CN105348374B - 获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体，属于生物技术领域。获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白DomainⅡ的loop2或/和loop3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10以上的氨基酸序列的改变。本发明连续多点突变体ModCry1Aid‑loop 2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍；连续多点突变体ModCry1Ai‑loop 2对玉米螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高了近9倍；连续多点突变体ModCry1Ai‑loop 2和连续多点突变体ModCry1Ai‑loop 3对水稻二化螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高5倍‑6倍左右。

Description

获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法，以及采用该方法获得的高活性的Cry1Ai蛋白突变体。
背景技术
cry1Ai基因为本申请人于2009年所克隆(专利号：ZL200910241558.8；束长龙等，2013)，其表达产物对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、水稻二化螟(Chilo suppressalis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)及家蚕(Bombyx mori)等鳞翅目昆虫具有较好的杀虫活性，但对棉铃虫(Helicoverpa armigera)仅具有体重抑制作用，在某种程度上限制了cry1Ai基因的应用范围。cry1Ah1(专利号：ZL200410009918.9；张杰等，2006)，其编码的Cry1Ah蛋白对棉铃虫、亚洲玉米螟和水稻二化螟等鳞翅目害虫具有很高的毒杀活性，而Cry1Ah蛋白对重要的经济昆虫家蚕却表现出较低的生物活性，显示出良好的环境安全性。Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白活性区域的氨基酸相似性为84％，两者DomainⅢ完全一致，Domain Ⅰ的差异集中定位在helixα-3、helixα-4和helixα-6上，在Domain Ⅱ的差异主要集中在loop 2和loop 3上。
近年来大量的研究表明，Cry蛋白上某些氨基酸位点或区域与杀虫特异性有关。Domain Ⅱ是Cry毒素结构中变化最多的结构域。主要是顶端的环(loop)，其长度、构象和序列都可以有很大的变化。Cry1A、Cry2A、Cry3A、Cry4A和Cry5A顶端loop的长度变化较大，Cry5A的loop最长，Cry3A的loop最短，由于Domain Ⅱ的多变性，该区域被认为是与Cry毒素作用的特异性有关。研究发现：Cry1Ab蛋白的loop 2上某些氨基酸与其对烟草天蛾的活性有关；Cry4Ba蛋白的loopα-8参与其与埃及伊蚊(Aedes aegypti)的结合过程；Cry11Ba蛋白的loopsα-8、1和3参与受体结合，并与对伊蚊的杀虫活性有关。Cry19Aa蛋白的loop 1中357W与其对尖音库蚊(Culex pipiens)的活性有关，loop 2中的410Y、416W、418D与其对尖音库蚊和埃及伊蚊的活性有关。但也有研究发现：Cry4Aa蛋白对尖音库蚊的活性相关区域不是Domain II的loops，可能是Domain III的某个位点。上述研究结果充分说明了Cry蛋白的loop区域与其杀虫活性有着密不可分的关系，但Cry类蛋白对棉铃虫杀虫特异性相关氨基酸区域尚无明确报道，且多数突变体为单点突变且活性大多丧失，是反面推测该位点可能与杀虫特异性相关的位点，而改变杀虫特异性、提高新活的成功案例较少。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种获得高活性Cry蛋白突变体的方法，采用多点连续突变的方法，得到了高活性的蛋白突变体。
本发明采用该方法，对Cry1Ai蛋白进行突变，获得的两个突变体，该两个突变体对某些鳞翅目害虫有毒杀效果有明显的提高。
获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白立体结构Domain Ⅱ的loop2或/和loop3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10个以上的氨基酸序列的改变。
所述Cry蛋白为Cry1Ai或Cry1Ah蛋白。
所述突变为Cry1Ai蛋白loop 2或/和loop 3中氨基酸序列突变。
所述突变为Cry1Ai突变体蛋白loop 2中的369RPFNIGINNQQ379序列突变，或/和Cry1Ai突变体蛋白loop 3中的435SMFRSGSSSSVSIIR449序列突变。
