CN109097315A

CN109097315A - 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109097315A
Application number: CN201810865295.7A
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 王苗苗
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN109097315B

Abstract

本发明公开了属于生物技术和生物化工领域的一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用。所述高产脂肽的基因工程菌，其是将生物素羧化酶基因转化至原始菌株构建而成，其过表达生物羧化酶。本发明的基因工程菌，在产脂肽枯草芽孢杆菌细胞中扩增并表达了生物素羧化酶YngH，强化了表面活性素分子结构中脂肪酸的合成，从而显著提高了脂肽的产量。本发明所得过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌与出发菌株相比，表面活性素产量最高可以提高47％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景。

Description

一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一类由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸链以内酯键连接而成的两性物质，主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成。由于组成脂肽的肽环中氨基酸组成与成环方式不同，芽孢杆菌脂肽可分为表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等，其中在气/液界面形成独特“马鞍”构象的表面活性素具有良好的表面活性、生物降解性及抗菌活性，在石油开采、生物防治、医药及日化等领域都有广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌发酵生产表面活性素产率低限制了表面活性素的工业化生产和应用。

目前，提高微生物脂肽发酵水平的方法包括培养条件优化、诱变育种、强化表面活性素跨膜运输、强化表面活性素合成酶表达等。专利文献(CN 101892176A、CN 101775427A、WO 2002026961A)等通过对枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性素发酵过程中培养基及培养条件进行优化，提高了发酵液中表面活性素的产量。诱变育种方面，CN101928677A公开了通过紫外诱变处理玫瑰孢链霉菌，US05227294公开了用亚硝基甲替尿烷处理枯草芽孢杆菌，上述文献中的微生物在诱变处理后，其表面活性素合成量都有增加。基因工程改造方面，中国专利文献CN103898038 A公开了通过强化脂肽由胞内向胞外运输的跨膜蛋白YcxA，枯草芽孢杆菌发酵生产的表面活性素产量提高了97％。中国专利文献CN1554747A公开了在枯草芽孢杆菌中表达comA基因，脂肽产量提高了50％。另外，枯草芽孢杆菌中脂肪酸和氨基酸在表面活性素合成酶的作用下催化合成表面活性素，中国专利文献CN105400784A通过将脂肽合成酶基因簇启动子替换成诱导型强启动子Pg3，表面活性素产量提高了17.7倍。(Dhali D,Coutte F,Arias AA,et al.Genetic engineering of the branched fatty acidmetabolic pathway of Bacillus subtilis for the overproduction of surfactinC14 isoform[J].Biotechnology journal,2017,12(7):1600574.)公开了敲除枯草芽孢杆菌中催化支链氨基酸生成脂肪酸的BKD操纵子中的lpdV基因，表面活性素产量提高了1.4倍。上述方法中都增加了表面活性素的产量，但是关于强化细胞中脂肪酸合成来提高表面活性素产量的研究未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点，本发明的目的在于提供一种高效的生产脂肽的基因工程菌，其可以提高脂肽的产量。

一种高产脂肽的工程菌其是将生物素羧化酶基因转化至原始菌株构建而成，其过表达生物羧化酶。

上述基因工程菌中，所述生物素羧化酶为YngH蛋白或其具有相同功能的突变体。

上述基因工程菌中，所述YngH蛋白其具有相同功能的突变体是指因为基因序列改变，但是表达后具有和YngH蛋白相同或相似的功能的YngH蛋白的突变体。

上述基因工程菌中，优选的，所述YngH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基因工程菌中，优选的，YngH蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因工程菌中，所述原始菌株为具有产脂肽能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株。

上述基因工程菌中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。

上述基因工程菌中，优选的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisTHY7。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY7，于2014年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.8906，并在中国专利文献CN 105400784A中公开。

上述基因工程菌中，最优选的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisTHY7/Pg3-srfA。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY7/Pg3-srfA，是指在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY7中加入诱导型强启动子Pg3，使强启动子Pg3控制表面活性素合成酶srfA的表达。关于诱导型强启动子Pg3、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY7/Pg3-srfA及其具体的制备方法在中国专利文献CN 105400784A中有公开。

