JP3598322B2 - ヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼに関し、更に詳細には、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ヒトＭｎ−ＳＯＤ）のペプチド配列を構成するアミノ酸の一部を置換することにより、他のアミノ酸に変異した新規なＭｎ−ＳＯＤ、該Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ遺伝子、宿主細胞、該Ｍｎ−ＳＯＤの製造法およびその用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酸素は、生体にとって必須であり、紫外線、放射線などの外界因子などの作用を受けて生体内組織において種々の活性酸素種になることが知られている。通常の状態では、酸素の約１％が活性酸素の状態で存在しているといわれている。この活性酸素種は、生体内において、マクロファージなどの貪食作用によって、細菌などに対して直接作用して強力な殺菌効果を示し、生体内における感染防御機構として重要な役割を担っていると考えられる。
しかし、酸素も高濃度で生体内に存在すると、逆に生体にとって有害な影響を及ぼすことも知られている。このことも、生体組織内で酸素が還元されて生成された種々の活性酸素が作用することによるものと考えられている。
【０００３】
活性酸素は、親水性環境よりも疎水性環境でのほうがその寿命が長く、他方、リン脂質の不飽和脂肪酸は活性酸素に対して極めて敏感に作用し、過酸化状態になりやすいことが知られている。従って、生体膜の不飽和脂肪酸は、過酸化反応を受けると過酸化脂質になり、この過酸化脂質が構造蛋白質などに作用して、細胞障害の原因になり、動脈硬化、老化、発癌などの有害な作用を及ぼしている。
この活性酸素は、生体が紫外線や放射線などに照射されることにより生成される。従って、日光、特に紫外線に露出される皮膚などの生体膜には、スクワランなどの不飽和脂肪酸が含まれる皮脂が存在することから、この不飽和脂肪酸が活性酸素の作用を受けて過酸化脂質になり、炎症、色素沈着、老化などの原因となっている。また、その過酸化脂質の量が著しく増加した場合には、メラミンの生成が促進され、メラミンの沈着を惹起すると推測されている。
更に、火傷や外傷などで皮膚が損傷を受けて皮膚細胞が直接空気と接触する場合には、その細胞膜では活性酸素が生成されて、この活性酸素が更に皮膚細胞中の不飽和脂肪酸に作用して過酸化脂質が生成されることになる。この過酸化脂質の形成が皮膚の損傷部位の治癒を遅らせる原因となっている。
上にも述べたように、最近、この活性酸素は、各種炎症性疾患や発癌、未熟児網膜症、老人性疾患などの原因の一つであるとの報告がなされている。さらには、免疫にも深い係わりがあると推定されている。
【０００４】
ところで、酸素を呼吸して生活する生物（好気性生物）は、当然取入れた酸素を全身に供給することになり活性酸素も同時に供給されることになるが、こうして体内に入った活性酸素を酵素分解し消去しているのが各種のスーパーオキシドジスムターゼ（以後ＳＯＤと呼称）である。従って、ＳＯＤは好気性生物が生存を続けるのに必須の成分であると言える。実際、各種生物間の体内ＳＯＤ量の濃度差はその生物の寿命と明白な相関関係があることが知られている。
また、局所的なＳＯＤの濃度の減少が上記した非常に多くの疾患を引き起こすことは数多くの文献にて報告されている。
【０００５】
例えば、癌細胞ではマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）の低下が著しいことが報告されている（大柳義彦：トキシコロジーフォーラム１１巻（１）、６２ー７０、１９８８等）。
従って、ＳＯＤは、局所的ＳＯＤの濃度の減少によって起きる多くの疾患の原因療法として治療あるいは予防に用いられる可能性を秘めている。
【０００６】
前述したような作用を有するスーパーオキシドジスムターゼ（以後ＳＯＤと略称する）としては、例えば、マンガンーＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ）、銅亜鉛−ＳＯＤ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）、鉄−ＳＯＤ（Ｆｅ−ＳＯＤ）等が挙げられる。
このうち、動物由来のＳＯＤをヒトに投与する場合には、抗原抗体反応に由来するような拒絶反応等の問題があるため、医薬として開発するには多くの困難が予想される。これに対して、ヒト由来のＳＯＤはかかる問題がない分だけ、医薬品として開発するに当たっては好ましい。
この意味で、Ｆｅ−ＳＯＤは細菌および植物由来であるために不適当であるといえる。
しかしながら、ヒト由来のＳＯＤについても製造および供給面で極めて大きな問題があると同時にウィルス等の混入に起因する感染の心配などがある。従って、前記問題を解決する手段として遺伝子工学的手段によりヒト型ＳＯＤを製造する試みがなされている。つまり、マンガンーＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ）と、銅亜鉛−ＳＯＤ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）とについて、遺伝子工学的手法により製造が可能であるので、これらのＳＯＤについて薬剤、化粧品などへの応用の可能性が検討されている。また、銅亜鉛−ＳＯＤ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）については、その寿命が短いために、医薬、化粧品などに応用する場合には、より体内半減期が長いＭｎ−ＳＯＤの方がより好ましいといえる。
【０００７】
ところで、Ｍｎ−ＳＯＤは、ヒトを含む動物には主として細胞中のミトコンドリアに多く含まれていて、その分子量が約２０，０００のペプチドよりなる４量体を形成していて、Ｍｎイオンを各ペプチドあたり１個づつ含む金属蛋白質である。酵素活性には、このＭｎイオンが必須である。
Ｍｎ−ＳＯＤは、ＣｕＺｎ−ＳＯＤに比して体内半減期が約１０倍も長いこと、さらにＳＯＤの代謝産物である過酸化水素に対して耐性であるため、ＣｕＺｎ−ＳＯＤよりもＭｎ−ＳＯＤの方が薬剤としてより有用と考えられる。
【０００８】
ところで、Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列については、ヒト型Ｍｎ−ＳＯＤの全アミノ酸１９８個のうち、１９６個からなるアミノ酸配列が報告された［バラ等（Ｂａｒｒａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ２５９， １２５９５−１２６０１， １９８４）］。
次いで、上記論文のアミノ酸配列を引用してＤＮＡプローブを作製し、ヒトＴ細胞からＭｎ−ＳＯＤの全アミノ酸配列である１９８個のアミノ酸をコードするクローンが同定されたと開示されている（特開昭６４ー２７４７０号公報）。
【０００９】
更に、特開昭６４ー６３３８３号公報には、ヒト型Ｍｎ−ＳＯＤが記載されていて、そのうちのＩＶａと表示されたポリペプチド（野生株）に対応するものの等電点がｐＩが８． １５であったと記載されている。しかしながら、同公報に記載されたｈＭｎ−ＳＯＤは、野生株の天然型Ｍｎ−ＳＯＤに対して他のアミノ酸残基を何ら置換されたものではなく、更に同公報に記載されたＤＮＡ配列は、後述する本発明に係るヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤとは著しく異なっている。また、この等電点がどのような方法で測定されたのか一切不明であるうえに、文献［Ｂ．Ａ． Ｏｍａｒ ＆ Ｊ．Ｍ． ＭｃＣｏｒｄ： Ｊ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２３， １４９−１５９ （１９９１）］ にも、このペプチドに該当するものの等電点が７． ４であると記載されているように、これまでのヒト型Ｍｎ−ＳＯＤの等電点が通常７． ０から７． ４の間にあるとされていることをも勘案すれば、上述した等電点は通例に比べて余りにも高すぎて唐突過ぎると言わざるを得ない。
【００１０】
また、ヒト型ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端部から３番目のアミノ酸ＳｅｒがＡｒｇに変異したものが同定されたとの報告がある（Ｓ．Ｌ． Ｃｈｕｒｃｈ： Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １０８７，２５０−２５２， １９９０）。しかしながら、その後著者自身がこのアミノ酸配列は誤報であったとの訂正がなされている（Ｓ．Ｌ． Ｃｈｕｒｃｈ： ＢＢＡ， １１７１， ３４１， １９９３） 。
【００１１】
ところで、Ｍｎ−ＳＯＤは高分子であるため組織浸透性が良好とは言えない。一方、酸素ラジカルは、酸素が生体内中隙間なく分布するため何れの組織あるいは器官においても発生する。従って、体外より投与されたＭｎ−ＳＯＤが体内で治療あるいは予防作用を効果的に発揮するためには組織浸透性のよいことが要求される。
【００１２】
しかしながら、従来のＭｎーＳＯＤをＳＯＤ欠乏に起因する各種の炎症性疾患、癌、未熟児網膜症、高血圧症、糖尿病等に対して投与した場合、もともと必要な局所に存在する内在性のＳＯＤと異なり、必要な局所に浸透せず治療効果は不充分であった。従って、組織浸透性の良いヒト型Ｍｎ−ＳＯＤの開発が強く要望されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
前述したようにＭｎ−ＳＯＤは組織浸透性が良好でないといっても、ＣｕＺｎを含むＳＯＤに比べると、Ｍｎ−ＳＯＤはウサギの心筋組織への浸透能力が高いことが報告されている［Ｂ．Ａ． Ｏｍａｒ ＆ Ｊ．Ｍ． ＭｃＣｏｒｄ： Ｊ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２３，１４９−１５９ （１９９１）］ 。このことは、Ｍｎ−ＳＯＤの示す等電点がＣｕＺｎ−ＳＯＤより高いことと関係があると言われている。また関節滑膜への親和性も等電点の高い分子の方がより効果的である。ちなみにヒトの場合ＣｕＺｎ−ＳＯＤの等電点はｐＩ約５．１であるのに対し、Ｍｎ−ＳＯＤのそれはｐＩ約７． ０〜７． ４である。このように、等電点のより高いＭｎ−ＳＯＤは組織への浸透性が高まり薬理効果の増大が予想される。
【００１４】
従って、本発明は、組換えＭｎ−ＳＯＤ（ｒＭｎ−ＳＯＤ）遺伝子を用いて各種変異操作を行なった後得られたヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤを提供するものである。
また、本発明は、天然型のＭｎ−ＳＯＤの等電点よりも高い等電点を有する組み換え変異Ｍｎ−ＳＯＤを創製することを課題とする。
さらに、本発明の他の課題は、Ｍｎ−ＳＯＤの等電点が高くなることによって酵素活性が低下せずまた持続性も天然型と同等以上である新規Ｍｎ−ＳＯＤの創製を課題とする。
さらに、本発明のその他の課題は、等電点が高く、かつ、組織浸透性が高くなったことにより、従来の公知であるＭｎ−ＳＯＤに比べて、各種の炎症性疾患、癌、未熟児網膜症、高血圧、糖尿病等に対してより強力な薬理効果を発揮する新規組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを提供することを課題とする。
これらに加えて、本発明は、ヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤをコードした遺伝子、その遺伝子配列を含む発現プラスミド、その発現プラスミドを含む宿主細胞、ヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤの製造方法、およびそれを使用した疾病の予防または治療方法を提供することを課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
これまでは、Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列の中のたとえひとつのアミノ酸でもその他の塩基性アミノ酸で置換変異させると、その酵素活性は低下してしまい、充分な目的を達成することできなかった。
ところが、極めて驚いたことには、ヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端から３番目のアミノ酸残基であるセリン残基（Ｓｅｒ） をアルギニン残基（Ａｒｇ） に変えたヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼにおいては、その等電点がｐＩ約７．１〜７． ４からｐＩ８．１〜８．４と有意に上昇したのに対して、酵素活性、体内半減期、過酸化水素に対する耐性に関しては変化が見られず、上記課題を満たしたものであることを見出した。なお、ヒトＭｎ−ＳＯＤを大腸菌に組換える場合には、そのＮ末端にメチオニン残基（Ｍｅｔ ）が付加されるため、組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤにおいてはＮ末端より４番目のセリン残基（Ｓｅｒ ）がアルギニン残基（Ａｒｇ ）に変換することになる。
同様に、ヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端から３番目のアミノ酸残基であるセリン残基（Ｓｅｒ） をアルギニン残基（Ａｒｇ） に変えると共に、４２番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸残基（Ｇｌｕ） をバリン残基（Ｖａｌ） で置換したヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼも、その等電点が、野生株のヒトＭｎ−ＳＯＤのｐＩ約７．１〜７． ４からｐＩ８．５〜９．４と有意に上昇することを見いだした。
【００１６】
その結果を踏まえて、本発明者等は、更に上記課題を解決するために鋭意努力した結果、Ｍｎ−ＳＯＤの場合には極性アミノ酸残基の総和が等電点に反映されることを見出した。つまり、たとえば、Ｍｎ−ＳＯＤの酸性アミノ酸の総数は１９個であり、また塩基性アミノ酸数は２９であって、合計で塩基性アミノ酸数が１０個多いことが知られるが、この塩基性アミノ酸の数を減らすと等電点は減少し、一方増加させると等電点が増加することが見い出された。
【００１７】
換言すると、ヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（以下「ｈＭｎ−ＳＯＤ」と略称することがある）のペプチド配列において、他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない部位に、よりプラスに荷電したアミノ酸で置換することによって、等電点が所望の値以上に上昇したヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤが得られることを見いだして、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
