JPH01110631A - 微小循環障害に基づく心筋虚血傷害治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、微小循環傷害に基づく虚血傷害治療薬に関す
るものであり、ざらに詳しくは、ヒト銅、亜鉛型スーパ
ーオキシドディスムターゼＭＡＴｊ　Ｍ転子を有する組
替えＤＮＡで形質転換された単細胞微生物中で産生きれ
たヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に同一
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分とする
微小循環障害に基づく虚血傷害治療薬に関するものであ
る。

［従来の技術］ スーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）
は、次式に示す不均化反応により、スーパーオキシド（
・０２−）を消失させる酵素である。

・０−十・０−１−２１−１　　→０２　＋　Ｈ２０２
スーパーオキシドは、牛体における酸素毒性の中で最も
毒性の高い分子種で、炎症、未熟児酸素網膜症、放射線
障害、ガンなどの疾病を引き起こすと言われている。

虚血性心疾患は成人病の中で重要な位置を占めている。

この疾患は、心筋虚血にＪ：る細胞傷害に基づくもので
あり、その細胞（セ害の重要な因子として活性酸素が考
えられている。

近年、急性心筋梗塞発症後に自然再疎通が高頻度に生じ
ることが明らかになり、また、血栓溶解療法が普及する
につれて再疎通する症例が増加してぎた。かかる再疎通
時には、血球成分による微小冠血管塞栓が生じ虚血が遷
延すること、また、心臓手術時の人工心肺循環や人工弁
置換後に微小血栓による冠動脈塞栓が生じやすいことが
知られている。さらに、血管挙縮などに起因する冠微小
循環障害が、虚血性心疾患の原因として注目されてきて
いる。

このような冠微小循環障害による心筋虚血の特徴は、虚
血部位が散在性、かつ多発性であることである。虚血部
位が、かかる状態では、虚血は持続的であり、周辺部か
らの酸素供給が持続的に活性酸素を産生じ、心筋虚血傷
害が助長される。

従って、フリー・ラジカル・スカベンジャーが、かかる
心筋傷害に対する有効な治療薬になると考えられるが、
未だ十分有効なものは見出されていない。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、ヒトスーパーオキシドディスムターゼ
と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
含有する微小循環障害に基づく虚血傷害治療薬を提供す
ることにおる。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質
的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、微小
循環障害に基づく虚血傷害治療薬として有効であること
を見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明はヒトスーパーオキシドジスムターゼと実
質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効
成分とすることを特徴とする微小循環障害に基づく虚血
傷害治療薬に関するものである。

本発明のポリペプチドは、例えばポジティブレギュレー
ションサイトを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト
銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子
を有する組替えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し
、培谷物中に蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシ
ドディスムターゼ（以下ヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤという
）を採取することによって製造される。

前記ヒトＣＬＪ、Ｚｎ−３ＯＤのＣＤＮＡ合成の鋳型と
して用いられるｍＲＮＡは正常なヒト組織（肝臓、胎盤
、腎臓など）から分離される。組織からのＤＮＡの分離
は、フェノ−ルー−クロロホルム法、グアニジニウム−
熱フェノール法、グアニジニウム−塩化セシウム法など
の公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｔ、ら、　ＭＯ
ｌ（ＩＣＬＩＩａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

１８７−１９８．１９８２．Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
ト１ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　＞が利用で
きる。次いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セ
ファロースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをもつｎ＋Ｒ
ＮＡを分離する。

このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒトＣＵ。

Ｚｎ−３ＯＤのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物で
あるが、これをそのままＣＤＮＡ合成に用いる。まず、
逆転写酵素を用いｍＲＮＡを鋳型として一本鎖ＣＤＮΔ
を合成し、次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラービ
を用いて二本Ｍ１ｃＤＮＡを合成した後、適当なベクタ
ーに組込まれた形でｃＤＮＡを得る。これにはｄＧ−ｄ
ＣまたはｄＡ−ｄＴホモポリマー結合法（Ｎｅｌｓｏｎ
　、　Ｔ。

Ｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ＥｎｚｙｍｏｌｏＱ
Ｖ　、　６８．４１　。

’１９７９．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｉ
ｎｃ、　）やＯｋａｙａｍａ−Ｂ　ｅｒ（］　　法　（
Ｑｋａｙａｍａ、　　　Ｈ、ａｎｄ　　Ｂｅｒｇ　　。

ｐ、　、　ＭＯｌ、　Ｃｅ１ｌ　、　［３ｉｏｌ　、、
　２．１６１゜１９８２＞が利用できる。

この場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ含０
が低い場合は、効率の高いＱｋａｙａｍａ−［３ｅｒｇ
法が好ましい。この方法に必要なりＮＡおよび宿主菌は
ファルマシアＰ、Ｌ、バイオケミカルズ社カタログＮｏ
、２７−４７５０−０１として入手できる。

このようにして得られる絹換えＤＮＡをたとえばエシェ
リヒア−］す（Ｅ　５ｃｈｃｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　
ｉ　）　ｘ１７７６株あるいはＤ　Ｈ１株（Ｌｏｗ、　
Ｂ、　、　Ｐｒ。

ｃ　、Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　、　　
６０．　１６０゜１９６８　：Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　、　
Ｍ、　ａｎｄ　Ｙｕａｎ　、　　Ｒ，。

ＮａｊＵｒｅ　、　　２１７．　１１１０．　１９６８
　：Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、、Ｊ、Ｍｏｌ、３ｉｏｌ　、
１６６．５５７゜１９８３＞に導入して形質転換させる
。形質転換法は公知の方法（重定勝哉、細胞工学、ＶＯ
Ｉ、　２゜Ｎｏ、３．６１６．１９８３＞またはそれに
準する方法で行うことができる。アンピシリン耐性など
の桑剤耐性によりまず形質転換体を選別したのち、ヒト
Ｃｕ、Ｚｒｌ−３ＯＤｉ仏子に対応すると考えられる塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、これ
を３２Ｐで標識してプローブとして用い、公知のコロニ
ーハイブリダイゼーション法（ト（ａｎａｈａｎ、　　
　Ｄ、　　　ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ　　。

１００．３３３．１９８３）によりポジティブなシグナ
ルを示した形質転換体をｍｌＪ’（する。

これらの形質転換体より常法に従ってプラスミドＤＮＡ
を単離し、ＣＤＮＡ部分の塩基配列をＭａＸａｍ　−Ｇ
　１ｌｂｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ
　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｗ、　、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、
　Ｓｃｉ、、　７４゜５６０．１９７７＞またはジデオ
キシ法（ＭｅＳＳｉｎｌＪ、Ｊ、ら、　Ｎｕｃｌｃｉｃ
Ａｃｉｄｓｌ？ｃｓ、　、　９．３０９゜１９８１＞に
Ｊ：って決定し、ヒ１−Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤ　ＣＤＮＡ
の存在を確認する。確認には、ヒト赤血球より単離され
たＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤのアミノ酸配列（Ｊａｂｕｓｃｈ
、　Ｊ、　Ｒ，、［３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　。

１９．２３１０．１９８０＞またはダウン症候群患者に
由来する樹立細胞株より分離されたｍＲＮＡから賀−ら
れたＣＤＮＡの塩基配列（Ｓ　ｈｅｒｍａｎ。

し、ら、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、
　Ｓｃｉ、、　８０゜５４６５．１９８３＞を参考にす
ることができる。

次に得られたヒ１−Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤのｃＤＮＡを適
当な形質発現調節遺伝子の下流に連結する。

これにはトリプトファンオペロンプロ［−ター（ｔｒｐ
プロモーター）、ラクトースオペロンプロモーター（ｌ
ａｃプロモーター）、λファージのＰＬプロモーター、
ｔａｃプロモーターなどの公知のプロモーターが利用で
きる。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内には０２−を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦、スー
パーオキサイドと医学、５８゜１９８１、共立出版）、
従って、０２−を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
さヒることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多足に産生させることが好ましい。

