JPH09500366A

JPH09500366A - 固形腫瘍及び他の疾患の治療のための薬剤の治療効果を改良する方法

Info

Publication number: JPH09500366A
Application number: JP7500873A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．デフィルスト，マーク; イー．ミーヤー，ロバート; ボナヴェンチュラ，ジョセフ; デアンゲロ，ジョセフ
Original assignee: アペックスバイオサイエンス，インコーポレーテッド; ドュークユニバーシティー; ノースカロライナステイトユニバーシティー
Priority date: 1993-05-24
Filing date: 1994-05-23
Publication date: 1997-01-14
Also published as: EP0705098A4; US6020308A; CA2163638A1; WO1994027585A1; EP0705098A1; US5788958A; US5554638A

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍血流および腫瘍酸素化を減少させるための抗腫瘍療法としての一酸化窒素（ＮＯ）活性阻害剤、例えばＮＯスカベンジャーまたはＮＯシンターゼ阻害剤等の使用に関する。本発明はまた、低酸素性または酸性化学療法剤あるいは加温を用いる腫瘍治療の効果を増強するための、ＮＯスカベンジャーまたはＮＯシンターゼ阻害剤の投与に関する。本発明はまた、腫瘍灌流を選択的に抑制するために、ＮＯシンターゼ阻害剤をあらかじめ投与した被験者にＮＯシンターゼ基質を投与することに関する。１つの実施例では、ＮＯスカベンジャーである無細胞ヘモグロビンを低酸素性細胞毒マイトマイシンＣと共に投与すると、マイトマイシンＣの単独投与に比較して、マウスにおけるヒト腫瘍異種移殖片の腫瘍増殖の有意な遅延がもたらされる。別の実施例では、ＮＯシンターゼ阻害剤の投与後にこの酵素の基質を投与すると、正常な血流は回復されるが、腫瘍血流の特異的不可逆的減少が引き起こされる。

Description

【発明の詳細な説明】固形腫瘍及び他の疾患の治療のための薬剤の治療効果を改良する方法１．発明の分野本発明は腫瘍の血流量及び酸素化を減少させる抗腫瘍治療として、又は低酸素性もしくは酸性化学療法剤あるいは加温療法による腫瘍治療の効果を増大させるための補助治療としての、一酸化窒素（ＮＯ）スカベンジャー(scavenger)またはＮＯ合成阻害剤の投与に関する。本発明はまた、阻害剤の正常組織における作用を逆転させるための、ＮＯシンターゼ阻害剤の投与に続くＮＯシンターゼの基質の投与に関する。２．本発明の背景２．１．低酸素性及び加温腫瘍治療固形腫瘍の治療に対する比較的新しく、珍しいアプローチは、腫瘍に低酸素症を誘発させた後、低酸素性細胞に対して選択的な細胞毒性を有する薬剤を投与することを含む（Chaplin and Acker，1987，Int.J.Rad.Oncology，Biol.Phys．16 :911-917; Brown and Koong，1991，J.Natl.Cancer Inst．83:178-185）。この戦略は、典型的には低酸素性細胞に対する細胞毒の全身投与の後、腫瘍の血流量を選択的に減少させる薬剤の投与を包含する。腫瘍血流量の低下により、腫瘍塊中に細胞毒性を有する薬剤が捕獲され、低酸素症の誘発を介してその細胞毒性が増加する（Babbs and DeWitt，1981，Med.Instrum．15:367-373; Chaplin and A cker，1987，Int．J．Rad．Oncology，Biol.Phys．16:911-917; Jain，1988， Cancer Res．48:2641-2658; Dewhirst et al.，1990，Int．J．Hyperthermia 6: 971-983）。腫瘍に対する加温補助治療は活発に研究されている領域である。温度上昇の達成は、血管拡張剤で腫瘍血流量を下げることで改善された（Dewhirst,et al.，1 990，Int.J.Hyperthermia 6:971-983）。