CN113373169A - 一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及方法 - Google Patents

一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及方法 Download PDF

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prkacaa
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蒋瑶
李舒盈
桂文君
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开了基因工程领域的一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及方法，包括所述蛋白基因prkacaa的克隆、重组表达载体pET‑28a‑prkacaa和基因工程菌的构建，基因工程菌诱导表达及目标蛋白表达形式分析，再通过镍离子亲和层析柱纯化获得目标蛋白。本发明提供的操作方法简便，成本低，重复性好，制备的目标蛋白可溶，纯度高，可应用于斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的功能研究，也为制备该蛋白的多克隆抗体奠定了基础。

Description

一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及 方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种制备斑马鱼蛋白激酶A α催化亚基蛋白的基因工程菌以及制备斑马鱼蛋白激酶A α催化亚基蛋白的方法。
背景技术
蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，又称cAMP依赖的蛋白激酶A(cyclic-AMPdependent protein kinase A)是生物体内广泛存在的一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调控众多关键细胞活动，包括细胞代谢、基因表达和细胞增殖等。
不同生物中蛋白激酶A的催化亚基(catalytic subunit，PKAc)和调节亚基(regulatory subunit，PKAr)存在不同的亚型，人(Homo sapiens)的未活化的PKA是一种异四聚体全酶，由一个调节亚基二聚体与两个失活状态的催化亚基结合而成，催化亚基具有α，β，γ三种亚型，调节亚基具有Iα，Iβ，IIα，IIβ四种亚型，其中PKAα催化亚基在体内普遍存在，是最常见的一种催化亚基。
发明内容
本发明的目的通过对斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因的克隆、表达载体的构建、基因工程菌诱导表达目标蛋白以及目标蛋白的纯化，从而获得斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白。
一种含有斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白全长编码基因prkacaa的重组表达载体pET-28a-prkacaa，所述prkacaa序列为SEQ ID N0.1。
一种包含重组表达载体pET-28a-prkacaa的基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa。
一种由基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa诱导表达的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
一种由基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa诱导表达的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白作为抗原免疫动物研究的应用或作为潜在靶点进行环境毒理学效应分子机制研究。
一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因prkacaa的克隆，上游引物F(BamH I)为SEQ ID N0.3，下游引物R(Sal1)为SEQ ID NO.4；(2)重组表达载体pET-28a-prkacaa以及基因工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa的构建，将所述prkacaa基因与表达载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a-prkacaa，转染BL21(DE3)感受态细胞，构建基因工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa；(3)基因工程菌的诱导表达，将所述的基因工程菌株诱导培养；(4)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的纯化，将诱导培养收集的菌体破碎，取上清液纯化。
优选的，所述的基因工程菌株用诱导剂IPTG诱导培养，诱导斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白表达的条件为37℃，180rpm条件下培养约2.5-3h至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5 mM的IPTG在25℃，180rpm下诱导6h。
优选的，所述菌体破碎取上清液的条件为以360w的功率冰浴超声破碎菌体，超3s，间隔3s，共超声20min，离心后沉淀重悬于PBS Buffer中，再次离心的上清液。
优选的，将上清液过柱纯化，过0.45μm滤膜的上清液负载到Ni2+亲和层析柱中室温摇床振荡1h以上，先用Equilibrium Buffer和Wash Buffer冲洗柱子，再用ElutionBuffer洗脱，收集洗脱液即得到斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，所述的EquilibriumBuffer组成为：50 mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，pH 7.4；所述的Wash Buffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，20-40mmol/L咪唑，pH 7.4；所述的ElutionBuffer组成为： 50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，50-200mmol/L咪唑，pH 7.4。
