CN109423511A - 一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物和实时荧光定量PCR方法 - Google Patents
一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物和实时荧光定量PCR方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及荧光定量PCR检测方法技术领域，特别涉及一种用于检测中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)Mn‑SOD基因的引物及实时荧光定量PCR法，该方法利用实时荧光定量PCR技术分析中华乌塘鳢不同组织的Mn‑SOD基因表达量，以GAPDH为内参基因，设计内参基因引物和目的基因引物；以逆转录的cDNA为模板，在ABI 7500 Fast Real‑time PCR system上对目的基因的表达水平进行检测，对检测结果进行统计分析，能快速、准确的检出Mn‑SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况，为该基因的利用和研究提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR检测方法技术领域，特别涉及一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物及实时荧光定量PCR法。
背景技术
中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)，隶属于鲈形目塘鳢科乌塘鳢属，系河口咸淡水暖水性小型鱼类。该鱼肉质细腻，营养价值高，具有加速伤口愈合的功效，是名贵的食用鱼之一。目前，中华乌塘鳢已成为我国福建、广东、广西等地区重要的海水经济养殖鱼类之一。随着环境污染和养殖水体的不断恶化，中华乌塘鳢不断受到病菌、重金属、有机污染物等的胁迫，导致出现由氧自由基造成的机体氧化损伤及多种疾病的发生，严重影响中华乌塘鳢养殖业的发展。Mn-SOD是生物体内重要的一类超氧化物歧化酶，广泛分布于动物、植物和微生物中，在清除氧自由基以及抗逆方面发挥非常重要的作用。
因此，检测Mn-SOD基因在中华乌塘鳢体内的表达量，对于研究中华乌塘鳢抗逆境胁迫相关机制的研究具有重要的意义。
然而，目前有关中华乌塘鳢Mn-SOD基因实时荧光定量PCR检测方法尚未见系统报道。
本发明针对现有技术的不足，探索开发一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物及实时荧光定量PCR法。
发明内容
为解决目前尚无对中华乌塘鳢Mn-SOD基因进行实时荧光定量PCR检测方法的问题，本发明提供了一种中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测方法及所用引物。本发明首要要实现对中华乌塘鳢Mn-SOD基因进行实时荧光定量PCR检测的目的。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，所述PCR方法包括以下步骤：
1)中华乌塘鳢目的基因Mn-SOD的实时荧光定量引物设计：
利用如SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因的开放阅读框序列，设计引物；
2)中华乌塘鳢内参基因GAPDH的实时荧光定量引物设计：
利用如SEQ ID NO.2所示中华乌塘鳢GAPDH基因的开放阅读框序列，设计引物；
3)中华乌塘鳢不同组织cDNA逆转录：
提取健康成年中华乌塘鳢不同组织的总RNA，并将提取的不同组织的总RNA分别逆转录成cDNA，0℃以下保存备用；
4)中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测：
以逆转录的cDNA为模板，以GAPDH为内参基因，在ABI 7500Fast Real-time PCRsystem上对中华乌塘鳢Mn-SOD基因的表达水平进行检测，分析Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。
作为优选，所述步骤1)中，利用SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150～300bp，退火温度60℃的引物序列。
作为优选，所述步骤2)中利用如SEQ ID NO.2所示的中华乌塘鳢GAPDH基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150～300bp，退火温度60℃的引物序列。
作为优选，所述步骤3)中，采集健康成年中华乌塘鳢个体，处死后快速采集心脏、肝脏、脾脏、头肾、肌肉、皮肤、血液、鳃、小肠与脑，迅速投入到液氮中进行保存；利用TrizolReagent试剂对中华乌塘鳢不同组织的总RNA分别进行提取，取4～6μg总RNA，利用SuperScript III Reverse Transcriptase kit试剂盒逆转录成cDNA，-20℃保存备用。
作为优选，所述步骤4)中，利用TaKaRaPremix Ex TaqTM II试剂盒，中华乌塘鳢不同组织逆转录cDNA为模板，开展中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测，以中华乌塘鳢GAPDH为内参基因，利用2-ΔΔCt方法分析检出Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。