上述基因工程菌中，所述YngH蛋白受强启动子控制。

上述基因工程菌中，所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素。

上述基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

扩增得到生物素羧化酶基因，将生物素羧化酶基因序列插入穿梭质粒，构建表达质粒；

将表达质粒导入原始菌株，构建基因工程菌。

上述基因工程菌的制备方法中，所述生物素羧化酶基因为YngH蛋白基因。

详细方法为：

1、利用上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得yng H基因序列，优选的，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、将yng H基因以及穿梭质粒分别进行双酶切，使用连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物。

3、将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，进行抗性筛选阳性克隆，得到含有yng H基因序列的表达质粒pJMP-yngH。

4、将表达质粒pJMP-yngH转入出发菌株中，获得转化有pJMP-yngH质粒的基因工程菌。

上述基因工程菌的制备方法中，所述穿梭质粒的构建方法为：

将强启动子和质粒复制基因按强启动子-MCS-质粒复制基因的顺序拼接入穿梭质粒；MCS位置为目的基因插入位置。

上述基因工程菌的制备方法中，优选的，所述穿梭质粒的构建方法为：

将强启动子和repA基因按强启动子-MCS-repA基因的顺序插入穿梭质粒；优选的，所述穿梭质粒为pJOE8999，穿梭质粒中插入时的酶切位点为BsrG I和Pst I。

上述基因工程菌的制备方法中，优选的，所述强启动子为Pg3。Pg3在CN105400784A中公开，其核心序列如SEQ ID NO.5所示。

所述穿梭质粒的构建的具体方法为：

①扩增得到强启动子Pg3基因序列。

②扩增获得repA-MCS序列。

③将步骤①中得到的Pg3片段、步骤②中得到的repA-MCS基因、质粒pJOE8999分别进行双酶切，使用连接酶将两种酶切产物进行连接强启动子-MCS-repA基因，得到连接产物；

④将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒并测序验证，得到用于基因过表达的质粒pJMP。

一种基因工程菌的制备方法，具体方法包括如下：

1、以yngH-F和yngH-R为上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得yngH基因序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、将yngH基因以及穿梭质粒分别进行BamH I和Xba I双酶切，纯化酶切产物，使用T4 DNA连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物。

3、将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于含氯霉素和卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒进行酶切及测序验证，得到含有正确yngH基因序列的表达质粒pJMP-yngH。

4、将表达质粒pJMP-yngH使用电转化方法转入枯草芽孢杆菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfA(CN 105400784A)中，涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB平板上，挑取抗性克隆进行培养，进行PCR验证，获得转化有pJMP-yngH质粒的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)。

优选的，步骤1中所述的枯草芽孢杆菌基因组可以选择枯草芽孢杆菌1012wt(MoBiTec公司)、枯草芽孢杆菌THY-7(CN 105400784A)、THY-8(化工进展，2013，32：2952-2956)、THY-15(Journal of industrial microbiology&biotechnology.2015,42(8):1139–1147)或携带yng H基因的其它芽孢杆菌菌株。

优选的，步骤2中所述穿梭质粒优选pJMP。

所述穿梭质粒pJMP通过pHT08(购自MoBiTec公司)、pJOE8999(Applied andEnvironmental Microbiology,2016,82:5421–5427)和诱导性强启动子Pg3(在“Biotechnology and Bioengineering,2016,114(4):832-842.”和CN 105400784A中有公开)连接组建而成，具体方法如下：

①利用上下游引物，以质粒Pg3-srfA(制备方法在CN105400784A中公开)为模板进行聚合酶链式反应，获得启动子Pg3基因序列。

②利用上下游引物，以质粒pHT08为模板进行聚合酶链式反应，获得repA-MCS序列。

③将步骤①中得到的Pg3基因用BsrGI和BamHI进行双酶切，将步骤②中得到的repA-MCS基因用BamH I和Pst I进行双酶切，将质粒pJOE8999用BsrG I和Pst I进行双酶切，酶切后纯化上述3个酶切基因片段，使用T4 DNA连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物；

④将连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒并测序验证，得到用于基因过表达的质粒pJMP。

本发明的目的也在于提供上述基因工程菌在制备脂肽的中的应用。

为此，本发明的目的还在于提供一种制备脂肽的方法，采用上述基因工程菌生产脂肽，步骤如下：

(1)将工程菌接入培养基中，进行扩大培养，得到基因工程菌菌液；

(2)按照1-20％体积百分比将步骤(1)得到的工程菌菌液接入发酵培养基中，进行发酵培养，得到含有脂肽的发酵液。

上述方法中，所述扩大培养的方法为：在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养10-20h。

上述方法中，所述发酵培养的方法为在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养1.5-4h时加入0.5-1.5mM IPTG诱导剂后继续培养40-60h。