エシェリヒア・コリから分離されたプラスミドＣ０１Ｅ
ｌ上に存在するコリシンＥＩＬｔ転子はコリシンＥ１タ
ンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常の状態
においてはリプレッサータンパクがオペレーターに結合
することにより遺伝子の発現は抑制されでいるが、ＤＮ
Ａに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照射、マ
イトマイシン処理、ナリジキシン酸処理などによりこの
抑制が解除されて誘発が起り、コリシンＥ１タンパクが
多量につくられる。これはいわゆる負の制御と呼ばれる
調節機構である。これに加えて、コリシンＥ１３ｕ伝子
には正の制御も存在しており（調恒明ら、生化学、Ｖｏ
ｌ、５６．Ｎｏ、８．１０８２．１９８４）、ユニーク
な形質発現調節機構を持つ遺伝子であって、誘発時には
正の制御の効果も加わってきわめて多串のコリシン上１
タンパク質が産生される。さらにコリシン上１タンパク
質はエシェリヒア・コリに対する抗菌性を機能とするタ
ンパク質であって、通常時の細胞の成育には必要ないタ
ンパク質とみなし得るものであり、その性質上、通常時
のコリシンＥ１ｍ転子の発現が厳密に抑制されているこ
とからも、コリシン「１遺伝子の形質発現調節遺伝子の
利用は本発明にとってきわめて右利である。

Ｃｏｌ　　Ｅｌ　　ＤＮＡはたとえばファルマシアＰ。

Ｌ、バイオケミカルズ社のカタログＮ０．２７−／１９
１４−０１として入手することが可能である。

また、正の制御に関与する領域、プロモーター・オペレ
ーター領域、リポソーム結合領域からなるコリシンＥ１
遺伝子の形質発現調節遺伝子の塩基配列は既に報告され
ている（Ｅｂｉｎａ、　Ｙ、ら。

Ｇｅｎｅ、１５，１１９．１９８１＞、なお、本発明に
ａ３けるコリシンＥｌｎ転子の形質発現調節遺伝子とは
、第１図の−１４０から７８番目までの塩基配列の存在
を必須とするものでおる。

コリシンＥＩｉ転子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤ　ｃＤＮＡを連結する際に、いわゆ
る融合タンパク質を産生ずるような形での連結は、適当
な制限酵素の切断部位を利用することにより比較的容易
に行うことができる。

しかし、コリシン上１タンパク質に由来する部分がある
程度以上の長さを持っている場合、この融合タンパク質
を人体に投与した際に免疫原性（抗原性）を発揮する危
険性が充分に考えられる。従って、コリシンＥｌＷ転子
の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後にヒトｃｕ、ｚｎ−
ｓｏＤのＮ末端アミノ酸フトンが連結される形が好まし
い。しかし、これを満足させてくれるような適当な制限
酵素の切断部位はどちらの遺伝子にも存在しない。

そこで、制限酵素を用いて両方のＤＮＡ断片を必要部分
が欠失した形で切り出し、欠失した部分は合成りＮＡ断
片により補完することができる。

合成りＮＡ断片は、たとえば固相トリエステル法（Ｍｉ
ｙｏｓｈｉ、　Ｋ、ら、ＮＬＩｃｌ　、△ｃｉｄｓ　　
Ｒ（！Ｓ、。

８．５５０７，１９８０）によりオリゴヌクレオチドを
化学合成し、これらをたとえばＴ４ＤＮ△リガーＵでつ
なぎ合けることにより得られる。合成りＮＡ断片は、も
との塩阜配夕１１を再現するものである必要は必ずしも
ない。アミノ酸コドンには縮重が存在し、かつ生物の種
によってコドンの使用頻度が異なることは良く知られて
いる。従って、アミノ酸の配列を変えない限りにおいて
は、合成りＮＡ断片の作製時にどのようなコドンを選ん
でも自由でおるが、宿主菌中で使用頻度の高いコドンを
選択すると、遺伝子の発現量の増大が期待できる。コリ
シンＥｌｎ転子の形質発現調節遺伝子領域に関しては、
もとの塩基配列を再現する方が好ましいが、結果として
遺伝子の発現量の増加につながるような塩基配列の変更
は採用できる。

