CN106834451A - 基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用；根据RACE方法得到VTGAb全长序列；梯度雌激素注射金钱鱼后采样提取肝脏RNA；RT实时定量PCR法检测VTGAb的表达，并以EF1‑a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体后采样提取肝脏RNA，检测VTGAb的表达量，与检测体系进行对比，进而分析水样的环境雌激素污染程度。本发明能够在经济损耗较小的情况下测得环境激素的污染情况，并且控制金钱鱼单一变量，可用于海水，河流入海口和盐水内湖水样的环境雌激素污染程度。

Description

基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用

技术领域

本发明属于分子生物学及环境污染检测领域，具体涉及一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用。

背景技术

针对环境雌激素的污染问题主要采用化学检测的方法，如液相色谱和质谱联用法(HPLC-MS)等。这些方法的优点是灵敏度高，但这些方法所需的分析仪器价格昂贵，成本非常高，难以进行推广和普及。另外，这些方法对样品的要求较高。环境样品与一般样品不同，具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度低于现有方法的检出限或者样品复杂，机体干扰严重的情况下，直接测定是不可能的。与化学方法相比，生物检测可以避开成分检测，直接分析污染样品引起的生物学效应，可更直观的反映环境污染的危害程度。但目前的生物检测法尚处于初始发展阶段，极少有海水小型模式动物运用生物学检测。因而有必要开发基于海水生物活体模型的检测技术，从海水的综合生物学和毒理学活性来直接评估海水污染的健康危害程度。

海洋环境雌激素活体检测模型具有以下优势：1)体型较小，耐受力较强，可在实验室大规模饲养；2)雌鱼产卵量大，世代周期短，繁殖代数多；3)对盐度的适应范围宽泛，可开发成有别于淡水斑马鱼模型的活体检测模型，在各种盐度的环境条件下进行推广应用。

鱼类卵黄蛋白原特异性产生于雌性动物肝脏中，正常条件下，雄鱼和幼鱼体内很难检测到表达，但在雌激素暴露下，雄性和幼鱼也会产生应激而表达卵黄蛋白原。因而，雄鱼或幼鱼卵黄蛋白原的诱导可以指示环境中雌激素污染(Sumpter，J.P.and Jobling，S.Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquaticenvironment.Environ Health Perspect)。

目前国内外已针对卵黄蛋白原开发出类雌激素检测方法，但所选择的鱼类模型均为淡水鱼类，包括鲤科和鲟科鱼类(如专利公开号：CN101519650和CN1763090)。通过查阅文献(中国期刊网、中华人民共和国专利局专利检索、Science Direct、ISI Web of Science、Springer Journal、NCBI，等)，海水鱼类用于环境雌激素的检测方面的专利报道较少。选用的鱼类存活的水域有限，如海水和淡水要选用不同的鱼，不能广泛应用于海水淡水的水体，需要建立多个检测标准才能够初步了解污染浓度的区间，

此外，现有的技术检测使用的定量方法为相对定量，无法准确估算出水体污染浓度的准确区间。同时现有技术下关于活体鱼同时可测海水淡水激素污染情况的研究较少，现有技术也没有对雌激素污染后的鱼进行梯度的采样时间，确定雌激素最佳检测时间点，若在体内基因全部合成蛋白后，再进行定量，则结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用。本发明实质是提供了一种检测各盐度条件下的环境雌激素污染的检测技术，并运用于海域的环境雌激素污染检测。本发明首次将金钱鱼(Scatophagus argus)作为该项技术的鱼类活体模型。方法上采用实时荧光定量PCR方法，检测幼鱼在环境样品注射后，卵黄蛋白原(vitellogenin，VTGAb)mRNA表达水平的变化情况，进而指示样品的雌激素污染。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、采用简并引物方法设计引物得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb部分序列，再根据RACE方法得到VTGAb全长氨基酸序列；

S2、根据克隆的到的VTGAb全长的菌液提取质粒，根据片段长度和质粒浓度计算拷贝数后视为原液；将原液梯度稀释后使用VTGAb和EF1-a荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR后得出标准曲线图；

