JPS63273473A - 熱安定性ヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ変異タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はタンパク化学および遺伝子工学の分野に属する
。さらに詳細には１本来のタンパクのアミノ酸配列にお
ける６位および１１１位の遊離システィンのいずれかま
たは両方が、中性アミノ酸で置換されているヒトＣｕ／
Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼに関する。

（従来の技術） スーパーオキシドジスムターゼは結合金属イオンを含有
する酵素タンパク系である。この系に属する酵素は、ア
ミノ酸配列および結合している金属のタイプの両方が異
なっている。スーパーオキシドジスムターゼのスーパー
オキシドイオンの分解を触媒する能力は、該酵素を薬剤
、化粧品および食品保存に有用なものとしている。ヒト
Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（以下ｈｓＯ
Ｄで表す）のアミノ酸配列は、　Ｊａｂｕｓｃｈら、…
匹ｈｅｍｉｓｔ■（１９８０）旦：　２３１０−２３１
６に記載されテいる。ｈｓＯＤ　ｃＤＮＡのクローニン
グと配列決定、および細菌と酵母でのｈｓＯＤの生産は
、欧州特許出願第８４１１１４１６．８号（１９８５年
４月２４日公開、第０１３８１１１号公報）に記載され
ている。

ｈｓｏｏの一つの潜在的な欠点は、熱に対して比較的不
安定なことである。この性質はこの酵素の貯蔵寿命、お
よび高温にして行われ得る薬剤２食品。

または化粧品の調製に使用される可能性を制限している
。これに関して、酵母のＣｕ／Ｚｎ５ＯＤは遊離のシス
ティンを含有せず、ウシのＳＯＤまたはｈｓＯＤよりも
熱安定性が゛低いことが知られている（Ｓｔｅｉｎｍａ
ｎ＋Ｈ，Ｍ、、　　Ｓｕ　ｅｒｏｘｉｄｅ　Ｄｉｓｎｕ
ｔａｓｅ　Ｖｏｌ　１．　　ｐｐ　１８−１９＋ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、　１９８２）。ｈｓＯＤの熱安定性の増大
に関する唯一の参照文献は、　　Ｊａｂｕｓｃｈらの文
献（前出）である。この文献は、天然ｈｓｏｏの１１１
位のＣｙｓをヨード酢酸でアルキル化すると、さらに安
定な分子を生じることを報告している。

ｈｓｏｏの変異タンパクを記載している唯一の参照文献
は、　Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８５）　ｖｏｌ　１
３．　Ｎｏ　６．　ｐｐ　２０１７−２０３４である。

この文献は、４位でＡ　１　ａ−＋Ｇ　１　ｕ置換され
ている変異タンパクを報告している。この変異タンパク
ではジスムターゼ活性は検出されず、その活性は天然分
子の２０倍以上低下したと推定された。

システィンの修飾は、その他の分子で行われている。例
えば、米国特許第４，５１８，５８４号は、適当なジス
ルフィド結合を有する分子の細菌内での生産を促進する
ために、生物学的活性に本質的ではないシスティンを中
性アミノ酸に置換したリンホカインの変異タンパクを記
載している。ＰｅｒｒｙおよびＷｅｔｚｅｌ、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　（１９８４）　２２６　：　５５５−５５７
は。

３位がｌ１ｅ−）Ｃｙｓ置換されており、３位と９７位
との間がジスルフィド結合し、そして５４位に遊離シス
ティンを有するＴ４リゾチームの変異タンパクを記載し
ている。この遊離システィンのアルキル化は、この変異
タンパクの熱安定性を増大させた。

これらの技術をまとめると、天然ｈｓＯＤの１１１位の
Ｃｙｓのアルキル化は熱安定性を増大させることが示唆
されるが、１１１位または他の位置のアミノ酸配列は機
能分子を生じるのか、そしてその様な変化は分子の熱安
定性を増大させるのかについては記載がない。実際、唯
一報告されているｈｓＯＤの変異タンパクはジスムター
ゼ活性を欠いており。

酵母、ウシおよびヒトのＳＯＤの相対的熱安定性は。

分子中に含有される遊離システィンではなく別のなにか
に依存することを示していることがわかる。

（発明の構成） 出願人らは、　ｈｓｏｏの６位と１１１位の遊離システ
ィンのいずれか、または両方を非荷電（中性の）アミノ
酸で置換すると２分子の熱安定性を増大させることを見
い出した。この両方のシスティンを置換したｈｓＯＤは
、単一のシスティン置換をしたｈｓｏ。

よりもかなり熱安定性である。それゆえ２両方のシステ
ィンを置換したｈｓＯＤが好適である。

従って、６位と１１１位のシスティン残基の少なくとも
一方が非荷電アミノ酸で置換されたｈｓｏｏの変異タン
パクが１本発明のひとつの面である。

本発明の他の面は、　ｈｓｏｏの熱安定性を増大させる
方法であり、該方法は、　ｈｓｏｏの６位と１１１位の
システィン残基の少なくとも一方を非荷電アミノ酸で置
換することを包含する。

この様な変異タンパクを含有する薬剤組成物および化粧
品組成物も２本発明のさらに他の面である。

上記の変異タンパクを生産するのに用いられるＤＮＡ　
、発現ベクターおよび組換え体止物もまた。

本発明の一部である。

（以下余白） （発明を実施するための様式） 本発明のｈｓＯＤ変異タンパクは、６位および１１１位
（ここでのアミノ酸の番号は、第１図に示した天然分子
の番号に対応する）の２つの遊離システィン残基の少な
くとも一方が、非荷電（非極性また１よ非荷電極性）の
、好ましくは非環式（非芳香族、非複素環式）のアミノ
酸で置換されている。

側鎖が水素であるアミノ酸（すなわちグリシン）。

脂肪族の側鎖を有するアミノ酸、または水酸基を持った
側鎖を有するアミノ酸は、置換に特に好適である。両方
のシスティンを置換する場合、２つの置換アミノ酸は同
じもの、または異なるものであり得る。システィンを置
換するのに用いられ得るアミノ酸の例としては、グリシ
ン、アラニン。

バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン
、アスパラギン、グルタミン、メチオニン。

プロリン、トリプトファン、およびチロシンがある。セ
リンおよびアラニンは、好適な置換残基である。天然ｈ
ｓＯＤの配列における他のアミノ酸も置換または欠失さ
せ得るが、そのような改変は変異タンパクのジムスター
ゼ活性とその熱安定性とに悪影響を及ぼさないものでな
ければならない。このような改変の数は１通常約５より
も少ない。

本発明の変異タンパクの詳細な例は、以下のとおりであ
る： 実施例の変異タンパクの特異的な例は。

ｈｓＯＤ　　ＡＩａ６．　　ｈｓＯＤ　　Ｇｌｙ６．　
　ｈｓｏｏ　Ｖａ１６．　　ｈｓＯＤ　　Ｌｅｕ６．　
　ｈｓＯＤ　　ｒｌｅ６゜ｈｓＯＤ　　Ｔｈｒ６．　ｈ
ｓＯＤ　　５ｅｒ６．　ｈｓＯＤ　　Ｇ１ｎ６．　ｈｓ
ＯＤ　　Ａｓｎ６．　ｈｓＯＤＭｅｔ６．　　ｈｓＯＤ
　　　５ｅｒｌｌｌ、　　ｈｓｏｏ　　Ａｌａｌｌｌ、
　　ｈｓＯＤ　　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓＯＤＶａｌ
ｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　ＬｅｕＬｌｌ、　　ｈｓｏｏ
　１１ｅＬＬＬ、　　ｈｓＯ［ｌ　　Ｔｈｒｉｌｌ、　
　ｈｓｏ口Ｇ１ｎ１ｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ａｓｎ１１
１．　　ｈｓＯＤ　　Ｍｅｔｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　
Ｇｌｙ６　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓｏ。

Ａ１ａ６　Ａｌａｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｌｅｕ６　Ｌｅ
ｕｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　ＩＩｅ６１１ｅｌｌｌ、　ｈｓ
ＯＤＳｅｒ６５ｅｒｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｔｈｒ６　Ｔ
ｈｒｉｌｌ、　ｈｓＯＤ　ＧＩｎ６　Ｇ１ｎ１ｌｌ　ｈ
ｓＯＤＡｓｎ６　Ａｓｎ１ｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｍｅｔ６
　Ｍｅｔｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｇ１ｙ６　Ａｌａｌｌｌ
、　ｈｓＯＤＧＩｙ６　Ｖａｌｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｇ
Ｉｙ６　Ｌｅｕｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｇｌｙ６１１ｅｌ
ｌｌ、　’ｈｓＯＤＧｌｙ６５ｅｒｌ１１．　ｈｓＯＤ
　ＧＩｙ６　Ｔｈｒｉｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｇ１ｙ６　Ｇ
１ｎ１ｌｌ、　ｈｓＯＤＧｌｙ６　Ａｓｎ１ｌｌ、　ｈ
ｓＯＤ　Ｇ１ｙ６　Ｍｅｔｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ａ１ａ
６　Ｇｌｙｌｌｌ、　ｈｓｏ。

Ａｌａ６　Ｖａｌｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６　Ｌａ
ｕｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６１１ｅｌｌｌ、　ｈｓ
Ｏ［１Ａ１ａ６５ｅｒｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ａｌａ６　
Ｔｈｒｉｌｌ、　ｈｓＯＤ　ＡＩａ６　Ｇ１ｎ１ｌｌ、
　ｈｓＯＤＡ１ａ６　Ａｓｎ１１１．　ｈｓＯＤ　ＡＩ
ａ６　Ｍｅｔｌｌｌ、　ｈｓＯＤ　Ｖａ１６　Ｇｌｙｌ
ｌｌ、　ｈｓｏ。

Ｖａ１６　　八Ｉａｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｖａ１６
　　Ｌｅｕｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｖａ１６　１１ｅ
ｌ１１．　　ｈｓｏ口Ｖａ１６５ｅｒｌｌｌ、ｈｓＯＤ
　　Ｖａ１６　Ｔｈｒｉｌｌ、ｈｓＯＤ　Ｖａ１６　Ｇ
１ｎ１ｌｌ、ｈｓＯＤＶａ１６　　八５ｎｌｌｌ、　　
ｈｓＯＤ　　Ｖａ１６　　Ｍｅｔｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ
　　Ｌｅｕ６　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓＯＤＬｅｕ６
　　八Ｉａｌ１１．　　ｈｓＯＤ　　Ｌｅｕ６　　Ｖａ
ｌｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｌｅｕ６　１１ｅｌｌｌ、
　　ｈｓｏ口Ｌｅｕ６　５ｅｒｌ１１．　　ｈｓＯＤ　
　Ｌｅｕ６　　Ｔｈｒｉｌｌ、　　ｈｓＯＯＬｅｕ６　
　Ｇ１ｎ１ｌｌ、　　ｈｓＯＤＬｅｕ６　　八５ｎｌ１
１．　　ｈｓＯＤ　　Ｌｅｕ６　　Ｍｅｔｌｌｌ、　　
ｈｓＯＤ　　ＩＩｅ６　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ
１１ｅ６　　八Ｉａｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　ＩＩｅ６
　　Ｖａｌｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　ＩＩｅ６　　Ｌｅ
ｕｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ１１ｅ６５ｅｒｌ１１．ｈｓＯ
Ｄ　　ＩＩｅ６　Ｔｈｒｉｌｌ、ｈｓＯＤ　　ＩＩｅ６
　Ｇ１ｎ１ｌｌ、ｈｓＯＤ１１ｅ６　　Ｍｅｔｌｌｌ、
　　ｈｓＯＤ　　５ｅｒ６　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓ
ｏｏ　　５ｅｒ６　　八１ａｌｌｌ、　　ｂｓＯＤＳｅ
ｒ６　シａｌｌｌｌ、ｈｓＯＤ　５ｅｒ６　　Ｌｅｕｌ
ｌｌ、ｈｓＯＤ　５ｅｒ６　１１ｅｌｌｌ、ｈｓＯＤＳ
ｅｒ６　　Ｔｈｒｉｌｌ、　　ｈｓｏｏ　５ｅｒ６　　
Ｇ１ｎ１１１．　　ｈｓＯＤ　　５ｅｒ６　　八５ｎｌ
ｌｌ、　　ｈｓＯＤＳｅｒ６　　Ｍｅｔｌｌｌ、　　ｈ
ｓＯＤ　Ｔｈｒ６　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓｏｏ　　
Ｔｈｒ６　　八１ａｌｌｌ、　　ｈｓｏ口Ｔｈｒ６　　
Ｌｅｕｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｔｈｒ６　１１ｅｌｌ
ｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｔｈｒ６　　Ｇ１ｎ１ｌｌ、　　
ｈｓＯＤＴｈｒ６　　八５ｎｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　
Ｔｈｒ６　　ＭｅＬｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｇ１ｕ６
　　Ｇｌｙｌｌｌ、　　ｈｓｏ。