蛋白激酶A作为生物体内最重要的激酶之一，或许是一些环境内分泌干扰物质造成内分泌紊乱的具体作用靶点，在环境毒理学研究中发挥着越来越重要的作用。蛋白激酶Aα催化亚基是蛋白激酶A分布最普遍的一种催化亚基，同时斑马鱼又是研究最为广泛的模式生物之一，在探究环境内分泌干扰物质对斑马鱼蛋白激酶A的影响或者探明两者的结合位点的实验中，本发明制备得到的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白提供了直接的实验材料，有助于后续进一步的构象与功能研究，因而PKAα催化亚基蛋白的体外原核制备可以为药理和毒理学研究提供一种基础研究手段。
本发明提供的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，操作简便，成本低，重复性好，获得的目标蛋白可应用于斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白功能研究，或者作为抗原免疫动物，开展该蛋白相关的免疫学研究。
附图说明
图1是prkacaa基因扩增PCR检测图，M为DNA Marker，1为prkacaa基因扩增产物。
图2是菌液PCR检测图，其中M为DNA Marker，1为工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa菌液PCR产物。
图3是重组斑马鱼PKAcα蛋白诱导表达电泳图，其中M为蛋白Marker，kDa：蛋白分子质量，1：未诱导菌液，2：0.5mM IPTG诱导后重细菌裂解液，3：0.5mM IPTG诱导后上清，4：0.5mM IPTG诱导后沉淀。
图4是重组斑马鱼PKAcα蛋白纯化电泳图，其中M：蛋白Marker，1：纯化前重组斑马鱼PKAcα蛋白，2：纯化后重组斑马鱼PKAcα蛋白。
图5是重组斑马鱼PKAcα蛋白纯化WB检测结果图，其中M1，M2：两种不同的WBMarker，1：纯化后重组斑马鱼PKAcα蛋白。
图6是测定蛋白浓度时的BCA标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制被发明的范围。实施例中未注明的实验方法，均可按照常规方法进行，如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor中所述操作条件，或按照厂商的使用说明。
实施例1斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因prkacaa的克隆
使用Trizol试剂从斑马鱼成鱼中提取总RNA，利用PCR技术，首先反转录得到prkacaa 全长序列cDNA。根据斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因全长编码序列，设计能扩增出完整编码阅读框的引物，以反转录得到的cDNA为模板扩增得到长度为1059bp的目的基因 prkacaa，其序列为：atgggcaacg cgcccaccgc caagaacaag ggcaatgaga tggagagcgttaaggagttt ctcgctaaag ccaaagaaga tttcctaaag aaatgggaga acccagcaca gaacactgcgtctctggacc attttgagcg gttgaagacg ctgggcaccg gctcctttgg acgagtcatg ctagtcaagcacaaagaatc aggccagcat tttgccatga agatcctcga caaacagaag gtggtgaagc tgaaacagatagaacacaca ctgaatgaga aacgcatcct gcaggctgtc agcttcccct ttcttgtgcg attggagcattctttcaagg ataatactaa cctgtatatg gtaatggagt atgttcctgg aggagagatg ttttctcacttacgtagaat cggaagattt agtgagcctc atgcccgatt ttacgccgcc caaatagttc tgacctttgaataccttcac tcactcgatc tcatctaccg agatctgaag cctgaaaacc tgctcataga ccagcagggctacatacagg tgacagattt tggatttgct aaacgtgtaa agggcaggac ctggacactg tgtggcacacctgagtacct ggcaccagaa atcatcctca gtaaaggcta taataaagct gtggactggt gggctctgggagtgctgatc tacgagatgg ctgctggtta cccgccattc tttgctgacc agcctatcca gatctacgagaaaattgtct ccgggaaggt ccgctttcct tcactttta gctctgacct taaggatctg ctgaggaacctgctgcaggt cgatctgacg aaacgcttcg ggaacctgaa gaacggcgtc aacgacatca agggccacaaatggtttgca accaccgact ggattgcaat ctaccagaag aaggtggaag ccccgttcat ccctaagtgcaaaggccccg gggacaccag caacttcgac gactacgacg aggaagaaat ccgggtctct atcacggagaaatgtggaaa ggagtttgct gaattctag(SEQ ID N0.1)。
结合后续表达载体的构建，在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点，最终设计的引物序列如下：上游引物F(BamH I)：GGTCGCGGATCCATGGGCAACG(SEQ ID N0.3)，划线部分为BamH I酶切位点。下游引物R(Sal1)：CCGCAAGCTTGTCGACGAATTCAGCAAA(SEQ IDN0.4)，划线部分为Sal I酶切位点。
PCR反应体系：上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.5μL，Taq酶(2×Rapid TaqMaster Mix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)5μL，ddH2O 3.7μL。
PCR反应程序：95℃预变性，3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸25s，循环35次；72℃延伸5min。
PCR产物鉴定：经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，图1的1泳道在略高于1000bp处有一清晰的亮带，与预期大小吻合，即为prkacaa目的基因。