自律複製できるベクターに、コリシン［１逍伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成りＮＡ断片、ヒ
トＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤＩ造遺伝子断転子正しく組込むこ
とにより目的の組替えＤＮＡが１昇られる。これらのＤ
ＮＡ断片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結す
ることができ、最終的に得られる組替えＤＮＡの＠造が
目的とするものである限り、ＤＮＡ断片の連結順序に制
限はない。使用するベクターは宿主微生物内で複製可能
なものであれば特にｌ１１１限はなく、宿主がエシェリ
ヒア・コリの場合はｐＢＲ３２２が良く用いられている
。

得られた組替えＤＮＡをベクターの宿主微生物内に導入
し形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシェ
リヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、
特にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能す
る限りにおいては、バヂルスφズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）、１ナツカロミセス・
セレビシェ（３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｃｒｃｖｉ
ｓｉａｃ）等の他の微生物も使用できる。エシェリヒア
・コリの場合はＷ３１１０株、２Ｏ３Ｏ株、Ｃ６００Ｓ
　ａなどの名前があげられる。特にＷ３１１０株が好ま
しい。Ｗ３１１０株はエシェリヒア・コリに１２株の野
性法（λ　、Ｆ　　）から誘導されたλ−１「−株であ
り、米る要求性などその他の点では野性法と同一で必る
（　Ｂ　ａｃｈｍａｎｎ　、　Ｂ、　Ｊ、　、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗｓ。

３６．５２５．１９７２＞。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのら、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
１１り素地図の解析ににり第２次のスクリーニングを行
う。さらに誘発時のヒトＣｕ。

ｚｎ−ｓｏｏの産生能によって目的の形質転換体を選択
する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、チトクロームＣ−キサン
チンーキンヂンオキシダーピを用いる方法（Ｍｃ　Ｃｏ
ｒｄ　、　Ｊ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、
　１．。

Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｃｍ、、２／１４，６０４９．１
９６９）、ニトロブルーテ１〜ラゾリウム（ＮＢＴ）−
リボフラビンを用いる方法（Ｂ　ｃａｕｃｈａｍｐ、　
Ｃ。

ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、　　Ｉ　、　、　Ａｎａ
ｌ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｃｍｆｔ４４．２７６．１９７１
＞等が利用できる。ＮＢＴ−リボフラビン法は簡便であ
り、電気泳動後のタンパクの活性染色にも利用できるた
め便利である。エシェリヒア・コリの場合について言う
と、組替えＤＮＡから産生されるヒトＣｕ、Ｚｎ−３Ｏ
Ｄに加えて、宿主染色体から産生される１ｖｌｎ−３Ｏ
ＤおよびＦｅ−３ＯＤが混在している。これらのＳＯＤ
の酵素としての作用は同一であるが、Ｃｕ、Ｚｎ−３Ｏ
Ｄは１〜２ｍＭのＣＮ−又は青酸イオンによって活性が
阻害されるのに対し、Ｍｎ−３ＯＤ、Ｆｅ−３ＯＤは同
条件下での阻害を受けないことから区別できる。また、
これら３種のＳＯＤは分子量や等電点が互いに異なるた
め、電気泳動、イオン交換またはゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーによって分離することができる。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子、特にコ
リシンＥ１３ｍ転子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
ｃｕ、ｚｎ−ｓｏｏ構造遺伝子を有する組替えＤＮＡで
形質転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に適し
た条件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を行わ
せてヒトＣＵ、Ｚｎ−５ｏＤを大量に産生きせる。エシ
ェリヒア・コリの場合、たとえばＬ培地、グルコースお
よびカザミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培地により
培巷を行う。培養は通常１５〜４３℃の温度で２〜２４
時間行う。必要により通気、攪拌を加えることができる
。対数増殖期にあるＪ８養物にマイトマイシンＣ、ナリ
ジキシン酸などの薬剤を添加したり、紫外線を照射する
ことにより誘発合成を行わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパク質の精製法に従ってヒトｃｕ、ｚｎ
−ｓｏＤ活性を持つタンパク質を単離ツることによりヒ
１〜Ｃｕ、Ｚｎ−３ＯＤが製造できる。ｍ製は、たとえ
ば熱処理、塩析、濃縮、透析、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、クロマトフオー
カシング、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ア
フイニティクロマトグラフイーなどの操作を適宜組合せ
て行うことができる。