一种中华乌塘鳢Mn-SOD荧光定量引物，所述引物包括：
上游引物SEQ ID NO.3：5′-GGCACTGGCTAAAGGAGATG-3′；
下游引物SEQ ID NO.4：5′-TCCACTGGGAGAGAGATTCG-3′。
该引物是所述检测方法步骤1)所设计引物的一种但不仅有这一种。
一种中华乌塘鳢GAPDH荧光定量引物，所述引物包括：
上游引物SEQ ID NO.5：5′-TCCACCCACGGTCGCTAC-3′；
下游引物SEQ ID NO.6：5′-TGTCCTCATTCACTCCCATC-3′。
该引物是所述检测方法步骤2)所设计引物的一种但不仅有这一种。
本发明的有益效果是：
1)本发明能够实现对中华乌塘鳢Mn-SOD基因进行实时荧光定量PCR检测；
2)本发明方法简洁，准确度高，可信度高；
3)本发明方法能够实现对中华乌塘鳢不同组织进行检测；
4)本发明方法对于研究中华乌塘鳢抗逆境胁迫相关机制的研究具有重要的意义。
附图说明
图1为Mn-SOD在中华乌塘鳢10个组织中的表达分布情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一分部的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所用原料均为市场可购得或本领域常用原料；如无特殊说明，本发明实施例中所用方法均为本领域技术人员可实现的常规方法。
实施例
1)中华乌塘鳢目的基因Mn-SOD的实时荧光定量引物设计
参考中华乌塘鳢Mn-SOD基因的开放阅读框序列(SEQ ID NO.1)，设计产物片段大小合适、参数优良的引物。中华乌塘鳢Mn-SOD基因的开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，包含678个核苷酸碱基，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列来自发明人前期研究获得的中华乌塘鳢Mn-SOD基因序列。利用Primer Premier5软件，参考中华乌塘鳢Mn-SOD基因开放阅读框序列序列(SEQ ID NO.1)，设计出产物片段大小在150～300bp、参数优良(无错配、无二聚体、无发夹结构、退火温度60℃左右)的引物序列。
所设计的中华乌塘鳢Mn-SOD基因实时荧光定量引物对序列：
F：GGCACTGGCTAAAGGAGATG，(SEQ ID NO.3)；
R：TCCACTGGGAGAGAGATTCG，(SEQ ID NO.4)。
2)中华乌塘鳢内参基因GAPDH的实时荧光定量引物设计
参考中华乌塘鳢GAPDH基因的开放阅读框序列(SEQ ID NO.2)，设计产物片段大小合适、参数优良的引物。中华乌塘鳢GAPDH基因的开放阅读框序列如SEQ ID NO.2所示，包含1008个核苷酸碱基，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列来自发明人前期研究获得的中华乌塘鳢GAPDH基因序列。利用Primer Premier5软件，参考中华乌塘鳢GAPDH基因开放阅读框序列序列(SEQ ID NO.2)，设计出产物片段大小在150～300bp、参数优良(无错配、无二聚体、无发夹结构、退火温度60℃左右)的引物序列。所设计的中华乌塘鳢GAPDH基因实时荧光定量引物对序列：
F：TCCACCCACGGTCGCTAC，(SEQ ID NO.5)：
R：TGTCCTCATTCACTCCCATC，(SEQ ID NO.6)。
3)中华乌塘鳢不同组织cDNA逆转录
采集健康成年中华乌塘鳢个体，处死后快速采集心脏、肝脏、脾脏、头肾、肌肉、皮肤、血液、鳃、小肠、脑等组织，迅速投入到液氮中进行保存。分别取中华乌塘鳢上述组织100～200mg，分别加入0.8～1mL Trizol Reagent(Invitrogen)试剂进行充分研磨，室温静置10～50min。10000～12000g 4℃离心5～10min，小心吸取上清。向上清中加入150～200uL氯仿，用力振荡混匀10～15秒，室温静置15～20min。10000～12000g 4℃离心10～15min，小心吸取上层水相。向上层水相中加入400～500uL异丙醇，振荡混匀，室温静置10～15min。10000～12000g 4℃离心10～15min，小心弃去上清，留沉淀，沉淀即为总RNA。向沉淀中加入1mL 75％乙醇，温和振荡悬浮沉淀，8000g 4℃离心5～10min，弃上清，重复操作1次。将沉淀在室温下晾干5～10min，加入20～80uL无RNAase去离子水溶解总RNA。将提取的总RNA采用紫外分光光度计检测其浓度，并将其稀释成500ng/uL的浓度，保存在-80℃备用。
4)实时荧光定量实验检验
利用TaKaRaPremix Ex TaqTM II试剂盒，20微升反应体系：
Premix Ex TaqTM II(2X)：10微升
上游引物：0.8微升(浓度为10微摩尔/微升)
下游引物：0.8微升(浓度为10微摩尔/微升)
ROX Reference Dye II(50X)：0.4微升
无菌水：7微升
各组织cDNA：1微升(浓度为45～50纳克/微升)。
