CN110628777A

CN110628777A - 中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因及克隆方法与应用

Info

Publication number: CN110628777A
Application number: CN201911060054.6A
Authority: CN
Inventors: 周克夫; 孟坤
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-11-01
Also published as: CN110628777B

Abstract

本发明涉及分子生物学和环境科学领域，公开了一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因及其克隆方法与应用，具有VTG基因序列如SEQ1所示和氨基酸序列如SEQ2。本发明首次获得对环境变化敏感的中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，填补了中华乌塘鳢基因组的空白，同时由于该基因是在E2刺激下诱导雄鱼获得的VTG基因，因此，该基因的表达与环境激素的刺激直接相关，该基因的调控和蛋白更能够反应环境激素的污染现状。因此，该基因及蛋白作为环境雌激素的生物标记物对环境监测和评价更准确和实用。同时对更深入研究VTG蛋白在环境激素作用下的表达作用和应用具有理论和实践意义。

Description

中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因及克隆方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和环境科学领域，具体公开了一种基于新型沿海岸边及滩涂模式鱼类-中华乌塘鳢卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)基因全长序列及其克隆方法与应用。

背景技术

近年来环境雌激素(Environmental Estrogens,EEs)以其对水体的恶劣影响吸引了公众的广泛关注。环境雌激素是具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，干扰机体内分泌系统运作的化合物，可分为酞酸酯类、二恶英类、双酚类、多氯联苯类、类固醇类等。自然条件下的环境雌激素主要来源于工业、农业和生活废水，在低浓度下即可对人类或其他生物产生深远的危害。在正常情况下，生物机体的功能受控于内分泌系统、免疫系统、神经系统，而每个系统都是通过微量的激素保持机体的平衡。一方面由大脑中的丘脑、松果体、脑垂体、咽部的甲状腺、甲状旁腺、肾脏的肾上腺、胰腺、胸腺、性腺(卵巢、精巢)分泌出的激素通过各种指令传送到各个脏器；另一方面激素还具有在输送时适当调整分泌量的反馈机能，这个系统可以在激素分泌过量时进行控制，过少时促进分泌，将正常的传导线路逆向传导。即靶器官→各分泌腺→脑垂体→丘脑。环境雌激素类物质进入机体后，会作为配体(Ligand)与体内竞争靶器官结合受体(Receptors)结合，导致机体正常分泌的激素类物质无法传递新陈代谢信息，使机体内一系列生理生化反应出现异常，致使新陈代谢发生紊乱【潘宗保.美国红鱼卵黄蛋白原多克隆抗血清的制备及其在农药环境雌激素活性筛选中的应用[D].中国海洋大学,2011】。有的甚至导致生殖器官功能损伤和肿瘤发生。2002年，中科院水生生物研究所发现武汉市东湖的部分鱼类已开始出现雄鱼雌化的变异现象，原因可能为长期遭受雌激素污染【田怀军,舒为群,邱志群,陈济安,赵清.长江流域某市饮用水雌激素污染物初步研究[J].第三军医大学学报,2004(19):1751-1754】；2005年，邵晶等人初步调查了海河流域部分水体中污染物的雌激素活性，结果发现雄鱼血清中的Vtg浓度显著高于正常浓度【邵晶,时国庆,金星龙,宋茂勇,史建波,江桂斌.海河地区部分水体雌激素活性的初步调查[J].科学通报,2005(16):40-45.】；2012年，Jiang等人对我国23个水源地的水质进行了检测，结果表明各水源地中均含有多种环境雌激素【JiangW,Yan Y,Ma M.Assessment of source water contamination by estrogenicdisrupting compounds in China[J].Journal of Environmental Sciences,24(2):64-68.】。环境问题是我国发展进程中所不可回避的问题之一。现阶段，我国面临着水资源总量较多但可利用的洁净水资源稀少的窘境，地表水污染较重，治理难度大，治理成本高，治理周期长。在我国科技飞速发展，国民生活质量不断提高的今天，人民群众对环境污染问题的关注上升到了一个前所未有的新高度。然而，目前我国在环境雌激素的测定及限值方面的标准却几乎是空白，如何对我国的广大水域的雌激素类化合物污染状况进行监测具有重大的意义。在这样的背景下，卵黄蛋白原做为一种灵敏的雌激素或类雌激素效应生物标志物进入了广大学者的视野。在自然条件下，只有发育成熟的雌鱼体内含有Vtg，幼鱼和雄鱼体内并不合成Vtg。但是在外源雌激素或类雌激素的诱导下，幼鱼和雄鱼也会在肝脏中合成Vtg并释放到血液中，由于雄鱼没有卵巢，无法灭活体内的Vtg，使得雄鱼体内Vtg水平保持在一个高的水平。因此，通过检测雄鱼体内Vtg的异常升高可以间接指示水环境中雌激素物质的污染。

