CN113604450B

CN113604450B - 一种kod dna聚合酶突变体及其制备方法与应用

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Publication number: CN113604450B
Application number: CN202110947469.6A
Authority: CN
Inventors: 胡松青; 何贤蓉; 刘光毅; 侯轶
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2041-08-18
Also published as: CN113604450A

Abstract

本发明公开了一种KOD DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明的KOD DNA聚合酶突变体KOFU‑S是将野生型KODDNA聚合酶进行缺失、定点突变、嵌合以及融合双链核酸结合蛋白Sso7d改造而成。本发明的KOD DNA聚合酶突变体与野生型KODDNA聚合酶相比，具有较高的保真度，同时扩增速率、延伸能力和耐抑制剂能力等PCR扩增性能提高，将拓宽该聚合酶在分子生物学领域的应用。

Description

一种KOD DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种KOD DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是现代分子生物学最重要的基本研究手段之一，它已被公认为研究基因功能的必备技术。PCR技术中的关键组分是耐热DNA聚合酶。

在耐热聚合酶被应用之前，PCR程序中使用的是不具有耐热性的大肠杆菌DNA聚合酶，PCR反应中变性温度就可以使它失活，因此，在当时的PCR过程中需要在每轮循环时添加新的聚合酶，操作复杂。而耐热DNA聚合酶在95℃仍具有聚合酶活性，因此不需要在PCR的每轮循环中添加聚合酶，这大大简化了PCR技术的操作，推动了PCR广泛的使用。随着PCR技术的发展，越来越多的DNA耐热聚合酶被发现并研究使用，不同的聚合酶具有不同的反应特性。

KODDNA聚合酶是一种具有高扩增能力的耐热DNA聚合酶，它是从来自日本鹿儿岛县(Kodakara)火山口温泉的超嗜热古菌Thermococcus kodakaraensisKOD1中分离出来。该聚合酶的扩增速度是TaqDNA聚合酶的2倍，PfuDNA聚合酶的6倍，扩增产量也很高；但KODDNA聚合酶的保真度不如Pfu DNA聚合酶，仅为其1/3。同时，KOD DNA聚合酶不具有长片段扩增能力，在扩增5kb左右的DNA片段时，产量开始变低。自2003年解析得到KODDNA聚合酶的晶体结构后，科研人员便开始了对该聚合酶进行分子改造。2005年，日本学者Toshihiro等人发现位于KODDNA聚合酶loop环上的147位氨基酸能够调控外切活性与聚合活性，他们对该位点进行突变，得到一系列外切活性为野生型的9％-276％的突变体。其中突变体H147K外切活性为野生型的276％，但其延伸性能降低，不能扩增出3.6kb的基因片段。因此，有必要对KODDNA聚合酶进行进一步优化改造。

发明内容

为了提高野生型KOD DNA聚合酶性能，提升其扩增长片段DNA能力和耐抑制剂能力，同时保证其保真度提升，本发明的首要目的在于提供一种KOD DNA聚合酶突变体。这是一种一种兼具快速延伸能力、耐抑制剂能力和高保真度的突变型DNA聚合酶。

本发明的另一目的在于提供上述KOD DNA聚合酶突变体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述KOD DNA聚合酶突变体的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种KOD DNA聚合酶突变体，命名为KOFU-S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的KOD DNA聚合酶突变体与NCBI编号为1WNS_A的野生型KOD DNA聚合酶相比，具有以下特点：第2位氨基酸处依次插入插入丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)3个氨基酸，332-563位氨基酸序列替换成NCBI编号为AHH82558.1的PfuDNA聚合酶332-564位氨基酸序列，C末端融合了双链DNA结合蛋白片段，连接子为“GTGGGG”；

在上述插入、嵌合和融合改造基础上，所述的KOD DNA聚合酶突变体还具有以下氨基酸残基的突变：150位组氨酸(His)突变为赖氨酸(Lys)。

所述的双链结合蛋白片段优选为Sso7d的2～64位氨基酸残基，NCBI编号为P39476.2，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。Sso7d双链结合蛋白，来自Sulfolobussolfataricus嗜热硫化裂片菌，共64个氨基酸。实验研究证明它与Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶结合能够提升对应聚合酶的延伸能力与耐抑制剂能力。

编码上述KOD DNA聚合酶突变体的DNA分子。

所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该序列是根据大肠杆菌表达系统特点进行密码子优化而得，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