ＧＩｎ６　　Ａｌａｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｇ１ｎ６
　　Ｖａｌｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　ＧＩｕ６　　Ｌｅ
ｕｌｌｌ、　　ｈｓＯＤＧ１ｎ６　５ｅｒｌｌｌ、　　
ｈｓＯＤ　　Ｇ１ｕ６　　Ｔｈｒｉｌｌ、　　ｈｓＯＤ
　　ＧＩｕ６　　八５ｎｌ１１．　　ｈｓＯＤＧｌｕ６
　　Ｍｅｔｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ａｓｎ６　　Ｇｌ
ｙｌｌｌ、　　ｈｓｏｏ　　Ａｓｎ６　　八ＩａｌｌＬ
　　ｈｓＯＤ＾ｓｎ６　　Ｖａｌｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ
　　Ａｓｎ６　５ｅｒｌ１１．　　ｈｓＯＤ　　Ａｓｎ
６　　Ｔｈｒｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ＾ｓｎ６　　Ｍｅｔ
ｌｌｌ、　　ｈｓＯＤ　　Ｍｅｔ６　　Ｇｌｙｌｌｌ、
　　ｈｓｏｏ　　Ｍｅｔ６　　Ａｌａｌｌｌ、　　ｈｓ
ｏ口Ｍｅｔ６　Ｖａｌｌｌｌ、ｈｓＯＤ　Ｍｅｔ６５ｅ
ｒｌｌｌ、ｈｓＯＤ　Ｍｅｔ６　Ｔｈｒｌｌｌ、ｈｓＯ
ＤＭｅｔ６　Ｇｌｕｌｌｌ、　　およびｈｓＯＤ　Ｍｅ
ｔ６八５ｎｌｌｌ　　である。

変異タンパクのＮ−末端は、変異タンパクを生産する生
物に依存してアセチル化され得る（天然ｈｓｏｏと同様
）か、またはアセチル化されていない。

細菌で生産された変異タンパクは、このようなアセチル
化がなされていないが、欧州特許出願第８４１１１４１
６．８号に記載された方法を用いて酵母で生産された変
異タンパクはアセチル化されている。

このようにアセチル化された変異タンパクが好適である
。同様に、生物、および変異タンパクとともに生産され
るシグナル配列に依存して、変異タンパクはグリコジル
化され得るか、またはグリコジル化され得ない。

本発明の変異タンパクをコードする遺伝子は。

オリゴヌクレオチドの合成および連結；第１図に示した
ＤＮＡ配列の部位特異的変異処理；および／または所望
のアミノ酸置換をコードする合成りＮＡ断片の、天然ｈ
ｓＯＤをコードするＤＮＡ配列への挿入により調製し得
る。部位特異的変異処理法は、当該技術分野で良く知ら
れている。例えば＋　Ｓｍ１ｔｈおよびＧｉｌｌｉａｍ
、む朋刀旦上旺堕並亘」」狙二江吐競ａｎｄ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　　（１９８１
）３：１−３２；　　ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｔｄｓＲｅｓ　（１９Ｂ２）１
０：６４８７−６５００、およびＢｒａｋｅら、　Ｐｒ
ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＩＪｓ＾（１９８
４）８１：４６４２−４６４６を参照のこと。変異遺伝
子を適当な原核または真核生物のレプリコン（プラスミ
ド、染色体、または細胞内でポリヌクレオチド複製の自
律単位としての性質を示すウィルスのような遺伝的要素
）に挿入し、得られた発現ベクターを適当な宿主生物ま
たは細胞に導入し２組換え体性物または細胞を変異遺伝
子が発現される条件下で増殖させ、そして得られた変異
タンパクを宿主から単離し得る。あるいは９分泌される
場合には、欧州特許出願第８４１１１１４１６．８号に
記載されている方法と同様の方法を用いて変異タンパク
を増殖培地から単離し組換え体ｈｓｏｏを生産し得る。

この欧州特許出願の開示内容は、ここに参照文献として
引用する。

発現ベクターを作成するには、変異配列をプロモーター
、リボゾーム結合部位、そして転写停止コドンおよび翻
訳停止コドンを有する適当な制御ＤＮＡ配列とともにベ
クター中に位置させる。コード配列の制御配列に対する
位置および方向は、制御配列の“制御°゛下でコード配
列が転写されるような位置および方向である：すなわち
、プロモーターはコード配列由来のｍＲＮＡの転写を制
御し；　リポゾームは翻訳過程を開始するためにリボゾ
ーム結合部位に結合し：そして翻訳を終止するために使
われる停止コドンは転写終止コドンの上流に存在する。

制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連する変異ｈｓ
ｏｏ遺伝子の発現を調節することを可能にする調節配列
を加えることが望ましい。

本発明のｈｓｏｏ変異タンパクは、　ｈｓＯＤと同様の
目的に用いられ得る。該変異タンパクは、より良い安定
性を有するので、混合または加工の際に高温の使用を必
要とする材料とともにより容易に調合される。この変異
タンパクは１種々の状態を処置（すなわち治療、苦痛の
緩和、または予防）するためのヒトまたは動物用薬剤に
用いられ得る。これらは、抗炎症剤１発癌および腫瘍の
発生を防ぐ化学予防剤、抗癌剤の細胞毒性および心臓に
対する毒性の効果を減少させる保護剤、または組織の虚
血防止剤として有用である。天然ｈｓｏｏと同様に。