S3、选择未性成熟的金钱鱼，进行梯度雌激素注射，在不同时间点采样提取肝脏RNA，使用罗氏反转录试剂盒反转cDNA；

S4、以步骤S2获得的标准曲线图作为标准曲线，采用SYBR实时定量PCR方法检测VTGAb的表达，并以EF1-a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；

S5、将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体中48～72h时采样提取肝脏RNA，反转为cDNA，根据步骤S4的方法以步骤S2建立的标准曲线图为标准曲线，以EF1-a为内参基因对待测样品进行荧光定量PCR检测VTGAb的表达量并分析VTGAb的表达水平，所得结果可与检测体系对比，得出雌激素大致的污染浓度区间，分析水样的环境雌激素污染程度。

优选地，步骤S1中，VTGAb简并引物对序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

优选地，步骤S1中，VTGAb全长引物对序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

优选地，步骤S2中，VTGAb荧光定量定量PCR引物对序列如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示。

优选地，步骤S2中，EF1-a荧光定量PCR引物对序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

优选地，步骤S2中，PCR反应为二步法反应程序：95℃30秒预变性，95℃5秒变性，60℃34秒复性、延伸和收集荧光信号，共40个循环。

优选地，步骤S3中，所述雌激素为类固醇类环境雌激素。

优选地，步骤S3中，所述梯度雌激素注射指的是分别注射10、100、1000、1000ug/kg雌激素。

优选地，步骤S3中，所述不同时间点为24h、48h、72h和96h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、现有技术下还没有完整的金钱鱼卵黄蛋白原的基因序列，本发明具有金钱鱼卵黄蛋白原基因的序列全长；

2、金钱鱼属于广盐性鱼类，在海水淡水中皆可生存，仅建立起一套检验体系即可广泛用于水体雌激素的含量检测；

3、目前检测手段中还没有激素处理后卵黄蛋白原的绝对定量，本发明将解决外源性雌激素处理后的肝组织中卵黄蛋白原基因的绝对定量，可以初步了解水体感染激素的浓度区间；

4、使用本发明的方案，能够在经济损耗较小的情况下测得环境激素的污染情况，并且控制金钱鱼单一变量，可用于海水，河流入海口和盐水内湖水样的环境雌激素污染程度；根梯度采样时间检测结果，可知卵黄蛋白原基因的变化时间规律，利于掌握使用金钱鱼检测水样污染的采样时间，避免错过雌激素表达的最佳检测时间；

5、在经济上，水产养殖中，首先取幼鱼或雄鱼测得卵黄蛋白原含量，确定是否有环境污染；在无环境污染的前提下，可检测雌鱼的卵黄蛋白原含量来预测雌鱼的成熟度，有利于把握繁殖育种。

附图说明

图1为金钱鱼卵黄蛋白原全长克隆得到的全长电泳图，左侧为5000bp的marker；

图2为实时定量PCR所获得的梯度标准曲线；

图3为定量中溶解曲线；表示PCR体系具有良好的特异性；

图4为雌激素梯度注射后在24h/48h/72h/96h卵黄蛋白原的表达水平示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

本实施例选用广盐性金钱鱼作为活体模型，建立了一种针对卵黄蛋白原的活体环境雌激素检测技术；具体涉及一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用。

具体步骤如下：

1)本发明选择适应能力强的广盐性动物金钱鱼(Scatophagus argus)作为活体模型，采用RACE技术，克隆获得金钱鱼卵黄蛋白原基因的cDNA全长序列；具体为：采用简并引物方法设计引物得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb部分序列，再根据RACE方法得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb全长氨基酸序列，由全长克隆得到的电泳图如图1可知，卵黄蛋白原序列全长约为5000bp，设计引物如下：

VTGAb简并引物：

F：5’-TTCTKGAGKTYGGAGYSMGADCTG-3’；(SEQ ID NO.1)

R：5’-GCAGCWGYRAGRYCYTCMACATYT-3’；(SEQ ID NO.2)

VTGAb全长引物：

F：5’-ATGGGGACATTCACCAGCCATGAGGGT-3’；(SEQ ID NO.3)