腫瘍のアシドーシスも熱殺に対する実質的な増感につながる（G.M.Hahn and E.C.Shiu，Int.J.Radiat.Oncol.Biol Phy s.，11:159-164，1985）。腫瘍血流量を下げるためのこれまでの努力は、初期にはヒドララジンまたはニトロプルシドのような血管拡張剤に集中していた。全身の血圧を下げることは腫瘍血流量の減少につながるが、正常組織内の潅流は上昇するか、または影響されないことが示された。これらの薬剤の正常組織潅流に対する作用は、薬剤の細動脈または静脈の緊張に対する直接的な作用並びに心拍出量及び動脈血圧に対する全身的作用における組織選択性によるものである。腫瘍潅流の減少は、動脈血圧が低下した状態における高い間質液圧及び高い流量抵抗による、腫瘍における血管虚脱の結果であると考えられる（Sevick and Jain，1989，Cancer Res．49:35 06-3512）。この戦略はマウス系及び腫瘍の発生したイヌにおいて効果的に働くことが示された（Dewhirst et al.，1990，Int.J.Hyperthermia 6:971-983; Pre scott et al.，1990，Int.J.Hyperthermia 23:377-385）が、血圧の降下に直接関連している。しかしながら、腫瘍潅流の減少が観察されるために必要な血圧の減少は、正常血圧の約６０％になることから、このようなアプローチは臨床応用には比較的実行不可能なものとなっている。こうした血圧の減少は、高齢の患者あるいは衰弱した患者にとっては特に危険である。患者にとって安全な全身血圧の減少の程度では腫瘍血流量を感知できる程落とすためには十分ではない。２．２．一酸化窒素（ＮＯ）一酸化窒素（ＮＯ）は一般にラジカルとして考えられているが、ＮＯの化学的な性質は未だ研究領域である。近年、ＮＯが内皮弛緩因子として同定された。ＮＯは血管平滑筋でグアニル酸サイクラーゼに結合し、それによって血管拡張を促進する。Ｎ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＡ）によるＮＯシンターゼの阻害またはヘムタンパク質によるＮＯの除去によって、血管収縮及び高血圧症が引き起こされる（Martin et al.，1986，Br.J.Pharmacol．89:563-571; Mon cada et al.，1991，Pharm.Rev．43:109-142）。血小板の凝集もＮＯによって減少する（Radomski et al.，1991，Cancer Res．51:6073-6078）。ＮＯは中枢及び末梢神経系における神経伝達に関与している（Moncada et al.，1991，Pharma col.Rev．43:109-142）。Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニン及びＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンのようなＮＯ合成の阻害剤は腫瘍血流量を減少させることが近年示された（Andrade et a l.，1992，Br.J.Pharmacol．107:1092-1095; Wood et al.，abstract presented at 41st Ann．Meeting of Radiation Research Society，Dallas，Texas，Marc h 20-25，1993; Wood et al.，abstract presented at 42nd Ann．Meeting of R adiation Research Society，Nashville，Tennessee，April 29-May 5，1994）。この効果は、ＮＯ合成の前駆物質であるＬ−アルギニンを予め注射することによって阻害することができた（Andrade et al.，上述）。ＮＯ合成酵素の阻害剤であるＬ−ＮＭＡは腫瘍のＸ線に対する耐性を増加させることが見い出された（Wood et al.,上述）。ここに挙げた文献の引用または同定は、こうした文献が本発明の先行技術として利用できることを承認するものとして解釈すべきではない。３．発明の要約本発明は、一酸化窒素スカベンジャーまたは一酸化窒素シンターゼ阻害剤のような血管内の一酸化窒素活性の阻害剤を、腫瘍血流量または酸素化を減少させるために十分な量で被験者に投与することを含む、固形腫瘍を有する被験者の治療方法に関する。