かくして製造されたヒトスーパーオキシドディスムター
ピと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、微小循環障害に基づく虚血傷害治療薬としての有効
性を示す。

本発明のポリペプチドは、通常の方法に従して注射剤、
錠剤、軟膏剤、カプセル剤、リポソームなどの製剤とす
ることができる。

本発明のポリペプチドは、例えば１〜”＋ｏｍｙの〕で
好適に用いられ、あるいは１日０．０１７〜０．１７ｍ
ｌ／Ｋｇ・体重の投与量で１回〜数回に分けて、例えば
、微小循環障害に基づく虚血傷害の治療を目的として、
経口的また非経［１的に投与し得る。

［実施例コ 以下、本発明の実施例および参考例を示す。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものでない。

参考例１　（ヒトＳＯＤのｃＤＮＡを組込んだプラスミ
ドｐｓＯＤ２の作製） 正常分娩によって得られたヒト胎盤から、グアニジウム
−塩化セシウム法によってＲＮＡを分離し、ついでオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースを用いてポリ（Ａ）テイルをしっ
たｍＲＮＡを分離した。

得られたｍＲＮＡより、岡１１１−バーグ法に従って、
ＣＤＮＡライブラリーを作成した。宿主菌として大腸菌
Ｄ　Ｉ−１１株を用いた。

コロニーバイブリグイセ−ジョン法にて、ヒトＳＯＤの
ＣＤＮＡが組込まれたプラスミドｐＳＯＤ２を保持した
大腸菌Ｄ）−１１（ｐｓＯＤ２＞株を得た。この菌株よ
り常法に従ってプラスミドｐＳ００２を単離した。

参考例２　（ヒトＳＯＤ産生用組替えＤＮＡの作製） コリシン２１３Ｍ仏子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ
トＳＯＤ構造道転子を連結して、組替えヒトＳＯＤを産
生きせるためのプラスミドは、第１図に示すストラテジ
ーに従って作製した。

（１）コリシンＥ１迫伝子の形質発現調節遺伝子断片を
組込んだプラスミドｐＡＯＫ１の作製コリシンＥ　１　
ＤＮＡ＠Ｄ　ｒ　ａ　Ｉテ切断し、ライで、５ｔｕＩで
切断したのち、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で３４０ｂＤの５ｔｕ■−ＤｒａＩ断片を得た。この断
片をプラスミドＩ）ＢＲ３２２の［）ｒａ■サイトに挿
入し、プラスミドＩ）ＡＯＫｌを作製した。

（２）ヒ１〜ＳＯＤ溝造道転子断片の作製プラスミドｐ
ＳＯＤ２をＡｌｕＩで切断し、ついでＴａｑ■で切断し
たのち、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で４４
．　Ｏｂ　ｌ）断片を得た。

（３）合成りＮＡの作製 コリシンＥ１Ｗ仏子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
５ＯＤＩ造遺伝子を連結するために、コリシンＥ１３４
０ｂｐ断片およびＳＯＤ構８道伝子の４４０ｂＤ断片で
欠失している部分８４　ｂｐを図２゛に示すように１２
個のオリゴペプチドに分割して合成した。