中华乌塘鳢Bostrychus sinensis(Lacepede,1802)，塘鳢科乌塘鳢属的一种鱼类。栖息于浅海、内湾和河口咸淡水水域，亦进入淡水，冬季潜在泥砂底中越冬。其性凶猛，摄食小鱼、虾蟹类、水生昆虫和贝类。分布于潮间带滩涂,营穴居生活,我国产于南海、台湾海峡和东海沿岸,栖息于河口咸淡水或淡水中,为暖水性小型鱼类。中华乌塘鳢，是我国东南沿海主要海水养殖鱼类之一。中华乌塘鳢作为海洋环境风险评估的指示生物具有重要的特点和优势。首先中华乌塘鳢是一类对环境变化尤其是激素类污染物反应敏感，根据洪万树长期研究观察发现，普通中华乌塘鳢种群中就有一定比例的雌雄同体现象，比例达到12.3％【洪万树，何超贤，陈仕玺，张其永，中华乌塘鳢生物学与养殖技术，M.厦门大学出版社。】。低浓度污染物就可能造成性腺及相关生理生化指标变化。此外中华乌塘鳢主要分布河口岸边，甚至红树林区都有分布，对沿岸排出的污染物容易接触，并且该鱼具有洞穴居住的特点，具有较强的定居性，更能够准确反应栖息地环境污染情况和现状。和同样生存环境的弹涂鱼相比，中华乌塘鳢还有一个优势，它属于肉食性，因此在食物链环节属于较高位置，食物链长。而弹涂鱼主要以底栖藻类，饶足类为食，食物链短。经过生物富集作用，中华乌塘鳢可能比弹涂鱼摄入更高浓度的污染物，环境对它的影响和反应会更明显。中华乌塘鳢作为近年来水产养殖的重要品种，如果作为一种生物标记物鱼类，所取得的研究成果可以直接用于近岸养殖和水体质量评估【李生,肖锦平,佘忠明.中华乌塘鳢的育苗技术[J].上海水产大学学报,1999,8(1):48-52.】。

根据类似鱼类Vtg序列长度分析，该基因往往超过4000bp,因此采用RACE方法获得全长基因。目前未见有关于中华乌塘鳢Vtg基因和其全长cDNA序列的报道。该研究对于提升中华乌塘鳢Vtg基因的应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)基因全长序列及其克隆方法；获得一种更能够有效反映和检测环境雌激素类污染的途径，提供基于qPCR分析雌激素作用下中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因表达谱的方法，旨在提供一种高效、准确的中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因表达谱的分析方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明第一目的是提供一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原的全长基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第二目的是提供一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原的全长基因的编码氨基酸系列，其基因的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

本发明第三目的是提供一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原在环境雌激素污染生物标记物，作为判断性别和雌鱼成熟度的指示蛋白中的应用。

本发明第四目的是提供一种克隆中华乌塘鳢Vtg基因全长序列的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、从经过E2诱导的中华乌塘鳢雄鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；

S2、分别设计Vtg的简并引物进行扩增反应，获得Vtg基因片段；

S3、以中华乌塘鳢肝脏总RNA为模板，根据RACE法分别制备Vtg基因、基因3’端和5’端cDNA序列；

S4、根据S2-S3的序列获得Vtg基因全长序列。

其中，所述步骤S2中，设计引物为：

Vg-CDS-F：ATGAGAGYNGTTGTRCTWGC；

Vg-CDS-R：CAGCCTTTCCACAAGWCCAC

其中，所述步骤S3中，Vtg基因对应的RACE引物为：

VG51：GGTAGGCTCCAACAGGTGAAGA

VG52：TTGATGAGAGTCGGCAGCACG

VG31：ACTGGAAGCTCTGCGTTGATGG

VG32：TTGACGACGGGCACATTACCAC

其对应位置分别为：

VG51：1232—1253bp

VG52：1047—1067bp

VG31：3778—3799bp

VG32：4239—4261bp

其中，所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因及内参基因Vtg、Actin的mRNA的qPCR引物分别如下：

F：GACATCGGGTTGGCATACAC

R:TTCATTTCCGAGTGCCTCCT

内参β-Actin引物：

F：GGAAGGTGGACAGAGAAGCC

R：TGCTGACAGGATGCAGAAGG

本发明第五目的是提供一种中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因在基于qPCR方法分析中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因在激素诱导下表达谱的变化分析中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)分别设计中华乌塘鳢卵黄蛋白原Vtg基因及内参基因β-Actin的mRNA的qPCR引物；根据中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因全长cDNA序列，将引物进行实时荧光定量PCR反应；

2)提取、纯化中华乌塘鳢肝脏总RNA，并以此为模板合成cDNA，得到qPCR模板；

3)将qPCR模板进行qPCR扩增，并对扩增产物进行qPCR分析，计算扩增效率。

其中，中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因以及内参基因Vtg、Actin的mRNA的qPCR引物分别如下：

F：GACATCGGGTTGGCATACAC

R:TTCATTTCCGAGTGCCTCCT

内参β-Actin引物：

F：GGAAGGTGGACAGAGAAGCC

R：TGCTGACAGGATGCAGAAGG

其中，所述将qPCR模板进行qPCR扩增的步骤中，PCR扩增反应体系为：

20μL反应体系：

反应条件为：

第一阶段预变性：92-95℃/3min；

第二阶段：92-95℃/5-10s，55-60℃/15-20s，68-72℃/10-15s；

共40～45个循环。

该方法应用于所有卵生生物的环境雌激素污染检测以及相应的雌雄鱼VTG的表达差异。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明获得了中华乌塘鳢Vtg基因全长cDNA序列，填补了中华乌塘鳢Vtg基因家族的空白。该基因与其他相近鱼类Vtg基因进行Blast比对，相似度在50％-70％之间，仍然有30％以上的特异性。