つまり、本発明に係るヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（以下「ｈＭｎ−ＳＯＤ」と略称することがある）は、そのペプチド配列において、他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない部位に、よりプラスに荷電したアミノ酸で置換したヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤである。
【００１９】
本発明においては、ヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列における他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない複数の部位のそれぞれに、よりプラスに荷電したアミノ酸で置換させて、等電点を上昇させたヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤも提供される。
【００２０】
更にまた、本発明においては、ヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列において、他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない部位に存在するアミノ酸残基を中性アミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基にて置換することによってその等電点が上昇したヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤが提供される。
【００２１】
ところで、ヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を系統的に比較した場合のヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を中心にした保存アミノ酸配列のみを表示すると以下の通りである［（）で囲むアミノ酸が保存アミノ酸であり、アミノ酸略称の上の数値はヒト組換Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列におけるＮ末端からのアミノ酸の位置を示す］。
【００２２】
【００２３】
このヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列において、アミノ酸残基が欠失、重複、置換等により異なる配列に変異した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを得ることができる。例えば、Ｎ末端より４番目のセリン残基をアルギニン残基（ヒト由来原料より精製した天然Ｍｎ−ＳＯＤにおいてはメチオニン残基がＮ末端に欠けているので３番目）に変えることによって、ｐＩを８．１〜８．４に上げることが可能である。
【００２４】
更に詳細には、例えば、天然型（野生株）のヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端から３番目のアミノ酸残基であるセリン残基（Ｓｅｒ） をアルギニン残基（Ａｒｇ） に置換したヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを大腸菌に組換えた場合には、ヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端にはメチオニン残基（Ｍｅｔ ）が付加されるので、Ｎ末端部のアミノ酸配列を示すと次のとおりである。つまり、
Ｎ 末端ーＭｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ…
↓
Ｎ 末端ーＭｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ…
この場合には、組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤにおいてはＮ末端より４番目のセリン残基（Ｓｅｒ ）がアルギニン残基（Ａｒｇ ）に変異されることになる。このセリン残基は、アルギニン残基の他に、リジン、ヒスチジン残基などの塩基性アミノ酸残基で置換されることもできる。
【００２５】
更に、ヒト組換Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列におけるＮ末端から４番のセリン残基を、アルギニン残基または別のアミノ酸残基で置換すると共に、同Ｎ末端から４３番目のグルタミン酸残基をバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン残基などの中性アミノ酸残基またはリジン、アルギニン、ヒスチジン残基などの塩基性アミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列をもつヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤは、酵素活性、体内半減期、過酸化水素に対する耐性については変化を及ばさないのに、その等電点だけを約ｐＩ８．５〜９．４にも上昇させることを見いだした。
【００２６】
更にまた、ヒト組換Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列におけるＮ末端から４３番目のグルタミン酸残基だけをバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン残基などの中性アミノ酸残基またはリジン、アルギニン、ヒスチジン残基などの塩基性アミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列をもつヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤも、前述した２つの部位を変異させたアミノ酸配列をもつヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤよりも若干劣る程度に上昇した等電点を示すことが判明した。
【００２７】
なお、上述したヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列において、上記保存アミノ酸以外は大幅な構造の変化をもたらさない限り全て変異可能なアミノ酸である。つまり、理論的には、他のアミノ酸で置換されてもそのポリペプチドとしての酵素活性を喪失しない部位に存在するアミノ酸残基の全てまたは多くを、よりプラスに荷電（チャージ）されたアミノ酸残基、または、中性アミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基で置換することも可能である。しかしながら、余りにも多くの部位を別のアミノ酸残基で置換すれば、場合によっては、全く別の蛋白質に変化する可能性があり、かかる蛋白質を医薬品として開発するには全くの新規物質として取り扱わなければならなくなり、ヒトＭｎ−ＳＯＤとして開発する利点が損なわれてしまい現実味がなくなる。また、前述した数よりも多い部位のアミノ酸を他のアミノ酸残基で置換することによってえられる新規ヒトＭｎ−ＳＯＤについても、抗原抗体反応などの克服困難な拒絶反応等の問題が生じる可能性があるので、かかるＭｎ−ＳＯＤを医薬品として開発するのは、かなりの困難が予想される。
【００２８】
従って、医薬品、化粧品などの開発に当たって、拒絶反応などの問題を考慮した場合には、本発明においては、ｈＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列における他のアミノ酸で置換される部位は、１個ないし４個が好ましい。
【００２９】
ｈＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列において、他のアミノ酸残基で置換されても酵素活性が変わらない位置にあるアミノ酸残基を置換される他のアミノ酸残基としては、例えば、アルギニン残基の他に、リジン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギンなどの塩基性アミノ酸残基、または、例えば、バリン残基の他に、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシンなどのアミノ酸残基を挙げることができる。
【００３０】
また、本発明において、ｈＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列において他のアミノ酸で置換される部位に存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することによって達成される等電点は、約ｐＩ７． ６以上、好ましくは約ｐＩ８． ０以上、更に好ましくは約ｐＩ８． １〜９． ４である。このように等電点を上昇させることにより、ヒトＭｎ−ＳＯＤの組織浸透性を上昇させることができる。
【００３１】
また、本発明には、上記ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を組換えたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ蛋白質および該ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列ならびにそれを形質転換された微生物をも包含される。
【００３２】
また、本発明には、例えばエリザベス・デー・ゲッツォフ等（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｄ．Ｇｅｔｚｏｆｆ ｅｔ ａｌ； Ｎａｔｕｒｅ： ３５８， ２３ Ｊｕｌｙ， Ｎｏ． ６３８４， １９９２ ）によってＣｕＺｎ−ＳＯＤについて報告されるように、活性中心の酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸）残基をグルタミン等の塩基性アミノ酸に変えることによって活性を数倍上昇させた後、例えば、Ｎ末端からの所定の位置のアミノ酸残基をその他のアミノ酸残基で置換することによって等電点を上昇させ、これによって組織透過性を増進させたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤおよび該ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列ならびにそれを形質転換された微生物をも包含される。
【００３３】
本発明に係る組換ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤは、例えば、ヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子配列における組換アミノ酸残基のアミノ酸配列に該当するアミノ酸残基を指令する遺伝子配列部分に変異を加えて置換されたアミノ酸残基を指令する遺伝子配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なう方法によって製造することができる。
【００３４】
つまり、例えば、ヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子配列におけるＮ末端から４番目のセリン残基のアミノ酸配列に該当するアミノ酸残基を指令する遺伝子配列部分に変異を加えて置換されたアルギニン残基またはその他のアミノ酸残基を指令する遺伝子配列を有するプライマーを用いて、および・または同Ｎ末端から４３番目のグルタミン酸残基のアミノ酸配列に該当するアミノ酸残基を指令する遺伝子配列部分に変異を加えて置換されたバリン残基またはその他のアミノ酸残基を指令する遺伝子配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法による増殖することによって製造することができる。
【００３５】
従って、本発明に用いることのできるプライマーのうち、Ｍｎ−ＳＯＤのＮ末端側のプライマーとしては次のものが挙げられる。
ＨＭＳー５： ５’ ＡＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡ ３’
（配列表１）
または
ＨＭＳー７： ５’ Ｃ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＣＣ Ｔ ３’
（配列表３）
また、Ｍｎ−ＳＯＤのＣ末端側プライマーとしては次のものが挙げられる。
ＨＭＳー６： ３’ ＧＣＴＡＧＣ ＡＡＴＡＣＧＡＣＧＴ ＣＴＡＣＡＡＴＴＣ ５’
（配列表２）
【００３６】
また、上記ヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端ペプチド配列の一部を指令する遺伝子配列を有するＮ末端側プライマーのうち、Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …配列のセリン残基を指令する遺伝子配列としては、他の塩基性アミノ酸配列を指令する遺伝子配列に変えるようなＮ末端側プライマーの変異配列の全てが包含される。
【００３７】
なお、例えば、天然型Ｎ末端側から１番目ないし７番目のＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列の一部分は次のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応する天然型Ｎ末端側Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
…ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００３８】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の１つの例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列１： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列２： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列３： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００３９】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の別の例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列４： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列５： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＴ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００４０】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の更に別の例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列６： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列７： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００４１】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の更に別の例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列８： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列９： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００４２】