实施例2重组表达载体pET-28a-prkacaa以及基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa 的构建
上述PCR产物经纯化试剂盒纯化后，将表达载体pET-28a(+)与纯化PCR产物同时进行BamH I和Sal I双酶切，37℃水浴条件下反应15min，然后用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒。表达载体pET-28a(+)上含有T7启动子和由6个组氨基酸组成的标签序列。连接体系为pET-28a(+)质粒100ng，prkacaa目的片段20ng，5×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4Ligase 1μL，ddH2O up to 10μL。
将重组质粒转化到表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，转化条件为：连接产物1μL加入50μL BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL 无菌LB液体培养基(不含抗生素)，轻轻混匀后置于37℃，200rpm振荡培养1h，然后涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。
挑取单菌落进行PCR验证，经1％琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆菌进行测序，将测序结果中开放阅读框顺序正确的质粒命名为pET-28a-prkacaa，对应的基因工程菌为BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa。PCR结果见于图2，图2中1泳道在略高于1000bp处有一特异性条带。
实施例3重组基因工程菌的诱导表达与目标蛋白的鉴定
挑取序列正确的重组基因工程菌株BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa阳性单克隆接种到20 ml含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃，180rpm条件下培养过夜。
按1:100的比例接种至200ml新鲜LB液体培养基(含50μg/mL Kan)中，在37℃，180rpm条件下培养2.5-3h至菌液OD600达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)，25℃，180rpm诱导6h。设置未进行诱导的重组基因工程菌株BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa进行对照。
菌液于4℃，8000rpm离心25min，弃上清，加等体积的PBS溶液重悬菌体沉淀，8000rpm离心25min，弃上清。加5ml细胞裂解液重悬，利用超声波破碎仪冰浴超声处理菌体悬液，在360w的功率下，每次超3秒，间隔3秒，共超声20min，直至溶液澄清透亮。
菌体裂解物在4℃，11500rpm离心10min后，分别收集上清和沉淀，沉淀用于上清等体积的PBS Buffer重悬，进行12％SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色鉴定。结果如图3所示，在约44kDa处出现特异性蛋白条带，与预期的重组斑马鱼PKAcα蛋白分子量相符，且诱导表达的重组斑马鱼PKAcα蛋白为可溶性表达(图3中3泳道)。斑马鱼PKAcα蛋白序列： MetGlyAsnAlaProThrAlaLysAsnLysGlyAsnGluMetGluSerValLysGluPheLeuAlaLysAlaLysGluA spPheLeuLysLysTrpGluAsnProAlaGlnAsnThrAlaSerLeuAspHisPheGluArgLeuLysThrLeuGlyThrGlySerPheGlyArgValMetLeuValLysHisLysGluSerGlyGlnHisPheAlaMetLysIleLeuAspLysGlnLy sValValLysLeuLysGlnIleGluHisThrLeuAsnGluLysArgIleLeuGlnAlaValSerPheProPheLeuValArg LeuGluHisSerPheLysAspAsnThrAsnLeuTyrMetValMetGluTyrValProGlyGlyGluMetPheSerHisLe uArgArgIleGlyArgPheSerGluProHisAlaArgPheTyrAlaAlaGlnIleValLeuThrPheGluTyrLeuHisSer LeuAspLeuIleTyrArgAspLeuLysProGluAsnLeuLeuIleAspGlnGlnGlyTyrIleGlnValThrAspPheGly PheAlaLysArgValLysGlyArgThrTrpThrLeuCysGlyThrProGluTyrLeuAlaProGluIleIleLeuSerLysG lyTyrAsnLysAlaValAspTrpTrpAlaLeuGlyValLeuIleTyrGluMetAlaAlaGlyTyrProProPhePheAlaAs pGlnProIleGlnIleTyrGluLysIleValSerGlyLysValArgPheProSerHisPheSerSerAspLeuLysAspLeuLe uArgAsnLeuLeuGlnValAspLeuThrLysArgPheGlyAsnLeuLysAsnGlyValAsnAspIleLysGlyHisLys TrpPheAlaThrThrAspTrpIleAlaIleTyrGlnLysLysValGluAlaProPheIleProLysCysLysGlyProGlyAs pThrSerAsnPheAspAspTyrAspGluGluGluIleArgValSerIleThrGluLysCysGlyLysGluPheAlaGluPh e(SEQID N0.2)。
实施例4重组斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白纯化
收集实施例3中蛋白上清液将5ml上清液通过0.45μm的滤膜后装载入Ni2+亲和层析柱中，置于室温摇床振荡1h以上；用十倍柱体积(10ml)的Equilibrium Buffer(50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，pH 7.4)和十倍柱体积(10ml)的Wash Buffer(50mmol/L 磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，40mmol/L咪唑，pH 7.4)洗涤柱子；最后用5ml ElutionBuffer(50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，50mmol/L咪唑，pH 7.4)洗脱重组蛋白。