R：5’-GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG-3’；(SEQ ID NO.4)

2)运用生物信息学软件进行氨基酸序列同源性分析；根据卵黄蛋白原(VTGAb)和EF1-a编码基因序列，设计VTGAb荧光定量PCR引物(序列为：F：5’-ATTCCCATTGACCTGCCAAG-3’(SEQ ID NO.5)；R：5’-AAAGCGGCATTGCGAGATTC-3’(SEQ ID NO.6))和内参基因EF1-a荧光定量PCR引物(序列为F：5’-TGTGAAGCAGCTCATCGTTG-3’(SEQ ID NO.7)；R：5’-ATGTAGGTGCTCACTTCCTTGG-3’(SEQ ID NO.8))；由图3可知引物具有良好的特异性。

进一步优化PCR反应体系(表1)，最终确定为二步法反应程序：95℃30秒预变性，95℃5秒变性，60℃34秒复性、延伸和收集荧光信号，共40个循环。

表1：实时定量PCR反应体系

试剂	使用量
		SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2X)	10.0μL
PCR上游引物(5μM)	0.4μL
		PCR下游引物(5μM)	0.4μL
ROX Reference DyeII(50X)*2	0.4μL
		DNA模板	1.0μL
dH20	7.8μL
		总量	20.0μL

3)根据克隆全长的菌液，使用LB液体培养基进行摇菌(接种比例为：1∶100)培养后抽质粒，取全长克隆的未稀释的质粒作为板间对照IAC，控制96孔板之间的差异变化。梯度稀释质粒后分别使用VT6Ab和EF1-a定量引物进行RT-PCR检测，所获得的数值构成的曲线如图2，作为后续检测的标准曲线。即根据反应体系(表1)采样所得的cDNA定量实验后所获得的拷贝数，对应标准曲线上的浓度即可换算出水体雌激素污染的浓度区间。根据实验可得采样时间为72h为最佳时间。

4)对未性成熟的金钱雄鱼进行10、100、1000、1000ug/kg17-α-雌二醇(EE2)注射，摸索合适的时间(24h，48h、72h和96h)采集肝脏样本；并注射雌激素溶剂无水乙醇作为空白对照；

5)使用trizol法提取肝脏mRNA，使用罗氏反转试剂盒反转得到肝组织的cDNA；

6)以图2作为标准曲线，采用SYBR实时定量PCR方法检测卵黄蛋白原(vitellogenin，VT6Ab)的表达，并以EF1-a核糖体RNA(EF1-a)为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立了VT6Ab转录水平的检测体系；(即此检测体系是建立在图2的前提下建立的，没有图2即不成立此检测体系)

7)定量分析：根据标准曲线获得的实时定量PCR中目的基因的量值计算，计算方法如下：

根据计算所得的终值做图得图4。

8)在具体实行时，将待测鱼的样品的肝脏cDNA(通过将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体中48～72h时(根据图4得最佳采样时间)采样提取肝脏RNA，反转为cDNA)使用荧光定量引物进行荧光定量PCR(根据步骤s4的方法以步骤s2建立的标准曲线图为标准曲线，以EF1-a为内参基因对待测样品进行荧光定量PCR检测VTGAb的表达量并分析VTGAb的表达水平)，得到的内参基因与目的基因的倍数关系，参照检测体系(图4)可知大致污染区间。也可进一步确定更准确范围区间：根据目的基因荧光定量的CT值对照图2标准曲线得出。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VTGAb 简并正向引物

<400> 1

Thr Thr Cys Thr Lys Gly Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Gly Ala Gly Tyr

1 5 10 15

Ser Met Gly Ala Asp Cys Thr Gly

20

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VTGAb 简并反向引物

<400> 2

Gly Cys Ala Gly Cys Trp Gly Tyr Arg Ala Gly Arg Tyr Cys Tyr Thr

1 5 10 15

Cys Met Ala Cys Ala Thr Tyr Thr

20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VTGAb 全长正向引物

<400> 3

atggggacat tcaccagcca tgagggt 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VTGAb 全长反向引物