もう１つの観点として、本発明は、（ａ）腫瘍血流量または酸素化を減少させるために十分な量の血管内一酸化窒素活性阻害剤、及び（ｂ）低酸素性またはアシドーシス性化学療法剤、を投与することを含む、固形腫瘍を有する患者の治療方法に関する。もう１つの観点として、本発明は、一酸化窒素スカベンジャーまたは一酸化窒素シンターゼ阻害剤のような血管内の一酸化窒素の阻害剤を、腫瘍血流量または腫瘍酸素化を減少させるために十分な量で被験者に投与し、かつ加温治療を適用することを含む、固形腫瘍を有する被験者の治療方法に関する。もう１つの観点として、本発明は、腫瘍血流量または腫瘍酸素化を減少させるために十分な量の一酸化窒素シンターゼの競合的阻害剤（例えば基質類似体）を被験者に投与し、次いで、正常組織の血流量及び酸素化の減少を選択的に低減するために、一酸化窒素シンターゼの基質を投与することを含む、固形腫瘍を有する被験者の治療方法に関する。好ましい観点として、基質は正常組織の正常な血流量及び酸素化を回復させるのに効果的な量で投与する。更に他の観点として、本発明は、一酸化窒素スカベンジャーまたは一酸化窒素シンターゼ阻害剤及び低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒を含有する、固形腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。更に他の観点として、本発明は、一酸化窒素シンターゼの基質を含有する固形腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた：製薬上許容し得る形態の血管内一酸化窒素シンターゼ阻害剤、及び製薬上許容し得る形態の一酸化窒素シンターゼの基質、を分離した容器に含有するキットをも提供する。本発明は、その微小環境条件が変化する種々の固形腫瘍集団を選択的に標的とするために、治療方法を組み合わせる。本発明の１つの利点は、低酸素性腫瘍に対する低酸素性細胞毒の腫瘍特異的な毒性を増大させることができることであり、従って低酸素性細胞毒の効率を高めることができる。毒性効率の増大は投与量の減量を可能にし、従って毒性の副作用の減少を可能にし、あるいはより良い成果につながるより効果的な治療を可能にすることができる。本発明のもう１つの特有の利点は、低酸素性細胞毒を用いて好気性細胞の治療ができることである。さらに、本発明により、例えば、好気性腫瘍細胞に対して効果的な放射線と、低酸素性及びアシドーシス性細胞に対して効果的な加温療法及び薬剤とを組み合わせた強力な治療が可能になる。この組み合せによって、いずれかの治療を単独で用いるよりも、全ての生理学的な亜型にわたってより均一に細胞を殺すことができる。本発明のもう１つの利点は、正常組織に対して最小限の影響を有しながら、腫瘍細胞の亜集団に対して治療養生の適用を可能にすることである。実施例によって、ＮＯ阻害を低酸素性細胞の細胞毒であるマイトマイシンＣと組み合わせる治療的なアプローチの可能性を述べることにより、本発明を説明する。以下の、特定の実施例において、腫瘍の発生した動物をマイトマイシンＣの投与の４０分後にストローマフリー(Stroma-free)ヘモグロビン（ＮＯスカベンジャー）で処理した場合、マイトマイシンＣ単独で処理したものと比較して、腫瘍の成長の遅れの増大傾向が観察された。以下の、もう１つの特定の実施例において、Ｌ−ＮＭＡによるＮＯシンターゼ阻害により、腫瘍組織における血流が減少したが、この阻害剤の効果はＬ−アルギニンの投与によって正常組織で選択的に逆転した。４．図面の説明図１．フィッシャー３４４系ラットの平均細動脈血圧（ＭＡＰ）（白四角、白丸、及び十字を引いた四角）及び心拍数（白ひし形、白三角、及び黒ひし形）に対するＬ−ＮＭＡの静脈内投与の効果。データは３回の実験から得たものである。図２．フィッシャー３４４系ラットの動脈血圧及び心拍数に対する無細胞ヘモグロビン溶液の静脈内投与の効果。データは５回の実験から集めたものであり、弛緩期血圧（白四角）、収縮期血圧（白ひし形）及び平均血圧（白丸）はｍｍＨｇでの、及び心拍数（白三角）は１分間当たりの拍動数での測定値を意味する。図３．アルブミン（白四角）、ヘモグロビンＰ₅₀９（黒ひし形）及びヘモグロビンＰ₅₀３２（黒四角）で処理したラットの平均心拍数（拍数／分）の経時変化。