一种表达载体，是将编码上述KOD DNA聚合酶突变体的DNA分子克隆入表达载体得到。

所述的表达载体优选为原核表达载体；更优选为pET系列载体；更优选为pET-28a。

一种重组工程细胞株，是将上述表达载体转化入工程细胞得到。

所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。该重组工程细胞株可快速、可溶表达上述表达载体。

上述KOD DNA聚合酶突变体的制备方法，具体包括如下步骤：

1)取上述重组工程细胞株，接种于LB培养基中，培养，得到种子液；

2)取所得种子液接种于LB培养基中，培养，得到菌液；

3)向所得菌液中加入IPTG至终浓度为0.1～0.5mmol/L，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀；

4)向所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，离心取上清液；

5)所得上清液70～80℃孵育25～35min，离心，0.22μm微孔滤膜过滤，取上清液；

6)通过镍离子亲和层析收集含有目的蛋白的样品洗脱液，即获得所述的KOD DNA聚合酶突变体。

优选地，步骤1)和步骤2)中所述的LB培养基均含50μg/mL卡那霉素。

优选地，步骤1)中所述的培养的条件为37℃振荡培养过夜。

优选地，步骤2)中所述的培养的条件为37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8。

优选地，步骤2)中所述的种子液按1:100的体积比接种于LB培养基。

优选地，步骤3)中所述的诱导的条件为18℃诱导16～20h。

优选地，步骤3)和步骤4)中所述的离心的条件为4℃以12000rpm的转速离心20～30min。

优选地，步骤4)中所述的裂解缓冲液的用量按每克菌体沉淀中加入5mL计。

优选地，步骤4)中所述的超声的条件为功率250W，超声5s，间隔5s，持续30min。

优选地，步骤4)中所述的裂解缓冲液的组分为：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/LNaCl、25mmol/L Imidazole、5％Glycerol，pH 8.0。

优选地，步骤5)中所述的孵育的条件为75℃孵育30min。

优选地，步骤5)中所述的镍离子亲和层析所用的结合缓冲液(Buffer A)的组分为：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl，pH8.0；所用的洗脱缓冲液(Buffer B)的组分为：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl、500mmol/L Imidazole，pH 8.0。

一种PCR反应试剂盒，包含PCR用水、PCR反应缓冲液和dNTPs中的至少一种，和上述KOD DNA聚合酶突变体。

优选地，所述的PCR反应缓冲液的组成如下：100～120mmol/L Tris-HCl、2～3mmol/L MgCl₂、5～20mmol/L(NH₄)₂SO₄、140～160mmol/L KCl、0.1～0.4g/L BSA、0.05％～0.1％Triton X-100，pH值为8～10。

优选地，所述的KOD DNA聚合酶突变体在体系中的浓度为0.01～0.05U/μL。

优选地，所述的dNTPs在体系中的浓度为50～300μmol/L。

上述PCR反应试剂盒在扩增DNA样本中的应用。

所述的应用的具体操作为：采用所述PCR反应试剂盒和含有所述DNA样本的样品进行PCR，获得经PCR扩增的靶基因产物。

所述的样品可能含有一种或多种抑制剂，包括但不限于SDS(十二烷基硫酸钠)、NaCl、乙醇、尿素、腐殖酸、肝素和胆盐；进一步地，所述的SDS的含量为0～0.01％，所述的NaCl的含量为0～100mmol/L，所述的乙醇的含量为0～10％，所述的尿素的含量为0～160mmol/L，所述的腐殖酸的含量为0～80ng/μL，所述的肝素的含量为0～0.03U/mL，所述的胆盐的含量为0～0.8μg/μL。

本发明相较于现有技术具有如下的优点和有益效果：

1、本发明所述突变型KOFU-SDNA聚合酶的保真度为野生型KOD DNA聚合酶的两倍，保真度的提升可以降低PCR反应过程中出现的碱基突变概率。因此，用所述突变型KOFU-SDNA聚合酶进行PCR扩增时获得的DNA产物，在进行进一步分析鉴定时，所得到的结果更加真实可靠。

2、本发明所述的突变型KOFU-SDNA聚合酶的PCR反应性能较野生型KOD DNA聚合酶有所提升，其延伸速率最高可达5s/kb，能扩增长度在10kb的DNA模板，能进行扩增模板核酸浓度为1pg/μL的PCR反应。这使得用所述突变型KOFU-SDNA聚合酶进行PCR反应时，更为高效省时。

