CN105177123B - 锌铜超氧化物歧化酶sod1表达量的分子检测方法及引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法及所用的引物，正向引物序列见序列1，反向引物序列见序列2。本发明提供一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法，首次用qPCR的方法，以基因水平的检测来鉴定SOD1的含量，同时提供一套有针对性引物序列和内参序列，即使在样品提取的RNA中有DNA污染的情况下，也可以稳定、特异、准确的检测出人的不同组织、细胞中SOD1基因的表达量差异，且有极高的重复性，克服了市场上常用酶活检测试剂盒的人为因素影响大、稳定性差、重复性差等因素。

Description

锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法及引物
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种体外基因分子诊断方法，尤其是一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法及所用的引物。
技术背景
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase简称SOD)是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶，是人体内的垃圾清道夫，SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。
由于现代生活压力、环境污染、各种辐射以及超量运动等都会造成氧自由基大量形成，现已证实，氧自由基可引发的疾病多达60多种。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标，它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，修复基因自由基造成的对细胞伤害。因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
SOD1是SOD家族中的一种，基本上所有的真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶，是一种可溶性蛋白，主要存在于细胞质中。目前体外的SOD的检测方法主要集中在蛋白质与蛋白质互作的elisa法和酶竞争法，此方法可以检测酶的活性，但是由于样品蛋白质人为操作因素导致误差大，且蛋白质不稳定，极易降解和变性，导致活性下降和失活,结果的可信度大打折扣。
CN102095856A公开了一种超氧化物歧化酶快速检测卡及其检测方法，在长条扁平薄壳状的检测卡外壳中设置测试条，检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；测试条是由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、胶体金膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成；支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样品垫，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜；胶体金膜为含抗超氧化物歧化酶抗体胶体金标记的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是：含超氧化物歧化酶的检测带，含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔，硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
目前市场还尚未发现有关SOD1的分子水平检测试剂盒，本发明对未来分子检测SOD提供了强有力的基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种人体内锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的体外分子检测方法及所用的引物，本方法可以在体外检测人体不同组织、细胞受到的氧化损伤程度的相对大小，可应用于体外基因分子诊断等方面。
本法实现目的的技术方案如下：
一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测用引物，
正向引物序列：CAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGA；
反向引物序列：AGTCTCCAACATGCCTCTCTTCATC。
与锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测用引物配合使用的内参基因GAPDH引物，内参基因的正向引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
内参基因的反向引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。
一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法，方法如下：
⑴目标组织或细胞中总RNA的提取：
⑵采用步骤⑴提取出的RNA进行逆转录PCR，获得模板RNA；
⑶采用权利要求1所述的引物和权利要求1所述的内参基因GAPDH，以及步骤⑵的模板RNA进行实时荧光定量PCR。
本发明的优点和积极效果：
本发明提供一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法，首次用qPCR的方法，以基因水平的检测来鉴定SOD1的含量，同时提供一套有针对性引物序列和内参序列，即使在样品提取的RNA中有DNA污染的情况下，也可以稳定、特异、准确的检测出人的不同组织、细胞中SOD1基因的表达量差异，且有极高的重复性，克服了市场上常用酶活检测试剂盒的人为因素影响大、稳定性差、重复性差等因素。
本发明可以应用在医疗检测和化妆品抗衰老领域，配合大量临床实验数据的基础上，可以早期判断由于SOD1酶表达量高低反映相关疾病的情况，对疾病的早期治疗和预防起到积极的作用，目前市场上还未出现关于SOD的分子检测产品，有利于推动SOD分子检测市场的发展。
附图说明
图1为本发明引物特异性：5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后SOD1与GAPDH熔解曲线图；
图2为本发明qPCR反应性灵敏性：5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后的SOD1的扩增曲线图，双氧水浓度为(μM)：0、200、400、800、1000；