変異タンパクはスーパーオキシドラジカルの過酸化水素
および酵素分子への還元を触媒し、このように虚血を伴
う潅流傷害を減少させ、切除単離した器官移植物の生存
能力を持続させ、器官移植またはを髄虚血症を伴う再潅
流での傷害を減少させ。

心筋梗塞の大きさを減少させ、そして気管支肺動脈形成
異常症を治療するのに用いられ得る。

医学への応用としては、この変異タンパクは。

錠剤、カプセル、および注射液のような多様な投与形態
で経口的または非経口的にそれぞれの個体に投与し得る
。インビトロで組織を処理するのに用いる場合には、変
異タンパクを潅流液または培養培地に添加する。この変
異タンパクは、そのまま投与するか、または効果的な量
を薬学的に受容され得る固体、半固体、または液体の賦
型剤（例えば、アルブミン、グロブリン、デキストラン
、フィコールポリマー、糖、デンプンおよびリポソー−
ム）と混合して投与し得る。好ましくは、　ｈｓｏ。

変異タンパクは、ＩＪ！（通常ショ糖であり９通常１：
２−／讐の割合で用いられる）とともに凍結乾燥して便
利に貯蔵される。凍結乾燥した酵素は、特定の適用の為
に適当な希釈剤で筒便に再調製される。

例えば、炎症性関節疾患の治療には、　ｈｓｏｏ変異タ
ンパクは関節的投与に都合のよい容量の生理食塩水で再
調製され得る。

個体に投与するｈｓｏｏ変異タンパクの投与量は。

治療を受けている個体の体質、治療の様式および治療を
受けている個体の状態に依存する。一般に投与される量
は、治療が望まれる部位に酵素学的に有効な量の変異タ
ンパクを供給するのに充分な量でなければならない。こ
の点に関して、変異タンパクを全身に投与する場合は、
変異タンパクを治療を必要とする部位に部分的に投与す
る場合よりも典型的には多くの投与量が必要である。炎
症性関節疾患を有するヒト患者は、実施例の方法により
、炎症を減少させるのに効果的な量のｈｓＯＤ変異タン
パク（通常１〜１０■、より一般的には２〜６■）を適
当な希釈液中に含有する溶液を、毎週疾患のある関節へ
関節的注射することによって治療される。注射は、炎症
を減少させるのに充分な期間にわたって毎週行われ、こ
の期間は通常２〜８週、より一般的には４〜６週である
。関節包は高分子量の化合物の漏出を制限するので、そ
れぞれの関節患部は必要な投与量で治療されるべきであ
る。虚血後の組織の損傷を最小に抑えるのに用いる場合
には、ヒト患者に１０■〜１　、０００■、より一般的
には適当な希釈液中のｈｓＯＤ変異タ変異タンパク５０
１−１ 病のために虚血を生じた場合，この溶液を静脈内または
関節内に丸薬投与または継続的な点滴として投与する。

このような場合には，　ｈｓＯＤ変異タンパクをウロキ
ナーゼ、ストレプトキナーゼ、または組織プラスミノー
ゲン活性化因子（ＴＰＡ）のようなフィブリン溶解剤と
組み合わせて投与し得る。

虚血による損傷が外科的方法による場合には，　ｈｓＯ
Ｄ変異タンパクを手術中に投与する。本出願は，好まし
くはｈｓＯＤが器官の再洗浄に先立って投与されるよう
な器官移植手術における特別な用法を見い出し、この用
法は心臓切開手術のように器官への血流が中断されるよ
うなその他のいずれの手術においても有用であることを
見い出している。

ｈｓＯＤ変異タンパクは、ケラチン物質の保護剤。

またはそのような組成物成分の酸化による劣化を防止す
るものとして、皮膚または髪を保護する化粧品組成物に
も使用し得る。例えば、これらｈｓｏ。

変異タンパクは、柔かさ、しなやかさ、または弾性のよ
うな皮膚や髪の質を維持または改善するため、または化
粧用調製物に使用される色素のような酸化され易いまた
は自己酸化され易い物質の酸化を防止するために、その
ような調合物に添加され得る。変異タンパクを含有する
化粧品調合物の形態は、固体（例えば、固形状洗顔料（
ｃｌｅａｎｓｉｎｇｂａｒｓ）　）　＋半固体（例えば
、クリーム、ゲル、軟膏）、または液体（例えば、スプ
レー、ローション、シャンプー）であり得る。このよう
な調合物中のｈｓＯＤ変異タンパクの量は２通常は約０
．０１〜５重量％、より一般的には０．０５〜１重量％
の範囲である。ｈｓＯＤ変異タンパクに加えて、化粧用
調製物は以下のものを含有し得る：天然油（例えば、オ
リーブオイル、アボカドオイルなど）のような脂肪運搬
物質；ステアリン、グリセリルモノステアレート、エチ
ルパルミテートセチルミリステート、イソプロピルオレ
エートなどの脂肪酸エステル；セチルアルコールまたは
ポリオキシエチレン化脂肪族アルコールのようなアルコ
ール；蜜蝋または合成ワックスのようなワックス；色素
、香料。

界面活性剤、防腐剤、糊料、または化粧品に通常含有さ
れる他の添加物を含有し得る。

これらｈｓｏｏ変異タンパクはまた２食品の成分の酸化
による品質の低下を防止するための防腐剤として食品に
添加し得る。

以下の実施例によりさらに本発明を説明する。

これらの実施例は、いかなる方法においても本発明を制
限することを意図しない。

（実施例） ｈｓＯＤ　ＡＩａ６の　　をコード　る　　ブースミド
ＹＳＯＤＡΩ構築 プラスミドｐＹｓＯＤＡの構築は第２図に示される。

次の配列を有するＤＮＡアダプター断片（第２図でＢと
命名されている）を合成した。

この断片は、コード配列（上側の鎖）のみがリン酸化さ
れた。そして、　ｈｓＯＤのＮ−末端配列（６番目のア
ミノ酸がシスティンの代わりにアラニンをコードするよ
うに変化したコドンを有する）をコードし、５′末端が
ＮｃｏＩ部位を、そして、３′末端がＪｕ１部位を有す
るように設計された。