上述方法得到的蛋白突变体。
所述蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。
编码上述蛋白突变体的基因。
所述基因的序列分别为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。
本发明明确了Cry1Ah蛋白与棉铃虫APN1片段H3的结合区域是loop 2和loop 3的基础上，在比对分析Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白Domain Ⅱ中4个loop的差异后，将Cry1Ai蛋白的loop 2和loop 3进行连续多点氨基酸突变(10个氨基酸序列以上)，增强其与受体的结合能力，以提高杀虫毒力。
本发明连续多点突变体ModCry1Aid-loop 2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍；连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2对玉米螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高了近9倍；连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2和连续多点突变体ModCry1Ai-loop 3对水稻二化螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高5倍-6倍左右。
附图说明
图1反向PCR示意图，
图2Western Blot分析Cry1Ah蛋白的标记情况，
图3SDS-PAGE分析APN1片段的表达情况，
图4棉铃虫APN1结合区域的鉴定，
图5Cry1Ah蛋白上受体结合区域的鉴定，
其中A：饱和结合浓度筛选；B：loop多肽竞争结合；C：loop多肽组合竞结合，
图6Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白Domain Ⅱ中loop区域对应的氨基酸，
图7反向PCR扩增构建连续多点突变体，
其中M：marker；1：modcry1Ai-loop 2；2：modcry1Ai-loop 3，
图8TG1中阳性克隆的PCR鉴定结果，
图9Rosetta(DE3)中阳性克隆的PCR鉴定结果，
1，2：modcry1Ai-loop 2；3，4：modcry1Ai-loop 3，
图10SDS-PAGE分析连续多点突变体蛋白在Rosetta(DE3)的表达情况(包涵体蛋白)，
其中1：pEB载体；2：Cry1Ai；3：ModCry1Ai-loop 2；4：ModCry1Ai-loop 3。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
1.材料与试剂
1.1菌株与质粒
实验所用菌株与质粒详见表1，可以对公众发放。
表1菌株与质粒
1.2引物及多肽序列
连续多点突变突变体构建的引物如表2所示，多肽序列如表3所示，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2构建连续多点突变的引物序列
表3多肽序列
1.3供试昆虫
棉铃虫室内敏感种群标准试虫，由中国农科院植保所棉花害虫组提供。
亚洲玉米螟室内敏感种群标准试虫，由中国农科院植保所玉米害虫组提供
水稻二化螟室内敏感种群标准试虫，由中国农科院植保所水稻害虫组提供
1.4酶与生化试剂
Primer star高保真扩增酶、限制性内切酶、连接试剂盒BKL试剂盒购自TaKaRa公司；PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂以及质粒提取试剂盒购自Axygen公司；Taq Mix聚合酶购自北京博迈德科技发展有限公司；蛋白Marker购自Bio-Rad公司；DNA marker TaKaRa公司；抗生素购自鼎国生物工程公司；
其它试剂均为市售国产或者进口分析纯或电泳级纯化学试剂。
蛋白高分子量标准：Protein Standard(High range)(kDa)：200、116、97、66、45
DL5000DNA Marker(bps)：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、200、100
DL15000DNA Marker(bps)：15000、10000、7500、5000、2500、1000、250
1.5培养基与抗生素
液体LB培养基：trytone 1％，yeast extract 0.5％，NaCl 1％，pH 7.0，121℃/20mim灭菌。
固体LB培养基：在液体培养基中加入1.3％琼脂，121℃/20mim灭菌。
液体1/2LB培养基：trytone 0.5％，yeast extract 0.25％，NaCl 0.5％，pH 7.0，121℃/20mim灭菌。
抗生素：氨苄青霉素水溶液100mg/mL用时稀释1000倍；红霉素乙醇溶液6mg/mL，使用时稀释1000倍；氯霉素乙醇溶液34mg/mL，使用时稀释1000倍，-20℃保存