以上所有浸出步骤均以1-2ml/min的流速进行，保留加入过膜上清样品后的所有流出液，通过SDS-PAGE和Western-blot检测内含蛋白情况。结果如图4和图5所示，在约44kDa 处有一特异性蛋白条带，与预期的重组斑马鱼PKAcα蛋白相符。将纯化蛋白置于-80℃超低温保存。
实施例5重组斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白浓度测定
用BCA蛋白测定法对实施例4纯化后蛋白液进行浓度测定，取适量100mg/ml蛋白标准液，用PBS稀释至终浓度为500μg/ml，稀释后的500μg/ml蛋白标准液可以-20℃长期保存；根据样品数量，按试剂A：试剂B＝50:1的比例配制BCA工作液，BCA工作液室温 24小时内稳定；将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl的体积依次加到96孔板的标准品孔中，加稀释液补足到20μl；加入20μl待测蛋白样本到96孔板的样品孔中；各孔加入200μl配置好的BCA工作液，37℃放置30min；测定562nm波长处的吸光值，根据标准曲线与稀释倍数计算出样品的蛋白浓度。
图6是测定蛋白浓度时的BCA标准曲线，线性方程为Y＝0.0006701*X+0.01997，相关系数R2＝0.9945，经过纯化后，zPKAcα蛋白BCA定量测得OD562为0.7318，对应浓度为1065.587μg/mL。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种制备斑马鱼蛋白激酶A α催化亚基蛋白的基因工程菌及方法
<141> 2021-05-19
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> Danio rerio
<400> 1
atgggcaacg cgcccaccgc caagaacaag ggcaatgaga tggagagcgt taaggagttt 60
ctcgctaaag ccaaagaaga tttcctaaag aaatgggaga acccagcaca gaacactgcg 120
tctctggacc attttgagcg gttgaagacg ctgggcaccg gctcctttgg acgagtcatg 180
ctagtcaagc acaaagaatc aggccagcat tttgccatga agatcctcga caaacagaag 240
gtggtgaagc tgaaacagat agaacacaca ctgaatgaga aacgcatcct gcaggctgtc 300
agcttcccct ttcttgtgcg attggagcat tctttcaagg ataatactaa cctgtatatg 360
gtaatggagt atgttcctgg aggagagatg ttttctcact tacgtagaat cggaagattt 420
agtgagcctc atgcccgatt ttacgccgcc caaatagttc tgacctttga ataccttcac 480
tcactcgatc tcatctaccg agatctgaag cctgaaaacc tgctcataga ccagcagggc 540
tacatacagg tgacagattt tggatttgct aaacgtgtaa agggcaggac ctggacactg 600
tgtggcacac ctgagtacct ggcaccagaa atcatcctca gtaaaggcta taataaagct 660
gtggactggt gggctctggg agtgctgatc tacgagatgg ctgctggtta cccgccattc 720
tttgctgacc agcctatcca gatctacgag aaaattgtct ccgggaaggt ccgctttcct 780
tcacatttta gctctgacct taaggatctg ctgaggaacc tgctgcaggt cgatctgacg 840
aaacgcttcg ggaacctgaa gaacggcgtc aacgacatca agggccacaa atggtttgca 900
accaccgact ggattgcaat ctaccagaag aaggtggaag ccccgttcat ccctaagtgc 960
aaaggccccg gggacaccag caacttcgac gactacgacg aggaagaaat ccgggtctct 1020
atcacggaga aatgtggaaa ggagtttgct gaattctag 1059
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> Danio rerio
<400> 2
Met Gly Asn Ala Pro Thr Ala Lys Asn Lys Gly Asn Glu Met Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Glu Phe Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asp Phe Leu Lys Lys Trp
20 25 30
Glu Asn Pro Ala Gln Asn Thr Ala Ser Leu Asp His Phe Glu Arg Leu
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Thr Gly Ser Phe Gly Arg Val Met Leu Val Lys His
50 55 60
Lys Glu Ser Gly Gln His Phe Ala Met Lys Ile Leu Asp Lys Gln Lys
65 70 75 80
Val Val Lys Leu Lys Gln Ile Glu His Thr Leu Asn Glu Lys Arg Ile
85 90 95
Leu Gln Ala Val Ser Phe Pro Phe Leu Val Arg Leu Glu His Ser Phe
100 105 110
Lys Asp Asn Thr Asn Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Val Pro Gly Gly
115 120 125
Glu Met Phe Ser His Leu Arg Arg Ile Gly Arg Phe Ser Glu Pro His
130 135 140
Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Gln Ile Val Leu Thr Phe Glu Tyr Leu His