反应程序：95℃30秒，40个循环(95℃5秒，60℃34秒)，95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。
以中华乌塘鳢GAPDH为内参基因，利用2-ΔΔCt方法分析检出Mn-SOD基因在中华乌塘鳢10个组织中的表达与分布情况，见图1。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD基因的引物和实时荧光定量PCR方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 中华乌塘鳢Mn-SOD基因开放阅读框序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
atgctttgca gagcagctca aatacgcaga tgtgctgcag gcctcagcca ctctctgact 60
caggtgaccg cgtcgaggca gaagcacagt ctgcctgatc tcatgtacga ctatggagct 120
ctggagcctc acatctgtgc agagatcatg cagctccacc acagcaagca tcacgcaaca 180
tacgtcaaca acctcaacgt tacagaggag aagtatcgtg aggcactggc taaaggagat 240
gttacaacac aggttgctct ccagcctgca ctgaaattca atggaggtgg ccacattaac 300
cacactattt tctggacgaa tctctctccc agtggaggtg gagagccaca gggggagctg 360
atggaggcca ttaagcggga cttcggctcc ttccagaaca tgaaggacaa gatgtctacc 420
gccactgttg ctgtccaggg ctcgggctgg ggctggctgg gctacgacaa ggacagcggg 480
agacttcgca tcgccgcctg tgccaatcag gacccgctcc agggaaccac tggcctgatt 540
cctcttctcg gcattgacgt ttgggagcac gcctattacc ttcagtacaa aaacgtccgg 600
cccgactatg tgaaagcaat ctggaacgtc attaactggg aaaatgtgag cgatcgtctc 660
cgagccgcca aaaagtaa 678
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> 中华乌塘鳢GAPDH基因开放阅读框序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
atgccacacc tccaagttgg aatcaatggc tttggccgca ttggacgcct ggttttgagg 60
gcctgccttg agaagggcat caaggtcgtg gccattaacg atcccttcat tgacctcaag 120
tacatggtct acatgttcaa gtatgactcc acccacggtc gctacaaagg agaagtctgc 180
ctggaaggta acaaactcat tgtcgatggc caaagcatca gcgtcttcac atgcatgaag 240
ccagcagaaa tcccatgggg cgaatgcgga gccaagtatg ttgttgagtc caccggtgtc 300
ttcctgagtc tggagaaggc ccatgcccac atcgagggcg gcgctcagcg cgtggttgtg 360
actgccccct cacctgacgc acctatgttt gtgatgggag tgaatgagga caaatatgac 420
ccaaactcta tgaccattgt cagtaatgcc tcttgcacca ccaactgcct ggccccactg 480
gccaaagtca tccacgataa ctttggcatt gaggaggctc ttatgaccac agtccatgcg 540
tacacagcca cacagaagac tgtggatggt cccagtgcaa aggactggcg tggcggtcgt 600
ggtgctcacc agaacatcat ccccgcctcc actggagctg cgaaggcagt cggcaaggtc 660
atccctgacc tgaatggcaa gctgaccggg atggccttca gagtgccagt gtgtgatgtg 720
tcagtggtcg acctgacctg ccgtctgacc aagcctgcgt cctacagtga gattaaggag 780
gccatcaaga aggcctccca cgggcccctg cacggaatac tgggttacac tgaagaacag 840
gtggtgtcca ctgactttat tggtgacact cactcctcca tctttgatgc tggtgctggc 900
atctccctca atgatcactt tgtcaaactt gtttcctggt atgataacga gtttggctac 960