プラスミドｐＡｓ１１ｒをＮｅｏ　Ｉで直線化し、アダ
プターＢに連結した。プラスミドｐＡｓ１１ｒは、　Ｓ
、Ｒ，３２２ベクター中にプラスミドｐＡｓ１１の発現
カセットを包含する。このｐＡｓｌｌの発現カセットは
、　ｈｓＯＤ遺伝子を、ヒトプロインシュリン遺伝子の
Ｎ−末端に、該２つの遺伝子の連結部がメチオニンコド
ンを形成するように融合させたものである。そしてこれ
ら遺伝子は、雑種誘導性の、　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓａｅ
アルコールデヒドロゲナーゼ２−グリセルアルデヒドホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２−ＧＡＰ）プロ
モーター、およびＧＡＰターミネータ−の制御下にある
。プラスミドｐＡｓ１１の組成および構築の詳細は。

共同出願である日本国特許出願、特願昭第６１−７０６
４８号に開示されており、そのｐＡｓｌｌに関する内容
は。

ここに示されている。（上記特順昭第６１−７０６４８
号においては、該プラスミドは、　ｐＹＡｓｌｌと命名
されている。）　Ｓ、Ｒ，３２２ベクターは、　Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　　（１９８５）並貼：　４３８４−
４３８９に述べられている。連結生成物を５ａｌｌで切
断し、得られた大きな断片をゲル精製した。

プラスミドｐｓ１１／８を」旦Ｉとｊ皿Ｉとで切断し。

６６０ｐＩ）　（７）−シ狙１−５ａｌＴ　断片（ヒト
プロインシュリン遺伝子のＮ末端に融合したｈｓＯＤ遺
伝子の部分を含む）を２分解物からゲル分離した。プラ
スミドｐＡｓ１１／８は、　ＧＡＰプロモーターおよび
ターミネータ−の制御下にあるヒトプロインシュリン遺
伝子のＮ−末端に融合したｈｓｏｏ遺伝子を含む。その
組成および構築の詳細は共同出願である日本国特許出願
、特願昭第６１−７０６４８号に開示されており、その
ｐＡｓ１１／８に関する内容は、ここに示されている。

（上記特願昭第６１−７０６４８号においては、該プラ
スミドは、　ｐＹｓｌｌ　と命名されている。）６６０
ｐｐのコＩ−５ａｉｌ断片を、直線状のｐＡｓｌｌｒ−
アダプターＢ構築物に連結し、プラスミドｐｓＩ６を調
製した。このプラスミドをＮｃｏｌ　と−５ｔｕｌ　と
で切断し、　１２６ｐｐの断片を分解物からゲル分離し
た。

プラスミドｐＧＡＰｓＯＤをＮｃｏ　Ｉ　と−５ｔｕｌ
　とで切断し、ベクターＤＮＡをゲル精製した。ｐＧＡ
ＰｓＯＤは。

ＧＡＰプロモーターおよびターミネータ−の制御下にあ
るｈｓｏｏ遺伝子を含む酵母プロモーターベクターであ
る。その組成および構築の詳細は、共同出願である日本
国特許出願、特願昭第５９−２０６４３４号に開示され
ており、このプラスミドに関する内容は、ここに示され
ている。（上記特願昭第５９−２０６４３４号において
は、該プラスミドは、　ｐＰＧＡＰｓＯＤと命名されて
いる。）　ｐｓＩ６からの１２６ｂｐの」匹１−　Ｓハ
■断片をベクター叶＾に連結し、プラスミドｐｓＯ［ｌ
Ａを形成させた。次いで、　ｐｓｏｏＡをＢａｍＨＩで
切断し。

Ｂａｍｌｌｌ発現カセットを単離した。この勿旧カセッ
トは、　ＧＡＰプロモーター配列とターミネータ−配列
とにはさまれ、６番目のアミノ酸の位置がＡｌａコドン
であるｈｓＯＤ遺伝子を有する。次いで、この発現カセ
ットを、」憇旧で分解し、ホスファターゼ処理したプラ
スミドｐｃｉ／１に１発現可能な方向にクローン化し、
　ｐＹｓＯＤＡを調製した。プラスミドｐｃ１／１は、
ｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９
７Ｂ）　２７５　：１０４）に由来する。このｐｃｉ／
１　は、　ｐＪＤＢ２１９中のバクテリアプラスミドｐ
Ｍ８９に相当する領域がｐＢＲ３２２で置換されたもの
である。

ｈｓＯＤ　Ｃｙｓｌｌｌ　コドンの、セリンをコードす
るトリプレットへの変異誘発を１Ｍ１３部位特異的変異
誘発法により行った。変異体Ｍ１３プラスミドおよびこ
れに関連するプラスミドの構築（ｐｙｓｏｏｓの構築に
包含される）は、第３図および第４図に示され、そして
、以下に述べられている。

プラスミドｐｓＯＤＸ８　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ　（１９８５）１３：２０１７−２０３４に
記載）を血■と韮■とで切断した。およそ４００ｂｐの
断片をゲル分離し、そして。

５ａｕ３Ａで部分分解し、　３２７ｂｐのｈｓｏｏ断片
を回収した。プラスミドｐｓＯＤＸ１６　　（Ｎｕｃｌ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８５）１３：２０１７−２
０３３に記載）を」旦Ｉと」憇ＩＩＩとで切断し、得ら
れた大きいベクター断片を９分解物中からゲル分離した
。このベクター断片を３２７ｂｐのｈｓＯＤ断片に連結
し、プラスミドｐｓＱＤｃＦｌを調製した。

プラスミドｐＳＩ８　（ｐＹＡｓｌｌ　（上記参照）由
来のｈｓＯＤ　−プロインシュリン融合発現プラスミド
であり、Ｓ。

Ｒ，３２２ベクター中にｐｓＹＡｌｌの発現カセットを
含む）を、　　ＮｃｏＩと５ｔｕＩとで切断し２分解物
中から１２４ｂｐの断片をゲル分離した。その断片を、
　ｐｓＯＤｃＦｌから５ｔｕｒ　と」閃旧とで分解して
単離された３３０ｂｐの断片に連結し、　４５４ｂｐの
ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。その断片をプラスミ
ドｐＨＢ５６　　（ヨーロッパ特許出願第８５１０５４
０５．６に開示されており、そのｐ　ＨＢ　Ｓ　６に関
する開示内容は、ここに述べられている）にクローニン
グし増幅した。