1.6其它试剂
(1)4.0mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液
无水NaAc 65.61g
少量超纯水溶解NaAc，用HAc将pH调至4.5，再定容至200mL
(2)50mM Na2CO3
无水Na2CO3 5.30g
超纯水定容至1000mL，121℃/20mim灭菌后，pH调至9.5
(3)1.0mol/L NaCl
NaCl 58.44g
超纯水定容至1000mL，121℃/20mim灭菌
(4)30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺
丙烯酰胺 29.2g
甲叉双丙烯酰胺 0.8g
超纯水配制100mL，4℃保存
(5)SDS-PAGE 3×上样缓冲液
超纯水定容至100mL
(6)电泳缓冲液
SDS 1.00g
甘氨酸 14.4g
Tris 3.03g
超纯水定容至1000mL，4℃保存
(7)分离胶缓冲液
Tris 27.23g
SDS 0.4g
超纯水定容至150mL，用盐酸调pH 8.8，4℃保存
(8)浓缩胶缓冲液
Tris 6g
SDS 0.4g
超纯水定容至100mL，用盐酸调pH 6.8，4℃保存
(9)50×TAE：
冰乙酸 57.1mL
0.5mol/L EDTA(pH 8.0) 100mL
Tris 242g
纯水定容至1000mL，4℃保存
(10)考马斯亮蓝R250染色法
溶液一：50％乙醇、10％乙酸
溶液二：5％乙醇、7.5％乙酸
溶液三：0.25％R250的95％乙醇溶液
注：50mL溶液二加入200μL溶液三
1.7主要仪器设备
摇床D250，美国NBS公司产品；
恒温培养箱DHP120，上海实验仪器总厂；
Beckman高速离心机Avanti J-26xp；
德国台式Eppenddorf离心机5415C；
PCR仪：Thermocycler，Biometra公司
核酸电泳仪：DYY-5型，北京六一厂；
凝胶成像系统Universal Hood Ⅱ，BIO-RAD公司；
蛋白电泳仪：Mini protein III，BIO-RAD公司；
转膜仪：eBlot快速转膜仪，南京金斯瑞公司
高效液相色谱系统：AKTA avant，GE公司
荧光信号监测系统：Typhoon扫描仪，GE公司
2.实验方法
2.1Cry1Ah蛋白的提取及活化
(1)挑取单菌落于5mL LB培养基中(加5μL红霉素)，30℃230rpm 12h；
(2)按1％的接菌量转接到1L三角瓶中(每瓶盛有400mL 1/2LB液体培养基，并加入400μL红霉素)，30℃，230rpm，培养至90％以上的晶体释放，停止培养；
(3)将发酵液4℃8000rpm离心10min，沉淀用预冷的1.0mol/L NaCl(50mL/1升菌液)洗涤，重复一次；
(4)4℃8000rpm离心10min后，用预冷的无菌水洗涤一次(50mL/1升菌液)；
(5)收集沉淀，悬于50mM Na2CO3溶液中并加入胰蛋白酶，37℃，230rpm处理2h，溶解与活化同时进行；
(6)4℃14000rpm离心20min，取上清，加入1/7体积的4.0mol/L NaAc-HAc(pH4.5)，调pH 4.5-5.0；
(7)4℃静止4h(或冰上沉淀1-4h)；
(8)4℃14000rpm离心15min，沉淀用无菌水洗悬浮后，4℃14000rpm离心15min，重复一次，最后收集沉淀，并溶于50mM Na2CO3中，搅拌至完全溶解。
(9)SDS-PAGE检测Cry蛋白的提取结果，并BSA标准品进行定量。
2.2生物标记Cry1Ah蛋白
称取1mg Biotin N-hydroxysuccinimide ester溶于1mL二甲基亚枫(DMSO)中，配制成1mg/mL母液于-20℃保存，向待标记蛋白溶液中加入30倍摩尔量的生物素溶液，室温静置1h，置于脱盐柱中离心除去过量的生物素。Western blot杂交检测标记效果。
2.3Ligand blot鉴定APN1受体结合区
(1)蛋白样品先进行SDS-PAGE分析，再转至PVDF膜上；
(2)PVDF膜在PBS缓冲液中漂洗3次，每次10min；
(3)PVDF膜在40mL PBS+2％Tween中封闭20min，再以PBS-T(0.1％Tween)漂洗3次，每次10min；
(4)在4mL PBS-T中加入8μg生物素标记的Cry1Ah蛋白，PVDF膜室温孵育1h，
(5)再以PBS-T漂洗3次，每次10min；
(6)以1:10000的比例在PBS-T中加入带有荧光标签的链霉亲和素，室温孵育1h，
(7)以PBS-T漂洗10min，再以PBS漂洗2次，每次10min；
(8)PVDF膜晾干，以Typhoon扫描仪分析结果。
(9)竞争结合：在结合时，以1:1000的摩尔比加入合成的多肽。
2.4序列分析软件
DNAMAN用来分析比较核苷酸或蛋白序列；
PyMOL软件用来分析预测的Cry蛋白的三维结构。
2.5反向PCR
