcat ggcactgatg 1560

gtcctaattt gcccagaaga gttcatgttg aagcaatctt ggccctgaag agcattgcta 1620

aactgaaggc caaggaggtc cagaatctgg ctctgcagct gtacatggac aaaactcttc 1680

accaggagct gcgtattctt gctgtcatgg tgctgtttga gaccaaacct tcaatggctg 1740

tgctgactaa tgttgtcaac actgtgaagt atgatcccag tttgccagtg gcaagcttta 1800

ctcactctct catcaagtcc ctggccagaa gcatcaatgg tgttcacacc tcagttgctg 1860

ccgagtgcaa tgttgctctt aaactcttga gccggaggac cctgaacatg aagctgagca 1920

acgctttcca catggactac tacagccatc ctttgatgct tggtactgct gccagtattt 1980

actgcatcaa cgacgctgcc actatcctcc ccaaaactgt tgtggcaaag acgagtgcct 2040

actttgctgg agttgctgct gatgtgtttg agatcaatgt cagaagtgag ggattccaag 2100

aatatttcct ccagaaagat cttaatgatg tctctgacag aatcaccaag atgaggaaca 2160

tccttaaggc tttctctaac tggaaggctc tgccagtcaa caagctcttg ggctctctgt 2220

ccatcaagat tatgggacag gaagttgcct ttgctgacat tgacaagcag gtcattgacg 2280

aagcagttaa gctttcctcc gagattgaca ttaagcagta tggtatcaac atcctccaca 2340

agctgatcca caatggcttt tccacacaca ttgttaaggc aatgctgccc actgcaatga 2400

gaaaaatcat gcccactgca gcaggtcttc ccatggagct tgccctgtac acctctgccg 2460

tgactgtagc agatgtccat gtcagtatca attccaacct gcctcagcac ttcaatcttc 2520

ctaatattct gacagcaaag atggatcttc aaagtgtgat caaacctagc attaacctga 2580

acacatttgc catcatggga gtcaacacgg atattgcaca ggcggccatg gtattaagag 2640

ccaaggtcaa tgtcagcgta cctgccaaaa tcgaagcttc tcttgacttc aaagagaaca 2700

actttaagat cagtgctctt ccagttaatc tccctgaaaa tgttgctctt ggtgtagatg 2760

ttgagactct agccattgca agatttgcca gaaggacgac acctctgatt cctgagcagg 2820

tccctaacat catgccagca tccacatcta ccgagtcatc cacccacagt tcccaggagc 2880

ggactgataa tatgcaggct cagaacaggc ttggttataa gccaaaagct gttaacaaga 2940

aattctgcgc cagtgccatt ggaatgaaaa gctgcctgaa gtttgtctct accaatgccg 3000

tctttatcag ggacagtgcc ctctacaaac tggttggaaa gcactcaatt gatctttctg 3060

tcagaccagc tgaaagtgat gtagttgaaa gattggaaat ggaagttcag ctcggaccaa 3120

acgccgccaa aaagctgatt aaacaaatca ccttggacat ggaggagatc ccgggcagcg 3180

gacctattgt atccaagctc aagagaatcc tgactcctga tctaaggaac tcctcttctt 3240

cttccagcag ctccaggtcc agggttcggc acagccctcg ctctcattcc tcctctgcct 3300

cttcgtcctc ctcttcctcc aagtctcata tcaccagcag agtcatcagt gctgtgggca 3360

agatcatcgg ggtgaggagc aagcacagaa gcagcagcag tagcagcagc agtagcagcc 3420

gaagccacaa gagccacaag tctactgtat ctagccttgg atctctgttc agcgcaagct 3480

ccagctcttc tcagtctgtt ccccactcac agcacaagag ttcacacaaa aaatttgaac 3540

caaatcatca gaagaggaca tccaagcgcc aatcaggatc tgcctccact gcaagcagtt 3600

ttgaagctat taggacacag aacaaattcc ttggcgattc cacttcccca ttttttgtca 3660

ttatcctgcg tgccatcagg gctgacaaca aactacaggg ttatcaaatc gctgcctaca 3720

aggacagagc tgaggccaga attcagatga tcatggcagc cctggctcct gaggacaact 3780

ggaagctctg cgttgatggc attgcactta gcaaaagcaa agtttctgct aaaattactt 3840

ggggagaaaa atacatgaaa tatgacacta caatcacagc tgagactggc ctcgtgcaaa 3900

caaagatggc agctcgcgtc cgagtggcct ggaagagact ccccactgcc gttgtcaaac 3960

acgtcaaaat gctctatgag cgcatccttg tcccttacct gtccagcaac tatctgcaga 4020

agagaatgga tgtcaccaag cagatctctt ttactgtcgt ggttgaatct gagaaagtgc 4080

tcaacctgat ttttaaatca cctgcatgtg tctacaggcg tgttgtgcct cttcccatcg 4140

ttctgccatg cagggagctg aaaggcctgg tgccatttga tgaagttctt gaaaatatcc 4200

gctacatact agctaagact actgcagctg agtgcagatt tgacgacggg cacattacca 4260