agcaaccgcg ttgctgacct gctgctctac atgaactcta aggagtag 1008
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 中华乌塘鳢Mn-SOD荧光定量上游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
ggcactggct aaaggagatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 中华乌塘鳢Mn-SOD荧光定量下游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
tccactggga gagagattcg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 中华乌塘鳢GAPDH荧光定量上游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
tccacccacg gtcgctac 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 中华乌塘鳢GAPDH荧光定量下游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 6
tgtcctcatt cactcccatc 20
Claims (7)
1.一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述PCR方法包括以下步骤：
1)中华乌塘鳢目的基因Mn-SOD的实时荧光定量引物设计：
利用如SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因的开放阅读框序列，设计引物；
2)中华乌塘鳢内参基因GAPDH的实时荧光定量引物设计：
利用如SEQ ID NO.2所示中华乌塘鳢GAPDH基因的开放阅读框序列，设计引物；
3)中华乌塘鳢不同组织cDNA逆转录：
提取健康成年中华乌塘鳢不同组织的总RNA，并将提取的不同组织的总RNA分别逆转录成cDNA，0℃以下保存备用；
4)中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测：
以逆转录的cDNA为模板，以GAPDH为内参基因，在ABI 7500 Fast Real-time PCRsystem上对中华乌塘鳢Mn-SOD基因的表达水平进行检测，分析Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。
2.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤1)中，利用SEQ ID NO.1所示中华乌塘鳢Mn-SOD基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150～300bp，退火温度60℃的引物序列。
3.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤2)中利用如SEQ ID NO.2所示的中华乌塘鳢GAPDH基因开放阅读框序列，通过Primer Premier5软件，设计出产物片段大小在150～300bp，退火温度60℃的引物序列。
4.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤3)中，采集健康成年中华乌塘鳢个体，处死后快速采集心脏、肝脏、脾脏、头肾、肌肉、皮肤、血液、鳃、小肠与脑，迅速投入到液氮中进行保存；利用Trizol Reagent试剂对中华乌塘鳢不同组织的总RNA分别进行提取，取4～6μg总RNA，利用SuperScript IIIReverse Transcriptase kit试剂盒逆转录成cDNA，-20℃保存备用。
5.根据权利要求1所述一种用于检测中华乌塘鳢Mn-SOD的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤4)中，利用TaKaRaPremix Ex TaqTM II试剂盒，中华乌塘鳢不同组织逆转录cDNA为模板，开展中华乌塘鳢Mn-SOD基因的实时荧光定量PCR检测，以中华乌塘鳢GAPDH为内参基因，利用2-ΔΔCt方法分析检出Mn-SOD基因在中华乌塘鳢不同组织中的表达与分布情况。
6.一种中华乌塘鳢Mn-SOD荧光定量引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物SEQ ID NO.3：5′-GGCACTGGCTAAAGGAGATG-3′；
下游引物SEQ ID NO.4：5′-TCCACTGGGAGAGAGATTCG-3′。
7.一种中华乌塘鳢GAPDH荧光定量引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物SEQ ID NO.5：5′-TCCACCCACGGTCGCTAC-3′；
下游引物SEQ ID NO.6：5′-TGTCCTCATTCACTCCCATC-3′。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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