ファージベクターＭ１３ｒｐ８をＮｃｏｌ　と」憇旧と
で切断し、得られたベクター断片を上記４５４ｂｐのｈ
ｓＯＤ断片に連結し、　Ｍ１３ｒｐ８ＳＯＤ−１を調製
した。１本鎖ＤＮＡをこのベクターから調製し９次に示
す合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるインビト
ロでの部位特異的変異誘発の鋳型として用いた。

５’　−ＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＣＴＣＣ
ＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＣ−３’
変異誘導は、　Ｂｒａｋｅら、（前出）の方法に従って
行った。ｈｓＯＤ　Ｃｙｓｌｌｌ遺伝子を含む変異体Ｒ
Ｆ　Ｍ１３クローン（Ｍ１３ｒｐ８ＳＯＤＣ１１１Ｓと
命名された）を１次の配列を有し　３ｔｐで標識された
プローブを用いてスクリーニングすることにより同定し
た。

５’　　−ＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＡ
ＴＣ−３’この変異体Ｍ１３クローン旧３ｒｐ８ＳＯＤ
Ｃ１１１Ｓを、　　５ｔｕＩおよび」短目で切断し、　
３３０ｂｐの」旦１−　Ｂ憇ＩＩＩ断片を分解生成物中
から単離した。その断片を、　ｐｓＯＤｃＦｌを５ｔｕ
Ｉ　とＢａｍＨＩとで分解することによって調製された
ベクター断片に連結した。得られたプラスミド、　ｐｓ
ＯＤＸｃｓ、を」短目で分解し、以下に示される配列を
有する合成アダプター（第５図で（Ｃ）と命名されてい
る）をベクターに連結した。

ａｌＩ この連結生成物を９次に、　　５ｔｕｌ’で切断し、　
２６０ｂｐの５ｔｕＩ−５ａｌＩ断片をゲル分離した。

次いでこの断片を、　ｐＧＡＰｓＯＤを５ｔｕｌ　と５
ａｌＩ　とで分解することにより調製したベクターＤＮ
Ａに連結し、プラスミドｐｓＯＤｓ−ｔ−調製した。次
いで、　ｐｓｏｏｓを」短目で切断し、　ＧＡＰプロモ
ーター配列とターミネータ−配列とにはさまれたｈｓＯ
Ｄ　Ｃｙｓｌｌｌ遺伝子からなる断片を１分解物中から
単離した。その断片を。

Ｂａｍ１ｌｌで切断しホスファターゼ処理したベクター
ｐｃｔ／１に連結し、プラスミドｐＹｓＯＤｓを調製し
た。

ｐＹｓＯＤＡｓの構築が第６図に示されている。

上記２６０ｂｐ（７）断片（ｐｓＯＤＸｃｓから＋７）
　ＢａｍＨＩ−５ｔｕＩ断片からなり勿旧端に連結した
アダプター（Ｃ）を有する）を、　　５ｔｕＩ　と５ａ
ｌＩ　とで切断したｐｓＯＤＡにクローン化した。得ら
れたプラスミドｐｓＯＤＡｓをＢａｍ１１１で切断し、
　ＧＡＰプロモーター配列とターミネータ−配列とには
さまれたｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５ｅｒｌｌｌに対応する遺
伝子からなる断片を得た。その断片を。

勿Ｉ１１で切断したｐｃｔ／１に挿入し、　ｐＹｓＯ［
ｌＡｓを調製した。

７　　え　　　　　のｘ、−１ プラスミドｐＹｓＯＤＡ、　ｐｙｓｏｏｓおよびｐｙｓ
ｏｏａｓを酵母株２１５０−２−３　（ＰＮＡＳ　ＵＳ
Ａ（１９７８）７５：１９２９−１９３３に記載）に導
入して形質転換し、ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６．　ｈｓＯｏ　
５ｅｒｌｌｌおよびｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５ｅｒｌｌｌを
生産する組換え株を調製した。

（以下余白） ７．のｌ　　′よびｈｓＯＤ゛　　　ンパクの　１ｈｓ
ＯＤ　Ａ１ａ６．　ｈｓＱＤ　５ｅｒｌｌｌ、そしてｈ
ｓＯＤ　ＡＬａ６Ｓｅｔｌｌｌを生産する酵母株を１０
リツトルの培養液中で増殖させた。この増殖は、ロイシ
ンを欠く最小グルコース培地（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、
、　Ｆｉｎｋ、　Ｇ、Ｒ，、＆ｆｌｉｃｋｓ、　Ｊ、Ｂ
、、　　ｒ酵母遺伝学における方法」、（１９８２）　
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　Ｎｅ
ｈ　Ｙｏｒｋ）に５０ｕＭＣｕＳＯ４が補われた培地を
用いた前培養液５００ｍＮを。

３ｍＭ　ＣｕＳＯ４を含むＹＥＰＤ培地１０ｆに接種し
、　００６．。

が約２０となるまで増殖させることにより行われた。

酵母ペースト（湿重量１００〜２５０ｇ　）をグイノミ
ルビーズ破砕機を用いて、２０ｍＭ）リスＨＣＩ、　ｐ
Ｈ８の緩衝液中で溶菌させた。その溶菌産物を遠心分離
し、ペレットを緩衝液で２回洗浄した。洗浄物を最初の
上清と共にプールした。遠心分離後、約１リツトルの抽
出物を得、それをＮａＯＨでｐＨ８に調整し、−２０°
Ｃで保存した。その抽出物を解凍し。

６５°Ｃで２時間加熱した。沈澱したタンパクおよび細
胞破砕物を除去するために遠心分離を行い、８５０−の
澄明な抽出物を得た。緩衝液を最終容量が約８．５２に
なるように加えると、伝導率が１．２ｍｍｈｏになった
。これを４００ｄのＤＥＡＥ−セファロースカラムに流
した。そのカラムを同様の緩衝液で洗浄し。