2、中华乌塘鳢是我国东南沿海广泛分布的常见河口性鱼类，Vtg是了解河口咸淡水水域、近岸滩涂处或底质烂泥的低潮区环境雌激素污染的重要生物标志物，获得中华乌塘鳢Vtg基因全长，对于更准确指示相应水域污染状况，以及更深入探究水生生物在污染水域的蛋白表达等问题具有重要意义。

3.目前中华乌塘鳢已经成为水产养殖的重要品种，应用该发明能够更好的反应水质质量及水域环境污染状况。

4.本发明通过设计特异性引物，建立了中华乌塘鳢Vtg和Actin(内参)基因的实时荧光定量PCR方法。运用荧光定量PCR法检测了雄鱼Vtg基因在E2诱导下的表达情况，结果表明：雄鱼体内没有或低表达Vtg基因，只有在雌鱼中才有明显表达，但在E2的诱导下，雄鱼开始表达，随着时间和E2浓度的升高，表达量呈现上升趋势，并且表达水平比雌鱼体内VTG水平还高。证明该基因及其表达的蛋白能够精确反应环境雌激素的污染状况和污染程度。

附图说明

图1本发明为中华乌塘鳢卵黄蛋白原Vtg基因的cDNA全长电泳图。M：Marker，1-6(表示挑取的不同菌落：Vtg 5000bp基因条带。

图2本发明不同E2浓度水体环境处理中华乌塘鳢雄鱼处理3天后对其卵黄蛋白原基因表达的影响图。图2中，male:雄鱼；female：雌鱼；L：低浓度E2,M(中浓度E2),H(高浓度E2)

图3本发明不同E2浓度水体环境处理中华乌塘鳢雄鱼处理8天后对其卵黄蛋白原基因表达的影响图。图3中，male:雄鱼；female：雌鱼；L：低浓度E2,M(中浓度E2),H(高浓度E2)

图4本发明不同E2浓度水体环境处理中华乌塘鳢雄鱼处理11天后对其卵黄蛋白原基因表达的影响图。图4中，male:雄鱼；female：雌鱼；L：低浓度E2,M(中浓度E2),H(高浓度E2)

图5本发明不同E2浓度水体环境处理中华乌塘鳢雄鱼处理14天后对其卵黄蛋白原基因表达的影响图。图5中，male:雄鱼；female：雌鱼；L：低浓度E2,M(中浓度E2),H(高浓度E2)

图6本发明不同E2浓度水体环境处理中华乌塘鳢雄鱼不同时间处理后对其卵黄蛋白原基因表达的影响图。3d:代表处理3天；8d：代表处理8天；11d：代表处理11天；14d：代表处理14天。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种克隆中华乌塘鳢Vtg基因全长序列的方法，其方法包括如下步骤：

1.应用17β-雌二醇(E2)诱导雄性中华乌塘鳢，从E2诱导的中华乌塘鳢雄鱼的肝脏组织中提取总RNA，进行反转录扩增；

2.在genebank中将16种亲缘关系较近的鱼类基因下载下来，利用DNAMAN进行比对，设计PCR引物：

Vg-CDS-F：ATGAGAGYNGTTGTRCTWGC

Vg-CDS-R：CAGCCTTTCCACAAGWCCAC

将DNA片段和T4载体进行连接并转化到大肠杆菌体内，根据蓝白斑筛选结果挑取若干菌落进行扩增培养，然后提取质粒凝胶电泳检验条带是否正确后送去测序。

3.合成RACE引物

VG51：GGTAGGCTCCAACAGGTGAAGA

VG52：TTGATGAGAGTCGGCAGCACG

VG31：ACTGGAAGCTCTGCGTTGATGG

VG32：TTGACGACGGGCACATTACCAC

位置分别在：

VG51：1232—1253bp

VG52：1047—1067bp

VG31：3778—3799bp

VG32：4239—4261bp

VG31+XP1378延伸2min；VG51+XP1379延伸1.5min；各扩25个循环,温度60℃

PCR结果各拿1ul再做PCR,VG32+XP1378和VG52+XP1379延伸1.5min；循环数：20

温度：60℃

其中，XP1378序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

XP1379序列为：CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT

凝胶电泳结果，在5000bp处有明亮条带，切胶回收。连接转化至大肠杆菌种进行培养，然后送去测序。与之前两次测序结果拼接，得到Vtg全长序列(见图1)：

实施例2

一种基于qPCR方法分析中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因在激素诱导下表达谱的变化分析，其方法通过如下步骤实现：

实验室饲养中华乌塘鳢，共设置五组，每组12条，分别编号第一组、第二组、第三组、第四组、第五组。所用箱体：30cm×20cm×15cm蓝色塑料箱。空气泵：型号SB-988，4×4L/min。饲养水体：二级纯水加海盐自行配制，盐度为35‰±2‰。

饲养环境：偏暗(中华乌塘鳢的生活习性)，昼：夜＝10：14

实验方案：

将E2溶解在无水乙醇中，然后和水混匀把第一、二、三组水体分别配成雌二醇含量为10μg/L、50μg/L和100μg/L的海水，饲养雄鱼。第四、五组不加雌二醇，分别饲养雄鱼和雌鱼作为对照。在饲养过程中每2天更换一次水体。

分别在第3、8、11、14天每组随机抓取三条鱼进行解剖获取肝脏，提取RNA转录成cDNA进行qPCR，研究水体中不同时间不同浓度E2与中华乌塘鳢卵黄蛋白原表达量之间的关系。