反向PCR原理示意图如下(图1)，根据原基因序列在受体结合区以外分别设计正向和反向引物，然后将拟插入的连续多点突变序列一分为二，分别加在正向引物和反向引物的5’端，从基因内部反向扩增，扩增得到的片段含有完整的载体，以及断开的插入序列，因此用磷酸化酶处理后，可以进行自连，形成闭合完整的质粒。
(1)反向PCR反应体系如下：
(2)扩增条件如下：
2.6磷酸化处理(BKL试剂盒)：
(1)反应体系：
(2)反应条件：
37℃处理10min，70℃处理5min；
2.7连接反应
取5μL上述反应产物加5μL SI，16℃连接3h。
2.8TG1和Rosetta(DE3)感受态细胞制备及转化
(1)将甘油菌在固体LB培养基上进行活化，37℃培养10小时后，再进行划线培养，37℃培养12小时后，挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养12小时，再按1％接菌量转入100mL液体LB培养基中扩大培养(500mL三角瓶)，37℃，220rpm培养，培养至OD600约为0.5。
(2)将菌液转移至2个无菌预冷的50mL离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却到0℃；
(3)4℃，4100rpm离心10min；
(4)倒出培养液，将管倒置1min，使最后痕量的培养液流尽；
(5)每50mL初始培养液用30mL预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2(20mM CaCl2-80mMMgCl2)重悬每份细胞；
(6)4℃，4100rpm离心10min；
(7)每50mL初始培养物用2mL冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，再加入等体积甘油，分装200μL/管，-70℃保存。
将200μL感受态细胞与10μL连接产物或2μL质粒混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min，冰浴3min，加入600μL LB培养基37℃培养1h，涂布含含相应抗生素的LB的平板，37℃培养过夜。
2.9阳性克隆的PCR鉴定
挑取单克隆于5mL LB液体培养基震荡培养，37℃，220rpm，震荡培养6h，取1μL作为模版，进行PCR鉴定，PCR鉴定体系和反应条件如下：
(1)PCR体系：
(2)反应条件：
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.10序列测定及分析
每个截短片段选取TG1中两个阳性克隆送往农科院测序部进行全长测序，DNAMAN软件分析测序结果正确后，提取TG1中质粒，并转入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行表达。
2.11大肠杆菌中蛋白诱导表达
(1)LB平板(AC抗性)上活化过夜，挑单菌落转接于5mL液体LB培养基(AC抗性)中，37℃，220rpm培养12h后，将5mL培养液全部转入300mL液体LB培养基(AC抗性)中，培养约3h，OD600达到0.5，加入IPTG终浓度为0.5mM，18℃，150rpm，培养过夜12h。
(2)8000rpm离心10min收集菌体，沉淀溶于30mL 20mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液中，进行超声破碎(冰浴)，功率65％，时间5min，超3s停5s。超声后10000rpm离心20min，收集上清，沉淀用少量20mM Tris-HCl pH 8.0重悬。
(3)SDS-PAGE分析蛋白表达情况：
(4)制样：上清，20μL样品+5μL 5×Loading Buffer
(5)沉淀，5μL样品+15μL 20mM Tris-HCl pH 8.0+5μL 5×Loading Buffer
(6)煮沸10min，12000rpm离心5min上样5μL。
(7)电泳条件：120V预电泳15min，80V浓缩胶，200V分离胶(冰浴)
(8)染色：50mL S Ⅰ微波加热30s，摇床上70rpm 5min，换50mL S Ⅱ+200μL考马斯亮蓝染液SⅢ，微微波加热30s，摇床上70rpm 30min，换蒸馏水，摇床70rpm。
2.12棉铃虫生物活性测定
(1)取30g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入3.0mL待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
(2)将全部饲料分装于3个已消毒的24孔细胞培养板中；
(3)先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于24孔板中，每孔一头；接完后，在24孔板上盖一层吹塑纸，再盖盖子，并用橡皮筋固定，严格密封，防止幼虫逃逸；
(4)放置25℃光照培养箱中培养，光周期为12：12。第一天时，培养箱中不需要额外添加水盆，从第二天起，湿度<30％时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结；
(5)7天分别调查死、活虫数，计算死亡率和LC50。