データは１実験群当たり３匹のラットから平均したものである。図４．アルブミン（白四角）、ヘモグロビンｐ５０９（黒ひし形）及びヘモグロビンｐ５０３２（黒四角）で処理したラットの平均細動脈血圧（ＭＡＰ、ｍｍＨｇ）の経時変化。データは１実験群当たり３匹のラットから平均したものである。図５．アルブミン（白四角）、ヘモグロビンｐ５０９（黒ひし形）及びへモグロビンｐ５０３２（黒四角）で処理したラットの平均ヘマトクリット値。データは１実験群当たり３匹のラットから平均したものである。図６．アルブミン（白四角）、ヘモグロビンｐ５０９（黒ひし形）及びヘモグロビンｐ５０３２（黒四角）で処理したラットにおける筋肉の酸素化変化（ｍｍＨｇ）。データは１実験群当たり３匹のラットから平均したものである。図７．アルブミンで処理した３匹のラットにおける平均腫瘍酸素化変化（ｍｍＨｇ）。図８．ヘモグロビンｐ５０９で処理した３匹のラットにおける平均腫瘍酸素化変化（ｍｍＨｇ）。図９．ヘモグロビンｐ５０３２で処理した３匹のラットにおける平均腫瘍酸素化変化（ｍｍＨｇ）。図１０．Ｌ−ＮＭＡの６０分間の注入（superfusion）及びその後のＬ−アルギニンの６０分間の注入の後の微小血管の直径の相対変化。Ｌ− ＮＭＡは、対照試料での細静脈と同様、全ての型の腫瘍試料の細静脈（腫瘍中心部、腫瘍周囲、腫瘍近傍の正常部）の直径を顕著に小さくした（全てのｐ＜０．０５）。Ｌ−アルギニンの過融解では、腫瘍試料細静脈に対する回復効果は無視し得るものであったが、対照細静脈は基準線の直径まで回復した。符号は平均値 ±SEMを示す。白四角：腫瘍中心部；白ひし形：腫瘍周囲；白丸：腫瘍近傍の正常部；白三角：対照、腫瘍無し。図１１．Ｌ−ＮＭＡの６０分間の注入及びその後のＬ−アルギニンの６０分間の注入の後の微小血管のＲＢＣ速度の相対変化。Ｌ−ＮＭＡは対照及び腫瘍中心部の細静脈のＲＢＣ速度を基準線から下げた（共にｐ＜０．０５）。Ｌ−アルギニンは腫瘍周囲の血管、腫瘍近傍の正常血管、及び対照血管においてＲＢＣ速度を基準線のレベルまで回復させたが、腫瘍中心部細静脈におけるＲＢＣ粘度は基準線から明らかに下がったままであった（ｐ＜０．０５）。符号は平均値±SEM を示す。白四角：腫瘍中心部；白ひし形：腫瘍周囲；白丸：腫瘍近傍の正常部；白三角：対照、腫瘍無し。図１２．Ｌ−ＮＭＡの６０分間の注入及びその後のＬ−アルギニンの６０分間の注入の後の微小血管流量の相対変化。Ｌ−ＮＭＡは腫瘍中心部及び腫瘍周囲の血管において４３％、対照血管において８３％相対流量を減少させた。Ｌ−アルギニンは腫瘍周囲の流量を腫瘍近傍の正常血管で観察されるものと同じレベルまで回復させた。腫瘍中心部の血管の流量はＬ−アルギニンの存在下では減少し続けた。グラフは直径とＲＢＣ速度との関係を説明するように作成した。白四角：腫瘍中心部；白ひし形：腫瘍周囲；白丸：腫瘍近傍の正常部；白三角：対照、腫瘍無し。図１３．Ｌ−ＮＭＡの６０分間の注入及びその後のＬ−アルギニンの６０分間の注入の後の血管長密度の相対変化。統計学的に有意ではないが、Ｌ−ＮＭＡは腫瘍血管における血管長密度を下げる可能性がある（腫瘍中心部、ｐ＝０．０７；腫瘍周囲及び腫瘍近傍の正常血管共にｐ＝０．０８）。腫瘍中心部及び腫瘍周囲血管双方ではＬ−アルギニンの後更に血管長密度が減少した（それぞれｐ＝０．０１及びｐ＝０．０５）。符号は平均値±SEM を示す。白四角：腫瘍中心部；白ひし形：腫瘍周囲；白丸：腫瘍近傍の正常部；白三角：対照、腫瘍無し。図１４．Ｌ−ＮＭＡの６０分間の注入及びその後のＬ−アルギニンの６０分間の注入の後、間欠性の血流または血行静止を示す血管の百分率。Ｌ−ＮＭＡは腫瘍中心部の血管において間欠性の血流及び血行静止を基準線に比較して増加させた（ｐ＝０．０３）。腫瘍周囲の血管及び腫瘍近傍の正常血管において、間欠性の血流及び血行静止はＬ−ＮＭＡで増加する可能性がある（共にｐ＝０．０６）。Ｌ−アルギニンは全ての型の血管において間欠性の血流及び血行静止を基準線のレベルまで回復させた。符号は平均値±SEMを示す。白四角：腫瘍中心部；白ひし形：腫瘍周囲；白丸：腫瘍近傍の正常部；白三角：対照、腫瘍無し。 5.発明の詳細な説明本発明は、腫瘍血流および酸素化を減少するための抗腫瘍療法として、または (1)化学療法薬、特に、低酸素性細胞毒素もしくはアシドーシス性細胞毒素、および／または(2)高体温を伴う固形腫瘍の治療における補助的な療法としての一酸化窒素(NO)活性の阻害剤、例えば、NOスカベンジャーまたはNOシンターゼ阻害剤の使用に関する。