基于qPCR方法分析中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因在E2诱导下表达谱变化分析的方法，包括以下步骤：

1)分别设计中华乌塘鳢卵黄蛋白原Vtg基因及内参基因β-Actin的mRNA的qPCR引物；根据中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因全长cDNA序列，利用Primer3Plus(http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/)，设计如下引物进行实时荧光定量PCR反应。

qPCR引物：

F：GACATCGGGTTGGCATACAC

R:TTCATTTCCGAGTGCCTCCT

内参β-Actin引物：

F：GGAAGGTGGACAGAGAAGCC

R：TGCTGACAGGATGCAGAAGG

3)将上述qPCR模板进行qPCR扩增，并对扩增产物进行qPCR分析，计算扩增效率。实时荧光定量PCR反应采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Applied Vazyme)配置20μl反应体系：

PCR反应条件为：

第一阶段预变性：92-95℃/3min；

第二阶段：92-95℃/5-10s，55-60℃/15-20s，68-72℃/10-15s；

共40-45个循环。

4)结果见(图2-图6)。以下分别结合图例进行说明：

图2～6展现了不同E2浓度(L，M，H)水体环境处理中华乌塘鳢雄鱼不同时间(3d，8d，11d，14d)后对其卵黄蛋白原(VG)基因表达的影响。其中，Male:正常雄鱼；Female:正常雌鱼；L：低浓度组，10μg/L；M:中浓度组，50μg/L；H：高浓度组，100μg/L；relativeexpression:相对表达量。0-400：倍数。3d：处理3天；8d：处理8天；11d：处理11天；14d：处理14天。Treatment:处理。

5)E2处理3天后，低剂量组雄鱼VTG表达水平最高，远高于未处理的雄鱼表达水平，也比雌鱼表达水平明显增高。而中剂量组和高剂量组与没有处理的雄鱼表达水平接近。结果见图2.

E2处理8天后，低剂量组，中剂量组和高剂量组均明显高于未处理组，各组水平顺序是：中剂量组<高剂量组<低剂量组，其中低剂量和高剂量组显著高于未处理的雄鱼表达水平，低剂量和高剂量组也显著高于雌鱼表达水平，而中剂量组低于雌鱼水平。结果见图3.

E2处理11天后，低剂量组，中剂量组和高剂量组比未处理雄鱼表达水平高，三个处理组表达水平顺序是：中剂量组<低剂量组<高剂量组。中剂量组低于雌鱼水平。结果见图4.

E2处理14天后，三个处理组仍然高于未处理的雄鱼组，三个组的表达水平顺序是：低剂量组<高剂量组<中剂量，可以发现中，高剂量组表达水平升高，尤其中剂量组明显升高，但是低剂量组开始明显下降，高中剂量组比雌鱼水平高，而低剂量组虽然高于未处理的雄鱼组，但比雌鱼表达水平低。结果见图5

将4个时间段不同剂量处理组放在一张图表中，我们发现低剂量组在第3天升高，第8天最高，而后逐渐下降；中剂量第8天升得最高后续逐渐下降，但是在14天它的水平是所有组别最高的。高剂量组第3天水平很低，第8天最高，11天也保持在较高水平，14天下降明显。结果见图6。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明保护范围为准。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因及克隆方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4738

<212> DNA

<213> 中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)