また、例えば、天然型Ｎ末端側から４１番目ないし４３番目のＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列の一部分は次のとおりである。
…Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｉｌｅ …
上記に対応する天然型Ｎ末端側Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
…ＣＧＣ ＧＡＧ ＡＴＡ …
【００４３】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の１つの例は下記のとおりである。
…Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列１０： …ＣＧＣ ＧＴＧ ＡＴＡ …
【００４４】
その他、各種変異アミノ酸とそれをコードする各種コドンを含む遺伝子の配列を挙げることができる。
【００４５】
従って、本発明には、例えば、前述したような置換アミノ酸残基のアミノ酸配列に対応する遺伝子配列を含むプライマーも包含されるのは当然である。さらには上記プライマーを用いて作成された組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子ＤＮＡ配列、それによって作成されたｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡを形質転換された大腸菌などの微生物も包含される。
【００４６】
さらに、前記形質転換微生物を培養後、ＤＥＡＥセファロース（ファルマシア）、ＣＭセファロースなどを用いてカラムクロマトグラフィーなどを行なって活性画分を集め、集めた活性画分より常法に従ってエンドトキシン等のパイロゲンを除去することによって等電点を高めたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを製造することができる。
【００４７】
本発明の組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤには各種の安定化剤、賦形剤例えばアルブミン、ラクトアルブミン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、単糖類、２単糖類、３単糖類等を添加することができる。例えば、上記の２糖類の一層好ましい例としてトレハロース（αー［Ｄーグルコピラノシル］αーＤーグルコピラノース）の０．０２〜１Ｍ濃度を含む溶液が挙げられる。
【００４８】
本発明に係るヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの製剤例としては、例えば、組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端より４番目のセリン残基をアルギニンに置換した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを下記処方のような注射用溶液に配合したものなどが挙げられる。つまり、
ＭＨＳ：ＳＯＤ １００ｍｇ
トレハロ−ス ０．２３Ｍ（最終濃度）
グルタミン酸ナトリウム １０ｍＭ
希釈水酸化ナトリウム ｐＨ７．２〜７．４に調整後、
蒸留水（パイロゼンフリ−）を加えて全量を１０ｍｌにする。
この溶液をバイアルに分注して保存する。
【００４９】
本発明の組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの投与量は、例えば、０． ０１ｍｇ〜１ｇ／ ｋｇ／ 日、好ましくは０． １ｍｇ〜５０ｍｇ／ ｋｇ／ 日であり、点滴、静注、筋注、皮下注、坐剤ないしは点鼻薬としてまたは関節腔へも投与することができる。なお、投与料や等よ方法などは、疾患の種類や程度、患者の状態などにより、適宜変えることができる。
なお、本発明に係る組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの毒性は極めて少なく、例えば組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端より４番目のセリン残基をアルギニンに変えた組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤはＳＤ雄ラットへの５０ｍｇ／ ｋｇの尾静脈からのボーラス投与によって何等の毒性も観察されなかった。
【００５０】
こうして得られた本発明に係るヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端より４番目がアルギニン残基に変異した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤは、これまで効果が明確でなかった関節炎のラットモデル等に対して有意の抗炎症作用を発揮した。
【００５１】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は下記実施例によって何等制限されるものではない。
【００５２】
遺伝子操作についての実験は、基本的にはサンブロック等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．， １９８９）の「モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル」（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」）に従って行なった。蛋白化学、精製その他の手法についてはパッカー編［（Ｌｅｓｔｅｒ Ｐａｃｋｅｒ，ｅｄ）Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１０５ １９８４ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］を参考にした。
【００５３】
実施例１ー１：ｃＤＮＡの作成
常法に従ってヒト培養細胞より抽出したｍＲＮＡあるいは公知のｐｈＭｎＳＯＤ４ｃＤＮＡを鋳型として用い、次にＮ末端から４番目のアミノ酸残基セリンをアルギニン残基に変異させた配列を有するＮ末端側プライマーとしてＨＭＳー５プライマー（配列表１）を化学合成し、これにＣ末端プライマーＨＭＳ−６（配列表２）を化学合成し、ＨＭＳー５およびＨＭＳー６の両プライマーを用いて遺伝子増幅法によりヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を増幅させた。
【００５４】
【００５５】
続いて、得られたヒト変異ＳＯＤ遺伝子を制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化された発現ベクター（Ａ）に前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した。発現ベクター（Ａ）は蛋白質の過剰発現用に用いられ、強力なｔａｃプロモーターをもち、適当な宿主中（ＪＭ１０５）でｌａｃリプレッサーによって調節され、培地へのイソプロピルーβーＤーチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される（図１ーＡ）。
【００５６】
実施例１ー２：
常法に従ってヒト培養細胞より抽出したｍＲＮＡあるいは公知のｐｈＭｎＳＯＤ４ｃＤＮＡを鋳型として用い、次にＮ末端から４番目のアミノ酸残基セリンをアルギニン残基に変異させた配列を有するＮ末端側プライマーとしてＨＭＳ−７プライマー（配列表３）を化学合成し、これにＣ末端プライマーＨＭＳ−６（配列表２）を化学合成し、ＨＭＳー７およびＨＭＳー６の両プライマーを用いて遺伝子増幅法によりヒト変異ＳＯＤ遺伝子を増幅させた。
続いて得られたヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子をムングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ− ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ ）および制限酵素ＰｓｔＩによって消化し、制限酵素ＮｃｏＩおよびムングビーンヌクレアーゼによって消化後ＰｓｔＩで処理した発現ベクターに前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した（図１ーＢ）。
【００５７】
実施例２：プロモーターおよびベクターの選択
大腸菌用プロモーターとしてＰａｃやその改良型Ｐｔａｃ＊ の下流にヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含むｃＤＮＡを連結することによって目的の発現プラスミドを作成した。Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子の両端にはそれぞれＥｃｏＲＩかＮｃｏＩおよびＰｓｔＩサイトを設置しプロモーターと連結した。こうして得られたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含む発現プラスミドを宿主大腸菌に導入しアンピシリン耐性菌として形質転換体を選抜した（図１）。
【００５８】
実施例３：培養および分離精製
ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含む発現プラスミドで形質転換された大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５をアンピシリン４０ｍｇ／ｌおよび塩化マンガン１５ｍＭを含む培地中で３７℃１５時間撹拌培養した。培養後ブレンダーにて細胞を破砕し低速遠心によって上清をえた。
こうして得た上清をＤＥＡＥセファロースに負荷してリン酸緩衝液を用いてクロマトグラフィーを行なう。続いて活性画分をＣＭセファロースを行なって高濃度リン酸緩衝液により溶出し活性画分を集める。集めた活性画分より常法に従ってエンドトキシン等のパイロゲンを除去した。
得られた精製組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤをマッコード等（ＭｃＣｏｒｄ， Ｊ．Ｍ．， Ｆｒｉｅｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４， ６０４９〜６０５５，１９６９ ）の方法に従って測定したところ、約４９００単位／ｍｇ蛋白質の活性を示した。一方対照に用いた組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤは約４８００単位／ｍｇの活性を示し、両者間に違いは見られなかった。
こうして本実施例によって得られた変異Ｍｎ−ＳＯＤはＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤと略称した。
【００５９】
このＭＨＳ：ＭｎＳＯＤのアミノ酸配列と遺伝子配列は次のとおりである。
【００６０】
実施例４：精製ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの酵素学的性質
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量約２００００の単一バンドを示した。天然型およびＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを各１０μｇ 含むスラブ型ポリアクリルアミドゲルを含有するｐＩ３．０〜９．０の等電点電気泳動を行なった結果、天然型Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約７．２を示した。一方、ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約８．２を示し明らかに天然型のＭｎ−ＳＯＤと異なっていた（図２）。
各種濃度の過酸化水素およびシアンの存在下でのＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの安定性を検討したところ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤの失活する過酸化水素濃度でＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤは失活せず、シアン耐性もＭｎ−ＳＯＤと変らなかった。
【００６１】
得られた本発明のＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を上記に示したが、Ｎ末端より４番目のセリンがアルギニンに変異したヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤであることがＮ末端分析により確認された。
【００６２】
実施例５：他のヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子におけるセリン残基の置換
Ｎ末端より５９番目のイソロイシン残基がスレオニン残基に置換しこれによって酵素活性が約５０％に落ちた組み換え変異Ｍｎ−ＳＯＤのＮ末端ーＭｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …配列部分のセリン残基（Ｓｅｒ ）を実施例１〜４の方法に従ってアルギニン残基（Ａｒｇ ）に変えた組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの場合においては、酵素活性は天然型に比較して約５０％のままで等電点のみがｐｌ約７．０からｐｌ８．１〜８．３と上昇したのが確認された。これによって組織浸透性も上昇したことが確認できた。
【００６３】
実施例６：ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの体内持続性
ラット尾静脈よりＣｕＺｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤおよびＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの各１０ｍｇ／ Ｋｇを投与後頚動脈より経時的に採血し持続性を測定した結果、それぞれ半減期６分、７４分および８２分を示した（図３）。
【００６４】
実施例７：アジュバント関節炎に対するＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの治療効果
レービス（Ｌｅｗｉｓ）雄ラット（６〜７週齢）体重２５０〜３００ｇのものを用いる。エーテル麻酔後尾部皮下にツベルクリン針を用いて０．１ｍｌの結核菌（５ｍｇ／ｍｌ流動パラフィン）液を投与する。
ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの１０００単位／ラットを後足関節に３日目より投与を開始し、２日に１回の割合で週３回投与を行なった。ＭＨＳ投与群で５週目より有意に抑制効果が見られた（図４）。
【００６５】
実施例８：再開通不整脈へのＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの治療効果
ＳＤラット雄（３００〜３５０ｇ）の心臓を摘出しランゲンドルフ法にて潅流を行なった。虚血５分前にＭｎ−ＳＯＤまたはＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの１００単位／ｍｌを投与後、３０分間虚血を実施し、再潅流後不整脈の出現頻度とその持続時間を測定した。
その結果、図５に示したようにＭｎ−ＳＯＤに比べて有意の頻度低下作用と持続時間短縮効果が見られた。
【００６６】
実施例９：血しょうクレアチニンキナーゼの放出抑制作用
フィンケ等は冠動脈血栓溶解時にウロキナーゼとともにＭｎ−ＳＯＤを併用することによりクレアチニンキナーゼの放出が防御されることを観察している［フィンケ等（Ｆｉｎｃｋｅ，Ｕ． Ａｒｚｎｅｉｍ Ｆｏｒｃｓｃｈ ３８Ｎｒ．１：１３８−１４２，１９８８）］。本発明の実施例１〜４で作成した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの１０ｍｇ／ｋｇと高分子ウロキナーゼ３ｍｇ／ｋｇをフィンケ等のイヌ心臓虚血再潅流モデルでの実験系にて虚血後に併用し検討し６時間後採血して血しょうクレアチニンキナーゼの測定を行なったところ大幅な血しょうクレアチニンキナーゼの放出抑制作用がみられ心筋の保護作用が観察された（図６）。
【００６７】
実施例１０：ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤに対する安定剤の効果
ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤは組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤと同様に高純度に精製された状態で不安定であり凍結融解、また長期保存等により活性が低下することがある。
そこでＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの５ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０６Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．８）にトレハロース０．２Ｍあるいはマルトース１２０ｍｇ／ｍｌを添加して凍結乾燥後５５℃３週間保存し活性の低下を検討した。その結果、糖無添加群では約７０％に活性が低下したが糖添加群では活性の低下が見られなかった。
【００６８】
実施例１１：ＭＨＳ２：ＭｎＳＯＤ調整におけるｃＤＮＡの作成
実施例１ー１に示した方法に従ってヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を増幅させ、発現ベクターに前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した。
続いて、ヒト培養細胞より抽出したｍＲＮＡあるいは公知のｐｈＭｎＳＯＤ４ｃＤＮＡを鋳型として用い、次にＮ末端から４番目のアミノ酸残基セリンをアルギニン残基に変異させた配列を有するＮ末端側プライマーとしてＨＭＳー７プライマー（配列表３）を化学合成し、これにＣ末端プライマーＨＭＳ−６（配列表２）を化学合成し、ＨＭＳー７およびＨＭＳー６の両プライマーを用いて遺伝子増幅法によりヒト変異ＳＯＤ遺伝子を増幅させた。続いて図８の遺伝子コードにおいて１３４番目の塩基アデニンがチミンとなるように塩基置換したプライマーをもちいてＮ末端より４３番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換した。
続いて、得られたヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子をムングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ−ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）および制限酵素ＰｓｔＩによって消化し、制限酵素ＮｃｏＩおよびムングビーンヌクレアーゼによって消化後ＰｓｔＩで処理した発現ベクターに前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した。
【００６９】
実施例１２：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤのプロモーターおよびベクターの選択
大腸菌用プロモーターとしてＰｔａｃやその改良型Ｐｔａｃ＊ の下流にヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含むｃＤＮＡを連結することによって目的の発現プラスミドを作成した。Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子の両端にはそれぞれＥｃｏＲＩかＮｃｏＩおよびＰｓｔＩサイトを設置しプロモーターと連結した。こうして得られたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含む発現プラスミドを宿主大腸菌に導入しアンピシリン耐性菌として形質転換体を選抜した。
【００７０】
実施例１３：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの培養および分離精製
ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの遺伝子を含む発現プラスミドで形質転換された大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５を実施例３の方法に従って培養した後、得られたＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤを常法により分離精製した。
得られた精製ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤをマッコード等（ＭｃＣｏｒｄ， Ｊ．Ｍ．， Ｆｒｉｅｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４４， ６０４９ 〜６０５５， １９６９）の方法に従って測定したところ、約４９５０単位／ｍｇの蛋白質の活性を示した。一方、対照に用いた組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤは約４８３０単位／ｍｇの活性を示し、両者間に違いは見られなかった。適当量のトレハロース等を添加して凍結乾燥し保存した。
こうして本実施例によって得られた変異Ｍｎ−ＳＯＤはＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤと略称した。
【００７１】
このＭＨＳ２：ＭｎＳＯＤのアミノ酸配列と遺伝子配列は次のとおりである。
【００７２】
実施例１４：精製ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの酵素学的性質
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量約２００００の単一バンドを示した。天然型およびＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを各１０μｇ 含むスラブ型ポリアクリルアミドゲルを含有するｐＩ３．０〜９．０の等電点電気泳動を行なった結果、天然型Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約７．２を示した。一方、ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約８．５〜９．４を示し、明らかに天然型のＭｎ−ＳＯＤの異なっていた。
各種濃度の過酸化水素およびシアンの存在下でのＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの安定性を検討したところ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤの失活する過酸化水素濃度でＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤは失活せず、シアン耐性もＭｎ−ＳＯＤと変らなかった。
得られた本発明のＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を上記に示したが、Ｎ末端より４番目のセリンがアルギニンに変異したヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤであり４２番目がバリンであることが遺伝子構造解析により確認された。
【００７３】
実施例１５：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの体内持続性
ラット尾静脈よりＣｕＺｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤおよびＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの各１０ｍｇ／Ｋｇを投与後頚動脈より経時的に採血し持続性を測定した結果、それぞれ半減期６分、７６分および８８分を示した。
【００７４】
実施例１６：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤに対する安定剤の効果
ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤは組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤと同様に高純度に精製された状態で不安定であり凍結融解、また長期保存等により活性が失われる。
そこで、ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの５ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０６Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．８）にトレハロース０．２Ｍあるいはマルトース１２０ｍｇ／ｍｌを添加して凍結乾燥後５５℃３週間保存し活性の低下を検討した。その結果、糖無添加群では約７０％に活性が低下したのに対して、糖添加群では活性の低下が見られなかった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、等電点が有意に上昇したＭｎ−ＳＯＤを得ることができこれによって、組織浸透性を上げ各種の炎症性疾患、癌、未熟児網膜症、高血圧症、糖尿病等に対してより強力な薬理効果を発揮すると共に、化粧品としても使用することができる新規なＭｎ−ＳＯＤを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクター：大腸菌宿主においてＰｔａｃプロモーターの下流に組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ（＝ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤ）遺伝子を結合した。図中において、（ａ）はＰｔａｃ−ｈＭｎＳＯＤへの組み込みを示し、（ｂ）はＰｔａｃ＊ −ｈＭｎＳＯＤへの組み込みを示す。
【図２】ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤのラット血中における体内持続性を示すグラフ。グラフにおいて、○印はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを、●印は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤを示し、□印はＣｕＺｎ−ＳＯＤを示す。
【図３】ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの等電点電気泳動（アンフォライト、ｐＨ３〜９、ファーマシア社製）を示すグラフ。グラフにおいて、（ａ）は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤ、（ｂ）はＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤ、（ｃ）は蛋白質スタンダードを示す。
【図４】ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤのアジュバント関節炎に対する抗炎症作用（ラット）を示すグラフ。グラフにおいて、○印はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤ、●印は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤを示す。
【図５】ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの冠動脈再開通後の不整脈出現頻度とその持続時間に対する作用を示すグラフ。グラフにおいて、（ａ）は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤ、（ｂ）はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを示す。
【図６】心臓虚血再潅流モデルでの心筋保護作用を示すグラフ。グラフにおいて、（ａ）はコントロール、（ｂ）は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤ、（ｃ）はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを示す。
【配列表】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼに関し、更に詳細には、ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ヒトＭｎ−ＳＯＤ）のペプチド配列を構成するアミノ酸の一部を置換することにより、他のアミノ酸に変異した新規なＭｎ−ＳＯＤ、該Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ遺伝子、宿主細胞、該Ｍｎ−ＳＯＤの製造法およびその用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酸素は、生体にとって必須であり、紫外線、放射線などの外界因子などの作用を受けて生体内組織において種々の活性酸素種になることが知られている。通常の状態では、酸素の約１％が活性酸素の状態で存在しているといわれている。この活性酸素種は、生体内において、マクロファージなどの貪食作用によって、細菌などに対して直接作用して強力な殺菌効果を示し、生体内における感染防御機構として重要な役割を担っていると考えられる。