上述方法中，所述发酵培养基的组成为：糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5-3g/L，KH₂PO₄ 0.1-1g/L,Na₂HPO₄·12H₂O 0.5-0.3g/L,CaCl₂ 0.002-0.01g/L,MnSO₄·H₂O 0.002-0.01g/L,FeSO₄·7H₂O 0.002-0.01g/L,pH 6.5-7.5。

本发明的优点和有益效果：

本发明采用基因工程技术构建基因工程菌，在产脂肽枯草芽孢杆菌细胞中扩增并表达了生物素羧化酶(也称乙酰CoA羧化酶)YngH，强化了表面活性素分子结构中脂肪酸的合成，从而显著提高了脂肽的产量。本发明所得过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌与出发菌株相比，表面活性素产量提高了47％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景，摇瓶发酵所得发酵液中脂肽产量平均为11-14g/L，5L发酵罐中表面活性素的平均产量为15-20g/L。

附图说明

图1为用于基因过表达质粒pJMP的示意图。

图2为携带生物素羧化酶基因yng H的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pJMP-yngH的示意图。

图3为含有yng H基因的过表达质粒pJMP-yngH的PCR与酶切验证图：泳道1为DNA分子量标准，泳道2为质粒使用引物yngH-F和yngH-R进行PCR扩增的结果，可得到1.3kb的条带；泳道3为过表达质粒pJMP-yngH进行BamHI-XbaI酶切的结果，可得到1.3kb和4.0kb的条带。

图4为过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌B.subtilis THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)的PCR验证图：泳道1为DNA分子量标准，泳道2为THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)用引物yngH-F和通用引物pJMP-R进行PCR扩增的结果，可得到1.9kb的条带。

图5为原始菌株THY-7与基因工程菌THY-7(pJMP-yngH)的发酵产物中表面活性素的浓度。

图6为原始菌株THY-7/Pg3-srfA与基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)的发酵产物中表面活性素的浓度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。

所用质粒pHT08购买于MobiTec公司，质粒pJOE8999受赠于德国JosefAltenbuchner教授，质粒pJMP是在pHT08和pJOE8999基础上自行购建(构建过程在实施例中详细阐述)。

脂肪酸合成途径中乙酰CoA到丙二酰CoA这一步是重要影响步骤，在微生物体内催化这一步反应的酶是乙酰CoA羧化酶复合体(AccABCD，accAD编码乙酰CoA羧化酶，accBC编码生物素羧化酶)，其他研究者在不同的研究体系中通过强化accABCD来促进乙酰CoA到丙二酰CoA这一重要步骤的进行。在发明人先前发现的枯草芽孢杆菌中发现催化这一步骤的除了AccABCD外，基因组中还有一个生物素羧化酶2YngH。

发明人前期实验中通过用反义RNA的方法分别弱化这几个相关基因的翻译水平发现：弱化YngH时能明显降低表面活性素的合成，由此推测在目标菌中YngH是催化这一步反应影响表面活性素合成的重要酶。

实施例1用于过表达目标基因的质粒pJMP的构建

挑取包含有质粒Pg3-srfA(质粒制备方法见中国专利文献CN105400784A具体实施方式部门)、质粒pHT08的大肠杆菌单菌落，接种于含50-100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，挑取包含有质粒pJOE8999的大肠杆菌单菌落接种于含20-50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，放置于37℃、200rpm的摇床中过夜培养。在12000rpm、1min条件下收集菌体，使用Omega公司的质粒提取试剂盒提取质粒Pg3-srfA、pHT08和pJOE8999。

以得到的Pg3-srfA质粒为模板，使用上游引物BsrGI-Pg3-F(序列如SEQ ID NO.3所示)和下游引物BamHI-Pg3-R(序列如SEQ ID NO.4所示)进行PCR扩增得到BsrGI-Pg3-BamHI片段，其中Pg3的核心序列如SEQ ID NO.5所示。