<400> 4

gggcaagcag tggtatcaac gcagag 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VTGAb 荧光定量PCR正向引物

<400> 5

attcccattg acctgccaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VTGAb 荧光定量PCR反向引物

<400> 6

aaagcggcat tgcgagattc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EF1-a 荧光定量PCR正向引物

<400> 7

tgtgaagcag ctcatcgttg 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EF1-a 荧光定量PCR反向引物

<400> 8

atgtaggtgc tcacttcctt gg 22

<210> 9

<211> 5346

<212> DNA

<213> Scatophagus argus

<400> 9

atggggacat tcaccagcca tgagggtgct tgtactagct cttgctgtgg cccttacagc 60

gggttaccag gtcagctttg ctccagaatt tgctgctgga aggacttacg tgtacaaata 120

tgaagcattt ctgatgggcg gcctgcctga agagggtctg gcacgtgctg gtgtaaaagt 180

tcgaagcaaa gttttcatca gtgcatcatc tgctgacacc ttcatgctca agcttgtaga 240

gcctgaaatc tttgagtata gcggtatctg gcccaaagat gctttcatcc cagcctccaa 300

gctcacctca gctctggctg ctcagctact gaccccaatc aagtttgagt atgctaatgg 360

tgtcgttggc aaagtgtttg caccagctgg tgtctctgca actgtgctga atatctacag 420

aggaatcctc aacatcttcc agttgaacat caagaagact caaaatgtct atgagctgca 480

agagcctgga gctcagggtg tgtgtatgac ccactacgtc atcagtgagg atgcaaaggc 540

tgaccgcatc gtgctgacca agaccaaaga catgaaccgc tgtcaggaga gaatttttaa 600

ggacattggc ttggcttaca cagagagatg tgttgagtgt gaggctagag gaaagacctt 660

gaagggagct gctgctttta actacatcat gaaaccggca gctacaggtt ctttgatcct 720

ggaggcaact gctacagagg tcatccagtt ctcacctttc aacatcttga acggcgctgc 780

ccagatggag gctaaacaaa tccttacctt tgtggaggtt gcgaagaccc cagtgcatcc 840

catcagtgct gaatatcttc atcgtggatc cctgcagtat gagtttggca gtgaactcct 900

tcaaacaccc atccagcttc tgaggatcag caatgctgag gctcagattg ttgagattct 960

gaaccacctg gtgaccttca atctagccaa ggtccatgaa gatgcccctc tgaaatttat 1020

tgagctcgtc cagctgctgc gtgtggccag atttgagagt attgaggctc tctggactca 1080

gttcaaagca cgagcagatt acaggcactg gatcctgaat gctgtccctg ccattggtac 1140

tcatgctact ctgaggttca tcaaggagaa gttccttgct ggtgagctga ctattgctga 1200

agctgctcaa gccctgctgg catctgtgca catggtgaca gctgacctgg aggccatcag 1260

gcttgctgag ggcctggcca tgcaccacaa gatccaagca aacccggttc tgcgtgagat 1320

tgccatgttg ggctatggta ccctggttgc taagttctgt gcagagaacc caacttgccc 1380

agctgagtta gtgaggccga tccatgaact tgctgtccag gctgttgcca gaggtgaaat 1440

tgaggcactc gttctcgccc tcaaagtcct aggtaatgct ggacatcctg ctagccttaa 1500

gccaatcatg aagctcctgc ctggctttgg cacggctggt gccagtctgc cgcacagagt 1560

tcacattgat accgccctgg ccctgaggaa cattgccaaa agggagccca agatggtcca 1620

ggaaatagct gttcagctgt tcatggacaa ggctctccac ccagagctcc gtatggctgc 1680

tgctatcatc ttgtttgaga ccaagctgcc catgggtctg gtgactactc ttgctgatgc 1740

cctcttgaaa gaagcaaatc tgcaggtcgc tagctttgtc tactcttaca tgaaggccat 1800

gaccaagaac actgcccctg actttgcctc tgttgctgct gcctgcaacg ttgctgtgaa 1860