しかし、酸素も高濃度で生体内に存在すると、逆に生体にとって有害な影響を及ぼすことも知られている。このことも、生体組織内で酸素が還元されて生成された種々の活性酸素が作用することによるものと考えられている。
【０００３】
活性酸素は、親水性環境よりも疎水性環境でのほうがその寿命が長く、他方、リン脂質の不飽和脂肪酸は活性酸素に対して極めて敏感に作用し、過酸化状態になりやすいことが知られている。従って、生体膜の不飽和脂肪酸は、過酸化反応を受けると過酸化脂質になり、この過酸化脂質が構造蛋白質などに作用して、細胞障害の原因になり、動脈硬化、老化、発癌などの有害な作用を及ぼしている。
この活性酸素は、生体が紫外線や放射線などに照射されることにより生成される。従って、日光、特に紫外線に露出される皮膚などの生体膜には、スクワランなどの不飽和脂肪酸が含まれる皮脂が存在することから、この不飽和脂肪酸が活性酸素の作用を受けて過酸化脂質になり、炎症、色素沈着、老化などの原因となっている。また、その過酸化脂質の量が著しく増加した場合には、メラミンの生成が促進され、メラミンの沈着を惹起すると推測されている。
更に、火傷や外傷などで皮膚が損傷を受けて皮膚細胞が直接空気と接触する場合には、その細胞膜では活性酸素が生成されて、この活性酸素が更に皮膚細胞中の不飽和脂肪酸に作用して過酸化脂質が生成されることになる。この過酸化脂質の形成が皮膚の損傷部位の治癒を遅らせる原因となっている。
上にも述べたように、最近、この活性酸素は、各種炎症性疾患や発癌、未熟児網膜症、老人性疾患などの原因の一つであるとの報告がなされている。さらには、免疫にも深い係わりがあると推定されている。
【０００４】
ところで、酸素を呼吸して生活する生物（好気性生物）は、当然取入れた酸素を全身に供給することになり活性酸素も同時に供給されることになるが、こうして体内に入った活性酸素を酵素分解し消去しているのが各種のスーパーオキシドジスムターゼ（以後ＳＯＤと呼称）である。従って、ＳＯＤは好気性生物が生存を続けるのに必須の成分であると言える。実際、各種生物間の体内ＳＯＤ量の濃度差はその生物の寿命と明白な相関関係があることが知られている。
また、局所的なＳＯＤの濃度の減少が上記した非常に多くの疾患を引き起こすことは数多くの文献にて報告されている。
【０００５】
例えば、癌細胞ではマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）の低下が著しいことが報告されている（大柳義彦：トキシコロジーフォーラム１１巻（１）、６２ー７０、１９８８等）。
従って、ＳＯＤは、局所的ＳＯＤの濃度の減少によって起きる多くの疾患の原因療法として治療あるいは予防に用いられる可能性を秘めている。
【０００６】
前述したような作用を有するスーパーオキシドジスムターゼ（以後ＳＯＤと略称する）としては、例えば、マンガンーＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ）、銅亜鉛−ＳＯＤ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）、鉄−ＳＯＤ（Ｆｅ−ＳＯＤ）等が挙げられる。
このうち、動物由来のＳＯＤをヒトに投与する場合には、抗原抗体反応に由来するような拒絶反応等の問題があるため、医薬として開発するには多くの困難が予想される。これに対して、ヒト由来のＳＯＤはかかる問題がない分だけ、医薬品として開発するに当たっては好ましい。
この意味で、Ｆｅ−ＳＯＤは細菌および植物由来であるために不適当であるといえる。
しかしながら、ヒト由来のＳＯＤについても製造および供給面で極めて大きな問題があると同時にウィルス等の混入に起因する感染の心配などがある。従って、前記問題を解決する手段として遺伝子工学的手段によりヒト型ＳＯＤを製造する試みがなされている。つまり、マンガンーＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ）と、銅亜鉛−ＳＯＤ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）とについて、遺伝子工学的手法により製造が可能であるので、これらのＳＯＤについて薬剤、化粧品などへの応用の可能性が検討されている。また、銅亜鉛−ＳＯＤ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ）については、その寿命が短いために、医薬、化粧品などに応用する場合には、より体内半減期が長いＭｎ−ＳＯＤの方がより好ましいといえる。
【０００７】
ところで、Ｍｎ−ＳＯＤは、ヒトを含む動物には主として細胞中のミトコンドリアに多く含まれていて、その分子量が約２０，０００のペプチドよりなる４量体を形成していて、Ｍｎイオンを各ペプチドあたり１個づつ含む金属蛋白質である。酵素活性には、このＭｎイオンが必須である。
Ｍｎ−ＳＯＤは、ＣｕＺｎ−ＳＯＤに比して体内半減期が約１０倍も長いこと、さらにＳＯＤの代謝産物である過酸化水素に対して耐性であるため、ＣｕＺｎ−ＳＯＤよりもＭｎ−ＳＯＤの方が薬剤としてより有用と考えられる。
【０００８】
ところで、Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列については、ヒト型Ｍｎ−ＳＯＤの全アミノ酸１９８個のうち、１９６個からなるアミノ酸配列が報告された［バラ等（Ｂａｒｒａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ２５９， １２５９５−１２６０１， １９８４）］。
次いで、上記論文のアミノ酸配列を引用してＤＮＡプローブを作製し、ヒトＴ細胞からＭｎ−ＳＯＤの全アミノ酸配列である１９８個のアミノ酸をコードするクローンが同定されたと開示されている（特開昭６４ー２７４７０号公報）。
【０００９】
更に、特開昭６４ー６３３８３号公報には、ヒト型Ｍｎ−ＳＯＤが記載されていて、そのうちのＩＶａと表示されたポリペプチド（野生株）に対応するものの等電点がｐＩが８． １５であったと記載されている。しかしながら、同公報に記載されたｈＭｎ−ＳＯＤは、野生株の天然型Ｍｎ−ＳＯＤに対して他のアミノ酸残基を何ら置換されたものではなく、更に同公報に記載されたＤＮＡ配列は、後述する本発明に係るヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤとは著しく異なっている。また、この等電点がどのような方法で測定されたのか一切不明であるうえに、文献［Ｂ．Ａ． Ｏｍａｒ ＆ Ｊ．Ｍ． ＭｃＣｏｒｄ： Ｊ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２３， １４９−１５９ （１９９１）］ にも、このペプチドに該当するものの等電点が７． ４であると記載されているように、これまでのヒト型Ｍｎ−ＳＯＤの等電点が通常７． ０から７． ４の間にあるとされていることをも勘案すれば、上述した等電点は通例に比べて余りにも高すぎて唐突過ぎると言わざるを得ない。
【００１０】
また、ヒト型ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端部から３番目のアミノ酸ＳｅｒがＡｒｇに変異したものが同定されたとの報告がある（Ｓ．Ｌ． Ｃｈｕｒｃｈ： Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １０８７，２５０−２５２， １９９０）。しかしながら、その後著者自身がこのアミノ酸配列は誤報であったとの訂正がなされている（Ｓ．Ｌ． Ｃｈｕｒｃｈ： ＢＢＡ， １１７１， ３４１， １９９３） 。
【００１１】
ところで、Ｍｎ−ＳＯＤは高分子であるため組織浸透性が良好とは言えない。一方、酸素ラジカルは、酸素が生体内中隙間なく分布するため何れの組織あるいは器官においても発生する。従って、体外より投与されたＭｎ−ＳＯＤが体内で治療あるいは予防作用を効果的に発揮するためには組織浸透性のよいことが要求される。
【００１２】
しかしながら、従来のＭｎーＳＯＤをＳＯＤ欠乏に起因する各種の炎症性疾患、癌、未熟児網膜症、高血圧症、糖尿病等に対して投与した場合、もともと必要な局所に存在する内在性のＳＯＤと異なり、必要な局所に浸透せず治療効果は不充分であった。従って、組織浸透性の良いヒト型Ｍｎ−ＳＯＤの開発が強く要望されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
前述したようにＭｎ−ＳＯＤは組織浸透性が良好でないといっても、ＣｕＺｎを含むＳＯＤに比べると、Ｍｎ−ＳＯＤはウサギの心筋組織への浸透能力が高いことが報告されている［Ｂ．Ａ． Ｏｍａｒ ＆ Ｊ．Ｍ． ＭｃＣｏｒｄ： Ｊ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２３，１４９−１５９ （１９９１）］ 。このことは、Ｍｎ−ＳＯＤの示す等電点がＣｕＺｎ−ＳＯＤより高いことと関係があると言われている。また関節滑膜への親和性も等電点の高い分子の方がより効果的である。ちなみにヒトの場合ＣｕＺｎ−ＳＯＤの等電点はｐＩ約５．１であるのに対し、Ｍｎ−ＳＯＤのそれはｐＩ約７． ０〜７． ４である。このように、等電点のより高いＭｎ−ＳＯＤは組織への浸透性が高まり薬理効果の増大が予想される。
【００１４】
従って、本発明は、組換えＭｎ−ＳＯＤ（ｒＭｎ−ＳＯＤ）遺伝子を用いて各種変異操作を行なった後得られたヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤを提供するものである。
また、本発明は、天然型のＭｎ−ＳＯＤの等電点よりも高い等電点を有する組み換え変異Ｍｎ−ＳＯＤを創製することを課題とする。
さらに、本発明の他の課題は、Ｍｎ−ＳＯＤの等電点が高くなることによって酵素活性が低下せずまた持続性も天然型と同等以上である新規Ｍｎ−ＳＯＤの創製を課題とする。
さらに、本発明のその他の課題は、等電点が高く、かつ、組織浸透性が高くなったことにより、従来の公知であるＭｎ−ＳＯＤに比べて、各種の炎症性疾患、癌、未熟児網膜症、高血圧、糖尿病等に対してより強力な薬理効果を発揮する新規組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを提供することを課題とする。
これらに加えて、本発明は、ヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤをコードした遺伝子、その遺伝子配列を含む発現プラスミド、その発現プラスミドを含む宿主細胞、ヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤの製造方法、およびそれを使用した疾病の予防または治療方法を提供することを課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
これまでは、Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列の中のたとえひとつのアミノ酸でもその他の塩基性アミノ酸で置換変異させると、その酵素活性は低下してしまい、充分な目的を達成することできなかった。
ところが、極めて驚いたことには、ヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端から３番目のアミノ酸残基であるセリン残基（Ｓｅｒ） をアルギニン残基（Ａｒｇ） に変えたヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼにおいては、その等電点がｐＩ約７．１〜７． ４からｐＩ８．１〜８．４と有意に上昇したのに対して、酵素活性、体内半減期、過酸化水素に対する耐性に関しては変化が見られず、上記課題を満たしたものであることを見出した。なお、ヒトＭｎ−ＳＯＤを大腸菌に組換える場合には、そのＮ末端にメチオニン残基（Ｍｅｔ ）が付加されるため、組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤにおいてはＮ末端より４番目のセリン残基（Ｓｅｒ ）がアルギニン残基（Ａｒｇ ）に変換することになる。
同様に、ヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端から３番目のアミノ酸残基であるセリン残基（Ｓｅｒ） をアルギニン残基（Ａｒｇ） に変えると共に、４２番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸残基（Ｇｌｕ） をバリン残基（Ｖａｌ） で置換したヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼも、その等電点が、野生株のヒトＭｎ−ＳＯＤのｐＩ約７．１〜７． ４からｐＩ８．５〜９．４と有意に上昇することを見いだした。
【００１６】
その結果を踏まえて、本発明者等は、更に上記課題を解決するために鋭意努力した結果、Ｍｎ−ＳＯＤの場合には極性アミノ酸残基の総和が等電点に反映されることを見出した。つまり、たとえば、Ｍｎ−ＳＯＤの酸性アミノ酸の総数は１９個であり、また塩基性アミノ酸数は２９であって、合計で塩基性アミノ酸数が１０個多いことが知られるが、この塩基性アミノ酸の数を減らすと等電点は減少し、一方増加させると等電点が増加することが見い出された。
【００１７】
換言すると、ヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（以下「ｈＭｎ−ＳＯＤ」と略称することがある）のペプチド配列において、他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない部位に、よりプラスに荷電したアミノ酸で置換することによって、等電点が所望の値以上に上昇したヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤが得られることを見いだして、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
つまり、本発明に係るヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（以下「ｈＭｎ−ＳＯＤ」と略称することがある）は、そのペプチド配列において、他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない部位に、よりプラスに荷電したアミノ酸で置換したヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤである。
【００１９】
本発明においては、ヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列における他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない複数の部位のそれぞれに、よりプラスに荷電したアミノ酸で置換させて、等電点を上昇させたヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤも提供される。
【００２０】
更にまた、本発明においては、ヒト型変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列において、他のアミノ酸残基に置換しても酵素活性に影響を及ぼさない部位に存在するアミノ酸残基を中性アミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基にて置換することによってその等電点が上昇したヒト型変異Ｍｎ−ＳＯＤが提供される。