3、本发明所述突变型KOFU-S DNA聚合酶的耐抑制剂能力较野生型KOD DNA聚合酶提高，至少可耐受0.01％的SDS，100mmol/L的NaCl，10％的乙醇，160mmol/L的尿素，80ng/μL的腐殖酸，0.03U/mL的肝素以及0.8μg/μL的胆盐。耐抑制剂能力的显著提升，扩大了聚合酶的应用范围，使得所述突变型KOFU-S聚合酶有可能应用在直接扩增PCR中。

4、本发明所述PCR反应缓冲液可以为突变型KOFU-SDNA聚合酶提供一个最佳反应环境，使聚合酶能够更好地发挥其良好的催化活性。也为更多PCR反应提出了可供选择的更快速、高保真、灵敏度更高的聚合酶以及其PCR反应缓冲液。

附图说明

图1为突变型KOFU-SDNA聚合酶的纯化结果；其中泳道M为(10-116kDa)预染蛋白Marker；泳道1为细胞破碎液；泳道2为细胞破碎液离心后的上清液；泳道3为细胞破碎液离心后的上清液，经75℃加热30min后离心处理所得的上清液；泳道4-9分别为亲和层析不同浓度咪唑洗脱液纯化后所得到的突变型KOFU-SDNA聚合酶。

图2为实施例7中突变型KOFU-SDNA聚合酶延伸速率测试的电泳结果图；其中泳道M为DNA Marker；图(A)、(B)、(C)分别为野生型KODDNA聚合酶与KOFU-S聚合酶延伸时间设置为15s/kb、30s/kb、60s/kb的电泳结果，其中每组片段长度分别为2kb、4kb、6kb；图(D)是进一步对KOFU-S聚合酶的延伸能力进行研究的结果，用KOFU-S聚合酶扩增2kb、4kb、6kb片段，各延伸时间所对应速率分别5s/kb、10s/kb、15s/kb、30s/kb、60s/kb。

图3为其实施例8中突变型KOFU-SDNA聚合酶扩增不同长度核酸模板PCR反应的电泳结果图；其中泳道M为DNA Marker。

图4为实施例9中突变型KOFU-SDNA聚合酶扩增不同浓度核酸PCR反应的电泳结果图；其中泳道M为DNA Marker。

图5为实施例10中突变型KOFU-SDNA聚合酶在不同浓度PCR抑制剂耐受程度PCR反应的部分电泳结果图；其中泳道M为DNA Marker；图(A)、(B)、(C)分别是抑制剂为不同浓度的SDS、NaCl、乙醇时PCR反应的电泳结果图。

图6为实施例10中突变型KOFU-S DNA聚合酶在不同浓度PCR抑制剂耐受程度PCR反应的部分电泳结果图；其中泳道M为DNA Marker；图(A)、(B)、(C)、(D)分别是抑制剂为不同浓度的尿素、腐殖酸、肝素、胆盐时PCR反应的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1构建含编码KOFU-S DNA聚合酶的核苷酸序列的重组载体

(1)根据所述突变型KOFU-SDNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，进行大肠杆菌表达系统的密码子优化后，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的DNA分子，利用拼接PCR的方法，人工合成编码所述突变型KOFU-SDNA聚合酶的DNA分子，具体如SEQ ID NO:2所示。

(2)将编码突变型KOFU-SDNA聚合酶的DNA分子与表达载体pET-28a进行重组。合成引物序列如下：

NdeI-FP：5'-GCGCCATATGATGTTAACCATC-3'(SEQ ID NO:4)；

XhoI-RP：5'-GCGCCTCGAGTTATTTTTTCTG-3'(SEQ ID NO:5)。

应用PCR对突变型KOFU-SDNA聚合酶的DNA分子进行扩增，以人工合成的编码所述突变型KOFU-S聚合酶的DNA分子为模板，加入25μL 2×Pfu Max HiFi PCR ProMix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)、各1μL(10μmol/L)上下游引物Nde Ⅰ-FP和XhoⅠ-RP以及适量的灭菌水，进行PCR扩增。扩增条件为：98℃30s；98℃10s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃5min。琼脂糖凝胶电泳回收全长约2.5kb的目的基因片段，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切目的基因片段和载体pET-28a，并用T4DNA连接酶进行连接反应，连接产物转化至DH5α感受态细胞中。

