CN111826359B

CN111826359B - 一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111826359B
Application number: CN201910323712.XA
Authority: CN
Inventors: 王全富; 王一帆; 潘抗; 李镕岐; 侯艳华; 王亚彤; 张艳
Original assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Current assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CN111826359A

Abstract

本发明公开了一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用。本发明首先从南极海冰微生物嗜冷杆菌（Psychrobactersp.）中克隆得到了过氧化物还原酶基因PsNTR，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。其表达方式是利用冷激质粒pColdI构建含有硝基还原酶基因PsNTR的重组表达载体，并将构建的重组表达载体转入大肠杆菌宿主细胞（Escherichia coli），经诱导使硝基还原酶PsNTR基因表达。本发明的表达产物PsNTR具有突出的耐盐性，具有良好的多种芳香硝基化合物降解能力，具有广阔的应用前景。此外，本研究中构建的重组基因工程菌株在低温条件下表现出良好的硝基苯降解能力，可应用于低温环境下芳香硝基化合物的降解及食品医药等相关领域。

Description

一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于酶工程及环境、医药等相关领域，具体涉及一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用。

背景技术

随着工农业的迅速发展，芳香硝基化合物被广泛应用于染料、杀虫剂、炸药、农药、医药及其他化工产品的生产。然由于芳香硝基化合物在环境中具有一定的稳定性及持久性，且易使人体产生免疫毒性、血液毒性，并具有致癌致畸的潜在危险，其高效降解引起了人们的广泛关注。其中，对硝基基团的还原是实现芳香硝基污染物降解的关键步骤。硝基还原酶降解法作为一种新型的高效的芳香硝基化合物降解方法，能够更有效地将硝基基团还原为相应氨基衍生物。此外，硝基还原酶因其解毒潜力以及在生物修复、生物催化、生物医学等领域的生物技术应用，特别是在化疗肿瘤治疗的前药活化、肿瘤细胞和体内荧光探针等诸多方面的应用，越来越受到人们的关注。

从动植物中提取的硝基还原酶易受时节、气候和地域的限制，且稳定性较差，难以直接应用于工业生产等相关领域。利用重组基因工程菌诱导表达是降低成本和获得具有天然活性的硝基还原酶的有效途径。

南极是能够在低温下高效催化底物反应的适冷酶的主要来源，且南极海冰环境中含有多种芳香硝基化合物。鉴于上述论述，从南极微生物Psychrobactor sp.体内克隆得到适冷耐盐硝基还原酶，且该基因在大肠杆菌中实现了表达，重组硝基还原酶PsNTR及其重组表达菌株具有降解包括硝基苯在内的多种芳香硝基化合物的能力，可应用于环境中相关污染物降解及食品医药等相关领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达法方法简单易行，表达产物易纯化且具有低温高盐催化特性的硝基还原酶PsNTR及其编码基因和应用。

本发明的第一个目的在于提供一种适冷耐盐的硝基还原酶PsNTR的基因序列和由此推断的氨基酸序列。本发明的适冷耐盐硝基还原酶PsNTR其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该适冷耐盐硝基还原酶PsNTR全长813 bp，编码270个氨基酸。

含有上述适冷耐盐硝基还原酶PsNTR的重组表达载体。

所述的表达载体优选为冷激载体pColdI。

一种含有上述重组表达载体的基因工程菌。

所述的工程菌优选为E. coli BL21 (DE3)。

培养含有本发明的适冷耐盐硝基还原酶PsNTR基因的宿主细胞的培养基和培养条件均可为培养出宿主细胞的培养基和培养条件。其中，培养所述组宿主大肠杆菌细胞时，在35-40 ℃下培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，培养基中加入IPTG至终浓度为0.5-1.5 mM，12-20 ℃下诱导发酵20-28 h，即可高效诱导表达适冷耐盐硝基还原酶PsNTR。

所述对表达产物重组适冷耐盐硝基还原酶PsNTR进行优化的方法优选为Ni柱亲和层析法。

本发明的第二个目的在于提供上述PsNTR重组蛋白能够高效降解包括硝基苯在内的多种芳香硝基化合物，可应用于环境中相关污染物降解及食品医药等相关领域。

本发明的另一目的在于提供重组基因工程菌株低温环境下硝基苯的降解的应用。

所以，本发明主要涉及一种适冷耐盐硝基还原酶PsNTR的基因序列及其重组基因工程菌朱，更具体的设计该适冷耐盐硝基还原酶PsNTR的氨基酸序列、重组表达载体构建、重组蛋白制备及纯化，本发明还涉及该适冷耐盐硝基还原酶重组蛋白对包括硝基苯在内的多种芳香硝基化合物的高效降解，及低温环境下重组基因工程菌株对硝基苯的降解，可应用于环境中相关污染物降解及食品医药等相关领域。