（／１）ヒトＳＯＤ産生用組替えＤＮＡの作製プラスミ
ドｐＡＯＫ１の［）ｒａＩｌ−ｉ’Ｍ：、８４ｂｐの合
成りＮＡと４４０ｂｐの５ＯＤＩ苦造遺伝子断転子挿入
し、コリシンＥ１ｎ仏子の形質発現調節遺伝子の下流に
、ヒト５ＯＤＩ造遺伝子が連結したヒトＳＯＤ産生用組
替えＤＮＡ、ｐＵＢＥ２を得た。

参考例３　ヒトＳＯＤを産生する組替え大腸菌Ｗ３１１
０（ｐＵＢＥ２＞（微工研条奇 第６３４号）株の作製 ＳＯＢ培地でｏｏｓｓｏ　＝０．５５まで培養した大腸
菌Ｗ３１１０株をＴｆｂＩついでＴｆｂＩＩで処理した
のち、処理液にプラスミドｐＵＢＥ２を加え、０℃で３
０分間、ついて４２℃で９０秒間熱処理して、プラスミ
ドｐＵＢＥ２を保持する大腸菌Ｗ３１１０　（ｐＵＢＥ
２＞株を得た。

参考例４　ヒトＣｕｔ、Ｚｒｌ−３ＯＤと実質上同一の
アミノ酸配列を有するポリペプチド の製造 カザミノ酸３００ｇ、グルコース４００９、テトラサイ
クリン１ｇ、Ｎａ２　ＨＰＯ４６００ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
３００９、ＮａＣ，ｌ！５０９、ＮＨ４ｃ、ｃ’＋ｏｏ
ｇ、ｖｑｓｏ４２４ｇ、ＣａＣｆ１２１．１１９、Ｃｕ
（、Ｑ２−２Ｈ２０５４０ｍｙ、ＺｎＳＯ４１７１−１
２ｏｓａｏｍｙ、ＦＦｅＳＯ４−７Ｈ２０６００１、Ｍ
ｎＳＯ４・Ｈ２０１５０ｍ１、Ａ、ｌ！　Ｃ，ｌ！　３
−６Ｈ２０１５０ｍｙとＨ３ＢＯ３７゜５ｍｇを含む滅
菌培地１００ρに、大腸菌Ｗ３１１０　（ｐＵＢＥ２）
を接種し、溶存酸素量を２　ｐｐｍ以上に保持するため
攪拌およびエアレーションを行いながら、ｐＨ７，１〜
７．４で、３７℃で培養を行った。

クレット７５まで培養したのち、培養液に、Ｎ　ａ２　
Ｐ　０４６００　ｇ、Ｋ１−１２　ＰＯ４３００ｙ、Ｎ
ａＣ，ｌ！５０９とＮ１−１４　ＣＮ　１００ｇを含む
水溶液２ｇ、グルコース１００ｇを含む水溶液１．１！
およびマイトマイシンＣ２００ｍｆｆを含む水溶液０゜
５ρを順次加えて誘発合成を３７℃で２時間行わせた。

誘発体１５０ｇを水６００威に懸濁して、フレンチプレ
スで破砕した。破砕液を遠心分離（８０ｏｏｒｐｍ、６
０分間）し、得られた上清液に０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
ｆ−１５，０＞３００ｄとＮａＣ，Ｑ　４３．’ｓｇを
加えたのち、水を加えて仝債を１．５ｆＪとし、ついで
０．７５ｍ１を加えた。