(3)挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，证实编码突变型KOFU-SDNA聚合酶的DNA分子的正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码突变型KOFU-SDNA聚合酶的DNA分子的重组载体。

实施例2表达突变型KOFU-SDNA聚合酶的转化体的制备

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落，接种至液体LB培养基培养至OD₆₀₀为0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，18℃诱导16h，收集菌体超声破碎，然后通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备的转化体能够高效表达突变型KOFU-SDNA聚合酶。

实施例3突变型KOFU-SDNA聚合酶的表达和鉴定

将实施例2获得的能够表达突变型KOFU-SDNA聚合酶的阳性转化体菌种接种至含50μg/mL硫酸卡那霉素的60mL LB培养基中，放置于37℃摇床中振荡培养过夜；取过夜培养的种子液，按1:100接种至500mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床中继续振荡培养4h(OD₆₀₀＝0.6～0.8)；向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，18℃继续振荡诱导18h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重；取诱导前及诱导后菌液各1mL，12000rpm离心1min后取沉淀，加入150μL裂解缓冲液，振荡均匀，用超声细胞破碎仪裂解菌体，超声条件为：超声4s，间隔4s，多次循环持续1min。离心取上清液，沉淀物加入150μL裂解缓冲液，振荡重悬。取上清及沉淀组分悬液进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达情况。表达结果为上清液在98.3kDa处有明显蛋白条带，而沉淀组分悬浮液在此处没有明显蛋白条带，证实了改造体为可溶性表达。

实施例4突变型KOFU-SDNA聚合酶纯化

1、重组菌体超声破碎

取-20℃冻存的诱导表达菌体，根据实施例3记录的菌体湿重，按每克菌体加入5mL裂解缓冲液重悬菌体，用超声波细胞破碎仪裂解菌体，超声条件为：功率250W，超声5s，间隔5s，持续30min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下，12000r/min离心30min，取上清液至250mL灭菌烧瓶中。上清液于75℃恒温水浴锅孵育30min，4℃下，12000r/min离心30min，0.22μm微孔滤膜过滤，取上清液至250mL灭菌烧瓶。

2、镍离子亲和层析纯化

选用的层析柱是HisTrap^TM HP 5mL(购自GE Healthcare)，结合缓冲液为bufferA：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl，pH 8.0；洗脱缓冲液为buffer B：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl、500mmol/L Imidazole，pH 8.0；0.22μm滤膜过滤备用。

将HisTrap^TM HP 5mL接入快速蛋白质纯化仪的柱位阀中，用超纯水清洗系统和柱子，再用buffer A平衡柱子，然后用样品泵将步骤1所述上清液进行上样，上样后，先用buffer A清洗柱子，再用洗脱缓冲液buffer B进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。分别对各个洗脱峰取样20μL，用SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图1所示。结果表明，KOD DNA聚合酶改造体在SDS-PAGE电泳图上形成了单一条带，且分子量在98.3kDa。

实施例5突变型KOFU-SDNA聚合酶活性和热稳定性测试

取实施例4制备的突变型KOFU-SDNA聚合酶，按照以下方法测定酶活。74℃下，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板、引物，在120mmol/L Tris-HCl、1.5mmol/L MgCl₂、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、150mmol/LKCl、0.01g/L BSA、0.05％Triton X-100，pH值为8.0-10.0的反应体系中进行酶催化反应。在30min内，将催化10nmol dNTPs掺入到DNA的聚合酶的量定义为1U。结果显示嵌合体的聚合酶活性浓度为16U/μL。

将突变型KOFU-SDNA聚合酶稀释为5U/μL，按上述方法测试突变型KOFU-SDNA聚合酶的热稳定性。将稀释后的聚合酶在95℃分别孵育0、1、2、3、4、5、6h后，分别取样进行DNA聚合酶活性测定，结果显示突变型KOFU-SDNA聚合酶具有极高的热稳定性，其在95℃下的半衰期为4h。