緩衝液中のＮａＣ１を０．１５Ｍにまで上昇させる濃度
勾配により溶出させた。ピークを示す両分を３つのプー
ル（Ａ、ＢおよびＣ）に採取した。そのうちのＡは、ピ
ークの中央部からの物ｔの大部分を含み−Ｂは初期の画
分を含み；そしてＣは後期の両分を含む。これらプール
をフィルター滅菌しそしてその一部を４°Ｃおよび一２
０″Ｃでそれぞれ保存した。これらの両分の電気泳動を
行なった結果を第７図に示す。

この方法により２．５倍に精製され、そして少なくとも
９５％の純度のタンパクが得られた（第７図参照）。発
現レベル（全タンパクの約４０％）が高いために、２．
５倍の精製が限界である。全収率は約６０％であり；加
熱工程の収率は８３％であり、そしてカラムにかけたと
きの収率は約７０％であった。

加熱工程はｈｓＯＤ変異タンパクを精製するのに有用で
あり、そしてまた、除去するのが困難な細胞破砕物で濁
っている抽出物を澄明にするという点において有用であ
る。ＤＥＡＲ−セファロースカラムは残留している混入
タンパクおよび他の非タンパク性混入物（例えば、脂質
、炭水化物、および核酸）を除去する。

精製したｈｓＯＤ変異タンパクを粗抽出物の中に存在す
るタンパクと比較し、活性が存在することだけではなく
、タンパクそれ自身が修飾を受けていないことを確認し
た。加熱工程の間に反応が起こり得るため、これは特に
重要である。アガロースゲルによる未変性ゲル電気泳動
を用いれば、　ｈｓｏ。

に帰属する５つの荷電した異性体を分離することが一般
に可能である。これらは、＋２．＋１．Ｏ。

−１そして一２型と呼ばれる。事実、未変性ポリアクリ
ルアミドゲルおよびアガロースゲルの電気泳動により、
　ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５ｅｒｌｌｌは加熱後においても
見かけ上は変化していないことが見い出された。

第８図Ａから明らかなように、抽出物を６５゛ｃまたは
７０°Ｃで２時間加熱すると、アガロースゲル電気泳動
後に見られるバンドパターンは、はんのゎずかだけ変化
する。これは、非常に急速に移動するいくつかの微量成
分が失われるためである。しかし、その他については変
化はない。

ピロガロール法による測定によれば、　ｈｓＯＤ　Ａｌ
ａ６Ｓｅｒ１１１の比活性（３４０００／■）は、野性
型ｈｓＯｏ　（３５００Ｕ／■）とほぼ同程度である。

ピロガロール法は。

ピロガロールの自動酸化におけるスーパーオキシドアニ
オンラジカルを包含し、スーパーオキシドジスムターゼ
の簡便な測定法である（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（
１９７４）打：４６９−４７４）。

酵母で生成されたｈｓＯＤ変異タンパクの熱安定性の検
定は、粗抽出物を８０°Ｃで１０分間および２５分間加
熱し、そして第９図で示すように、加熱したスーパーオ
キシドジスムターゼのＳＯＤ活性を未加熱の対照のＳＯ
Ｄ活性と、　ＳＯＯ活性ゲル上で比較することにより行
なった（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ、　Ｃ，およびＦｒ１ｄｏ
ｖｉｃｈ。

！、、　Ａｎａｌ　ｔ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７１）４
４：２７６−２８７）　、第９図に示す結果によると、
　ｈｓｏ口＾１ａ６５ｅｒｌｌｌは、　ｈｓＯＤおよび
ｈｓＯＤ　ＡＩａ６およびｈｓＯＤ　５ｅｒｌｌｌより
も熱安定性の高いことが検知され得る。ｈｓＯＤ　ＡＩ
ａ６およびｈｓＯＤ　５ｅｒｌｌｌ　もまた、野性型ｈ
ｓＯＤよりも熱に対して安定であるように思われる。

ｈｓＯＤ　Ａｌａ６５ｅｒｌｌｌの Ａ、此虹虹　精製した組換えｈｓＯＤ、ウシＳＯＤおよ
びｈｓｏ口Ａｌａ６５ｅｒｌｌｌの熱安定性を、　２０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中、タンパク濃度２０ｕ
ｇ／ｍ１Ｍ：測定した。加熱後、　ＳＯＤ活性をピロガ
ロール法で測定した。第１０図は５０゛Ｃから７０°Ｃ
の温度で１時間加熱したときにＳＯＤ活性が除々に低下
する様子を示すグラフである。ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５ｅ
ｒｌｌｌは、これらの条件下において、熱変性に対して
最も抵抗性を示すことに留意されたい。熱変性に対する
抵抗性が次に高いのは、ウシＳＯＤであり、その次はｈ
ｓｏｏである。６０°Ｃで１時間保持した後、　ｈｓＯ
Ｄ　Ａｌａ６５ｅｒｌｌｌは８６％の活性を保持してい
る。これに対して、ウシＳＯＤおよびｈｓｏｏは、それ
ぞれ６８％および４８％の活性を保持している。

第１１図は６０°Ｃにおける変性の速度を示す。ここで
は、１時間後のｓｏｎ活性の差は先の実験よりも小さい
（６９％：６２％：５６％）。しかし、相対的な安定性
は先の結果と一致する。

ｈｓＯＤ　Ａｌａ６５ｅｒｌｌｌの安定性が向上してい
ることは、特に７０゛Ｃで加熱したときに明らかである
（データは示さない）。ここでは、３０分後、　ｈｓＯ
Ｄ　Ａｌａ６Ｓｅｒｌｌｌがその活性の２９％を保持し
ていたのに対して他の３０口では約１０％であった。そ
して７０°Ｃで９０分間保持した後においても、　ｈｓ
ＯＤ　Ａｌａ６５ｅｒｌｌｌはもとの活性の２５％を保
持していたが、他のＳＯＤは１０％を下まわる活性を保
持するのみであった。

Ｂ、Ｊ！ｕＬＬ　　実験の条件は、緩衝液が０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７，８）であること以外は、ｐＨ
４における場合と同じであった。第１２図は７０°Ｃに
おける不活性化の速度を示す。ここでは、安定性の差は
劇的である；　ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５ｅｒｌｌｌが最も
安定であり２次は、ウシＳＯＤであり、その次はｈｓＯ
Ｄである。