附图说明

图1是嗜冷杆菌中硝基还原酶PsNTR的表达和纯化电泳图。

图2是重组硝基还原酶PsNTR对芳香硝基化合物的降解能力比较。

图3是不同温度下重组表达菌株对硝基苯降解能力图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中未具体注明的试验方法均可按照常规方法进行，或者按照所用产品生产厂商的使用说明。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：硝基还原酶基因的克隆及测序分析。

南极微生物Psychrobactorsp. ANT206于2216E液体培养基中活化，培养至对数生长期的中后期（约4 d），利用Takara全基因组提取试剂盒提取菌株的总基因DNA。以提取的总DNA为模板，设计引物进行PCR。

上游引物：5’-ATAGGATCCATGCAATCGATAATGC-3’

下游引物：5’-CCGAAGCTTGTACGTAATGTACAAA-3’

划线处分别为BamHI，HindIII酶切位点。

扩增条件为：94 ℃变性1 min，59.1 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循环30次。然后通过琼脂糖凝胶电泳检测含有目的基因PsNTR的条带并进行测序。分析测序结果，得到一个全长为813 bp完整阅读框序列的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码一个由270个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：硝基还原酶基因的表达与纯化。

将扩增得到的PsNTR基因与冷激质粒pColdI双酶切后胶回收产物按比例利用T4连接酶连接，构建重组表达载体pColdI-NTR。将重组表达载体转化至感受态细胞E. coliBL21 (DE3)中，进行阳性克隆筛选及酶切验证。

将筛选得到的重组菌株（E. coli pColdI-NTR），利用IPTG诱导表达。将重组菌株接种至LB培养基中，在35-40 ℃下培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，培养基中加入IPTG至终浓度为0.5-1.5 mM，12-20 ℃下诱导发酵20-28 h。离心，收集菌体沉淀，冰浴中研磨和超声波破碎，提取粗蛋白。用Ni柱亲和层析对重组硝基还原酶PsNTR进行纯化，进行SDS-PAGE电泳分析，最终得到单一目的条带，其分子量约为31.4 kDa。结果如图1所示，M，标准分子量蛋白marker；1，空白质粒对照；2，重组pColdI-NTR；3，纯化后PsNTR。Ni柱亲和层析具体实施方案如下：提取粗蛋白上Ni柱后，使用5-20 mM咪唑洗脱8-10个柱体积，40-60 mM咪唑洗脱8-10个柱体积，最后用100-500 mM咪唑洗脱8-10个柱体积，收集峰值处洗脱液，得到纯化后适冷耐盐硝基还原酶。

实施例3：适冷耐盐硝基还原酶对芳香硝基化合物的降解能力比较。

硝基还原酶在催化硝基苯及其他芳香硝基化合物还原时，需要以NAD(P)H为辅酶，而NAD(P)H在340nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定不同浓度底物单位时间内340nm处的光吸收值的减少量，利用米氏方程，可测得硝基还原酶对不同底物的动力学参数。反应体系包括0.01 mM NADPH，20 mM PB （pH 7.0），100 μL硝基还原酶及不同浓度芳香硝基化合物，酶促反应体系总体积为1 mL，25 ℃下反应3 min。1个单位的酶活力定义为每分钟还原1 μmol硝基所需的酶量。适冷耐盐硝基还原酶对芳香硝基化合物的降解能力比较结果如图2所示。结果表明，该适冷耐盐硝基还原酶能够与多种芳香硝基化合物反应，且硝基苯、对硝基酚为最适底物。该结果表明适冷耐盐硝基还原酶PsNTR能够应用于多种芳香硝基化合物的生物降解，能够广泛应用于包括工业废水处理等在内的诸多领域。

实施例4：不同温度下重组基因工程菌株对硝基苯降解能力。

将一定量IPTG诱导后的重组基因工程菌株（E. coli pColdI-NTR）转移至基础盐培养基至一定浊度，向培养基中添加5.0 mM 硝基苯，在不同温度下培养一定时间。利用分光光度法测定培养基中硝基苯含量变化，不同温度下菌株硝基苯降解能力如图3所示。结果表明，在低温环境（8-12 ℃）下，E. coli pColdI-NTR对硝基苯具有良好的降解能力，其最大降解速率约为3.03 mM/h。证明该重组基因工程菌株在低温环境下能够高效降解硝基苯，能够广泛应用于环境中相关污染物降解及食品医药等相关领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨工业大学（威海）

