CN104946608B

CN104946608B - 一种适冷超氧化物歧化酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104946608B
Application number: CN201510414418.1A
Authority: CN
Inventors: 王全富; 李钰金; 候艳华; 史永磊; 岳晓娜; 刘远平
Original assignee: Rongcheng Tai Xiang Food Limited-Liability Co; Harbin Institute of Technology Weihai
Current assignee: Rongcheng Tai Xiang Food Limited-Liability Co; Harbin Institute of Technology Weihai
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2035-07-15
Also published as: CN104946608A

Abstract

本发明公开了一种适冷超氧化物歧化酶及其编码基因与应用，所述适冷超氧化物歧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，其表达方法是，构建含有适冷超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经降低培养温度诱导方法使适冷超氧化物歧化酶基因表达。本发明的表达产物酶学特殊，其最适温度为30℃，且在低温和高盐环境下催化活性较好，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种适冷超氧化物歧化酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别是涉及一种适冷超氧化物歧化酶及其编码基因与其在适冷超氧化物歧化酶生产中的应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是普遍存在于真核细胞和原核细胞中的抗氧化金属酶，能够特异性清除超氧负离子自由基(O₂ ^.-)，使活性氧的生成和清除处于动态平衡，从而有效地防护生物体受到自由基和活性氧的伤害。根据活性中心所含金属离子的不同，SOD主要包括四大类：分别是Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD和Ni-SOD。

对于SOD的研究，不仅受到生物化学、微生物学、医药学、医学等学科领域的广泛关注，而且对化工、食品、医药等生产行业具有广泛的应用价值。1)SOD的可以作为化妆品的添加剂，具有防晒作用，有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱，有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。2)SOD在食品当中得到了广泛的应用，开发出来的很多富含SOD的食品，营养丰富，有很好的市场经济效益。3)在医药上SOD在治疗关节炎，类风湿关节炎等自身免疫疾病方面有明显疗效。SOD在治疗胶原病、心脏病、辐射病、水肿以及老年白内障等疾病也有疗效。4)富含SOD的保健品，可以通过食用来抗衰老。

从动植物中提取的SOD易受时节、气候和地域的限制，而且卫生安全性不能保证。利用基因工程是降低成本和获得具有天然活性的SOD有效途径。但是天然的SOD稳定性差，一直以来，科学家们通过研究SOD结构的改造，以使其稳定性提高。SOD在溶液中也不稳定，通常采用在SOD制品中添加保护剂或者对酶进行修饰，提高其稳定性。

南极是一个重要的生态区，具有强辐射、高盐度和低温等各种极端条件的特点，南极微生物在适应南极极端环境的进化过程中具备了独特的生物学性状。南极强烈的紫外辐射，常会加剧超氧负离子自由基(O₂ ^.-)的产生，导致南极微生物处于一个活性氧浓度高的环境中，因而抗氧化酶也成为南极生物体内必备的酶类。

因此从南极微生物中寻找优质的SOD外源基因来源，构建基因重组菌，是突破传统制备方法的有效途径之一。目前，国内外尚未见对南极微生物适冷超氧化物歧化酶的有关研究报道。南极微生物Pseudoalteromonas sp.是2001年10月第18次南极科学考察采集的南极海冰(68°30′E，65°00′S)中分离纯化所得，从其微生物体内克隆出PsSOD为Fe-SOD。该基因在大肠杆菌中实现了表达，分离纯化后，该酶的最适温度为30℃，最适pH为8.0；在0℃可以检测到最大酶活性的13.9％，经2M NaCl预处理保持最大活性的62.4％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达方法简单易行，表达产物易纯化，稳定性好，适冷性较好的超氧化物歧化酶及其编码基因。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种适冷超氧化物歧化酶，名称为PsSOD，是具有下述氨基酸残基序列之一蛋白质：1)序列表中的如SEQ ID NO.1所示；2)序列表中的如SEQ ID NO.1由193氨基酸残基组成。

本发明上述适冷超氧化物歧化酶的编码基因(PsSOD)，是具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO.2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO.1蛋白质序列的多核苷酸；3)序列中的SEQ ID NO.2由582个碱基组成，其编码序列为自5’端第一到第582位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增PsSOD中任意片段的引物也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的是提供一种表达上述适冷超氧化物歧化酶的方法。

本发明所提供的上述耐适冷氧化物歧化酶的表达方法，是构建含有适冷超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，培养宿主细胞使适冷超氧化物歧化酶基因表达。

所述宿主可为大肠杆菌、枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coliBL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys等。

用于构建所述表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，优选为可表达His6-hag结构的pET-28a、pET-28b或pET-28c。

