CN101768212B - 极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了了极端嗜盐菌(Natrinema altunense sp.)高盐耐受相关蛋白NASOD(SEQ ID No.2)及其编码基因NASOD(SEQ IDNo.1)，经实验验证将NASOD以融合蛋白形式，在大肠杆菌内可溶性表达，可提高大肠杆菌耐受高盐环境的能力，这对于作物转基因技术具有重要借鉴意义，可将其转入农作物中，获得具有耐高盐能力的转基因农作物以提高农作物适应性，具有重要应用前景。

Description

极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其编码基因与应用

(一)技术领域

本发明涉及极端嗜盐菌(Natrinema altunense sp.)高盐耐受相关蛋白及其编码基因，以及其在提高微生物和农作物耐受高盐能力中的应用。

(二)背景技术

生物的逆境生存一直是生物学研究的主要内容之一，尤其是近年来，它已经成为一个重大生物学问题，极端环境生物作为全新的生物资源，因此倍受关注。目前对于生物逆境生长主要集中在植物、动物和模式生物上，对原本生活在极端环境中的古菌，研究很少，尤其是极端嗜盐菌的分子信息更加匮乏。

极端嗜盐菌作为一种常见古菌，其分子水平的研究开展得相对较少，因此大量获取其基因资源，来研究它们的适应极端环境的机理显得尤为重要。极端嗜盐菌属于古菌，是和真核生物、细菌完全不同的生物类型，还远没有被人们认识，其本身作为一种全新生物资源具有广阔的研究价值和应用前景。耐受极端环境的分子机理一旦被破解，势必可以应用到医药和农业领域，大幅提高它们的生产和研究水平。目前有关极端嗜盐菌的研究主要局限于细菌的分离鉴别、一般组织化学、生化成分和基本生理指标，在基因水平的认识和可操作性则几乎为零。

(三)发明内容

本发明目的是提供极端嗜盐菌(Natrinema altunense sp.)高盐耐受相关蛋白及其编码基因，以及其在提高微生物和农作物耐受高盐能力中的应用。

本发明采用的技术方案是：

极端嗜盐菌(Natrinema altunense sp.)高盐耐受相关蛋白，具有与SEQID No.2所示氨基酸序列90％以上同源性的氨基酸序列。在已知SEQ IDNo.2氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可根据常识对其进行结构改造，比如对序列2中的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、插入或缺失，得到且具有相同活性的蛋白质，上述蛋白质也在本发明保护范围之内。

优选的，所述高盐耐受相关蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还涉及编码所述极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因。优选的，所述基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明是对极端嗜盐菌AJ2在不同盐浓度下的蛋白表达差异入手，通过SDS-Page、HPLC、氨基酸测序、基因克隆等研究，获得了极端嗜盐菌AJ2的高盐耐受相关蛋白NASOD和相对应的基因NASOD。并将NASOD基因转入大肠杆菌表达，研究了NASOD融合蛋白提高大肠杆菌耐盐能力的影响。

本发明还涉及极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其编码基因在提高微生物菌株耐受高盐能力中的应用。

具体的，所述应用为：将编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因转入宿主菌，使宿主菌表达极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白，得到具有耐高盐能力的重组菌株。

优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。实验证明，所述NASOD以融合蛋白形式，在大肠杆菌内可溶性表达，可提高大肠杆菌耐受高盐环境的能力。由于大肠杆菌是本领域最为常见和最具代表性的微生物菌种，因此可以推论NASOD以融合蛋白形式，在其他微生物菌株内可溶性表达，也可相应提高其耐受高盐环境的能力。

本发明还涉及极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其编码基因在提高农作物耐受高盐能力中的应用。根据极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白相关性质，可以预见该高盐耐受相关蛋白也可用于提高农作物耐受高盐能力。目前世界各国都面临着耕地资源缺乏的问题，盐碱地是很常见的不可利用土地，一般的作物都无法在其上生长。目前的转基因技术主要集中在病虫害的防治上，对作物的适应性研究还是空白。NASOD转化大肠杆菌，提高其耐盐能力，这对作物转基因技术具有重要的借鉴意义。

具体的，所述应用为：将编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因转入农作物，使农作物表达极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白，得到具有耐高盐能力的转基因农作物。

本发明的有益效果主要体现在：提供极端嗜盐菌(Natrinema altunensesp.)高盐耐受相关蛋白NASOD及其编码基因NASOD，经实验验证将NASOD以融合蛋白形式，在大肠杆菌内可溶性表达，可提高大肠杆菌耐受高盐环境的能力，这对于作物转基因技术具有重要借鉴意义，可将其转入农作物中，获得具有耐高盐能力的转基因农作物以提高农作物适应性，具有重要应用前景。