<400> 1

gccgccatgg cggccgcggg aattcgatta tgagagctgt tgtgcttgcc ctggctctgg 60

cccttgtggc tggacataat caaaacttgg ctccttattt tgcccccgga aatacctatg 120

tgtacaagta cgagactgag atcctgggtg gtctgcccga gcagggtctg gctagagctg 180

gatttaaact cgtcagccag gttaagatca gtgctgccgc aacaaacatg atcctgctgc 240

agcttgagaa ccctcagatc tttgagtaca gtgatgtttg gcctaaacag tcctttagcc 300

acacccgcct cactgcagcc ctggaagctc agctccaaat ccccatcaag tttgagtaca 360

acaatgggat tgtgagtaaa atccatgccc cagagagtgt cccaacactg gtgctcaaca 420

tccacagagg tgtcctcagc tttctccaaa tgaacatcaa gcaaacacag aacgtctatg 480

agctgcagga ggagggagcc cagggtgtgt gcaagaccca gtatgccatc acagaggacg 540

aaaaggctgg acgcatcctt ttgaccagga gcagaaatct aaaccactgc caggagaagg 600

tcattaagga catcgggttg gcatacacta ggacatgtat gaagtgccag gagatttcta 660

agagcctgag aggaaccaca ggatacaatt acaaactgaa ggaagttccc aatggcgtct 720

tgatcgagga ggcactcgga aatgaagtca ttcagtttac acctttccat gagctgaacg 780

gtgctgccat gatgaagact atgcaacgct tggttttcgt tcagattgct agggctccta 840

ttgtccccat taatgcagag taccgtcagc gtggttccct gaagtatgag ttctccaccg 900

agcttcttaa gacacctatc aggttcatgc agatgactga tgttagggaa cagattccag 960

aagtcctaac ccacctggtt acacacaatg aggaaagagt gcatgaagat gctcctatga 1020

attttttgaa gctgatagag ctgctgcgtg ctgccgactc tcatcaactg cgtacacagt 1080

ggaatgctta tgctagaaaa cctctctatc gccagtggtt gttggatgct atcccctaca 1140

ttgggacacg tgaagctctg gagcttgtta aggaggaact tgagaaggag gaattaagta 1200

ttccccaagc aactcagctt ttgattggat ctcttcacct gttggagcct accagtgaca 1260

tgatcaggca ggtttggaac atcattcagc agaaggcaaa tctcgctgaa gaaacaatct 1320

ttaaacgagt tgtgcgcaag accctgctcc ttggctatgg cagtttgatc cactggcact 1380

gtgctggaag ggctgagtgc catgaagaag acattcggcg cattcaggtg tattttgaca 1440

aggcctatgc ggagaaaaac attgaggaaa ttgtcctgtt gaccaaagtt atggctaatg 1500

ctgcccatcc ttggagcttt aaaactatca caaagctctt gccaattcat ggcactgatg 1560

gtcctaattt gcccagaaga gttcatgttg aagcaatctt ggccctgaag agcattgcta 1620

aactgaaggc caaggaggtc cagaatctgg ctctgcagct gtacatggac aaaactcttc 1680

accaggagct gcgtattctt gctgtcatgg tgctgtttga gaccaaacct tcaatggctg 1740

tgctgactaa tgttgtcaac actgtgaagt atgatcccag tttgccagtg gcaagcttta 1800

ctcactctct catcaagtcc ctggccagaa gcatcaatgg tgttcacacc tcagttgctg 1860

ccgagtgcaa tgttgctctt aaactcttga gccggaggac cctgaacatg aagctgagca 1920

acgctttcca catggactac tacagccatc ctttgatgct tggtactgct gccagtattt 1980

actgcatcaa cgacgctgcc actatcctcc ccaaaactgt tgtggcaaag acgagtgcct 2040

actttgctgg agttgctgct gatgtgtttg agatcaatgt cagaagtgag ggattccaag 2100

aatatttcct ccagaaagat cttaatgatg tctctgacag aatcaccaag atgaggaaca 2160

tccttaaggc tttctctaac tggaaggctc tgccagtcaa caagctcttg ggctctctgt 2220

ccatcaagat tatgggacag gaagttgcct ttgctgacat tgacaagcag gtcattgacg 2280

aagcagttaa gctttcctcc gagattgaca ttaagcagta tggtatcaac atcctccaca 2340

agctgatcca caatggcttt tccacacaca ttgttaaggc aatgctgccc actgcaatga 2400

gaaaaatcat gcccactgca gcaggtcttc ccatggagct tgccctgtac acctctgccg 2460

tgactgtagc agatgtccat gtcagtatca attccaacct gcctcagcac ttcaatcttc 2520

ctaatattct gacagcaaag atggatcttc aaagtgtgat caaacctagc attaacctga 2580

acacatttgc catcatggga gtcaacacgg atattgcaca ggcggccatg gtattaagag 2640

ccaaggtcaa tgtcagcgta cctgccaaaa tcgaagcttc tcttgacttc aaagagaaca 2700

actttaagat cagtgctctt ccagttaatc tccctgaaaa tgttgctctt ggtgtagatg 2760

ttgagactct agccattgca agatttgcca gaaggacgac acctctgatt cctgagcagg 2820

tccctaacat catgccagca tccacatcta ccgagtcatc cacccacagt tcccaggagc 2880

ggactgataa tatgcaggct cagaacaggc ttggttataa gccaaaagct gttaacaaga 2940

aattctgcgc cagtgccatt ggaatgaaaa gctgcctgaa gtttgtctct accaatgccg 3000

tctttatcag ggacagtgcc ctctacaaac tggttggaaa gcactcaatt gatctttctg 3060

tcagaccagc tgaaagtgat gtagttgaaa gattggaaat ggaagttcag ctcggaccaa 3120

acgccgccaa aaagctgatt aaacaaatca ccttggacat ggaggagatc ccgggcagcg 3180

gacctattgt atccaagctc aagagaatcc tgactcctga tctaaggaac tcctcttctt 3240

cttccagcag ctccaggtcc agggttcggc acagccctcg ctctcattcc tcctctgcct 3300

cttcgtcctc ctcttcctcc aagtctcata tcaccagcag agtcatcagt gctgtgggca 3360

agatcatcgg ggtgaggagc aagcacagaa gcagcagcag tagcagcagc agtagcagcc 3420

gaagccacaa gagccacaag tctactgtat ctagccttgg atctctgttc agcgcaagct 3480

ccagctcttc tcagtctgtt ccccactcac agcacaagag ttcacacaaa aaatttgaac 3540

caaatcatca gaagaggaca tccaagcgcc aatcaggatc tgcctccact gcaagcagtt 3600

ttgaagctat taggacacag aacaaattcc ttggcgattc cacttcccca ttttttgtca 3660