以得到的pHT08质粒为模板，使用上游引物BamHI-MCS-repA-F(序列如SEQ IDNO.6所示)和下游引物PstI-MCS-repA-R(序列如SEQ ID NO.7所示)进行PCR扩增得到BamHI-MCS-repA-PstI片段，其中MCS-repA的基因片段如如SEQ ID NO.8所示。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10μM备用。

PCR扩增所用聚合酶、缓冲液和限制性内切酶购自TaKaRa公司。PCR扩增反应体系为：

热循环条件为

将BsrGI-Pg3-BamHI片断用BsrG I和BamH I进行双酶切，将BamHI-MCS-repA-PstI片段用BamH I和Pst I进行双酶切，将质粒pJOE8999用BsrG I和Pst I进行双酶切，27-33℃酶切1-3h后用Omega公司的DNA纯化试剂盒纯化回收上述3个酶切片段，使用T4 DNA连接酶(NEB公司)将3种酶切产物在16-22℃条件下过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌E.coliTOP10感受态细胞(TianGen公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒并测序验证，得到用于基因过表达的质粒pJMP，如图1所示。

实施例2携带生物素羧化酶基因yng H的质粒构建

挑取枯草芽孢杆菌B.subtilis THY-7单菌落，接种于LB液体培养基中，放置于37℃、200rpm的摇床中过夜培养，在12000rpm、5min离心条件下收集菌体，使用Omega公司的细菌基因组提取试剂盒提取THY-7基因组。以得到的基因组为模板，使用上游引物BamH I-yngH-F(序列如SEQ ID NO.9所示)和下游引物Xba I-yngH-R(序列如SEQ ID NO.10所示)进行PCR扩增得到yngH片段。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10μM备用。PCR扩增所用聚合酶、缓冲液和限制性内切酶购自TaKaRa公司。PCR扩增反应体系为：

热循环条件为

扩增纯化得到枯草芽孢杆菌yng H基因片断，其序列如SEQ ID NO.2所示。与穿梭质粒pJMP进行BamH I/Xba I(TaKaRa公司)双酶切，27-33℃酶切1-3h后用Omega公司的DNA纯化试剂盒进行纯化，然后使用T4 DNA连接酶(NEB公司)在16-22℃条件下过夜连接。连接产物转化大肠杆菌E.coli TOP10感受态细胞(TianGen公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板，倒置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上长出来的抗性克隆进行培养，提取质粒并测序验证，得到含有yngH基因的表达质粒pJMP-yngH，如图2所示。将得到的质粒pJMP-yngH进行PCR验证与酶切验证(使用引物BamH I-yngH-F和Xba I-yngH-R可扩增出约1.3kb条带，BamHI/Xba I双酶切可得到4.0kb+1.3kb条带)，验证结果如图3所示。

实施例3过表达生物素羧化酶YngH基因工程菌的构建

将实施例2中构建的携带生物素羧化酶基因yngH的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pJMP-yngH以电穿孔法转化枯草芽孢杆菌THY-7的感受态细胞，可得到过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌THY-7(pJMP-yngH)。其中，枯草芽孢杆菌THY-7感受态细胞的制备及电转化采用中国专利文献CN105400784A中的方法。

复苏后取100uL菌液涂布于含10-30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落，使用上下游引物BamHI-yngH-F和pJMP-R进行PCR验证，可扩增出约1.9kb条带，验证结果如图4所示，即获得过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌THY-7(pJMP-yngH)。所述质粒引物pJMP-R的碱基序列如SEQ ID NO.11所示。

按上述方法，类似的，将实施例2中构建的携带生物素羧化酶基因yngH的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pJMP-yngH以电穿孔法转化枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA的感受态细胞，可得到过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)。其中，枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA感受态细胞的制备及电转化采用中国专利文献CN105400784A中的方法。

复苏后取100uL菌液涂布于含5-10μg/mL氯霉素和10-30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)。

实施例4使用基因工程菌THY-7(pJMP-yngH)生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例3所得到的过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)接种于LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃、200rpm条件下培养16h，得到基因工程菌菌液；

以5％的比例接入装有100mL发酵培养基的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养2-6h时加入1mM的IPTG，继续培养至2d，即得到含脂肽的发酵液。