(四)附图说明

图1为实施例2实验菌在20℃、3％盐浓度下的生长曲线；

图2为实施例1极端嗜盐菌AJ2样品SDS-Page分析结果；

图3为实施例1极端嗜盐菌AJ2样品HPLC分析结果；1为blank，2为1.7M NaCl浓度的取样结果，2为3.0M NaCl浓度的取样结果；

图4为IPTG诱导表达细菌的SDS-Page分析结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：NASOD蛋白的分离纯化、氨基酸测序、基因克隆

1)A.将极端嗜盐菌AJ2(由浙江大学生命科学学院微生物所吴敏教授馈赠)培养在1.7M和3.0M NaCl浓度下，在生长到指数生长中期时取样。进行SDS-Page分析(图2)和HPLC分析(图3)。结合两个分析结果，获得差异蛋白，并且用HPLC和SDS-Page纯化得到这个蛋白。

B.氨基酸测序。获得NASOD氨基酸序列N端25个残基。

2)a.通过blast比对，NASOD应该属于极端嗜盐菌SOD家族。根据已报道的嗜盐菌SOD序列，在保守区域设计简并引物(SOD-PF2：CTNCCVTACGACTACGAYGC，SOD-PR2：GTAGTAKGARTG YTC CCAGACG)，PCR扩增、测序得到NASOD ORF中间一段基因序列。

b.以步骤a中获得的基因序列约500bp为模版，制备DNA探针(DIG标记法)，对AJ2的基因组DNA的XhoI酶切产物，做southern杂交，获得一个杂交信号。

c.根据步骤b的southern杂交的结果，将杂交信号位置的基因组DNA的XhoI酶切产物回收，利用Taq酶补平末端，连接到T载体。转化大肠杆菌DH5a。将转化菌铺板。