cttttaacca caggagatac aagaactaca tgcctaactc ctgctaccag cttctggctc 4320

aggattgcac tgacaggctc agattcatta ttttgctgaa gaaggatagt ccagaacgct 4380

acatgatcac tgtgaagatt ggtacaaagg atatcgacat gttccttgat ggacataggg 4440

tggctgttag ggtcaatgga caggaaatag ccacagacaa cctgccatac atcagagatt 4500

cagtcaagat cgatctccag gagaacaagc tcgttctctt ggcccccaag attggtattg 4560

ctgagctcca ttttagcaac agggacgtga tgcttcgtgt tttggactca atgaggaacc 4620

aagtctgtgg acttgtggaa aggctgaatc actagtgaat tcgcggccgc ctgcaggtcg 4680

accatatggg agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattcta tagttcac 4738

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

<213> 中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)

<400> 2

gttaagatca gtgctgccgc aacaaacatg atcctgctgc agcttgagaa ccctcagatc 60

tttgagtaca gtgatgtttg gcctaaacag tcctttagcc acacccgcct cactgcagcc 120

ctggaagctc agctccaaat ccccatcaag tttgagtaca acaatgggat tgtgagtaaa 180

atccatgccc cagagagtgt cccaacactg gtgctcaaca tccacagagg tgtcctcagc 240

tttctccaaa tgaacatcaa gcaaacacag aacgtctatg agctgcagga ggagggagcc 300

cagggtgtgt gcaagaccca gtatgccatc acagaggacg aaaaggctgg acgcatcctt 360

ttgaccagga gcagaaatct aaaccactgc caggagaagg tcattaagga catcgggttg 420

gcatacacta ggacatgtat gaagtgccag gagatttcta agagcctgag aggaaccaca 480

ggatacaatt acaaactgaa ggaagttccc aatggcgtct tgatcgagga ggcactcgga 540

aatgaagtca ttcagtttac acctttccat gagctgaacg gtgctgccat gatgaagact 600

atgcaacgct tggttttcgt tcagattgct agggctccta ttgtccccat taatgcagag 660

taccgtcagc gtggttccct gaagtatgag ttctccaccg agcttcttaa gacacctatc 720

aggttcatgc agatgactga tgttagggaa cagattccag aagtcctaac ccacctggtt 780

acacacaatg aggaaagagt gcatgaagat gctcctatg 819

<210> 3

<211> 273

<212> PRT

<213> 中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)

<400> 3

Val Lys Ile Ser Ala Ala Ala Thr Asn Met Ile Leu Leu Gln Leu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gln Ile Phe Glu Tyr Ser Asp Val Trp Pro Lys Gln Ser Phe

20 25 30

Ser His Thr Arg Leu Thr Ala Ala Leu Glu Ala Gln Leu Gln Ile Pro

35 40 45

Ile Lys Phe Glu Tyr Asn Asn Gly Ile Val Ser Lys Ile His Ala Pro

50 55 60

Glu Ser Val Pro Thr Leu Val Leu Asn Ile His Arg Gly Val Leu Ser

65 70 75 80

Phe Leu Gln Met Asn Ile Lys Gln Thr Gln Asn Val Tyr Glu Leu Gln

85 90 95

Glu Glu Gly Ala Gln Gly Val Cys Lys Thr Gln Tyr Ala Ile Thr Glu

100 105 110

Asp Glu Lys Ala Gly Arg Ile Leu Leu Thr Arg Ser Arg Asn Leu Asn

115 120 125

His Cys Gln Glu Lys Val Ile Lys Asp Ile Gly Leu Ala Tyr Thr Arg

130 135 140

Thr Cys Met Lys Cys Gln Glu Ile Ser Lys Ser Leu Arg Gly Thr Thr

145 150 155 160

Gly Tyr Asn Tyr Lys Leu Lys Glu Val Pro Asn Gly Val Leu Ile Glu

165 170 175

Glu Ala Leu Gly Asn Glu Val Ile Gln Phe Thr Pro Phe His Glu Leu

180 185 190

Asn Gly Ala Ala Met Met Lys Thr Met Gln Arg Leu Val Phe Val Gln

195 200 205

Ile Ala Arg Ala Pro Ile Val Pro Ile Asn Ala Glu Tyr Arg Gln Arg

210 215 220

Gly Ser Leu Lys Tyr Glu Phe Ser Thr Glu Leu Leu Lys Thr Pro Ile

225 230 235 240

Arg Phe Met Gln Met Thr Asp Val Arg Glu Gln Ile Pro Glu Val Leu

245 250 255

Thr His Leu Val Thr His Asn Glu Glu Arg Val His Glu Asp Ala Pro

260 265 270

Met

Claims

1.中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因(4738bp)的克隆部分片段(819bp)进行融合蛋白的原核表达，获得可溶性蛋白；