所使用的发酵培养基的组成为：糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5-3g/L，KH₂PO₄ 0.1-1g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 0.5-0.3g/L,CaCl₂ 0.002-0.01g/L,MnSO₄·H₂O 0.002-0.01g/L,FeSO₄·7H₂O 0.002-0.01g/L,pH 6.5-7.5。

发酵液中表面活性素检测采用中国专利文献CN105400784A中的方法。基因工程菌THY-7(pJMP-yngH)与出发菌株THY-7发酵液中表面活性素浓度的统计结果如图5所示：THY-7(pJMP-yngH)表面活性素产量为0.89g/L，比THY-7出发菌(0.49g/L)提高了81.6％。

实施例5使用基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)生产脂肽类表面活性剂—表面活性素

将实施例3所得到的过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)接种于LB液体培养基(含氯霉素和卡那霉素)中，37℃、200rpm条件下培养16h，以5％的比例接入装有100mL发酵培养基的摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养2-6h时加入IPTG，继续培养至2-3d，即得到含脂肽的发酵液。

发酵液中表面活性素检测采用于慧敏等(CN201510654218.3)的方法。基因工程菌THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)与出发菌株THY-7/Pg3-srfA发酵液中表面活性素浓度的统计结果如图6所示：THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)表面活性素产量可达13.3g/L，比THY-7/Pg3-srfA出发菌(9.05g/L)提高了47％。5L发酵罐培养THY-7/Pg3-srfA(pJMP-yngH)，表面活性素产量达到16g/L。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Phe Thr Lys Val Leu Ile Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Met Arg

1 5 10 15

Ile Ile Arg Thr Cys Ser Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Ala Val Tyr