ttatcctgcg tgccatcagg gctgacaaca aactacaggg ttatcaaatc gctgcctaca 3720

aggacagagc tgaggccaga attcagatga tcatggcagc cctggctcct gaggacaact 3780

ggaagctctg cgttgatggc attgcactta gcaaaagcaa agtttctgct aaaattactt 3840

ggggagaaaa atacatgaaa tatgacacta caatcacagc tgagactggc ctcgtgcaaa 3900

caaagatggc agctcgcgtc cgagtggcct ggaagagact ccccactgcc gttgtcaaac 3960

acgtcaaaat gctctatgag cgcatccttg tcccttacct gtccagcaac tatctgcaga 4020

agagaatgga tgtcaccaag cagatctctt ttactgtcgt ggttgaatct gagaaagtgc 4080

tcaacctgat ttttaaatca cctgcatgtg tctacaggcg tgttgtgcct cttcccatcg 4140

ttctgccatg cagggagctg aaaggcctgg tgccatttga tgaagttctt gaaaatatcc 4200

gctacatact agctaagact actgcagctg agtgcagatt tgacgacggg cacattacca 4260

cttttaacca caggagatac aagaactaca tgcctaactc ctgctaccag cttctggctc 4320

aggattgcac tgacaggctc agattcatta ttttgctgaa gaaggatagt ccagaacgct 4380

acatgatcac tgtgaagatt ggtacaaagg atatcgacat gttccttgat ggacataggg 4440

tggctgttag ggtcaatgga caggaaatag ccacagacaa cctgccatac atcagagatt 4500

cagtcaagat cgatctccag gagaacaagc tcgttctctt ggcccccaag attggtattg 4560

ctgagctcca ttttagcaac agggacgtga tgcttcgtgt tttggactca atgaggaacc 4620

aagtctgtgg acttgtggaa aggctgaatc actagtgaat tcgcggccgc ctgcaggtcg 4680

accatatggg agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattcta tagttcac 4738

<210> 1

<211> 1541

<212> PRT

<213> 中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)

<400> 1

Met Arg Ala Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Ala Gly His

1 5 10 15

Asn Gln Asn Leu Ala Pro Tyr Phe Ala Pro Gly Asn Thr Tyr Val Tyr

20 25 30

Lys Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Gly Gly Leu Pro Glu Gln Gly Leu Ala

35 40 45

Arg Ala Gly Phe Lys Leu Val Ser Gln Val Lys Ile Ser Ala Ala Ala

50 55 60

Thr Asn Met Ile Leu Leu Gln Leu Glu Asn Pro Gln Ile Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Ser Asp Val Trp Pro Lys Gln Ser Phe Ser His Thr Arg Leu Thr Ala

85 90 95

Ala Leu Glu Ala Gln Leu Gln Ile Pro Ile Lys Phe Glu Tyr Asn Asn

100 105 110

Gly Ile Val Ser Lys Ile His Ala Pro Glu Ser Val Pro Thr Leu Val

115 120 125

Leu Asn Ile His Arg Gly Val Leu Ser Phe Leu Gln Met Asn Ile Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Asn Val Tyr Glu Leu Gln Glu Glu Gly Ala Gln Gly Val

145 150 155 160

Cys Lys Thr Gln Tyr Ala Ile Thr Glu Asp Glu Lys Ala Gly Arg Ile

165 170 175

Leu Leu Thr Arg Ser Arg Asn Leu Asn His Cys Gln Glu Lys Val Ile

180 185 190

Lys Asp Ile Gly Leu Ala Tyr Thr Arg Thr Cys Met Lys Cys Gln Glu

195 200 205

Ile Ser Lys Ser Leu Arg Gly Thr Thr Gly Tyr Asn Tyr Lys Leu Lys

210 215 220

Glu Val Pro Asn Gly Val Leu Ile Glu Glu Ala Leu Gly Asn Glu Val

225 230 235 240

Ile Gln Phe Thr Pro Phe His Glu Leu Asn Gly Ala Ala Met Met Lys

245 250 255

Thr Met Gln Arg Leu Val Phe Val Gln Ile Ala Arg Ala Pro Ile Val

260 265 270

Pro Ile Asn Ala Glu Tyr Arg Gln Arg Gly Ser Leu Lys Tyr Glu Phe

275 280 285

Ser Thr Glu Leu Leu Lys Thr Pro Ile Arg Phe Met Gln Met Thr Asp

290 295 300

Val Arg Glu Gln Ile Pro Glu Val Leu Thr His Leu Val Thr His Asn

305 310 315 320

Glu Glu Arg Val His Glu Asp Ala Pro Met Asn Phe Leu Lys Leu Ile

325 330 335

Glu Leu Leu Arg Ala Ala Asp Ser His Gln Leu Arg Thr Gln Trp Asn

340 345 350

Ala Tyr Ala Arg Lys Pro Leu Tyr Arg Gln Trp Leu Leu Asp Ala Ile

355 360 365

Pro Tyr Ile Gly Thr Arg Glu Ala Leu Glu Leu Val Lys Glu Glu Leu

370 375 380

Glu Lys Glu Glu Leu Ser Ile Pro Gln Ala Thr Gln Leu Leu Ile Gly

385 390 395 400

Ser Leu His Leu Leu Glu Pro Thr Ser Asp Met Ile Arg Gln Val Trp

405 410 415

Asn Ile Ile Gln Gln Lys Ala Asn Leu Ala Glu Glu Thr Ile Phe Lys

420 425 430

Arg Val Val Arg Lys Thr Leu Leu Leu Gly Tyr Gly Ser Leu Ile His

435 440 445

Trp His Cys Ala Gly Arg Ala Glu Cys His Glu Glu Asp Ile Arg Arg

450 455 460

Ile Gln Val Tyr Phe Asp Lys Ala Tyr Ala Glu Lys Asn Ile Glu Glu

465 470 475 480

Ile Val Leu Leu Thr Lys Val Met Ala Asn Ala Ala His Pro Trp Ser

485 490 495

Phe Lys Thr Ile Thr Lys Leu Leu Pro Ile His Gly Thr Asp Gly Pro

500 505 510

Asn Leu Pro Arg Arg Val His Val Glu Ala Ile Leu Ala Leu Lys Ser

515 520 525

Ile Ala Lys Leu Lys Ala Lys Glu Val Gln Asn Leu Ala Leu Gln Leu

530 535 540

Tyr Met Asp Lys Thr Leu His Gln Glu Leu Arg Ile Leu Ala Val Met

545 550 555 560

Val Leu Phe Glu Thr Lys Pro Ser Met Ala Val Leu Thr Asn Val Val

565 570 575

Asn Thr Val Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Pro Val Ala Ser Phe Thr His