(2)融合蛋白的纯化；

(3)融合蛋白单体酶切分析；

(4)分析纯化后融合蛋白浓度，采用蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)包含以下步骤：

1)根据中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因设计表达蛋白引物，克隆从全长基因的第201个碱基开始，设计如下引物：

vg3.1-SalI-F1:GGCGGCCGCGATATCGTCGACgttaagatcagtgctgccgcg

vg3.1-BamHI-R:ACCTGCAGGGAATTCGGATCCtcataggagcatcttcatgcac

2)PCR反应及凝胶电泳：经预变性、变性、退火、延伸，35次循环；再延伸；PCR结果产物通过凝胶电泳的819bp左右清晰明亮条带，切胶回收目的片段并纯化；

3)酶切载体

选用PMAL-c5x载体重组，用sal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切37℃过夜；加loading buffer点胶验证，根据显示条带，酶切结果符合设计预期，说明酶切成功；

4)切胶回收酶切成功的质粒，与目的片段连接；

5)转化，细菌扩增，涂布平板，过夜培养；挑选菌落；

6)提取质粒。

3.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)克隆表达还包含以下步骤：

1)转化，取1μL重组的PMAL-c5x质粒转化BL21(DE3)菌株，42℃热击50s，冰上静置2min后100μg/mL氨苄青霉素涂平板，37℃培养过夜；

2)选择诱导条件，经过16℃、20℃、28℃、37℃四种诱导条件进行诱导；

3)选择2)获得的最优诱导条件大量诱导，将培养的菌液200μL接种于1L的LB液体培养基中，添加100μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.5左右时，添加0.1M的IPTG 3mL，16℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体，放置-20℃冰箱保存。

4.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)融合蛋白的纯化包含以下步骤：

1)：超声破碎菌体，解冻后的菌液置于Bioruptor超声破碎仪进行破碎，破碎条件：4℃，持续15s，暂停15s，连续20个循环；

2)：离心，条件：4℃，转速4000rcf，20min，分离上清和沉淀；

3)：融合蛋白的表达及定位，取上清样品，采用SDS-PAGE电泳鉴定表达情况；

4)：Amylmose亲和柱纯化。

5.根据权利要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)融合蛋白单体酶切分析包含以下步骤：

1)：融合蛋白的表达及定量，通过步骤(1)融合蛋白的表达和(2)融合蛋白的纯化获得样品进行SDS-PAGE分析；

3)：MBP融合蛋白采用Factor Xa酶切后，进行SDS-PAGE分析。

6.根据权利要求要求1所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)融合蛋白浓度测定包含以下步骤：

蛋白浓度测定，用Qubit^TM Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度；具体步骤如下：

①.将需要使用的试剂在常温下复苏30min；

②.加入800μL protein buffer；

③.加入4μL染液，并混匀；

⑤.在a管中加入10μL 1#标准液，b管中加入10μL 2#标准液，c管中加入10μL 3#标准液，d管中加入3μL待测蛋白样品，分别混匀；

⑥.避光反应15min；

⑦.利用Qubit仪测a、b、c三个管，获得样品浓度。

7.根据权利要求3所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中2)选择诱导条件的具体步骤包括：

④.收集菌体并用PBS缓冲液悬浮；

⑤.SDS-PAGE电泳检测，分析获得最佳的蛋白表达诱导条件。

8.根据权利要求4所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中1)超声破碎菌体包括以下步骤：

①：将收集的细菌菌体用20mL，1.0M Tris-HCL，011.7g NaCl，2mL EDTA，pH＝7.4的破碎Buffer溶解，于4℃冰浴中超声破碎菌体，持续15s，暂停15s，连续20个循环；

②：超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，获得上清液，待下一步纯化；

所述步骤(2)中4)Amylmose亲和柱纯化可包括以下步骤：

将Amylase resin混匀倒入过滤柱中，待其中液体滴完加入Column Buffer冲洗，待液体全部滴完，加入以上分离出的上清液并关闭阀门，静置10min后打开阀门，其中液体再次滴完，加入Column Buffer冲洗两次；

将收集的液体倒入过滤管中，4℃，转速4000rcf反复离心，直至上层只剩下250μL左右完成离心纯化过程。

9.根据权利要求5所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白单体酶切步骤如下：

将factor Xa稀释成1mg/mL酶浓度，融合蛋白与factor Xa按20∶1(浓度比)混合，在37℃条件下进行酶切20h，样品经过SDS-PAGE分析，证明成功切去载体MNP部分，获得中华乌塘鳢卵黄蛋白原3.0KD分子量大小的重组表达单体。

10.根据权利要求9所述的中华乌塘鳢卵黄蛋白原重组表达及纯化方法，其特征在于所获得的单体具有抗真菌、抗细菌功能，并且具有蛋白免疫原性，用于制备相应抗体，建立免疫检测方法检测水生卵生生物的VTG，或用于间接测定水中环境雌激素污染水平。