本発明によれば、NO合成の阻害剤またはNOスカベンジャーによるNOの抑制は、固形腫瘍中の血流を選択的に減少し、そして幾つかの腫瘍血管中の不可逆的な血管の血行静止をもたらす。正常な組織中のNO減少の効果はそれ程頻繁ではなく、また極めて広範囲ではなく、NO濃度の低下が腫瘍中に選択的効果を生じることを示す。NO合成の阻害剤およびNOスカベンジャーは最小の副作用を生じ、そしてこれらの副作用は主として軽度かつ一時的な昇圧効果からなる。本発明者らは、NOシンターゼ抑制が優先的な腫瘍血流減少を行うのに使用し得ることを発見した。何となれば、腫瘍血流減少はNOシンターゼ基質の投与後でさえも不可逆的であり、一方、正常な組織中の血流減少はこのような基質の投与により反転するからである。本発明は、NOシンターゼの基質を投与することにより一酸化窒素シンターゼ阻害剤の投与（必要により、阻害剤は低酸素性またはアシドーシス性の化学療法薬剤の投与または高体温と同時または連続的に投与される）により得られる正常な組織中の血流減少を選択的に減少する方法を提供する。本発明によれば、化学療法薬剤の投与と連係してNOスカベンジャーまたはNOシンターゼ阻害剤の治療投与は、増強された抗腫瘍化学療法の有効性をもたらす。高体温療法と連係してのNOスカベンジャーまたはNOシンターゼ阻害剤の治療投与は、固形腫瘍に対する増強された毒性をもたらす。低酸素性細胞毒素は、低酸素性または酸性の細胞に対し、または低酸素条件下で有効に細胞毒性である細胞毒素である。アシドーシス性細胞毒素は、胞毒性が酸性pH条件下で増進される物質である。本発明者らは、腫瘍血流減少の生理学的結果が腫瘍の伝熱能力、並びに低酸素症およびアシドーシスの誘導の減少を含むことを発見した。低酸素症およびアシドーシスは高体温細胞毒性に寄与する。高体温細胞毒性は、pH低下の大きさがわずかにpHの十分の二三である場合でさえも、pHの急激な低下を示す細胞中で大きく増進される。本発明によれば、NOシンターゼのアンタゴニストまたはNOの脱除（例えば、ストローマフリーヘモグロビンによる）によるNOの抑制が腫瘍血流を減少し、そして腫瘍血管の血行静止をもたらす。その効果は軽度かつ一時的な全身の昇圧効果のみでもって腫瘍中で得られる。いかなる特別な理論により拘束されることを意図しないが、二つの機構がこの効果の原因となるものと考えられる。(1)NOの減少が腫瘍を供給する正常な細動脈中で血管収縮を生じ、そして(2)血小板凝集が腫瘍血管中で優先的に剌激され、微小血栓形成をもたらす。 5.1.NOスカベンジャー本発明は、腫瘍血流および酸素化を減少するための抗腫瘍療法として、または低酸素性もしくは酸性の細胞毒素の化学療法効果を強化または増進し、または高体温療法の効果を増進するための補助的な療法としてのNOスカベンジャーの使用を意図している。本明細書に使用される“NOスカベンジャー”という用語は、NOの濃度を局所または全身で減少するように遊離NO と結合する分子そのものを表す。このようなスカベンジャーとして、金属タンパク質、特に、ヘム含有タンパク質、例えば、ヘモグロビン、ミヨグロビン、シトクロム-P- 450、ヘムアルブミン（これらに限定されない）、ヘム含有ペプチド、例えば、シトクロムＣのウンデカペプチド、並びに水溶性ヘモグロビン類似体、例えば、ストラップド(strapped)ヘム(例えば、TraylorおよびTraylor，1982 ，Ann．Rev．Biophys．Bioeng．11:105-127)およびピケットフェンス(picket fe nce)ポルフィリン(Collmanら，1975 J．Am．Chem．Soc．97:1427-1439)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、使用に選ばれたスカベンジャーは、インビボ、インビトロ、または動物モデル実験でL-アルギニンにより反転されない血管血行静止を生じ得ると示されるものである。本発明の多くのNOスカベンジャーの使用は、細胞内のNO生成または血管外のNO 活性に影響しないで、血管系に対しNO減少を制限するという利点を有する。こうして、神経系中の可溶性グアニル酸シクラーゼの導入機構および免疫細胞、例えば、マクロファージの機能としてのNO活性は、最小に影響され、こうしてNOスカベンジャーによる療法の可能な副作用を減少するであろう。