图3为本发明GAPDH、SOD1扩增基因琼脂糖凝胶电泳图，从左至右依次为：maker(从上至下依次为700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)、GAPDH(185bp)、sod1(187bp)；
图4为本发明结果分析5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后的SOD1表达量差异柱状图。
图5为标准曲线，横坐标为拷贝数lg值，众坐标为Cq值。
具体的实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本方法中荧光定量PCR引物的正反向引物均是跨基因组内含子设计，避免了由于样品中残留的基因组DNA的污染，而导致结果的准确度低和重复性差的缺点，提高了特异性和结果的准确度。使用NCBI blast比较，与使用PRIMER5.0设计软件分析，优化引物，将发各项指征均控制在最优范围之内，极大程度降低了引物二聚体的形成。将引物长度达到较高的25bp，在一定程度上也提高了扩增的特异性。无需加入DNase处理，同时采用sybergreen法，同探针法相比节省了一定的成本。RNA序列号NM_000454.4GI:48762945
一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法及所用的引物，以下方法以人皮肤细胞为例子，来说明具体的检测方法。本发明以5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后SOD1检测为例来说明所使用引物的特异性，具体操作过程如下：
第一部分：细胞样本的收集与处理：以人皮肤细胞(HSF)体外培养，给5种不同浓度的双氧水处理为例
⑴将HSF细胞铺于2个六孔板的10个孔之中，每孔数量控制在80000，每孔含1ml的高糖DMEM培养基，含10％的胎牛血清，放置于CO2培养箱37℃培养24h使其正常贴壁。
⑵吸走原有培养基，用培养基配置5个不同浓度的双氧水，双氧水浓度为(单位μM)0、200、400、800、1000，每2个孔分别加入同一种浓度的双氧水处理。放置于CO2培养箱37℃培养24h使其正常贴壁。
⑶弃去含双氧水的培养基，用PBS冲洗2遍，每遍1分钟，之后进入RNA提取步骤。
第二部分：RNA提取步骤提取及相关PCR部分
一、组织、细胞中总RNA的提取：
⑴样品处理：
贴壁细胞：取1ml裂解液加入六孔板内对细胞进行吹打。
悬浮细胞：将5-10 X 106个细胞(6孔板中1个孔)溶于1ml裂解液中，进行吹打。
组织块：均值样本40-100mg组织样本溶于1ml裂解液中，组织块需完全浸入。
⑵将处理后的溶液转入1.5ml离心管中，室温静置5分钟。
⑶加0.2ml氯仿，手摇15s，静置3分钟；4℃，12000g，15分钟。
⑷吸取上层无色水相到新管中，加0.5ml异丙醇，静置10分钟，4℃，12000g，10分钟，弃上清，加1ml，75％的乙醇。漩涡混合，离心：4℃，7500g，5分钟。
⑸室温干燥5-10分钟，用20-50ul的无RNA酶的水溶解，可于—80℃保存。
二、RT-PCR：
⑴1ul的oligo(dt)，(500ug/ml)，4ul的dNTP(2.5mM)，1ng-5ug(1-2ul)的总RNA。加水至13ul。
⑵65℃孵育5分钟，迅速置冰上冷却1分钟。短暂离心加入：4ul的5*缓冲液，2ul的0.1M DTT，轻轻混匀。缓冲液含为Tris-HCl、KCl、MgCl2的常用缓冲液。
⑶37℃，2分钟。加入1ul逆转录酶，轻轻混匀；37℃，40分钟，紧接着70℃，10分钟，可于—20℃保存。
三、qPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)：
⑴荧光PCR反应体系如下所示：
正向引物序列：CAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGA；
反向引物序列：AGTCTCCAACATGCCTCTCTTCATC。
内参基因GAPDH：
内参基因的正向引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
内参基因的反向引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
⑵荧光PCR扩增反应程序：
四、标准曲线的制作：将上述测序正确的阳性克隆连入质粒，然后进行质粒浓度测定、计算质粒拷贝数，进行10倍系列稀释，分装成1×106拷贝/μl、1×105拷贝/μl、1×104拷贝/μl、1×103拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×10拷贝/μl。
五、结果分析：
根据扩增曲线的ΔΔCT值，与阴性对照相比较，来评估细胞中SOD1的表达量。随着细胞受氧化程度的加深，即试验中双氧水浓度的升高，Cq值下降，即SOD1基因的表达量也随之升高，与Cq值呈负相关，与表达量成正相关。因此可根据Cq值的高低来衡量SOD1的体外表达量的多少，并反应细胞受到的氧化损伤程度的大小。
图1中可以看出5条SOD1和GAPDH的溶解曲线都是平滑的单峰，且基因内的重复性非常好，证明2个基因的引物具有非常好的特异性。
图2结果反映出SOD1在不同浓度双氧水处理下，5条曲线分布的间距都比较清晰，说明有比较好的反应灵敏性。
从图3可以很直观的看出GAPDH和SOD1的条带大小均符合理论设计的片段大小，且没有其他杂带，从肉眼宏观上证明了该基因具有非常好的准确性和特异性。
图4中结果反应出随着细胞受氧化程度的加深，即试验中双氧水浓度的升高，SOD1基因的表达量的Cq值也随之升高。因此可根据Cq值的高低来衡量SOD1的体外表达量的多少，并反应细胞受到的氧化损伤程度的大小。
图5标准曲线。横坐标为拷贝数lg值，众坐标为Cq值。
本发明不局限于上述实施例，凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种用于分子检测锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的引物组合物，其特征在于：
所述引物组合物中包括用于扩增SOD1的正向、反向引物序列和与之配合使用的用于扩增内参基因GAPDH的正向、反向引物序列；用于扩增SOD1的正向、反向引物序列分别如序列表中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；用于扩增内参基因GAPDH的正向、反向引物序列分别如序列表中的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
2.一种锌铜超氧化物歧化酶SOD1表达量的分子检测方法，其特征在于：方法如下：
⑴目标组织或细胞中总RNA的提取：
⑵采用步骤⑴提取出的RNA进行逆转录PCR，获得模板cDNA；
⑶采用权利要求1所述的引物和权利要求1所述的内参基因GAPDH，以及步骤⑵的模板cDNA进行实时荧光定量PCR；
所述分子检测方法用于非疾病诊断目的。
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