20 25 30

Ser Glu Ala Asp Lys Asp Ala Leu His Thr Lys Ala Ala Thr Glu Ala

35 40 45

Tyr Leu Ile Gly Glu Ser Arg Val Ser Glu Ser Tyr Leu Asn Ile Glu

50 55 60

Arg Ile Ile Lys Thr Ala Lys Lys Ala Lys Ala Asp Ala Ile His Pro

65 70 75 80

Gly Tyr Gly Leu Leu Ser Glu Asn Ser Arg Phe Ala Glu Arg Cys Lys

85 90 95

Gln Glu Asn Ile Val Phe Ile Gly Pro Ser Pro Asp Ile Ile Ala Lys

100 105 110

Met Gly Ser Lys Ile Glu Ala Arg Lys Ala Met Glu Ala Ala Gly Val

115 120 125

Pro Val Val Pro Gly Val Ser Glu Ser Leu Gly Asp Ile Glu Ala Ala

130 135 140

Cys Arg Thr Ala Ser Gln Ile Gly Tyr Pro Val Met Leu Lys Ala Ser

145 150 155 160

Ala Gly Gly Gly Gly Ile Gly Met Gln Arg Val Glu Asn Glu Glu Ala

165 170 175

Leu Lys Lys Ala Tyr Glu Gly Asn Lys Lys Arg Ala Ala Asp Phe Phe

180 185 190

Gly Asp Gly Ser Met Tyr Ile Glu Lys Val Ile Glu His Ala Arg His

195 200 205

Ile Glu Val Gln Leu Leu Ala Asp Gln His Gly His Thr Val His Leu

210 215 220

Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Val Ile Glu

225 230 235 240

Glu Ala Pro Ser Pro Phe Val Asp Asp Glu Leu Arg Met Lys Ile Gly

245 250 255

Gln Thr Ala Val Lys Ala Ala Lys Ala Ile Gly Tyr Thr Asn Ala Gly

260 265 270

Thr Ile Glu Phe Ile Val Asp Gln Lys Gln Asn Phe Tyr Phe Leu Glu

275 280 285

Met Asn Thr Arg Leu Gln Val Glu His Pro Val Thr Glu Glu Ile Thr

290 295 300

Gly Leu Asp Leu Val Glu Gln Gln Leu Arg Ile Ala Ala Gly His Thr

305 310 315 320

Leu Thr Phe Ser Gln Lys Asp Ile Gln Arg Asn Gly His Ala Ile Glu

325 330 335

Val Arg Ile Tyr Ala Glu Asp Pro Lys Thr Phe Phe Pro Ser Pro Gly

340 345 350

Thr Ile Thr Ala Phe Ser Leu Pro Asp Gln Lys Gly Val Arg His Glu

355 360 365

Cys Thr Val Ala Lys Asp Ser Thr Val Thr Pro Phe Tyr Asp Pro Met

370 375 380

Ile Ala Lys Met Ile Val Lys Gly Gln Thr Arg Thr Glu Ala Ile Glu

385 390 395 400

Lys Leu Glu Thr Ala Leu Arg Asn Tyr Arg Val Glu Gly Ile Lys Thr

405 410 415

Asn Leu Pro Leu Leu Ile Gln Ala Ala Ala Thr Lys Ala Phe Lys Glu

420 425 430

Gly Asp Val Thr Thr Asp Phe Leu Lys Gln His Leu

435 440

<210> 3

<211> 1335

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgtttacaa aagtactgat cgccaaccgc ggagaaattg caatgagaat tatccgaaca 60

tgcagccgtc tcggcattaa aacggttgcg gtttattcag aagccgacaa ggacgcgctc 120

catacaaaag ccgctacaga ggcttatttg atcggggaat cgagagtcag tgaaagttat 180

ttaaatatag agagaataat aaagacagcg aaaaaagcaa aagccgacgc gatccacccg 240

ggatatggat tgttatcaga aaacagccgg ttcgctgaac gctgcaagca agaaaacatc 300

gtgtttatcg gaccttcccc tgatatcatc gcaaagatgg gcagcaaaat tgaagcgcga 360

aaagcaatgg aggctgcagg tgtccctgtg gtgccgggcg tttctgaatc cctcggagat 420

atagaggcag cctgccgcac cgcaagtcaa atcggctatc ctgtcatgct gaaagcttca 480

gcgggcggag gcggcatcgg aatgcagcgt gttgaaaatg aagaagcatt aaaaaaagcg 540

tacgagggaa acaaaaagcg cgcagcagat tttttcggtg acgggtcgat gtatatagaa 600

aaagttattg aacatgcgcg ccacatcgag gttcagcttt tggccgatca acacggccat 660

acagtacatc tgtttgaacg tgattgctct gttcagaggc gccaccaaaa agtcattgaa 720

gaagcaccgt ctccatttgt agacgatgaa ctaagaatga agatcgggca aacagcggta 780

aaagcagcga aggcaatcgg ctatacgaac gcaggcacca tcgaattcat agttgaccag 840

aagcaaaatt tttatttcct cgaaatgaat acgagactgc aagttgaaca ccccgtgact 900

gaagaaataa caggcctgga cttagttgag cagcagctgc ggattgctgc gggccataca 960

ctcacattct cccaaaaaga catccaacgg aacgggcatg cgatagaggt tcgaatatac 1020

gcggaagatc ccaagacctt cttcccgtca ccaggtacga tcactgcgtt ttcacttcct 1080

gaccaaaaag gagtcagaca cgaatgtacg gtagcaaaag acagcaccgt tacccctttt 1140

tatgacccga tgatcgctaa gatgattgtc aaaggccaaa ccagaacaga agcaattgaa 1200

aaactagaga cagcgcttcg caactatcgt gtagagggaa tcaaaacaaa tcttccgctt 1260

ctcatacagg ctgcggcaac aaaggcattt aaagaagggg atgtcacgac tgactttttg 1320

aaacagcacc tataa 1335

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aactgtacaa gctattgtaa cataatcggt acgg 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaaggatcca gatccttcct cctttaattg ggaa 34

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttgacattgg aagggagatt ctttataat 29

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cacggatcct ctagagtcga cgt 23

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

acactgcagt tattgcactt ttcttagttc g 31

<210> 8

<211> 2108

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggatcctcta gagtcgacgt ccccggggca gcccgcctaa tgagcgggct tttttcacgt 60