实施例6突变型KOFU-SDNA聚合酶保真性测试

取实施例4制备的突变型KOFU-SDNA聚合酶，按照以下方法测定保真度。根据质粒pUC19的碱基序列设计引物，以质粒pUC19为模板，pUCl9 F、pUCl9 R为引物。引物序列如下：

pUC19 F：5'-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3'(SEQ ID NO:6)；

pUC19 R：5'-TGGCTTAACTATGCGGCATC-3'(SEQ ID NO:7)。

分别用KOFU-SDNA聚合酶、野生型KODDNA聚合酶、KOD商品酶(TOYOBO，KOD FX Neo)进行PCR扩增；扩增产物经同源重组后，将5μL连接产物转化入50μL大肠杆菌感受态DH5α中；37℃复壮1h后，取100μL菌液、800μg X-gal、20μL 100mmol/L IPTG涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基上，于37℃培养箱培养12h以上，形成单菌落。记录平板培养基上蓝色菌落及白色菌落的数量，其中蓝色菌落为正常体，白色菌落为变异体。经过计算，突变型KOFU-SDNA聚合酶保真度为7.1×10^-6，较野生型KODDNA聚合酶提升了2倍，与商品酶KOD FXNeo相当。

实施例7突变型KOFU-SDNA聚合酶的延伸速率

取实施例4制备的突变型KOFU-SDNA聚合酶，按照以下方法测定延伸速率。在本实施例中，使用10ng/μL的λDNA作为模板，用KOFU-S以及野生型KODDNA聚合酶扩增2、4、6kb片段，各延伸时间所对应速率分别15s/kb、30s/kb、60s/kb。反应程序为：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃15s/kb、30s/kb、60s/kb，共30个循环；68℃5min。配制1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。

在相同的反应体系下，用KOFU-S聚合酶扩增2kb、4kb、6kb片段，各延伸时间所对应速率分别5s/kb、10s/kb、15s/kb、30s/kb、60s/kb。反应程序为：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃5s/kb、10s/kb、15s/kb、30s/kb、60s/kb，共30个循环；68℃5min。配制1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。图2结果显示：KOFU-S的延伸速率性能要高于野生型KOD DNA聚合酶；图中，KOFU-S对于不同长度的片段均有明显条带，而野生型KOD DNA聚合酶在不同的延伸速率下均不能扩增出6kb的条带，这说明其长片段延伸能力有限制，而在15s/kb的情况下，即图2(A)中，野生型KOD DNA聚合酶对于4kb的目的条带不能扩增出。图2(D)是进一步对KOFU-S的延伸能力进行研究的结果。用KOFU-S聚合酶扩增2kb、4kb、6kb片段，各延伸时间所对应速率分别5s/kb、10s/kb、15s/kb、30s/kb、60s/kb。KOFU-S在10s/kb时依然可以扩增出6kb的条带，而在5s/kb时，4kb以下的条带能够扩增出。在扩增长片段时，KOFU-SDNA聚合酶延伸速率最快可达10s/kb，扩增4kb以下的片段时，KOFU-S DNA聚合酶延伸速率最快可达5s/kb。KOFU-S DNA聚合酶的延伸速率较野生型KOD DNA聚合酶显著提升。

实施例8突变型KOFU-SDNA聚合酶的长片段延伸能力

取实施例4制备的突变型KOFU-SDNA聚合酶，按照以下方法测定聚合酶的长片段延伸能力。长片段延伸能力是指聚合酶在PCR反应中延伸长片段的能力，野生型KOD DNA聚合酶在PCR反应延伸后期活力不够，延伸能力下降，只能延伸4-5kb的模板。在实际应用中，这限制了PCR在长片段扩增中的应用。

在本实施例中，使用10ng/μL的λDNA作为模板。在相同的反应体系下，用KOFU-S以及野生型KOD DNA聚合酶扩增2kb、4kb、6kb、8kb、10kb、12kb的片段，延伸时间所对应速率设为1min/kb。反应程序为：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃1min/kb，共30个循环；68℃5min。配制1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。从图3可以看出，KOFU-S可扩增长达10kb的片段，约为野生型KOD DNA聚合酶的2.5倍。改造后的KOFU-S的长片段延伸能力较野生型KOD DNA聚合酶显著提升。

实施例9突变型KOFU-SDNA聚合酶对不同模板浓度的灵敏度

取实施例4制备的突变型KOFU-SDNA聚合酶，按照以下方法测定聚合酶对不同浓度核酸模板的扩增灵敏度。在本实施例中，使用1ng/μL的λDNA作为模板，对模板进行10倍梯度稀释，一共涉及5个梯度(1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg)，在相同的反应体系下，用KOFU-S，野生型KOD DNA聚合酶去扩增1kb的λDNA。反应程序为：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s，共30个循环；68℃5min。配制1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。