gatccttagc cccaaattcg acagactgag ctaccgctac agcagagctt tctattttga 1920

tgcctaccaa aacccctgga tgatgggtgc tgctgccagt gccttctaca ttaatgatgc 1980

tgcaactgtt atgccaaaag cctttgtggc caaagctcgc acctacctgg caggagctta 2040

tgctgatgtt tttgagtttg gagtgagagc tgagggtgtc caggaggccc tcctgaagca 2100

ccaagaagct catgagaatg ttgacaggat cgccaagatg aaacaagtca tgaaggctct 2160

ttccgagtgg agggctaatc cctcaagccc gcccctggcc tctgtgtatg tgaagttctt 2220

tggacaggaa attgcatttg ccaacatcga caaagcaatc gttgatcaga ttattgagct 2280

tgccagtgga ccagcagttc acacttatgg caggaaggtt ttggatgctg tgctgtctgg 2340

ttttgcattt cattatgcta aaccaatgct ggttgctgag gttcgccgca tccttcccac 2400

agctgttggt ctgcccatgg agctcagttt ctatactgct gcagtggctg ctgcatctgt 2460

cgaactccaa gccactgtgt caccacctct gcctgagaac ttccatgctg cccagtttct 2520

gaagtctgat atcagcatga gggctgccat ttctccaagt gtctccatgc acacctatgc 2580

agttatggga gtgaatactg ctttcatcca agctgccctt ctatcaagag ccagagttta 2640

cacaatcgtt cctgcaaaga ttgaagcaag aattgacatg atcaagggca acttcaagtt 2700

tcagttcttt cctgttcagg gcgttgataa gattgcatct gcactcgttg agactttcgc 2760

tgttgcaaga aatgtggaag acctggcagc tgccaagttc acaccagtga ttccaacaga 2820

acctgcaact cagctgtcaa gggcggcttc taggatggca tactctctgg ctggtgaaat 2880

gtcagcatca tctgaaatca ttcccattga cctgccaaga aaaattgtga gcaaactgaa 2940

attccccaag gcctttgaga agaaaatgtg tgcagcattt gaaactcttg gaatcaaagc 3000

atgcacagag attgaatctc gcaatgccgc tttcatcaga gactgcccac tctacgccat 3060

tattggaaag catgctgtct cggttgaagt tgctccagcg gctggaccag tcattgagaa 3120

gattgaaatt gagattcagg taggagataa agcagctgaa aaaatcctca aggtgattaa 3180

cctgagcgaa gaagaggaaa ttcttgagga caggaacgtg ttgatgaaac tcaagaaaat 3240

cttggttcct ggtctgaaga acaggacatc agcttcctcc agctccagca gctctcgttc 3300

cattagctcc atctccagca gctcccgttc aagcctctcc tctgctgcat catccctctc 3360

tagctcctcc tctcgcagta agagcaagat ggttgatgtt gttgctgccg tcagcaagac 3420

atcaaagaga gtaagcagca ttttcagcgg ctcctccagc agtagatcaa gccttcgctc 3480

aaagagctcc tccagcagtg cttcaagcag ccgctcatct ctcctttcca gcagccgctc 3540

ttccagctcc agcttgtcta gatccagtgc cctgtccaag tatgaaatga agtttaccaa 3600

aaaccatatc catcagcatg ccctctccac agcacgagcc aacagcaaga gcagtgccta 3660

cagcttcgaa gctatctaca acaaggccaa atatcttgct aatgctgtca cccctgctgt 3720

gaccattctc atccgtgctg tgagagctga ccacaaggtt caaggatacc agattgcagc 3780

ttactttgac agagctactg ccagagtgca ggtcattttt gccaacttgg ccgagaatga 3840

ccatttcaga atctgcgctg atggtgtgat gctgagctac cacaaactga tggccaaggt 3900

cgcctggggc atcgagtgca aacaatacca gactgaaatc atagctgaga ctggtcttgt 3960

tggtcaagag cctgcgttac gcctgaagct gacctgggac aaacttccaa agagcatgaa 4020

acgctacgca aagcagcttt ctgagtacat ttctcgcatt gcttgggaaa ctggagtaaa 4080

cctggtaaag gtcaagaatg ctcgtaatca gatcaaactg agtgtagctg ttgcttctga 4140

gacaagcctc aatgttgtgc tgaagacacc aaagaggacc atttacaaac ttggtgtggg 4200