d.用步骤b的DNA探针，针对步骤c铺的板，做菌落杂交。选取杂交信号的单菌落测序。获得NASOD的ORF全序列，以及其5’上游和3’下游序列。

3)将第2步和第1步的结果比对，仅一个氨基酸序列的差异，可以认为是氨基酸测序的误差。

获得的NASOD的5’上游、ORF、3’下游序列，NASOD的氨基酸序列如下：

                                                                            TC

GAGCACGCCCACCACAAGGAGTTCGAGTGAGTCGGGACGGGACTGTCACGCCCGCTTGCGCGACGGAAGACGCTCGGAA

GGACGTTGCTGAAAGGTTTAATACGCAGTCCGTAGTTCGTTCACCGAAGTGTCGGGAAATCACGAGACAGGACGGCCGC

GCCTTTATGAGGTGTGATATCGTCTCACTCCTCAAAACTTAACAGGCGAGATACCGATACGGAACGTGAGGTGCATACT

nt1   ATG ACT GAT CAC GAA CTT CCA CCA CTC CCG TAC GAT TAC GAC GCG CTC GAA CCG GCA CTG

aa1   M   T   D   H   E   L   P   P   L   P   Y   D    Y   D   A   L  E    P   A   L

nt61  TCC GAA CAG GTA CTG ACC TGG CAT CAC GAT ACG CAC CAC CAG GGC TAC GTC AAC GGC CTC

aa21   S   E   Q   V   L   T   W   H   H   D    T   H   H   Q   G   Y   V   N   G   L

nt121 AAC GCC GCC GAG GAG ACC CTC GCG GAG AAC CGC GAG GAG GGC GAC TTC GGC TCG ACG CCC

aa41   N   A   A   E   E   T   L   A   E   N    R   E   E   G   D   F   G   S   T   P

nt181 GGT GCC CTC AAA AAC GTT ACT CAC AAC GGC TGT GGT CAC TAT CTC CAC ACG CTG TTC TGG

aa61   G   A   L   K   N   V   T   H   N   G    C   G   H   Y   L   H   T   L   F   W

nt241 GAG AAC ATG TCC CCC AAC GGC GGC GGC GAG CCG GAC GGC GAC CTC GCC GAC CGC ATC GAG

aa81   E   N   M   S   P   N   G   G   G   E    P   D   G   D   L   A   D   R   I   E

nt301 GAG GAC TTC GGA TCC TAC GAG GGC TGG AAA GGC GAG TTC GAG GCC GCT GCC GGT GCC GCC

aa101  E   D   F   G   S   Y   E   G   W   K    G   E   F   E   A   A   A   G   A   A

nt361 GGT GGC TGG GCA CTG CTG GTG TAC GAT CCG GTT GCG AAG CAA CTT CGC AAC GTC GCG GTC

aa121  G   G   W   A   L   L   V   Y   D   P    V   A   K   Q   L   R   N   V   A   V

nt421 GAC AAG CAC GAC CAG GGC GCG CTC TGG GGC GCA CAT CCA GTG CTC GCG CTG GAC GTC TGG

aa141  D   K   H   D   Q   G   A   L   W   G    A   H   P   V   L   A   L   D   V   W

nt481 GAG CAC TCC TAC TAC TAC GAC TAC GGT CCG GAC CGC GGA GAC TTC ATC GAC GCC TTC TTC

aa161  E   H   S   Y   Y   Y   D   Y   G   P    D   R   G   D   F   I   D   A   F   F

nt571 GAC GTC GTC AAC TGG GAG AAG GCC GAA GAG GAG TAC CAG ACC TGC CTC GAC CAC TTC GAG

aa181  D   V   V   N   W   E   K   A   E   E    E   Y   Q   T   C   L   D   H   F   E

nt601 TAA CTCGCCGGCGAAGCGACGAGCCAGTTGATCGCGTCTTTTTATTGCCACGGCCACGGCGACTGTCGGTTGCACCTC

aa201  .

CGAGTTACCCGTATAGTGATCGATATAAACACTCATGGCTACTTCATTGAGTTCGCCAATGCTGATATTTATGCTCATG

TGTCAACTTCGCTGAGCGGCGAGTACAAAGCCTCACGACAGAGTAGGCAGAATTAACGCTTTCCGCGTTCGTTACTACT

GCTAATAATCTACTACCG

NASOD的ORF全长603bp(序列见SEQ ID No.1)，5’上游序列一共286bp，3’下游序列一共670bp。

它编码200个氨基酸(序列见SEQ ID No.2)，分子量约22.4kDa。它推演的氨基酸序列中，具有已知极端嗜盐菌SOD的37个保守氨基酸残基中的35个。

NASOD和已知极端嗜盐菌SOD在氨基酸上的同源性在70％～83％，表明这个蛋白属于极端嗜盐菌SOD家族的成员。NASOD作为SOD蛋白，与已知嗜盐菌以及其他物种的SOD蛋白应该具有超氧化物歧化酶功能。

实施例2：NASOD融合蛋白提高大肠杆菌耐盐能力的作用

1)构建pGEX-SOD。参照GST Gene Fusion System(Amersham18-1157-58)，具体方法如下：设计含有EcoRI和XhoI酶切位点的一对引物(引物序列如下：SOD-EXPF2：GGAATTCATGACTGATCACGAACTTCC，SOD-EXPR1：CCGCTCGAGTTACTCGAAGTGGTCGAGGCAG)，通过PCR扩增得到NASOD的完整ORF。质粒pGEX-4T-1和前述PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，两者的酶切产物进行连接，构建pGEX-SOD。pGEX-SOD转入大肠杆菌大量扩增，并测序确定插入是否正确。最终该质粒包含NASOD的完整ORF，并整合到GST标签的3’端。

2)将pGEX-SOD转化大肠杆菌DE3，IPTG诱导表达。用SDS-Page检测，在50kDa附近可以清楚看到表达的NASOD融合蛋白。可见低温IPTG诱导(20℃)可以让NASOD融合蛋白可溶性表达(见图4)。

NASOD融合蛋白的纯化。参照Glutathione Sepharose 4B(Amersham XY-058-00-08)，具体方法如下：培养足量的实验菌，低温IPTG诱导表达。离心收集全部菌体，并用1×PBS悬浮。超声法破碎细菌，离心破碎的悬液，收集上清液到干净的管子里。根据Glutathione Sepharose 4B产品说明书，将上清液和GlutathioneSepharose 4B珠子一起培育，洗涤，洗脱，最终得到纯化的NASOD融合蛋白。

3)20℃低温诱导条件下，表达GST的大肠杆菌DE3(对照菌)和表达SOD融合蛋白的大肠杆菌DE3(实验菌)，在3wt％和5wt％NaCl浓度下，比较它们的生长情况。可以发现实验菌的生长速度明显好于对照菌(图1)。

实验结果表明：NASOD以融合蛋白形式，在大肠杆菌内可溶性表达，可提高大肠杆菌耐受高盐环境的能力。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其编码基因与应用

<130>

<160>7

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>603

<212>DNA

<213>Natrinema altunense sp.

<400>1

atgactgatc acgaacttcc accactcccg tacgattacg acgcgctcga accggcactg    60

tccgaacagg tactgacctg gcatcacgat acgcaccacc agggctacgt caacggcctc    120

aacgccgccg aggagaccct cgcggagaac cgcgaggagg gcgacttcgg ctcgacgccc    180

ggtgccctca aaaacgttac tcacaacggc tgtggtcact atctccacac gctgttctgg    240

gagaacatgt cccccaacgg cggcggcgag ccggacggcg acctcgccga ccgcatcgag    300

gaggacttcg gatcctacga gggctggaaa ggcgagttcg aggccgctgc cggtgccgcc    360

ggtggctggg cactgctggt gtacgatccg gttgcgaagc aacttcgcaa cgtcgcggtc    420

gacaagcacg accagggcgc gctctggggc gcacatccag tgctcgcgct ggacgtctgg    480

gagcactcct actactacga ctacggtccg gaccgcggag acttcatcga cgccttcttc    540

gacgtcgtca actgggagaa ggccgaagag gagtaccaga cctgcctcga ccacttcgag    600

taa                                                                  603

<210>2

<211>200

<212>PRT

<213>Natrinema altunense sp.