本实施例中，检测了λDNA浓度为1ng-0.1pg范围内对PCR反应的影响，从图4中可以看出，KOFU-S聚合酶最低可检测出1pg的λDNA，而野生型KOD DNA聚合酶扩增微量浓度的DNA能力比较低，当λDNA为10p就不能扩增出目标产物。KOFU-S的模板灵敏度为野生型KOD DNA聚合酶的100倍，改造后的KOFU-S的核酸模板灵敏度较野生型KOD DNA聚合酶显著提升。

实施例10突变型KOFU-SDNA聚合酶对不同抑制剂的耐受能力

取实施例4制备的突变型KOFU-SDNA聚合酶，按照以下方法测定聚合酶对不同抑制剂的耐受能力。在本实施例中，使用5ng/μL的pUC19质粒作为模板，分别使用不同浓度的SDS(十二烷基硫酸钠)、NaCl、乙醇、腐殖酸、胆盐、肝素和尿素作为PCR抑制剂。在相同的反应体系下，用KOFU-S，野生型KOD，野生型Pfu聚合酶去扩增0.7kb的pUC19质粒。反应程序为：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s，共30个循环；68℃5min。配制2％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测。

本实施例中，检测了KOFU-S聚合酶对浓度0-0.08％(W/V)的SDS、浓度0-125mM的NaCl、浓度0-20％(V/V)的乙醇、浓度0-240mM的尿素、0-120ng/μL的腐殖酸、0-0.48U/mL的肝素以及0-1.6μg/μL的胆盐的耐受程度。从图5、图6中可以看出，KOFU-SDNA聚合酶至少可耐受0.01％的SDS，100mmol/L的NaCl，10％的乙醇，160mmol/L的尿素，80ng/μL的腐殖酸，0.03U/mL的肝素以及0.8μg/μL的胆盐。而KODDNA聚合酶仅能耐受0.01％的SDS，50mmol/L的NaCl，5％的乙醇，120mmol/L的尿素，40ng/μL的腐殖酸，0.03U/mL的肝素以及0.2μg/μL的胆盐。同时，Pfu DNA聚合酶仅能耐受0.01％的SDS，0mM的NaCl，10％的乙醇，120mmol/L的尿素，40ng/μL的腐殖酸，0.03U/mL的肝素以及0.4μg/μL的胆盐。

因此突变型KOFU-SDNA聚合酶对PCR抑制剂的耐受能力较KOD DNA聚合酶有所提升。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 华南理工大学

<120> 一种KOD DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 847

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变型KOFU-S聚合酶氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Ser Ala Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys

1 5 10 15

Pro Val Ile Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu

20 25 30

Tyr Asp Arg Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp

35 40 45

Ser Ala Ile Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr

50 55 60

Val Val Thr Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly

65 70 75 80

Arg Pro Val Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val

85 90 95

Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile

100 105 110

Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly

115 120 125

Leu Val Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp

130 135 140

Ile Glu Thr Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile

145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp

165 170 175

Lys Asn Val Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu

180 185 190

Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val

195 200 205

Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys

210 215 220

Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys

245 250 255

Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn

260 265 270

Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln

275 280 285

Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr

290 295 300

Gly Glu Asn Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys

305 310 315 320

Val Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu

325 330 335

Ser Arg Leu Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr

340 345 350

Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn

355 360 365

Glu Val Ala Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu

370 375 380

Arg Glu Ser Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu

385 390 395 400

Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile

405 410 415

Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys

420 425 430

Lys Asn Tyr Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp

435 440 445

Ile Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg

450 455 460

Gln Lys Ile Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys

465 470 475 480

Ile Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser

485 490 495

Phe Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu

500 505 510

Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val

515 520 525

Trp Lys Glu Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp

530 535 540

Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile

545 550 555 560

Lys Lys Lys Ala Leu Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro

565 570 575

Gly Ala Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe

580 585 590

Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr

595 600 605

Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys

610 615 620

Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val

625 630 635 640

Glu Lys Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys

645 650 655

Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg

660 665 670

Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys

675 680 685

Arg Leu Ala Ala Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser

690 695 700

Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro

705 710 715 720

Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr

725 730 735

Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe

740 745 750

Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly

755 760 765

Leu Ser Ala Trp Leu Lys Pro Lys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly

770 775 780

Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Ile

785 790 795 800

Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe Thr

805 810 815

Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys

820 825 830

Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

835 840 845

<210> 2

<211> 2544

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变型KOFU-S聚合酶优化后的核酸序列

<400> 2

atggcgtcgg cgatcttaga caccgattac attaccgagg acggcaagcc ggttatccgc 60

atcttcaaaa aagagaacgg cgagtttaag attgaatacg atcggacctt tgagccgtat 120

ttctatgcgt tgcttaagga cgattctgcg atagaagagg tcaaaaagat cacagcagag 180

cgtcacggca ccgtggttac cgtgaagcgg gtagaaaaag tacaaaaaaa gtttcttggg 240

cgtcctgtcg aagtttggaa gctgtatttt acccatccgc aagatgtgcc ggccatacgg 300

gacaagattc gtgaacatcc ggcggttatt gatatatacg agtacgatat cccctttgcg 360

aaacgctatc tgatagataa gggcctggtg ccgatggaag gcgatgagga actgaaaatg 420

cttgcgtttg acatagagac actgtataaa gagggggaag agttcgcgga aggcccgatc 480

ctgatgatat cttatgctga tgaagagggc gctcgcgtca ttacatggaa gaacgtggac 540

cttccttatg tggatgtcgt gagcaccgag cgtgaaatga ttaagcggtt tctgcgtgtt 600

gtgaaagaaa aggaccctga tgtactgatt acctataatg gggataattt cgactttgct 660

tacttaaaga aacgttgcga gaaattgggc atcaactttg cactgggacg tgatgggagc 720

gaaccgaaga ttcaacgtat gggcgatcgt tttgcggtag aagttaaagg ccgtatacat 780

tttgacttgt atccggtgat tcgtcgcacc attaacctgc cgacatatac cctggaagca 840

gtctacgaag cggtgttcgg ccaacccaag gaaaaggtat acgccgaaga gattactacc 900

gcgtgggaga caggcgagaa cctggaacgt gtggctcgtt atagtatgga ggacgcgaag 960

gtaacgtacg agctgggcaa ggagttcctg cctatggaag cgcagctgtc acgcctggtc 1020

ggtcagccgt tgtgggatgt ctcacgtagc agcaccggca atctggtgga atggttcttg 1080

ttgcgtaagg cgtacgaacg taatgaagtg gcgcccaata agccctccga ggaagaatat 1140

cagcgtcgtc tgcgggaatc ttacaccggc ggatttgtca aagaaccgga gaaaggcctg 1200

tgggaaaaca ttgtctactt agactttcgt gcgctgtacc cgtcgatcat aataacccat 1260

aacgtgagcc cagacacgtt aaatctggaa gggtgcaaga attatgacat tgccccccaa 1320

gtgggtcaca agttctgtaa ggacataccg ggctttatcc cgagcctgct gggtcatctg 1380

ttggaggaac gtcagaagat aaagacaaaa atgaaggaaa ctcaagatcc aatagagaaa 1440

attctgctgg attatcgtca aaaggcaatt aaactgctgg ctaactcgtt ttatggctat 1500

tacgggtatg ctaaagctcg ctggtattgc aaggaatgtg cggaaagcgt gacggcatgg 1560

ggccgtaaat acattgagct ggtgtggaag gagctggagg agaagttcgg cttcaaagta 1620

ctgtacatag ataccgatgg cttatatgcg acaattccgg gtggcgaaag cgaggagatt 1680

aagaaaaaag cgttggaatt tctgaagtac ataaatgcca agctgcctgg cgctctggaa 1740

ctggaatatg aaggcttcta taaacgtggc tttttcgtga ctaagaagaa gtacgcagta 1800

attgacgagg agggaaagat taccactcgc ggcttggaga ttgtgcgtcg tgattggtcg 1860

gaaattgcca aggagacaca agcgcgtgtg ttagaggcgc tgctgaaaga cggcgatgtc 1920

gaaaaggcgg tccgtattgt caaggaagtt accgaaaaac tgagcaagta cgaggtgcct 1980

cctgaaaagc tggttattca tgagcaaatt acccgtgacc tgaaggatta taaggctact 2040