ｐＨ４で見られたのと同様の相対的安定性が認められる
が、　ｐＨ７，８においては、　ｈｓＱＤ＾１ａ６５ｅ
ｒｌｌｌは。

７０°ＣにおいてｈｓＯＤよりも１０倍長い半減期を有
する（１７５分：１６分）　、　ｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５
ｅｒｌｌｌはまた。ランＳＯＯよりも２倍を越える程度
安定である（１７５分二８イ分）。

タンパク化学、遺伝子工学、医学および関連する分野の
当業者に明らかであるような１本発明を実施するための
上述の様式の改変は１本発明の特許請求の範囲内にある
。

（発明の要約） ヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ｈｓＯ
Ｄ）に対する本発明の熱安定性変異タンパクは、６位お
よび１１１位における遊離システィン残基の一方または
両方が非荷電アミノ酸で置換されている。

ここでは、特にｈｓＯＤ　Ａｌａ６．　ｈｓＯＤ　５ｅ
ｒｌｌｌ、およびｈｓＯＤ　Ａｌａ６５ｅｒｌｌｌが例
証されている。

４　　°　　の　　　なｉ″Ｈ 第１図は、　ｈｓＯＤをコードするＤＮＡ断片の配列お
よびｈｓＯＤのアミノ酸配列を示す。

第２図は、第１図に示したアミノ酸配列の６位がＣｙｓ
→Ａｌａ置換されている。　ｈｓｏｎ変異タンパク生産
に用いる酵母の発現プラスミドである。プラスミドｐＹ
ｓＯＤＡの構築の流れ図である（この変異タンパクをｈ
ｓＯＤ　Ａ１ａ６と命名する）。

第３図は、以下に述べるプラスミドｐＹｓＯＤＡｓの構
築に用いる中間体であるプラスミドｐｓＯＤｃＦ　１の
構築の流れ図である。

第４図は、以下に述べるプラスミドｐＹｓＯＤｓの調製
に用いる中間構築物である。変異Ｍ１３クローンＭ１３
ｒｐ８ＳＯＤＣ１１１Ｓの構築の流れ図である。

第５図は、第１図に示した配列のアミノ酸の１１１位が
Ｃｙｓ−”Ｓｅｒ置換されているｈｓＯＤ変異タンパク
生産に用いられ、酵母の発現プラスミドである。

プラスミドｐＹｓＯＤｓを構築するための流れ図である
（この変異タンパクをｈｓＯＯ５ｅｒｌｌｌと命名する
）。

第６図は、６位がＣｙｓ→Ａｌａ置換、そして１１１位
がＣｙｓ→Ｓｅｒ置換されているｈｓＯＤ変異タンパク
生産のための酵母発現プラスミドである。プラスミドｐ
ＹｓＯＤＡｓを構築′スるための流れ図である（この変
異タンパクをｈｓＯＤ　Ａ１ａ６５ｅｒｌｌｌ　と命名
する）第７図〜第９図は、実施例に記載の種々の電気泳
動を行ったゲルの分析結果を示す図である。

第１０図〜第１２図は、実施例に記載のｈｓＯＤ変異タ
ンパクの相対的熱安定性を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、６位および１１１位におけるシステイン残基の少な
   くとも一方が非荷電アミノ酸で置換されているヒトＣｕ
   ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼの変異タンパク。 ２、前記非荷電アミノ酸が非環式である特許請求の範囲
   第１項に記載の変異タンパク。 ３、前記非荷電非環式アミノ酸の側鎖が、水素、脂肪酸
   側鎖、または水酸基を有する側鎖である特許請求の範囲
   第２項に記載の変異タンパク。 ４、Ｎ−末端がアセチル化されている特許請求の範囲第
   １項、第２項、または第３項に記載の変異タンパク。 ５、前記システイン残基の一方だけが非荷電アミノ酸で
   置換されている特許請求の範囲第１項、第２項、第３項
   、または第４項に記載の変異タンパク。 ６、前記システイン残基の一方が６位にある特許請求の
   範囲第５項に記載の変異タンパク。 ７、前記システイン残基の一方が１１１位にある特許請
   求の範囲第５項に記載の変異タンパク。 ８、前記非荷電アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリ
   ン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、ア
   スパラギン、グルタミン、またはメチオニンである特許
   請求の範囲第１項、第４項、第５項、第６項、または第
   ７項に記載の変異タンパク。 ９、前記システイン残基の両方が非荷電アミノ酸で置換
   されている特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、ま
   たは第４項に記載の変異タンパク。 １０、前記非荷電アミノ酸が、グリシン、バリン、アラ
   ニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、
   アスパラギン、グルタミン、またはメチオニンである特
   許請求の範囲第９項に記載の変異タンパク。 １１、前記６位のシステイン残基がアラニンで置換され
   、前記１１１位のシステイン残基がセリンで置換されて
   いる特許請求の範囲第９項に記載の変異タンパク。 １２、ヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼの
   熱安定性を向上させる方法であって、６位および１１１
   位におけるシステイン残基の少なくとも一方を非荷電ア
   ミノ酸で置換することを包含する、方法。 １３、前記６位のシステイン残基だけが置換され、そし
   て前記非荷電アミノ酸がセリンである特許請求の範囲第
   １２項に記載の方法。 １４、前記１１１位のシステイン残基だけが置換され、
   そして前記非荷電アミノ酸がセリンである特許請求の範
   囲第１２項に記載の方法。 １５、前記６位のシステイン残基がアラニンで置換され
   、そして前記１１１位のシステイン残基がセリンで置換
   されている特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １６、特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに
   記載の変異タンパクを酵素的に有効な量で、薬学的に許
   容される担体と混合して含有する薬剤組成物。 １７、特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに
   記載の変異タンパクを酵素的に有効な量で、担体と混合
   して含有する化粧品組成物。 １８、特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに
   記載の変異タンパクをコードするＤＮＡ。 １９、特許請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡを生物体
   において発現させるための発現ベクターであって、 特許請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡを含み、該ＤＮ
   Ａが、該生物体における該ＤＮＡの発現を可能にするＤ
   ＮＡに作動可能なように連結されている、発現ベクター
   。 ２０、前記変異タンパクをコードするＤＮＡを発現させ
   る特許請求の範囲第１９項に記載のベクターを含有する
   宿主生物。