以pET-28a为出发载体构建的含有适冷超氧化物歧化酶编码基因的重组表达载体为pET28a(+)/PsSOD。

上述表达载体均可按照常规方法构建。

培养含有本发明的适冷超氧化物歧化酶编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入的IPTG浓度为0.1-0.4mM，优选为0.2mM，诱导温度为32-37℃，诱导时间为3-5小时，培养约2-4小时左右至OD₆₀₀为0.4-0.8，培养物至IPTG终浓度为0.5-0.8mM，降低培养温度至28℃，200rpm继续培养6-8小时。

所述对表达产物适冷超氧化物歧化酶进行优化的方法优选为Ni柱亲和层析法。

本发明从南极微生物中克隆到PsSOD，并使其获得表达，表达方法简单易行，表达产物易纯化，稳定性好，该酶的最适温度为30℃，最适pH为8.0；在0℃可以检测到最大酶活性的13.9％。经2M NaCl预处理保持最大活性的62.4％，验证该酶为/Fe-SOD。本发明的/PsSOD将具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1PsSOD表达SDS-PAGE电泳图。

图2温度对PsSOD活性的影响。

图3NaCl对PsSOD活性的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。

一、超氧化物歧化酶基因的克隆

(一)、细菌总DNA的提取

在本发明中，南极微生物Pseudoalteromonas sp.ANT506挑取斜面上的菌体于2216E液体培养基中，活化的菌液按10％的接种量接入2216E液体培养基中，待培养至对数生长期的中后期(约4d)，将菌体于4℃，7500rpm离心15min收集菌体。同时加入适量0.1MTris-HCl(pH 7.6)反复洗涤菌体沉淀，4℃，12000rpm，10min离心后弃去上清，收集菌体沉淀。结合CTAB法和苯酚-氯仿抽提法提取南极微生物ANT506的总基因组DNA。

(二)、利用PCR技术扩增PsSOD基因

分别以所提取的各菌株的全基因组为模板，利用引物进行PCR扩增。

上游引物：5′-TATGCATTGATGGCATTTGAACTA-3′

下游引物：5′-TTAAGCGAAGTTAGCGTTAGC-3′

扩增条件为：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸90sec，循环30次。然后通过琼脂糖凝胶电泳检测从中寻找含有目的基因的菌株。

将PCR技术扩增的PsSOD基因的胶回收产物与T载体进行连接后转化至感受态细胞E.coli DH5α中，过夜培养。以过夜培养的菌液为PCR模板，进行PCR及双酶切验证，进行测序。测序结果表明其具有序列表中序列2的核苷酸序列，由582个碱基组成，编码序列为自5’端第一到第582位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的蛋白质，预测其分子量是21.4kDa，将该基因命名为PsSOD。

二、超氧化物歧化酶基因的表达与纯化

(一)、重组质粒的构建与转化

根据测定的SOD全长序列重新设计一对引物。

上游引物5′-GCAGGATCCATGGCATTTGAACTA-3′

下游引物5′-TACAAGCTTAGCGAAGTTAGCGTT-3′

将PsSOD基因双酶切胶回收产物及pET-28a(+)载体双酶切回收产物纯化后按比例进行连接，构建重组表达载体。将克隆重组表达载体转化至感受态细胞E.coli DH5α中，并进行重组pET-SOD菌株阳性克隆的筛选及酶切验证。

(二)、超氧化物歧化酶基因的纯化

培养含有本发明的适冷超氧化物歧化酶编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入的IPTG浓度为0.1-0.4mM，优选为0.2mM，诱导温度为32-37℃，诱导时间为3-5小时，培养约2-4h左右至OD₆₀₀为0.4-0.8，培养物至IPTG终浓度为0.5-0.8mM，降低培养温度(28℃)，200rpm继续培养6-8h。离心，收集菌体沉淀，冰浴中研磨和超声波破碎，提取蛋白，用Ni柱亲和层析进行纯化，其纯化倍数达12.6倍，纯化后的PsSOD活性为587.4U/mg，进行SDS-PAGE蛋白分析。如图1所示，泳道1，蛋白质标准分子量；泳道2，空白质粒对照；泳道3，重组pET-SOD；泳道4，纯化的PsSOD。

三、超氧化物歧化酶的鉴定与酶学性质分析

测定了PsSOD对H₂O₂和氯仿-乙醇的敏感性实验，结合生物信息学基因分析，确认该PsSOD为Fe-SOD。

PsSOD最适温度为30℃，检测到在0℃和10℃时相对活性分别是13.9％和25.7％，如图2所示。

40℃对PsSOD的活性影响不大，在40℃保温40min，酶活性仍为82.2％，经50℃保温40min，活性为59.4％，当温度高于60℃时，PsSOD活性迅速下降，60℃分别处理30、40min时，活性分别降至21.3％和15.7％，在70℃水浴20min后，酶彻底失活。