580 585 590

Ser Leu Ile Lys Ser Leu Ala Arg Ser Ile Asn Gly Val His Thr Ser

595 600 605

Val Ala Ala Glu Cys Asn Val Ala Leu Lys Leu Leu Ser Arg Arg Thr

610 615 620

Leu Asn Met Lys Leu Ser Asn Ala Phe His Met Asp Tyr Tyr Ser His

625 630 635 640

Pro Leu Met Leu Gly Thr Ala Ala Ser Ile Tyr Cys Ile Asn Asp Ala

645 650 655

Ala Thr Ile Leu Pro Lys Thr Val Val Ala Lys Thr Ser Ala Tyr Phe

660 665 670

Ala Gly Val Ala Ala Asp Val Phe Glu Ile Asn Val Arg Ser Glu Gly

675 680 685

Phe Gln Glu Tyr Phe Leu Gln Lys Asp Leu Asn Asp Val Ser Asp Arg

690 695 700

Ile Thr Lys Met Arg Asn Ile Leu Lys Ala Phe Ser Asn Trp Lys Ala

705 710 715 720

Leu Pro Val Asn Lys Leu Leu Gly Ser Leu Ser Ile Lys Ile Met Gly

725 730 735

Gln Glu Val Ala Phe Ala Asp Ile Asp Lys Gln Val Ile Asp Glu Ala

740 745 750

Val Lys Leu Ser Ser Glu Ile Asp Ile Lys Gln Tyr Gly Ile Asn Ile

755 760 765

Leu His Lys Leu Ile His Asn Gly Phe Ser Thr His Ile Val Lys Ala

770 775 780

Met Leu Pro Thr Ala Met Arg Lys Ile Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu

785 790 795 800

Pro Met Glu Leu Ala Leu Tyr Thr Ser Ala Val Thr Val Ala Asp Val

805 810 815

His Val Ser Ile Asn Ser Asn Leu Pro Gln His Phe Asn Leu Pro Asn

820 825 830

Ile Leu Thr Ala Lys Met Asp Leu Gln Ser Val Ile Lys Pro Ser Ile

835 840 845

Asn Leu Asn Thr Phe Ala Ile Met Gly Val Asn Thr Asp Ile Ala Gln

850 855 860

Ala Ala Met Val Leu Arg Ala Lys Val Asn Val Ser Val Pro Ala Lys

865 870 875 880

Ile Glu Ala Ser Leu Asp Phe Lys Glu Asn Asn Phe Lys Ile Ser Ala

885 890 895

Leu Pro Val Asn Leu Pro Glu Asn Val Ala Leu Gly Val Asp Val Glu

900 905 910

Thr Leu Ala Ile Ala Arg Phe Ala Arg Arg Thr Thr Pro Leu Ile Pro

915 920 925

Glu Gln Val Pro Asn Ile Met Pro Ala Ser Thr Ser Thr Glu Ser Ser

930 935 940

Thr His Ser Ser Gln Glu Arg Thr Asp Asn Met Gln Ala Gln Asn Arg

945 950 955 960

Leu Gly Tyr Lys Pro Lys Ala Val Asn Lys Lys Phe Cys Ala Ser Ala

965 970 975

Ile Gly Met Lys Ser Cys Leu Lys Phe Val Ser Thr Asn Ala Val Phe

980 985 990

Ile Arg Asp Ser Ala Leu Tyr Lys Leu Val Gly Lys His Ser Ile Asp

995 1000 1005

Leu Ser Val Arg Pro Ala Glu Ser Asp Val Val Glu Arg Leu Glu Met

1010 1015 1020

Glu Val Gln Leu Gly Pro Asn Ala Ala Lys Lys Leu Ile Lys Gln Ile

1025 1030 1035 1040

Thr Leu Asp Met Glu Glu Ile Pro Gly Ser Gly Pro Ile Val Ser Lys

1045 1050 1055

Leu Lys Arg Ile Leu Thr Pro Asp Leu Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ser