cacgcgtcca tggagatctt tgtctgcaac tgaaaagttt ataccttacc tggaacaaat 120

ggttgaaaca tacgaggcta atatcggctt attaggaata gtccctgtac taataaaatc 180

aggtggatca gttgatcagt atattttgga cgaagctcgg aaagaatttg gagatgactt 240

gcttaattcc acaattaaat taagggaaag aataaagcga tttgatgttc aaggaatcac 300

ggaagaagat actcatgata aagaagctct aaactattca taaccttaca tggaattgat 360

cgaagggtgg aaggttaatg gtacgaaatt aggggatcta cctagaaagc acaaggcgat 420

aggtcaagct taaagaaccc ttacatggat cttacagatt ctgaaagtaa agaaacaaca 480

gaggttaaac aaacagaacc aaaaagaaaa aaagcattgt tgaaaacaat gaaagttgat 540

gtttcaatcc ataataagat taaatcgctg cacgaaattc tggcagcatc cgaagggaat 600

tcatattact tagaggatac tattgagaga gctattgata agatggttga gacattacct 660

gagagccaaa aaacttttta tgaatatgaa ttaaaaaaaa gaaccaacaa aggctgagac 720

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gaattaagaa agacatggga ataaaaatat tttaaatcca gtaaaaatat gataagatta 840

tttcagaata tgaagaactc tgtttgtttt tgatgaaaaa acaaacaaaa aaaatccacc 900

taacggaatc tcaatttaac taacagcggc caaactgaga agttaaattt gagaagggga 960

aaaggcggat ttatacttgt atttaactat ctccatttta acattttatt aaaccccata 1020

caagtgaaaa tcctctttta cactgttcct ttaggtgatc gcggagggac attatgagtg 1080

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cggaagagaa gatatggaca gaagagcaaa taaaaaactt ttctttagac aaatttggta 1260

cgcatatacc ttacatagaa ggtcattata caatcttaaa taattacttc tttgattttt 1320

ggggctattt tttaggtgct gaaggaattg cgctctatgc tcacctaact cgttatgcat 1380

acggcagcaa agacttttgc tttcctagtc tacaaacaat cgctaaaaaa atggacaaga 1440

ctcctgttac agttagaggc tacttgaaac tgcttgaaag gtacggtttt atttggaagg 1500

taaacgtccg taataaaacc aaggataaca cagaggaatc cccgattttt aagattagac 1560

gtaaggttcc tttgctttca gaagaacttt taaatggaaa ccctaatatt gaaattccag 1620

atgacgagga agcacatgta aagaaggctt taaaaaagga aaaagagggt cttccaaagg 1680

ttttgaaaaa agagcacgat gaatttgtta aaaaaatgat ggatgagtca gaaacaatta 1740

atattccaga ggccttacaa tatgacacaa tgtatgaaga tatactcagt aaaggagaaa 1800

ttcgaaaaga aatcaaaaaa caaataccta atcctacaac atcttttgag agtatatcaa 1860

tgacaactga agaggaaaaa gtcgacagta ctttaaaaag cgaaatgcaa aatcgtgtct 1920

ctaagccttc ttttgatacc tggtttaaaa acactaagat caaaattgaa aataaaaatt 1980

gtttattact tgtaccgagt gaatttgcat ttgaatggat taagaaaaga tatttagaaa 2040

caattaaaac agtccttgaa gaagctggat atgttttcga aaaaatcgaa ctaagaaaag 2100

tgcaataa 2108

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cacggatcca tgtttacaaa agtactgatc 30

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

acatctagat tataggtgct gtttca 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cagcctttgt tggttctttt 20

Claims

1.一种高产脂肽的基因工程菌，其是将生物素羧化酶基因转化至原始菌株构建而成，其过表达生物羧化酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述生物素羧化酶为YngH蛋白或其具有相同功能的突变体，优选的，所述YngH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1-3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述原始菌株为具有产脂肽能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株。

4.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌，优选的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY7，最优选的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY7/Pg3-srfA。

5.一种高产脂肽的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

扩增得到生物素羧化酶基因，将生物素羧化酶基因序列插入穿梭质粒，构建表达质粒，优选的，所述生物素羧化酶基因为YngH蛋白基因；将表达质粒导入原始菌株，构建基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述穿梭质粒的构建方法为：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述强启动子为启动子Pg3，所述质粒复制基因为repA基因，所述穿梭质粒为pJOE8999，穿梭质粒中插入时的酶切位点为BsrG I和Pst I。

8.权利要求1-4任一所述的基因工程菌在制备脂肽的中的应用。

9.一种制备脂肽的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一所述基因工程菌生产脂肽，步骤如下：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述扩大培养的方法为：在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养10-20h；所述发酵培养的方法为在35-40℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养1.5-4h时加入0.5-1.5mM IPTG诱导剂后继续培养40-60h。