PsSOD在pH 6-10之间，PsSOD保持大部分酶活性，达70％以上，其中，pH 8时酶活最高，将此活性记为相对活性100％，分别在pH7和pH9条件下预处理后，活性检测为93.5％，90.6％，pH低于6或者大于10都能导致酶活的迅速损失。

Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺对PsSOD活性有不同程度的提高，Zn²⁺对酶的活性最高，可达126.7％，Fe³⁺对PsSOD的抑制率最大，抑制率为90.5％，K⁺对PsSOD无影响。

PsSOD经2.5M NaCl作用，PsSOD相对酶活仍可保持在60％以上，表明该蛋白具有一定的盐胁迫耐受能力。如图3所示。

序列表

<110> 荣成泰祥食品股份有限公司；哈尔滨工业大学(威海)

<120> 一种适冷超氧化物歧化酶及其编码基因与应用

<140> 2015104144181

<141> 2015-07-15

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 193

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas sp. ANT506

<400> 1

Met Ala Phe Glu Leu Arg Ser Leu Pro Tyr Ala Ile Asp Ala Leu Ser

1 5 10 15

Pro His Ile Ser Lys Glu Thr Leu Glu Phe His His Gly Lys His His

20 25 30

Asn Thr Tyr Val Val Lys Leu Asn Gly Leu Ile Pro Gly Thr Lys Phe

35 40 45

Glu Asn Lys Ser Leu Glu Glu Ile Val Cys Ser Ser Asp Gly Gly Val

50 55 60

Phe Asn Asn Ala Ala Gln Ile Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Asn Ser

65 70 75 80

Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Ala Val Ala Asp Ala

85 90 95

Ile Asn Ala Lys Trp Gly Ser Phe Asp Ala Phe Lys Glu Ala Leu Asn

100 105 110

Asp Lys Ala Val Asn Asn Phe Gly Ser Ser Trp Thr Trp Leu Val Lys

115 120 125

Leu Ala Asp Gly Ser Leu Asp Ile Val Asn Thr Ser Asn Ala Ala Thr

130 135 140

Pro Leu Thr Asp Asp Gly Val Thr Pro Ile Leu Thr Val Asp Leu Trp

145 150 155 160

Glu His Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Arg Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu

165 170 175

Lys Gly Phe Trp Ser Leu Val Asn Trp Glu Phe Ala Asp Ala Asn Phe

180 185 190

Ala

<210> 2

<211> 582

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. ANT506

<400> 2

atggcatttg aacttaggtc actaccatat gcaattgatg cacttagccc gcatatttca 60

aaagaaactc ttgagtttca tcatggtaaa catcacaaca cttatgttgt taaacttaat 120

ggtttgatcc caggcactaa gtttgaaaac aaatctcttg aagaaatcgt atgttcatca 180

gacggtggcg tgtttaacaa cgctgcacaa atctggaacc atacgttcta ctggaacagt 240

ttatcgccaa atggcggtgg tgcaccgact ggcgcggttg ctgatgcaat caatgctaaa 300

tggggctctt ttgatgcatt taaagaagca ttaaacgaca aagcagttaa taactttggt 360

tctagctgga cttggttagt taaactagct gatggttcac tagacatagt taacacttct 420

aacgctgcta caccattaac tgatgatggc gttactccaa tcctaactgt ggatttatgg 480

gaacacgctt actacttcga ttaccgtaac gttcgtccag attaccttaa aggtttttgg 540

tcgctagtta actgggaatt cgcagacgct aacttcgctt aa 582

Claims

1.一种适冷超氧化物歧化酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的适冷超氧化物歧化酶的编码基因PsSOD，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为编码序列表中SEQ ID NO.1蛋白质序列的多核苷酸。

3.一种权利要求1所述的适冷超氧化物歧化酶的编码基因PsSOD，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种权利要求1所述的适冷超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：其是构建含有适冷超氧化物歧化酶基因的重组表达载体，将构建的重组表达载体导入宿主细胞，降低培养温度培养诱导宿主细胞使适冷超氧化物歧化酶基因表达。

5.根据权利要求4所述的适冷超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：构建所述含有适冷超氧化物歧化酶的重组表达载体的出发载体为pET-28a、pET-28b或pET-28c。

6.根据权利要求5所述的适冷超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为pET-28a。

7.根据权利要求4所述的适冷超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或E.coli BL21(DE3)plys。

8.根据权利要求7所述的适冷超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：培养所述重组大肠杆菌宿主时加入诱导剂IPTG，所加入的IPTG浓度为0.1-0.4mM，诱导温度为32-37℃，诱导时间为3-5小时，培养2-4小时至OD600为0.4-0.8，培养物至IPTG终浓度为0.5-0.8mM，降低培养温度至28℃，200rpm继续培养6-8小时。

9.根据权利要求5-8任一所述的适冷超氧化物歧化酶的表达方法，其特征在于：对表达产物适冷超氧化物歧化酶进行纯化的方法为Ni柱亲和层析法。