1060 1065 1070

Ser Ser Ser Arg Ser Arg Val Arg His Ser Pro Arg Ser His Ser Ser

1075 1080 1085

Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser His Ile Thr Ser Arg

1090 1095 1100

Val Ile Ser Ala Val Gly Lys Ile Ile Gly Val Arg Ser Lys His Arg

1105 1110 1115 1120

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser His Lys Ser His

1125 1130 1135

Lys Ser Thr Val Ser Ser Leu Gly Ser Leu Phe Ser Ala Ser Ser Ser

1140 1145 1150

Ser Ser Gln Ser Val Pro His Ser Gln His Lys Ser Ser His Lys Lys

1155 1160 1165

Phe Glu Pro Asn His Gln Lys Arg Thr Ser Lys Arg Gln Ser Gly Ser

1170 1175 1180

Ala Ser Thr Ala Ser Ser Phe Glu Ala Ile Arg Thr Gln Asn Lys Phe

1185 1190 1195 1200

Leu Gly Asp Ser Thr Ser Pro Phe Phe Val Ile Ile Leu Arg Ala Ile

1205 1210 1215

Arg Ala Asp Asn Lys Leu Gln Gly Tyr Gln Ile Ala Ala Tyr Lys Asp

1220 1225 1230

Arg Ala Glu Ala Arg Ile Gln Met Ile Met Ala Ala Leu Ala Pro Glu

1235 1240 1245

Asp Asn Trp Lys Leu Cys Val Asp Gly Ile Ala Leu Ser Lys Ser Lys

1250 1255 1260

Val Ser Ala Lys Ile Thr Trp Gly Glu Lys Tyr Met Lys Tyr Asp Thr

1265 1270 1275 1280

Thr Ile Thr Ala Glu Thr Gly Leu Val Gln Thr Lys Met Ala Ala Arg

1285 1290 1295

Val Arg Val Ala Trp Lys Arg Leu Pro Thr Ala Val Val Lys His Val

1300 1305 1310

Lys Met Leu Tyr Glu Arg Ile Leu Val Pro Tyr Leu Ser Ser Asn Tyr

1315 1320 1325

Leu Gln Lys Arg Met Asp Val Thr Lys Gln Ile Ser Phe Thr Val Val

1330 1335 1340

Val Glu Ser Glu Lys Val Leu Asn Leu Ile Phe Lys Ser Pro Ala Cys

1345 1350 1355 1360

Val Tyr Arg Arg Val Val Pro Leu Pro Ile Val Leu Pro Cys Arg Glu

1365 1370 1375

Leu Lys Gly Leu Val Pro Phe Asp Glu Val Leu Glu Asn Ile Arg Tyr

1380 1385 1390

Ile Leu Ala Lys Thr Thr Ala Ala Glu Cys Arg Phe Asp Asp Gly His

1395 1400 1405

Ile Thr Thr Phe Asn His Arg Arg Tyr Lys Asn Tyr Met Pro Asn Ser

1410 1415 1420

Cys Tyr Gln Leu Leu Ala Gln Asp Cys Thr Asp Arg Leu Arg Phe Ile

1425 1430 1435 1440

Ile Leu Leu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Arg Tyr Met Ile Thr Val Lys

1445 1450 1455

Ile Gly Thr Lys Asp Ile Asp Met Phe Leu Asp Gly His Arg Val Ala

1460 1465 1470

Val Arg Val Asn Gly Gln Glu Ile Ala Thr Asp Asn Leu Pro Tyr Ile

1475 1480 1485

Arg Asp Ser Val Lys Ile Asp Leu Gln Glu Asn Lys Leu Val Leu Leu

1490 1495 1500

Ala Pro Lys Ile Gly Ile Ala Glu Leu His Phe Ser Asn Arg Asp Val

1505 1510 1515 1520

Met Leu Arg Val Leu Asp Ser Met Arg Asn Gln Val Cys Gly Leu Val

1525 1530 1535

Glu Arg Leu Asn His

1540

Claims

1.中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示基因序列。

2.根据权利要求1所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，其特征在于编码中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因的氨基酸吸料如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，其特征在于，所述中华乌塘鳢Vtg基因的基因序列最大开放阅读框如SEQ ID NO.1中第30位～第4626位所示。

4.根据权利要求1所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因，其特征在于，所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因在表达水平作为环境雌激素污染标记物以及无污染状态下的性别判断中的用途。

5.中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因的克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S4、根据S2-S3的序列获得Vtg基因全长序列。

6.根据权利要求5所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤S2中，设计引物为：

Vg-CDS-F：ATGAGAGYNGTTGTRCTWGC；

Vg-CDS-R：CAGCCTTTCCACAAGWCCAC

所述步骤S3中，Vtg基因对应的RACE引物为：

VG51：GGTAGGCTCCAACAGGTGAAGA

VG52：TTGATGAGAGTCGGCAGCACG

VG31：ACTGGAAGCTCTGCGTTGATGG

VG32：TTGACGACGGGCACATTACCAC

其对应位置分别为：

VG51：1232—1253bp

VG52：1047—1067bp

VG31：3778—3799bp

VG32：4239—4261bp

所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因及内参基因Vtg、Actin的mRNA的qPCR引物分别如下：

F：GACATCGGGTTGGCATACAC

R:TTCATTTCCGAGTGCCTCCT

内参β-Actin引物：

F：GGAAGGTGGACAGAGAAGCC

R：TGCTGACAGGATGCAGAAGG。

7.根据权利要求1所述中华乌塘鳢卵黄蛋白原全长基因在基于qPCR方法分析中华乌塘鳢卵黄蛋白原基因在激素诱导下表达谱的变化分析中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在步骤3)中，所述将qPCR模板进行qPCR扩增，PCR扩增反应体系的反应条件为：

第一阶段预变性：92-95℃/3min；

第二阶段：92-95℃/5-10s，55-60℃/15-20s，68-72℃/10-15s；

共40-45个循环。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，该方法应用于所有卵生生物的环境雌激素污染检测以及相应的雌雄鱼VTG的表达差异。