ggcccacatg tagcagtggc caaacgtctg gccgcacgtg gcgtgaagat acgtccgggc 2100

actgtaatta gctacattgt gctgaagggc tctggtcgca ttggcgaccg tgcgattccg 2160

tttgatgaat ttgaccctac caaacataag tatgatgctg aatattacat cgagaatcag 2220

gttttaccgg cagttgaacg tatcctgcgt gcttttggct atcgtaagga ggatttgcgt 2280

taccaaaaaa cccgtcaggt aggcctgagc gcatggctga aaccaaaggg tactggcacc 2340

gggggtggtg gagcgactgt taagttcaaa tacaaggggg aggaaaaaga ggtggatatt 2400

agcaaaatca agaaggtttg gcgtgtgggg aaaatgataa gctttacata cgacgagggt 2460

ggaggcaaaa caggtcgtgg cgcggtgtcc gagaaagatg ccccgaaaga gttgttacag 2520

atgttagaaa agcagaagaa ataa 2544

<210> 3

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 双链结合蛋白Sso7d氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NdeI-FP

<400> 4

gcgccatatg atgttaacca tc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> XhoI-RP

<400> 5

gcgcctcgag ttattttttc tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pUC19 F

<400> 6

ccaggcttta cactttatgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pUC19 R

<400> 7

tggcttaact atgcggcatc 20

Claims

1.一种KOD DNA聚合酶突变体，其特征在于：命名为KOFU-S，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.编码权利要求1所述的KOD DNA聚合酶突变体的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的KOD DNA聚合酶突变体的DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述的DNA分子的重组表达载体或重组工程细胞株。

5.权利要求1所述的KOD DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1)取权利要求4所述的重组工程细胞株，接种于LB培养基中，培养，得到种子液；

2)取所得种子液接种于LB培养基中，培养，得到菌液；

6)进行镍离子亲和层析，蛋白变性电泳检测各个洗脱峰，收集含有目的蛋白的样品，即获得所述的KOD DNA聚合酶突变体。

6.根据权利要求5所述的KOD DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于：

步骤1)和步骤2)中所述的LB培养基均含50μg/mL卡那霉素；

步骤1)中所述的培养的条件为37℃振荡培养过夜；

步骤2)中所述的培养的条件为37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；

步骤2)中所述的种子液按1:100的体积比接种于LB培养基；

步骤3)中所述的诱导的条件为18℃诱导16～20h；

步骤3)和步骤4)中所述的离心的条件为4℃以12000rpm的转速离心20～30min；

步骤4)中所述的裂解缓冲液的用量按每克菌体沉淀中加入5mL计；

步骤4)中所述的超声的条件为功率250W，超声5s，间隔5s，持续30min；

步骤4)中所述的裂解缓冲液的组分为：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl、25mmol/L Imidazole、5％Glycerol，pH 8.0；

步骤5)中所述的孵育的条件为75℃孵育30min；

步骤5)中所述的镍离子亲和层析所用的结合缓冲液的组分为：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl，pH8.0；所用的洗脱缓冲液的组分为：50mmol/L Tris-HCl、300mmol/LNaCl、500mmol/L Imidazole，pH 8.0。

7.一种PCR反应试剂盒，其特征在于：包含PCR用水、PCR反应缓冲液和dNTPs中的至少一种，和权利要求1所述的KOD DNA聚合酶突变体。

8.根据权利要求7所述的PCR反应试剂盒，其特征在于：

所述的PCR反应缓冲液的组成如下：100～120mmol/L Tris-HCl、2～3mmol/L MgCl₂、5～20mmol/L(NH₄)₂SO₄、140～160mmol/L KCl、0.1～0.4g/L BSA、0.05％～0.1％Triton X-100，pH值为8～10；

所述的KOD DNA聚合酶突变体在体系中的浓度为0.01～0.05U/μL；

所述的dNTPs在体系中的浓度为50～300μmol/L。

9.权利要求7或8所述的PCR反应试剂盒在扩增DNA样本中的应用，其特征在于：

所述的应用的操作为：采用所述PCR反应试剂盒和含有所述DNA样本的样品进行PCR，获得经PCR扩增的靶基因产物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的样品还含有一种或多种抑制剂；所述的抑制剂包括但不限于SDS、NaCl、乙醇、尿素、腐殖酸、肝素和胆盐；进一步地，所述的SDS的含量为0～0.01％，所述的NaCl的含量为0～100mmol/L，所述的乙醇的含量为0～10％，所述的尿素的含量为0～160mmol/L，所述的腐殖酸的含量为0～80ng/μL，所述的肝素的含量为0～0.03U/mL，所述的胆盐的含量为0～0.8μg/μL。