混合物を４℃付近の温度で１日攪拌したのち、β−メル
カプトエタノール１．１７！？を加えた。混合物をＮａ
ＯＨ水溶液でｐＨ７，０に調整したのち、４℃付近の温
度で１晩攪拌した。混合物に硫酸アンモニウム６８０ｇ
を加え、４℃付近の温度で３時間攪拌したのち、遠心分
離（８０００ｒｐｍ、１５分間）した。得られた上清液
に硫酸アンモニウム３８７ｇを加え、４°Ｃ付近の温度
で１晩攪拌したのち、生だ沈澱物を遠心分離（８０００
ｒｐｍ、１５分間〉で集めた。得られた沈澱物を１０ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７゜０）に溶解し
、１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，０）
に対して透析した。透析によって得た溶液を、１０ｍＭ
トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，０＞で平衡化し
たＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラ
ムに通した。このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミ
ンｔｌｉ液（ｐＨ７，０＞１．［！で洗ったのち、３０
ｍＭＮａ（Ｊ！　−１０ｍＭ　トリエタノールアミン緩
衝液（１１７，０＞で展開し、ヒトＳＯＤ含有画分を集
めた。１ｑられた両分に酢酸ナトリウム・３水和物４７
．６９とＮａＣ，ｌ！　１．０２．３９を加え、塩酸で
ｐｔ−＋を５．０に調整したのち、ＩＭＣｕＣ、ｌ！２
水溶液９０μｐを加えた。混合物を４℃付近の温度で１
晩攪拌したのち、ＮａＯＨ水溶液でＤＨを７．０に調整
し、０５ＭＮａＣｕ−１０ｍＭトリエタノールアミン緩
衝液（ｐＨ７，０＞で平衡化した同担持キレ−ティング
セファロース６Ｂ（ファルマシア社製）カラムに通した
。このカラムを０．５ＭＮａＣＪ−１０ｍＭトリエタノ
ールアミン緩衝液（ｐＨ７，０）３５０ｍ、ついで０．
５ＭＮａＣ，ｌ！−５０ｍＭリンＭ緩衝液（ｐＨ６，０
）１８００ｍで洗ったのち、５０ｍＭグリシン−０，５
ＭＮａ（ｊ！　−１０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液
（ｐｔ−１７，０＞で展開し、ヒトＳＯＤ含有画分を集
めた。集めた両分に硫酸アンモニウム３５５．５９を加
え、混合物を４℃付近の温度で４時間攪拌したのち、生
じた沈澱を遠心分離（９０００ｒｐｍ、２０分間）で集
めた。得られた沈澱物を１０ｍＭトリエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ７，０＞に対して透析した。透析液を、１
０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したＱセフ１０−スＦＦ（ファルマシア社製）カラ
ムに通した。このカラムを１０ｍＭトリエタノールアミ
ン緩衝液（ｐｌ−１７，０＞５００ｍ１で洗ったのち、
２０ｍＭＮａＣ、ｌ！−１０ｍＭトリエタノールアミン
緩衝液（ｐ　１−１７．０）で展開し、ヒトＳＯＤ含有
画分を集めた。

この両分に硫酸アンモニウム７８１ｇを加え、４℃付近
の温度で４時間攪拌したのち、生じた沈澱物を遠心分離
（９０００ｐｐｍ、２０分間）で集めた。１ｑられた沈
澱物を水に溶解し、水に対して透析したのち、凍結乾燥
すると、濃青緑色固体としてヒトｃｕ、ｚｎ−ｓｏＤ′
”と実質上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが
９３３ｍ５’ｔ＊られた。実施例１（マウスにお（プる
急性毒性試験）ｄｄＶ系雄マウス（体重３２±２ｇ）１
群８匹を用いて、本物質を生理食塩液に溶解し、静脈内
（ｉ、ｖ、）投与した。投与口は３０ｍＦＪ／に’ｊ、
”１００ｔｒｒｙ／Ｋｇ、３００Ｉ！ｒｇ／に３の３詳
である。投与後２週間中焉症状について観察したが、各
群とも異常なく生存した。屠殺後の解剖所見においても
、生理食塩液のみを投与したコントロール群（投与量Ｏ
Ｒｇ／Ｋｙ＞と何ら変わるところがなかった。従って、
マウスにおける本物質の静脈内投与におけるＬＤ５Ｑ値
は３００１ｒ１ｇ／Ｋｇ以上である（第１表参照）。