ヘモグロビンの如き巨大分子のNOスカベンジャーは固形腫瘍の脈管周囲の空間中に捕捉されるようになることができる。何となれば、腫瘍血管系は正常な組織と較べて非常に漏出性であるからである。ヘモグロビンの如き巨大分子は正常な組織の脈管周囲の空間中に容易に流入しないため、それらはおそらくそこで捕捉されない。腫瘍の脈管周囲の空間中のヘモグロビンの如き NOスカベンジャーの捕捉は、NO脱除効果を腫瘍に制限する傾向があり、こうして正常な組織に対する最小の効果で腫瘍低酸素を増進する。本発明の好ましい局面において、NOスカベンジャーは、ストローマフリーヘモグロビンとも称される、無細胞ヘモグロビン(CFHb)である。ストローマフリーヘモグロビンは、当業界で知られている操作を使用して得られる（例えば、1988年５月19日に公開されたPCT出願公開番号WO 88/03408;米国特許第4,001,401号; Fe olaら，1983，Surgery Gynecology and Obstetrics 157:399-408；De Venutoら，1979，Surgery Gynecology and Obstetrics 149:417-436を参照のこと）。例えば、ストローマフリーヘモグロビンは以下のようにして得られる。(a)全血を得；(b)赤血球を全血のその他の成分から分離し；(c)ヘモグロビンを赤血球から単離し；そして(d)ヘモグロビンをストローマおよびその他の不純物から分離する。ストローマフリーヘモグロビンは、新たに採取された細胞、古くなった細胞、もしくは凍結充填細胞または全血中の赤血球を原料として調製し得る。血液は、血ぺい形成を防止するのに充分な血液凝固阻止薬活性でもって容器に無菌様式で採取されるべきである。一つの実施態様において、赤血球は食塩溶液中で洗浄され、そして遠心分離されて、赤血球を白血球から分離し、更にフリータンパク質を除去する(Feolaら，1983，Surgery Gynecology and Ob-stetrics 157 :399-408)。別の実施態様において、赤血球は1988年５月19日に公開されたPCT出願公開番号WO 88/03408に記載されたようにして半連続型遠心分離機に通すことによりその他の赤血球から分離してもよい。ヘモグロビンは一つの実施態様において赤血球溶液を水または有機溶媒中で約２〜約10℃で希釈して赤血球中のヘモグロビンを全ての細胞デブリから分離することにより単離してもよい（1988年５月19日に公開されたPCT出願公開番号WO 88 /03408;米国特許第4,001,401号; Feolaら，1983，Surgery Gynecology and Ob-s tetrics 157:399-408）。別の実施態様において、ヘモグロビンはヘモグロビン溶液への亜鉛塩の添加により亜鉛錯体として沈殿する(De Venutoら，1979，Surg ery Gynecology and Obstetrics 149:417-436)。単離したヘモグロビンは、一つの実施態様において、例えば、細胞成分を保持し、そしてヘモグロビンを通す0.5μの細孔のフィルターによる限外濾過により精製してもよい。また、ヘモグロビンは、当業界で知られているその他の操作により得られてもよい。例えば、バクテリア株（例えば、1991年７月２日に発行されたNagai およびHoffman の米国特許第5,028,588号を参照のこと）または酵母（例えば、1990 年11月15日に公開されたPCT 出願番号WO 90/13645;“酵母中の組換えヘモグロビンまたはヘモグロビン変異体の発現”という発明の名称の、1992年４月29日に出願された米国特許出願第07/876,290号を参照のこと）、またはその他の真核生物が組換えDNA 技術により操作されてヘモグロビンを生産し得る。ヘモグロビンは、例えば、HbA(α₂β₂)、HbA2(α₂δ₂)、HbF(α₂γ₂)、Hbバルト(γ₄)、HbH(γ₄)、およびHbポートランドＩ(ζ₂γ₂)、HbポートランドII(ζ₂ β₂)、HbポートランドIII(ζ₂δ₂)、HbゴワーＩ(ζ₂ε₂)、およびHbゴワーII(α₂ ε₂)を含むが、これらに限定されない、ヒトヘモグロビンまたはヘモグロビン変異体；並びにあらゆるその他の動物ヘモグロビン、例えば、ウシまたはブタのヘモグロビンであってもよい。