2.13亚洲玉米螟生物活性测定
(1)取30g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入3.0mL待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
(2)将全部饲料分装于3个一次性灭菌培养皿中；
(3)先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于饲料上，每皿30头；接完后，将盖子盖好，并用橡皮筋固定，严格密封，防止幼虫逃逸；
(4)放置25℃光照培养箱中培养。第一天时，培养箱中不需要额外添加水盆，从第二天起，湿度<30％时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结；
(5)7天分别调查死、活虫数，计算死亡率和LC50。
2.14水稻二化螟生物活性测定
(1)取30g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入3.0mL待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；
(2)将全部饲料分装于3个已消毒的一次性培养皿中；
(3)先将幼虫轻轻抖落在一张白纸上，再将白纸倒置，此时幼虫将从白纸上开始拉丝下滑，用毛笔轻轻挑丝将幼虫接于饲料上，每皿30头；接完后，再盖盖子，并用橡皮筋固定，严格密封，防止幼虫逃逸；
(4)放置25℃光照培养箱中培养。第一天时，培养箱中不需要额外添加水盆，从第二天起，湿度<30％时，需要额外添加水盆增加湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结；
(5)7天分别调查死、活虫数，计算死亡率和LC50。
3结果与分析
3.1Cry1Ah蛋白的生物素标记
如图2所示，western blot可以检测到60kDa的条带，说明，Cry1Ah已被标记。
3.2Cry1Ah和Cry1Ai蛋白三维结构及氨基酸序列的比较
在分析棉铃虫APN1的结构基础上，将其分为4个区域进行表达，分别为H1(33-257位氨基酸)、H2(258-547位氨基酸)、H3(548-798位氨基酸)和H4(799-1014位氨基酸)，并将其连在pET28a表达载体上，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达，SDS-PAGE检测结果表明：4个片段均可在大肠杆菌中表达(图3)；Ligand blot结果表明：片段H3(548-798)可以与Cry1Ah蛋白结合，其余片段不与Cry1Ah蛋白结合(图4)。
3.3受体结合区域的鉴定
大量研究表明：Cry蛋白Domain Ⅱ上的loop区域与受体结合有关。在分析预测Cry1Ah蛋白三维立体结构的基础上，确定其Domain Ⅱ的4个loop区域，并合成相应的短肽，多肽序列见表3。首先以生物素标记的Cry1Ah蛋白进行与棉铃虫APN1饱和结合分析，结果如图5A所示，选取在结合体系中加入2.0μg的BiotinCry1Ah蛋白，接近饱和结合的浓度进行后续的竞争结合实验；竞争结合实验结果表明：loopα-8和loop 1不能竞争Cry1Ah与片段H3的结合，loop 2和loop 3能减弱Cry1Ah蛋白与片段H3的结合，但不能完全竞争(图5B)。而loop 2和loop 3同时存在时，可以竞争Cry1Ah蛋白与片段H3的结合(图5C)。
3.4Cry1Ah和Cry1Ai蛋白三维结构及氨基酸序列的比较
将Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白的氨基酸序列提交SWISS-MODEL workspace进行三维结构的预测，并用PyMOL软件分析预测的三维结构，根据序列比对和结构分析，首先确定了Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白的三个Domain相应的位置及Domain Ⅱ中loop区域对应的氨基酸序列(见图6)。
3.5连续多点突变体的构建与表达
明确了Cry1Ah蛋白与棉铃虫APN1片段H3的结合区域是loop 2和loop 3的基础上，在比对分析Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白Domain Ⅱ中4个loop的差异后，拟将Cry1Ai蛋白的loop2和loop 3进行连续多点氨基酸突变，增强其与受体的结合能力，以提高杀虫毒力。以pEB-cry1Ai质粒为模板，用Primer star高保真酶进行反向PCR扩增，扩增引物序列见表2。反向PCR是从插入区域向载体方向扩增目的片段和载体，扩增引物上包含插入区域的碱基序列。电泳检测PCR扩增结果如图7所示，均能扩增出11kb左右的目的条带。
3.6阳性克隆的鉴定
挑取TG1中阳性克隆进行PCR鉴定(PEBF和PEBR为引物)，电泳检测PCR鉴定结果如图8所示，大部分阳性克隆均含有目的片段，说明连续多点突变体构建成功。