<120> 一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用

<130> 11

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Psychrobacter sp . ANT206

<400> 1

atgcaatcga taatgcctga agctgattac tcaggcctca gcatggaccc tactatgaat 60

gctaatactg gcaatgcaga cagtcttgcg acgcctagtg ccaccccgca gctggcagcg 120

ttttgtgacg tggtatcgtc acgccgttca gtacgccgat ttacagatgc gccgatacct 180

gccgatgtgt tagcagactg tctggatttg gcgatgcttg caccaaactc aagcaatctt 240

cagccatggg cgttttatgt gattgatgat gctgacaagc gcaagctcgc ggtcgcaaac 300

tgcatgggtc aaaacgcagc aggaacctca gcggccttaa tcgctgtcgt tgctcgtact 360

gacgtttggc atgaccacgc caaaaaaatc ctatctgaat accctgatat gccggtgcca 420

aaagcagtca aagactacta cggcaaagtc gttgccttag attttttgcg tggacctgct 480

aacgtagtat cagtagctaa ggggagcgcc attcaagtag ttggacgaat aaaaggtcct 540

attaagtcgc ctatctatac cgctggagat accaaaaact gggcaaccaa taacaccgcc 600

ttagcggctg gaaacctgat gcttgcactg cgtgcgcatg gctttgatag ctgtccgatg 660

ggcggtttcg atgagcctgc gatgaagcgc ttattaaagc tgagtaattc tggttctatc 720

gttatgatga ttggtgctgg cgagcgtgct gataatggtg tctacaatac ccagctccgc 780

tttgcgcaag atcaatttgt acattacgta taa 813

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Psychrobacter sp . ANT206

<400> 2

Met Gln Ser Ile Met Pro Glu Ala Asp Tyr Ser Gly Leu Ser Met Asp

1 5 10 15

Pro Thr Met Asn Ala Asn Thr Gly Asn Ala Asp Ser Leu Ala Thr Pro

20 25 30

Ser Ala Thr Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Asp Val Val Ser Ser Arg

35 40 45

Arg Ser Val Arg Arg Phe Thr Asp Ala Pro Ile Pro Ala Asp Val Leu

50 55 60

Ala Asp Cys Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Pro Asn Ser Ser Asn Leu

65 70 75 80

Gln Pro Trp Ala Phe Tyr Val Ile Asp Asp Ala Asp Lys Arg Lys Leu

85 90 95

Ala Val Ala Asn Cys Met Gly Gln Asn Ala Ala Gly Thr Ser Ala Ala

100 105 110

Leu Ile Ala Val Val Ala Arg Thr Asp Val Trp His Asp His Ala Lys

115 120 125

Lys Ile Leu Ser Glu Tyr Pro Asp Met Pro Val Pro Lys Ala Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Tyr Gly Lys Val Val Ala Leu Asp Phe Leu Arg Gly Pro Ala

145 150 155 160

Asn Val Val Ser Val Ala Lys Gly Ser Ala Ile Gln Val Val Gly Arg

165 170 175

Ile Lys Gly Pro Ile Lys Ser Pro Ile Tyr Thr Ala Gly Asp Thr Lys

180 185 190

Asn Trp Ala Thr Asn Asn Thr Ala Leu Ala Ala Gly Asn Leu Met Leu

195 200 205

Ala Leu Arg Ala His Gly Phe Asp Ser Cys Pro Met Gly Gly Phe Asp

210 215 220

Glu Pro Ala Met Lys Arg Leu Leu Lys Leu Ser Asn Ser Gly Ser Ile

225 230 235 240

Val Met Met Ile Gly Ala Gly Glu Arg Ala Asp Asn Gly Val Tyr Asn

245 250 255

Thr Gln Leu Arg Phe Ala Gln Asp Gln Phe Val His Tyr Val

260 265 270

Claims

1.一种适冷耐盐硝基还原酶PsNTR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的适冷耐盐硝基还原酶PsNTR的基因。

3.根据权利要求2所述的编码适冷耐盐硝基还原酶PsNTR的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种含有权利要求2或3所述的基因的重组表达载体。

5.一种含有权利要求4所述的重组表达载体的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的工程菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

7.一种诱导表达权利要求1所述的硝基还原酶PsNTR的方法，其特征在于，包括以下步骤：将转入编码权利要求1所述硝基还原酶PsNTR的基因的重组菌，在35-40℃下培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.5-1.5mM，12-20℃下诱导发酵20-28h，即可高效诱导表达硝基还原酶PsNTR。

8.权利要求1所述的适冷耐盐硝基还原酶PsNTR在降解芳香硝基化合物中的应用，所述芳香硝基化合物为硝基苯或对硝基苯酚。

9.权利要求5所述的基因工程菌在降解芳香硝基化合物中的应用，所述芳香硝基化合物为硝基苯或对硝基苯酚。