第１表 実施例２（急性冠微小血管塞栓に対する効果）体重１８
〜２０ｆｆｇの雑種成人をコントロール群（生理食塩水
投与）８例、ヒトｃｕ、ｚｎ−ｓ。

Ｄ投与群８例、計１６例を用いた。

実験穴をベンドパルビタール麻酔下で左肋間開胸し、内
題動脈より左冠動脈、前下行枝（ＬＡＤ）を体外バイパ
スチューブにて潅流した。急性冠微小血管塞栓モデルは
本チューブ内に直径１５μ７ｎのマイクロスフェア（Ｍ
Ｓ）を血流ｆｆ１１ｍ／分あたり、５Ｘ１０４個注入す
ることにより作成した。

冠血流但はバイパスチューブ内に装着した電磁流伍計に
より計測した。また心筋虚血の程度を表わす指標として
乳酸摂取率（ＬＥＰ）を局所冠静脈血採取により算出し
、局所心機能の指標として、前下行枝領域に超音波クリ
スタルデイメンジョンゲージを装着し、局所心筋短縮率
（ｒｅｇｉｏｎａｌｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｓｈｏｒｔ
ｅｎｉｎｇ　　：　ＦＳ）を計測した。

ヒトＣｕ、Ｚｎ−５００（コントロール群では生理食塩
水）は、マイクロスフェア注入１０分前に、２５ｒＩｔ
ｇ静注後、実験終了時まで２５Ｉｎｇ／時間で持続注入
した。マイクロスフェアの注入は、冠血流ｆｆ１１ｍｌ
１／分当り５万個で、血行動態の安定する１０分毎に反
復投与を行なった。マイクロスフェア注入前および注入
後に冠血流量、心筋虚血（ＬＥＲ）　、心機能（％ＦＳ
）を計測し、ヒトＣｕ。

Ｚｎ−３ＯＤの効果を検討した。

図３に示すようにヒトＣｕ、Ｚｎ−３ＯＤ投与によりＬ
ＥＲ１％ＦＳの悪化が有意におさえられ（Ｍａｎｎｏｖ
ａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓＰ　＜　０　、０５　＞　、冠
血流量がＯになるまでのマイクロスフェア塞栓量（最大
ＭＳ投与母）も５０万個／ｇ（心筋）から９０万個／ｇ
（心筋）に増大した。

次に、同モデルにおける心筋浮腫に対するヒトＣｕ、Ｚ
ｎ−８ＯＤの影響をしらべるために、虚血域（左前下行
枝領域）および非虚血域（左回旋枝領域）を取り出し、
（湿重量−乾燥重量）／乾燥重量＝粗減水分但を算出し
た。図４に示したように、ヒトＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ投
与により、虚血領域にみられる心筋浮腫は有意（Ｐ＜０
．０１＞に抑制された。

［発明の効果］ 本発明の虚血傷害治療薬は、微小冠血管塞栓などの虚血
１カ害の治療薬として有効である。

【図面の簡単な説明】

第１図は組替えヒトＳＯＤを産生せしめるためのプラス
ミドの作製手順を示す図である。 第２図は合成りＮＡ断片を示す図である。 第３図は、ヒトＣｕ、　Ｚｎ−３ＯＤ投与の右室ににる
心筋虚血（ＬＥＲ）　、心機能（％ＦＳ）、血流量の変
化を示している。 第４図は、Ｃｏｎｔｒｏ１時およびヒトＣＬＪ、　Ｚｎ
　−３ＯＤ投与時の組織水分量の比較を示している。 特許出願人　　　宇部興産株式会社 ７Ｎ開干１−１１０６３１　（１０）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトスーパーオキシドディスムターゼと実質的に
   同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分と
   することを特徴とする微小循環障害に基づく虚血傷害治
   療薬。
2. （２）ポリペプチドが単細胞微生物中で産生されたもの
   である特許請求の範囲第１項に記載の微小循環障害に基
   づく虚血傷害治療薬。
3. （３）単細胞微生物がポジテイプレギユレーシヨンサイ
   トを有する形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛型
   スーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する組
   替えＤＮＡで形質転換されたものである特許請求の範囲
   第２項に記載の微小循環障害に基づく虚血傷害治療薬。