提取各突变体在TG1中的质粒，转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，阳性克隆进行PCR鉴定，电泳分析PCR鉴定结果如图9所示。
3.7突变体的表达分析
突变体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，进行IPTG诱导表达，并利用超声波破碎法提取目的蛋白，最后以SDS-PAGE分别检测可溶性蛋白和包涵体蛋白。结果表明：连续多点突变体均能在大肠杆菌中正常表达(图10)。
3.8棉铃虫生物活性分析
首先将连续多点突变体蛋白进行定量，梯度稀释法将蛋白稀释成相应浓度后，加入到30g人工饲料中，混匀备用。7天分别统计死虫数与活虫数，计算校正死亡率。随着Cry1Ai蛋白浓度由1μg/g升高到243μg/g，棉铃虫的校正死亡率并没有呈现出明显上升的趋势，而是维持在40％左右；连续多点突变体ModCry1Ai-loop 3对棉铃虫的作用与对照相似，校正死亡率为0％。而连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2不同，随着浓度的升高，棉铃虫的校正死亡率也逐渐升高。利用SPSS 17.0软件分析各各蛋白的致死中浓度(LC50)，结果显示(表4)，Cry1Ai蛋白对棉铃虫的致死中浓度>500μg/g，而连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2对棉铃虫的致死中浓度为44.90μg/g，至少提高了13倍。
3.9亚洲玉米螟生物活性分析
以梯度稀释法将蛋白稀释成相应浓度后，加入到30g人工饲料中，混匀备用。7天分别统计死虫数与活虫数，计算校正死亡率。利用SPSS 17.0软件分析各蛋白的致死中浓度(LC50)，结果显示(表4)，Cry1Ai蛋白的活性为9.07μg/g，连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2的活性为1.09μg/g，比改造前的Cry1Ai蛋白提高了近9倍。
3.10棉铃虫生物活性分析
以梯度稀释法将蛋白稀释成相应浓度后，加入到30g人工饲料中，混匀备用。7天分别统计死虫数与活虫数，计算校正死亡率。利用SPSS 17.0软件分析各各蛋白的致死中浓度(LC50)，结果显示(表4)，Cry1Ai蛋白对水稻二化螟的活性为15.31μg/g，连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2和连续多点突变体ModCry1Ai-loop 3对水稻二化螟的活性分别为3.97μg/g和2.52μg/g，比改造前的Cry1Ai蛋白提高5-6倍左右。
表4连续多点突变体对几种鳞翅目害虫的致死中浓度
4结论
5.1棉铃虫APN1片段H3(548-798位氨基酸)与Cry1Ah蛋白结合
5.1Cry1Ah蛋白上Domain Ⅱ的loop 2(RPFNIGINNQQ)和loop 3(SMFRSGSSSSVSIIR)是受体结合区域；
5.2Cry1Ah蛋白上Domain Ⅱ其中loop 2(RPFNIGINNQQ)决定其对棉铃虫的杀虫特异性；
5.3本发明采用10个以上的氨基酸连续多点突变Domain Ⅱ中的loop 2或loop 3，可以得到高活性的Cry蛋白突变体。
5.4连续多点突变体ModCry1Aid-loop 2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍；连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2对玉米螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高了近9倍；连续多点突变体ModCry1Ai-loop 2和连续多点突变体ModCry1Ai-loop 3对水稻二化螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高5倍-6倍左右。

Claims (5)

1.获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白立体结构DomainⅡ的loop 2或/和loop 3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10以上的氨基酸序列的改变，
所述突变为Cry1Ai蛋白loop 2或/和loop 3中氨基酸序列突变，所述突变为Cry1Ai突变体蛋白loop 2中的序列突变为369RPFNIGINNQQ379，或/和Cry1Ai突变体蛋白loop 3中的序列突变为435SMFRSGSSSSVSIIR449。
2.权利要求1所述方法得到的蛋白突变体。
3.根据权利要求2所述蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。
4.编码权利要求3所述的蛋白突变体的基因。
5.根据权利要求4所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。
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