145 150 155 160
Ser Leu Asp Leu Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Ile
165 170 175
Asp Gln Gln Gly Tyr Ile Gln Val Thr Asp Phe Gly Phe Ala Lys Arg
180 185 190
Val Lys Gly Arg Thr Trp Thr Leu Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala
195 200 205
Pro Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Tyr Asn Lys Ala Val Asp Trp Trp
210 215 220
Ala Leu Gly Val Leu Ile Tyr Glu Met Ala Ala Gly Tyr Pro Pro Phe
225 230 235 240
Phe Ala Asp Gln Pro Ile Gln Ile Tyr Glu Lys Ile Val Ser Gly Lys
245 250 255
Val Arg Phe Pro Ser His Phe Ser Ser Asp Leu Lys Asp Leu Leu Arg
260 265 270
Asn Leu Leu Gln Val Asp Leu Thr Lys Arg Phe Gly Asn Leu Lys Asn
275 280 285
Gly Val Asn Asp Ile Lys Gly His Lys Trp Phe Ala Thr Thr Asp Trp
290 295 300
Ile Ala Ile Tyr Gln Lys Lys Val Glu Ala Pro Phe Ile Pro Lys Cys
305 310 315 320
Lys Gly Pro Gly Asp Thr Ser Asn Phe Asp Asp Tyr Asp Glu Glu Glu
325 330 335
Ile Arg Val Ser Ile Thr Glu Lys Cys Gly Lys Glu Phe Ala Glu Phe
340 345 350
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcgcggat ccatgggcaa cg 22
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcaagctt gtcgacgaat tcagcaaa 28

Claims (8)

1.一种含有斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白全长编码基因prkacaa的重组表达载体pET-28a-prkacaa，所述prkacaa序列为SEQ ID N0.1。
2.一种包含权利要求1所述的重组表达载体pET-28a-prkacaa的基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa。
3.一种由权利要求2所述的基因工程菌诱导表达的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
4.一种如权利要求3所述的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，作为抗原免疫动物研究的应用或作为潜在靶点进行环境毒理学效应分子机制研究。
5.一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因prkacaa的克隆，上游引物F(BamH I)为SEQ ID N0.3，下游引物R(Sal1)为SEQ ID NO.4；(2)重组表达载体pET-28a-prkacaa以及基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa的构建，将所述prkacaa基因与表达载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a-prkacaa，转染BL21(DE3)感受态细胞，构建基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa；(3)基因工程菌的诱导表达，将所述的基因工程菌株诱导培养；(4)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的纯化，将诱导培养收集的菌体破碎，取上清液纯化。
6.如权利要求5所述的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于所述的基因工程菌株用诱导剂IPTG诱导培养，诱导斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白表达的条件为37℃，180rpm条件下培养约2.5-3h至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG在25℃，180rpm下诱导6h。
7.如权利要求5所述的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于所述菌体破碎取上清液的条件为以360w的功率冰浴超声破碎菌体，超3s，间隔3s，共超声20min，离心后沉淀重悬于PBS Buffer中，再次离心的上清液。
8.如权利要求5所述的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于将上清液过柱纯化，过0.45μm滤膜的上清液负载到Ni2+亲和层析柱中室温摇床振荡1h以上，先用Equilibrium Buffer和WashBuffer冲洗柱子，再用Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即得到斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，所述的EquilibriumBuffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，pH 7.4；所述的Wash Buffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，20-40mmol/L咪唑，pH 7.4；所述的Elution Buffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，50-200mmol/L咪唑，pH 7.4。
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