【００２１】
ところで、ヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を系統的に比較した場合のヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を中心にした保存アミノ酸配列のみを表示すると以下の通りである［（）で囲むアミノ酸が保存アミノ酸であり、アミノ酸略称の上の数値はヒト組換Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列におけるＮ末端からのアミノ酸の位置を示す］。
【００２２】
このヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列において、アミノ酸残基が欠失、重複、置換等により異なる配列に変異した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを得ることができる。例えば、Ｎ末端より４番目のセリン残基をアルギニン残基（ヒト由来原料より精製した天然Ｍｎ−ＳＯＤにおいてはメチオニン残基がＮ末端に欠けているので３番目）に変えることによって、ｐＩを８．１〜８．４に上げることが可能である。
【００２４】
更に詳細には、例えば、天然型（野生株）のヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端から３番目のアミノ酸残基であるセリン残基（Ｓｅｒ） をアルギニン残基（Ａｒｇ） に置換したヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを大腸菌に組換えた場合には、ヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端にはメチオニン残基（Ｍｅｔ ）が付加されるので、Ｎ末端部のアミノ酸配列を示すと次のとおりである。つまり、
Ｎ 末端ーＭｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ…
↓
Ｎ 末端ーＭｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ…
この場合には、組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤにおいてはＮ末端より４番目のセリン残基（Ｓｅｒ ）がアルギニン残基（Ａｒｇ ）に変異されることになる。このセリン残基は、アルギニン残基の他に、リジン、ヒスチジン残基などの塩基性アミノ酸残基で置換されることもできる。
【００２５】
更に、ヒト組換Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列におけるＮ末端から４番のセリン残基を、アルギニン残基または別のアミノ酸残基で置換すると共に、同Ｎ末端から４３番目のグルタミン酸残基をバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン残基などの中性アミノ酸残基またはリジン、アルギニン、ヒスチジン残基などの塩基性アミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列をもつヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤは、酵素活性、体内半減期、過酸化水素に対する耐性については変化を及ばさないのに、その等電点だけを約ｐＩ８．５〜９．４にも上昇させることを見いだした。
【００２６】
更にまた、ヒト組換Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列におけるＮ末端から４３番目のグルタミン酸残基だけをバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン残基などの中性アミノ酸残基またはリジン、アルギニン、ヒスチジン残基などの塩基性アミノ酸残基で置換されたアミノ酸配列をもつヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤも、前述した２つの部位を変異させたアミノ酸配列をもつヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤよりも若干劣る程度に上昇した等電点を示すことが判明した。
【００２７】
なお、上述したヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列において、上記保存アミノ酸以外は大幅な構造の変化をもたらさない限り全て変異可能なアミノ酸である。つまり、理論的には、他のアミノ酸で置換されてもそのポリペプチドとしての酵素活性を喪失しない部位に存在するアミノ酸残基の全てまたは多くを、よりプラスに荷電（チャージ）されたアミノ酸残基、または、中性アミノ酸残基または塩基性アミノ酸残基で置換することも可能である。しかしながら、余りにも多くの部位を別のアミノ酸残基で置換すれば、場合によっては、全く別の蛋白質に変化する可能性があり、かかる蛋白質を医薬品として開発するには全くの新規物質として取り扱わなければならなくなり、ヒトＭｎ−ＳＯＤとして開発する利点が損なわれてしまい現実味がなくなる。また、前述した数よりも多い部位のアミノ酸を他のアミノ酸残基で置換することによってえられる新規ヒトＭｎ−ＳＯＤについても、抗原抗体反応などの克服困難な拒絶反応等の問題が生じる可能性があるので、かかるＭｎ−ＳＯＤを医薬品として開発するのは、かなりの困難が予想される。
【００２８】
従って、医薬品、化粧品などの開発に当たって、拒絶反応などの問題を考慮した場合には、本発明においては、ｈＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列における他のアミノ酸で置換される部位は、１個ないし４個が好ましい。
【００２９】
ｈＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列において、他のアミノ酸残基で置換されても酵素活性が変わらない位置にあるアミノ酸残基を置換される他のアミノ酸残基としては、例えば、アルギニン残基の他に、リジン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギンなどの塩基性アミノ酸残基、または、例えば、バリン残基の他に、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシンなどのアミノ酸残基を挙げることができる。
【００３０】
また、本発明において、ｈＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列において他のアミノ酸で置換される部位に存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することによって達成される等電点は、約ｐＩ７． ６以上、好ましくは約ｐＩ８． ０以上、更に好ましくは約ｐＩ８． １〜９． ４である。このように等電点を上昇させることにより、ヒトＭｎ−ＳＯＤの組織浸透性を上昇させることができる。
【００３１】
また、本発明には、上記ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を組換えたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ蛋白質および該ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列ならびにそれを形質転換された微生物をも包含される。
【００３２】
また、本発明には、例えばエリザベス・デー・ゲッツォフ等（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｄ．Ｇｅｔｚｏｆｆ ｅｔ ａｌ； Ｎａｔｕｒｅ： ３５８， ２３ Ｊｕｌｙ， Ｎｏ． ６３８４， １９９２ ）によってＣｕＺｎ−ＳＯＤについて報告されるように、活性中心の酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸）残基をグルタミン等の塩基性アミノ酸に変えることによって活性を数倍上昇させた後、例えば、Ｎ末端からの所定の位置のアミノ酸残基をその他のアミノ酸残基で置換することによって等電点を上昇させ、これによって組織透過性を増進させたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤおよび該ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列ならびにそれを形質転換された微生物をも包含される。
【００３３】
本発明に係る組換ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤは、例えば、ヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子配列における組換アミノ酸残基のアミノ酸配列に該当するアミノ酸残基を指令する遺伝子配列部分に変異を加えて置換されたアミノ酸残基を指令する遺伝子配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なう方法によって製造することができる。
【００３４】
つまり、例えば、ヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子配列におけるＮ末端から４番目のセリン残基のアミノ酸配列に該当するアミノ酸残基を指令する遺伝子配列部分に変異を加えて置換されたアルギニン残基またはその他のアミノ酸残基を指令する遺伝子配列を有するプライマーを用いて、および・または同Ｎ末端から４３番目のグルタミン酸残基のアミノ酸配列に該当するアミノ酸残基を指令する遺伝子配列部分に変異を加えて置換されたバリン残基またはその他のアミノ酸残基を指令する遺伝子配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法による増殖することによって製造することができる。
【００３５】
従って、本発明に用いることのできるプライマーのうち、Ｍｎ−ＳＯＤのＮ末端側のプライマーとしては次のものが挙げられる。
ＨＭＳー５： ５’ ＡＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡ ３’
（配列表１）
または
ＨＭＳー７： ５’ Ｃ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＣＣ Ｔ ３’
（配列表３）
また、Ｍｎ−ＳＯＤのＣ末端側プライマーとしては次のものが挙げられる。
ＨＭＳー６： ３’ ＧＣＴＡＧＣ ＡＡＴＡＣＧＡＣＧＴ ＣＴＡＣＡＡＴＴＣ ５’
（配列表２）
【００３６】
また、上記ヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端ペプチド配列の一部を指令する遺伝子配列を有するＮ末端側プライマーのうち、Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …配列のセリン残基を指令する遺伝子配列としては、他の塩基性アミノ酸配列を指令する遺伝子配列に変えるようなＮ末端側プライマーの変異配列の全てが包含される。
【００３７】
なお、例えば、天然型Ｎ末端側から１番目ないし７番目のＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列の一部分は次のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応する天然型Ｎ末端側Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
…ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００３８】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の１つの例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列１： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列２： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列３： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００３９】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の別の例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列４： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列５： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＴ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００４０】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の更に別の例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列６： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列７： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００４１】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の更に別の例は下記のとおりである。
…Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列８： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＡＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
部分遺伝子配列９： …ＡＡＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＣ …
【００４２】
また、例えば、天然型Ｎ末端側から４１番目ないし４３番目のＭｎ−ＳＯＤのペプチド配列の一部分は次のとおりである。
…Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｉｌｅ …
上記に対応する天然型Ｎ末端側Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
…ＣＧＣ ＧＡＧ ＡＴＡ …
【００４３】
上記の天然型末端側Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド部分配列に対応する、Ｎ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤのペプチド配列部分の１つの例は下記のとおりである。
…Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ …
上記に対応するＮ末端側変異Ｍｎ−ＳＯＤペプチド配列を指令する遺伝子配列は次のとおりである。
部分遺伝子配列１０： …ＣＧＣ ＧＴＧ ＡＴＡ …
【００４４】
その他、各種変異アミノ酸とそれをコードする各種コドンを含む遺伝子の配列を挙げることができる。
【００４５】
従って、本発明には、例えば、前述したような置換アミノ酸残基のアミノ酸配列に対応する遺伝子配列を含むプライマーも包含されるのは当然である。さらには上記プライマーを用いて作成された組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子ＤＮＡ配列、それによって作成されたｃＤＮＡおよび該ｃＤＮＡを形質転換された大腸菌などの微生物も包含される。
【００４６】
さらに、前記形質転換微生物を培養後、ＤＥＡＥセファロース（ファルマシア）、ＣＭセファロースなどを用いてカラムクロマトグラフィーなどを行なって活性画分を集め、集めた活性画分より常法に従ってエンドトキシン等のパイロゲンを除去することによって等電点を高めたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを製造することができる。
【００４７】
本発明の組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤには各種の安定化剤、賦形剤例えばアルブミン、ラクトアルブミン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、単糖類、２単糖類、３単糖類等を添加することができる。例えば、上記の２糖類の一層好ましい例としてトレハロース（αー［Ｄーグルコピラノシル］αーＤーグルコピラノース）の０．０２〜１Ｍ濃度を含む溶液が挙げられる。
【００４８】
本発明に係るヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの製剤例としては、例えば、組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端より４番目のセリン残基をアルギニンに置換した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤを下記処方のような注射用溶液に配合したものなどが挙げられる。つまり、
ＭＨＳ：ＳＯＤ １００ｍｇ
トレハロ−ス ０．２３Ｍ（最終濃度）
グルタミン酸ナトリウム １０ｍＭ
希釈水酸化ナトリウム ｐＨ７．２〜７．４に調整後、
蒸留水（パイロゼンフリ−）を加えて全量を１０ｍｌにする。
この溶液をバイアルに分注して保存する。
【００４９】
本発明の組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの投与量は、例えば、０． ０１ｍｇ〜１ｇ／ ｋｇ／ 日、好ましくは０． １ｍｇ〜５０ｍｇ／ ｋｇ／ 日であり、点滴、静注、筋注、皮下注、坐剤ないしは点鼻薬としてまたは関節腔へも投与することができる。なお、投与料や等よ方法などは、疾患の種類や程度、患者の状態などにより、適宜変えることができる。
なお、本発明に係る組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの毒性は極めて少なく、例えば組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤのＮ末端より４番目のセリン残基をアルギニンに変えた組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤはＳＤ雄ラットへの５０ｍｇ／ ｋｇの尾静脈からのボーラス投与によって何等の毒性も観察されなかった。
【００５０】
こうして得られた本発明に係るヒトＭｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列のＮ末端より４番目がアルギニン残基に変異した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤは、これまで効果が明確でなかった関節炎のラットモデル等に対して有意の抗炎症作用を発揮した。
【００５１】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は下記実施例によって何等制限されるものではない。
【００５２】
遺伝子操作についての実験は、基本的にはサンブロック等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．， １９８９）の「モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル」（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」）に従って行なった。蛋白化学、精製その他の手法についてはパッカー編［（Ｌｅｓｔｅｒ Ｐａｃｋｅｒ，ｅｄ）Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１０５ １９８４ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］を参考にした。
【００５３】
実施例１ー１：ｃＤＮＡの作成
常法に従ってヒト培養細胞より抽出したｍＲＮＡあるいは公知のｐｈＭｎＳＯＤ４ｃＤＮＡを鋳型として用い、次にＮ末端から４番目のアミノ酸残基セリンをアルギニン残基に変異させた配列を有するＮ末端側プライマーとしてＨＭＳー５プライマー（配列表１）を化学合成し、これにＣ末端プライマーＨＭＳ−６（配列表２）を化学合成し、ＨＭＳー５およびＨＭＳー６の両プライマーを用いて遺伝子増幅法によりヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を増幅させた。
【００５４】
続いて、得られたヒト変異ＳＯＤ遺伝子を制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化された発現ベクター（Ａ）に前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した。発現ベクター（Ａ）は蛋白質の過剰発現用に用いられ、強力なｔａｃプロモーターをもち、適当な宿主中（ＪＭ１０５）でｌａｃリプレッサーによって調節され、培地へのイソプロピルーβーＤーチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される（図１ーＡ）。
【００５６】
実施例１ー２：
常法に従ってヒト培養細胞より抽出したｍＲＮＡあるいは公知のｐｈＭｎＳＯＤ４ｃＤＮＡを鋳型として用い、次にＮ末端から４番目のアミノ酸残基セリンをアルギニン残基に変異させた配列を有するＮ末端側プライマーとしてＨＭＳ−７プライマー（配列表３）を化学合成し、これにＣ末端プライマーＨＭＳ−６（配列表２）を化学合成し、ＨＭＳー７およびＨＭＳー６の両プライマーを用いて遺伝子増幅法によりヒト変異ＳＯＤ遺伝子を増幅させた。
【００５７】
実施例２：プロモーターおよびベクターの選択
大腸菌用プロモーターとしてＰａｃやその改良型Ｐｔａｃ＊ の下流にヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含むｃＤＮＡを連結することによって目的の発現プラスミドを作成した。Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子の両端にはそれぞれＥｃｏＲＩかＮｃｏＩおよびＰｓｔＩサイトを設置しプロモーターと連結した。こうして得られたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含む発現プラスミドを宿主大腸菌に導入しアンピシリン耐性菌として形質転換体を選抜した（図１）。
【００５８】
実施例３：培養および分離精製
ヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含む発現プラスミドで形質転換された大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５をアンピシリン４０ｍｇ／ｌおよび塩化マンガン１５ｍＭを含む培地中で３７℃１５時間撹拌培養した。培養後ブレンダーにて細胞を破砕し低速遠心によって上清をえた。
こうして得た上清をＤＥＡＥセファロースに負荷してリン酸緩衝液を用いてクロマトグラフィーを行なう。続いて活性画分をＣＭセファロースを行なって高濃度リン酸緩衝液により溶出し活性画分を集める。集めた活性画分より常法に従ってエンドトキシン等のパイロゲンを除去した。
得られた精製組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤをマッコード等（ＭｃＣｏｒｄ， Ｊ．Ｍ．， Ｆｒｉｅｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４， ６０４９〜６０５５，１９６９ ）の方法に従って測定したところ、約４９００単位／ｍｇ蛋白質の活性を示した。一方対照に用いた組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤは約４８００単位／ｍｇの活性を示し、両者間に違いは見られなかった。
こうして本実施例によって得られた変異Ｍｎ−ＳＯＤはＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤと略称した。
【００５９】
このＭＨＳ：ＭｎＳＯＤのアミノ酸配列と遺伝子配列は次のとおりである。
実施例４：精製ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの酵素学的性質
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量約２００００の単一バンドを示した。天然型およびＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを各１０μｇ 含むスラブ型ポリアクリルアミドゲルを含有するｐＩ３．０〜９．０の等電点電気泳動を行なった結果、天然型Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約７．２を示した。一方、ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約８．２を示し明らかに天然型のＭｎ−ＳＯＤと異なっていた（図２）。
各種濃度の過酸化水素およびシアンの存在下でのＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの安定性を検討したところ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤの失活する過酸化水素濃度でＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤは失活せず、シアン耐性もＭｎ−ＳＯＤと変らなかった。
【００６１】
得られた本発明のＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を上記に示したが、Ｎ末端より４番目のセリンがアルギニンに変異したヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤであることがＮ末端分析により確認された。
【００６２】
実施例５：他のヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子におけるセリン残基の置換
Ｎ末端より５９番目のイソロイシン残基がスレオニン残基に置換しこれによって酵素活性が約５０％に落ちた組み換え変異Ｍｎ−ＳＯＤのＮ末端ーＭｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ …配列部分のセリン残基（Ｓｅｒ ）を実施例１〜４の方法に従ってアルギニン残基（Ａｒｇ ）に変えた組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの場合においては、酵素活性は天然型に比較して約５０％のままで等電点のみがｐｌ約７．０からｐｌ８．１〜８．３と上昇したのが確認された。これによって組織浸透性も上昇したことが確認できた。
【００６３】
実施例６：ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの体内持続性
ラット尾静脈よりＣｕＺｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤおよびＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの各１０ｍｇ／ Ｋｇを投与後頚動脈より経時的に採血し持続性を測定した結果、それぞれ半減期６分、７４分および８２分を示した（図３）。
【００６４】
実施例７：アジュバント関節炎に対するＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの治療効果
レービス（Ｌｅｗｉｓ）雄ラット（６〜７週齢）体重２５０〜３００ｇのものを用いる。エーテル麻酔後尾部皮下にツベルクリン針を用いて０．１ｍｌの結核菌（５ｍｇ／ｍｌ流動パラフィン）液を投与する。
ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの１０００単位／ラットを後足関節に３日目より投与を開始し、２日に１回の割合で週３回投与を行なった。ＭＨＳ投与群で５週目より有意に抑制効果が見られた（図４）。
【００６５】
実施例８：再開通不整脈へのＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの治療効果
ＳＤラット雄（３００〜３５０ｇ）の心臓を摘出しランゲンドルフ法にて潅流を行なった。虚血５分前にＭｎ−ＳＯＤまたはＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの１００単位／ｍｌを投与後、３０分間虚血を実施し、再潅流後不整脈の出現頻度とその持続時間を測定した。
その結果、図５に示したようにＭｎ−ＳＯＤに比べて有意の頻度低下作用と持続時間短縮効果が見られた。
【００６６】
実施例９：血しょうクレアチニンキナーゼの放出抑制作用
フィンケ等は冠動脈血栓溶解時にウロキナーゼとともにＭｎ−ＳＯＤを併用することによりクレアチニンキナーゼの放出が防御されることを観察している［フィンケ等（Ｆｉｎｃｋｅ，Ｕ． Ａｒｚｎｅｉｍ Ｆｏｒｃｓｃｈ ３８Ｎｒ．１：１３８−１４２，１９８８）］。本発明の実施例１〜４で作成した組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤの１０ｍｇ／ｋｇと高分子ウロキナーゼ３ｍｇ／ｋｇをフィンケ等のイヌ心臓虚血再潅流モデルでの実験系にて虚血後に併用し検討し６時間後採血して血しょうクレアチニンキナーゼの測定を行なったところ大幅な血しょうクレアチニンキナーゼの放出抑制作用がみられ心筋の保護作用が観察された（図６）。
【００６７】
実施例１０：ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤに対する安定剤の効果
ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤは組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤと同様に高純度に精製された状態で不安定であり凍結融解、また長期保存等により活性が低下することがある。
そこでＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの５ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０６Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．８）にトレハロース０．２Ｍあるいはマルトース１２０ｍｇ／ｍｌを添加して凍結乾燥後５５℃３週間保存し活性の低下を検討した。その結果、糖無添加群では約７０％に活性が低下したが糖添加群では活性の低下が見られなかった。
【００６８】
実施例１１：ＭＨＳ２：ＭｎＳＯＤ調整におけるｃＤＮＡの作成
実施例１ー１に示した方法に従ってヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を増幅させ、発現ベクターに前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した。
続いて、ヒト培養細胞より抽出したｍＲＮＡあるいは公知のｐｈＭｎＳＯＤ４ｃＤＮＡを鋳型として用い、次にＮ末端から４番目のアミノ酸残基セリンをアルギニン残基に変異させた配列を有するＮ末端側プライマーとしてＨＭＳー７プライマー（配列表３）を化学合成し、これにＣ末端プライマーＨＭＳ−６（配列表２）を化学合成し、ＨＭＳー７およびＨＭＳー６の両プライマーを用いて遺伝子増幅法によりヒト変異ＳＯＤ遺伝子を増幅させた。続いて図８の遺伝子コードにおいて１３４番目の塩基アデニンがチミンとなるように塩基置換したプライマーをもちいてＮ末端より４３番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換した。
続いて、得られたヒトＭｎ−ＳＯＤ遺伝子をムングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ−ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）および制限酵素ＰｓｔＩによって消化し、制限酵素ＮｃｏＩおよびムングビーンヌクレアーゼによって消化後ＰｓｔＩで処理した発現ベクターに前記ヒト変異ＳＯＤ遺伝子を連結した。
【００６９】
実施例１２：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤのプロモーターおよびベクターの選択
大腸菌用プロモーターとしてＰｔａｃやその改良型Ｐｔａｃ＊ の下流にヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含むｃＤＮＡを連結することによって目的の発現プラスミドを作成した。Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子の両端にはそれぞれＥｃｏＲＩかＮｃｏＩおよびＰｓｔＩサイトを設置しプロモーターと連結した。こうして得られたヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を含む発現プラスミドを宿主大腸菌に導入しアンピシリン耐性菌として形質転換体を選抜した。
【００７０】
実施例１３：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの培養および分離精製
ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの遺伝子を含む発現プラスミドで形質転換された大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５を実施例３の方法に従って培養した後、得られたＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤを常法により分離精製した。
得られた精製ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤをマッコード等（ＭｃＣｏｒｄ， Ｊ．Ｍ．， Ｆｒｉｅｄｏｖｉｃｈ， Ｉ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４４， ６０４９ 〜６０５５， １９６９）の方法に従って測定したところ、約４９５０単位／ｍｇの蛋白質の活性を示した。一方、対照に用いた組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤは約４８３０単位／ｍｇの活性を示し、両者間に違いは見られなかった。適当量のトレハロース等を添加して凍結乾燥し保存した。
こうして本実施例によって得られた変異Ｍｎ−ＳＯＤはＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤと略称した。
【００７１】
このＭＨＳ２：ＭｎＳＯＤのアミノ酸配列と遺伝子配列は次のとおりである。
実施例１４：精製ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの酵素学的性質
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量約２００００の単一バンドを示した。天然型およびＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを各１０μｇ 含むスラブ型ポリアクリルアミドゲルを含有するｐＩ３．０〜９．０の等電点電気泳動を行なった結果、天然型Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約７．２を示した。一方、ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤはｐＩ約８．５〜９．４を示し、明らかに天然型のＭｎ−ＳＯＤの異なっていた。
各種濃度の過酸化水素およびシアンの存在下でのＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの安定性を検討したところ、ＣｕＺｎ−ＳＯＤの失活する過酸化水素濃度でＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤは失活せず、シアン耐性もＭｎ−ＳＯＤと変らなかった。
得られた本発明のＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤのアミノ酸配列を上記に示したが、Ｎ末端より４番目のセリンがアルギニンに変異したヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤであり４２番目がバリンであることが遺伝子構造解析により確認された。
【００７３】
実施例１５：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの体内持続性
ラット尾静脈よりＣｕＺｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤおよびＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの各１０ｍｇ／Ｋｇを投与後頚動脈より経時的に採血し持続性を測定した結果、それぞれ半減期６分、７６分および８８分を示した。
【００７４】
実施例１６：ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤに対する安定剤の効果
ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤは組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤと同様に高純度に精製された状態で不安定であり凍結融解、また長期保存等により活性が失われる。
そこで、ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの５ｍｇ／ｍｌ溶液（０．０６Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．８）にトレハロース０．２Ｍあるいはマルトース１２０ｍｇ／ｍｌを添加して凍結乾燥後５５℃３週間保存し活性の低下を検討した。その結果、糖無添加群では約７０％に活性が低下したのに対して、糖添加群では活性の低下が見られなかった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、等電点が有意に上昇したＭｎ−ＳＯＤを得ることができこれによって、組織浸透性を上げ各種の炎症性疾患、癌、未熟児網膜症、高血圧症、糖尿病等に対してより強力な薬理効果を発揮すると共に、化粧品としても使用することができる新規なＭｎ−ＳＯＤを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクター：大腸菌宿主においてＰｔａｃプロモーターの下流に組み換えヒト変異Ｍｎ−ＳＯＤ（＝ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤ）遺伝子を結合した。図中において、（ａ）はＰｔａｃ−ｈＭｎＳＯＤへの組み込みを示し、（ｂ）はＰｔａｃ＊ −ｈＭｎＳＯＤへの組み込みを示す。
【図２】ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤのラット血中における体内持続性を示すグラフ。グラフにおいて、○印はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを、●印は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤを示し、□印はＣｕＺｎ−ＳＯＤを示す。
【図３】ＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤの等電点電気泳動（アンフォライト、ｐＨ３〜９、ファーマシア社製）を示すグラフ。グラフにおいて、（ａ）は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤ、（ｂ）はＭＨＳ２：Ｍｎ−ＳＯＤ、（ｃ）は蛋白質スタンダードを示す。
【図４】ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤのアジュバント関節炎に対する抗炎症作用（ラット）を示すグラフ。グラフにおいて、○印はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤ、●印は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤを示す。
【図５】ＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤの冠動脈再開通後の不整脈出現頻度とその持続時間に対する作用を示すグラフ。グラフにおいて、（ａ）は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤ、（ｂ）はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを示す。
【図６】心臓虚血再潅流モデルでの心筋保護作用を示すグラフ。グラフにおいて、（ａ）はコントロール、（ｂ）は組み換えヒトＭｎ−ＳＯＤ、（ｃ）はＭＨＳ：Ｍｎ−ＳＯＤを示す。
【配列表】
Claims (11)
- ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列において、そのＮ末端から３番目のセリン基をアルギニン基で置換していることを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ。
- ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列において、そのＮ末端から４２番目のグルタミン基をバリン基で置換していることを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ。
- 請求項１または２に記載のヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼにおいて、そのＮ末端から３番目のセリン基をアルギニン基で、またそのＮ末端から４２番目のグルタミン基をバリン基で置換していることを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ。
- 請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼにおいて、等電点ｐＩが７．６以上であることを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼ。
- ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列において、そのＮ末端から３番目のセリン基がアルギニン基で置換されていること、および／またはそのＮ末端から４２番目のグルタミン基がバリン基で置換しているヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのペプチド配列をコードしていることを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子。
- 請求項５に記載のヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子において、上記置換部位を含む部分遺伝子配列を含むことを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのプライマー。
- 請求項５または６に記載の遺伝子を含むことを特徴とする発現プラスミド。
- 請求項７に記載の発現プラスミドを含むことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項５に記載のヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子を含む発現プラスミドを含む宿主細胞を培養することを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼの製造方法。
- 請求項６に記載のヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼのプライマーを用いてヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼの遺伝子を増幅することを特徴とするヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼの製造方法。
- 請求項１ないし４のいずれかの１項に記載のヒト変異マンガンスーパーオキシドジスムターゼを活性成分として含有する医薬品用または化粧品用組成物。
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