<400>2

Met Thr Asp His Glu Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Asp Tyr Asp Ala Leu

1        5            10          15

Glu Pro Ala Leu Ser Glu Gln Val Leu Thr Trp His His Asp Thr His

       20           25           30

His Gln Gly Tyr Val Asn Gly Leu Asn Ala Ala Glu Glu Thr Leu Ala

    35           40           45

Glu Asn Arg Glu Glu Gly Asp Phe Gly Ser Thr Pro Gly Ala Leu Lys

  50          55           60

Asn Val Thr His Asn Gly Cys Gly His Tyr Leu His Thr Leu Phe Trp

65           70          75           80

Glu Asn Met Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Asp Gly Asp Leu Ala

Asp Arg Ile Glu Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Glu Gly Trp Lys Gly Glu

      100            105          110

Phe Glu Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Trp Ala Leu Leu Val Tyr

    115           120           125

Asp Pro Val Ala Lys Gln Leu Arg Asn Val Ala Val Asp Lys His Asp

  130           135          140

Gln Gly Ala Leu Trp Gly Ala His Pro Val Leu Ala Leu Asp Val Trp

145          150           155           160

Glu His Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Gly Pro Asp Arg Gly Asp Phe Ile

         165            170          175

Asp Ala Phe Phe Asp Val Val Asn Trp Glu Lys Ala Glu Glu Glu Tyr

      180           185          190

Gln Thr Cys Leu Asp His Phe Glu

     195         200

<210>3

<211>1093

<212>DNA

<213>Natrinema altunense sp.

<400>3

tcgagcacgc ccaccacaag gagttcgagt gagtcgggac gggactgtca cgcccgcttg  60

cgcgacggaa gacgctcgga aggacgttgc tgaaaggttt aatacgcagt ccgtagttcg  120

ttcaccgaag tgtcgggaaa tcacgagaca ggacggccgc gcctttatga ggtgtgatat  180

cgtctcactc ctcaaaactt aacaggcgag ataccgatac ggaacgtgag gtgcatacta  240

tgactgatca cgaacttcca ccactcccgt acgattacga cgcgctcgaa ccggcactgt  300

ccgaacaggt actgacctgg catcacgata cgcaccacca gggctacgtc aacggcctca  360

acgccgccga ggagaccctc gcggagaacc gcgaggaggg cgacttcggc tcgacgcccg  420

gtgccctcaa aaacgttact cacaacggct gtggtcacta tctccacacg ctgttctggg  480

agaacatgtc ccccaacggc ggcggcgagc cggacggcga cctcgccgac cgcatcgagg  540

aggacttcgg atcctacgag ggctggaaag gcgagttcga ggccgctgcc ggtgccgccg  600

gtggctgggc actgctggtg tacgatccgg ttgcgaagca acttcgcaac gtcgcggtcg  660

acaagcacga ccagggcgcg ctctggggcg cacatccagt gctcgcgctg gacgtctggg  720

agcactccta ctactacgac tacggtccgg accgcggaga cttcatcgac gccttcttcg  780

acgtcgtcaa ctgggagaag gccgaagagg agtaccagac ctgcctcgac cacttcgagt  840

aactcgccgg cgaagcgacg agccagttga tcgcgtcttt ttattgccac ggccacggcg  900

actgtcggtt gcacctccga gttacccgta tagtgatcga tataaacact catggctact  960

tcattgagtt cgccaatgct gatatttatg ctcatgtgtc aacttcgctg agcggcgagt  1020

acaaagcctc acgacagagt aggcagaatt aacgctttcc gcgttcgtta ctactgctaa  1080

taatctacta ccg                                                     1093

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>n is a，c，g，or t

<400>4

ctnccvtacg actacgaygc                    20

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

gtagtakgar tgytcccaga cg                 22

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

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<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

ccgctcgagt tactcgaagt ggtcgaggca g       31

Claims (5)

1.极端嗜盐菌(Natrinema altunense sp.)盐耐受相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述极端嗜盐菌盐耐受相关蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

4.SEQ ID No.2所示极端嗜盐菌盐耐受相关蛋白的编码基因在提高大肠杆菌耐盐能力中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将SEQ ID No.1所示基因转入大肠杆菌，使大肠杆菌表达极端嗜盐菌盐耐受相关蛋白，得到具有耐盐能力的重组菌株。

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