tctcccaatc tctctgccat tcggagatac tgctgccgaa atggaaacat accagagcaa 4260

ctgggctgac aaaatttcct acatgatcac gaaggcccat gcagctgaat gcaccatggt 4320

taaagacaca ctgatcacat tcaacaacag gaaatataag aacgagatgc cccactcttg 4380

ctaccaggtt ttggctcagg attgcaccca agaacttaaa ttcatggttc tattgaagag 4440

ggaccaaaca caggaacaga accagatcaa tgtgaagatt gctgacattg atgttgacat 4500

gtatccgaag gataatgtta tcatggtgaa ggttaatgga gtcgaaatcc cactcagcaa 4560

cctgccatat cagcatccca caggcaaaat tcagatcaga cagagaggtg agggcatcac 4620

tctccatgct cccagccatg gtcttcagga ggtctatttt gatctgaacg cactgaaggt 4680

taaagttgtg gactggatga gaggacagac ttgtggtctc tgtggaaggg ctgatgggga 4740

agtcagacag gagtaccgca cacccaacaa acgcttcacc aagaacgcag tcagctacgc 4800

tcattcctgg gttctgcctg gaaagagctg ccgtgatgct tctgagtgtt acataaagct 4860

tgagtctgtg aagttagaga aacagattga cctccatggc caggactcaa aatgctactc 4920

tgttgagcct gtgctgcgct gtctgcccgg atgcgtgcca gtgaggacca ccaacgttta 4980

tattggctac cactgcgtac ctgctgattc taacgtgaac cgttctgagg gtctcagcag 5040

catctttgag aagagtgttg acctgagaga atcagctgaa gcccacctgg cctgtcgctg 5100

cactgctcag tgcgcttaat gccttaatta cttcaatcat gttttagtct ttgtttcata 5160

aaaacattgt taattgttgt ttggactgta aatctgaata aacatcagga gcacaaaaaa 5220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtactctg cgttgatacc actgcttgcc ctatagtgag 5280

tcgtattaga atcactagtg aattcgcggc cgcctgcagg tcgaccatat gggagagctc 5340

ccaacg 5346

Claims (9)

1.一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、采用简并引物方法设计引物得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb部分序列，再根据RACE方法得到VTGAb全长氨基酸序列；

S2、根据克隆得到的VTGAb全长的菌液提取质粒，根据片段长度和质粒浓度计算拷贝数后视为原液，将原液梯度稀释后使用VTGAb和EF1-a荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR后得到曲线图；

S3、选择未性成熟的金钱鱼，进行梯度雌激素注射，在不同时间点采样提取肝脏RNA，使用罗氏反转录试剂盒反转cDNA；

S4、以步骤S2获得的曲线图作为标准曲线，采用SYBR实时定量PCR方法检测VTGAb的表达，并以EF1-a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；

S5、将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体中48～72h时(采样提取肝脏RNA，反转为cDNA，根据步骤S4的方法以EF1-a为内参基因对待测样品进行荧光定量PCR检测VTGAb的表达量并分析VTGAb的表达水平，所得结果与步骤S4的检测体系对比，得出雌激素的污染浓度区间，进而分析水样的环境雌激素污染程度。

2.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S1中，VTGAb简并引物对序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S1中，VTGAb全长引物对序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S2中，VTGAb荧光定量PCR引物对序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S2中，EF1-a荧光定量PCR引物对序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S2中，PCR反应为二步法反应程序：95℃30秒预变性，95℃5秒变性，60℃34秒复性、延伸和收集荧光信号，共40个循环。

7.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S3中，所述雌激素为类固醇类环境雌激素。

8.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S3中，所述梯度雌激素注射指的是分别注射10、100、1000、1000ug/kg雌激素。

9.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S3中，所述不同时间点为24h、48h、72h和96h。