また、ヘモグロビン二量体が有益であるが、未修飾ヘモグロビンモノマーまたは二量体は許容できない腎臓毒性をもたらし得る。本発明の方法に使用されるヘモグロビンは、当業界で知られている操作を使用して化学的に修飾されてHbテトラマーのポリマーを形成し（循環中の半減期を増大するため、例えば、Hbポートアレグレ）、またはテトラマー安定性を増大し（腎臓毒性を低下するため）かつ／または酸素アフィニティーを低下し得る。テトラマー安定性を増大するための化学的修飾の例として、ポリアルキレングリコール(Iwashita の米国特許第4,412,989号および同第4,301,144号)、ポリアルキレンオキサイド(Iwasakeの米国特許第4,670,417号)、多糖(Nicolauの米国特許第4, 321,259号および同第4,473,563号)、イノシトールホスフェート(Wong の米国特許第4,710,488号および同第4,650,786 号)、二官能性架橋剤(Morrisらの米国特許第4,061,736号)、インスリン(Ajisakaの米国特許第4,377,512号)、およびヘモグロビン組成物がlys99 α₁とlys99 α₂の間で分子内架橋されるような架橋剤(W alder の米国特許第4,598,064号）による架橋が挙げられるが、これらに限定されない。単離されたヘモグロビンの酸素アフィニティーを低下させるための化学的修飾の例として、ピリドキサルホスフェート(Sehgal ら，1984，Surg ery 95:433-438)による重合および２，３−ジホスホグリセレート(DPG)を模擬する試薬(Bucciらの米国特許第4,584,130号）を使用する重合が挙げられるが、これらに限定されない。更に別の実施態様において、本発明の方法に使用されるヘモグロビンはヘモグロビン変異体、即ち、ヌクレオチド配列がヘモグロビンの構造または機能の変化を生じるような様式で変化されているが、ヘモグロビンが酸化窒素に可逆的に結合する能力により規定されるように依然として機能上活性のままであるように変化されているグロブリン鎖を含むヘモグロビンであってもよい。ヘモグロビン変異体のカテゴリーとして、自己重合する変異体；テトラマーがインビボで生理条件下で解離しない変異体(例えば、Hbライニール、β-145チロシンがシステインにより置換されている);低下された固有の酸素アフィニティーを有する変異体、即ち、生理条件下で少なくとも約10mmHgのp50(p50はヘモグロビン中の酸素結合の50％の飽和を生じる酸素の分圧である)を有するヘモグロビン（例えば、Hbチコ、β-66リシンがスレオニンにより置換されている；Hbラレイフ、β-1バリンがアラニンにより置換されている；Hbチツスビル、α-94 アスパルテートがアスパラギンにより置換されている；Hbベスイスラエル、β-102アスパラギンがセリンにより置換されている；およびHbカンサス、β-102アスパラギンがスレオニンにより置換されている）；アルカリ中で安定である変異体（例えば、モタウン／ハセッテペβ-127またはグルタミンがグルタミン酸により置換されている）；酸中で安定である変異体；ハプトグロビンに対し低下された結合アフィニティーを有する変異体；増大された固有の酸素アフィニティーを有する変異体、即ち、生理条件下でせいぜい約１mm Hgのp50 を有するヘモグロビン（例えば、HbA デアーロッジ、β-2ヒスチジンがアルギニンにより置換されている、Labossiereら，1972，Clin．Bio-chem.5:46- 50; HbA アブルッゾ、β-143ヒスチジンがアルギニンにより置換されている、Te ntori ら，1972，Clin.Chim.Acta 38:258-262;およびHbA マッキーズロックス（ β-145チロシンをコードする配列が終止コドンにより置換されるようにコード配列が変化されている(Winslowら，1976，J.Clin.Invest．57:772-781)）が挙げられるが、これらに限定されない。酸安定性のヘモグロビン変異体は、α-103位でヒスチジンを酸中でイオン化しないアミノ酸で置換する変異体(Perutz，1974,Nature 247:341)を含んでいてもよい。このようなアミノ酸の例として、セリン、スレオニン、ロイシン、およびアラニンが挙げられる。ハプトグロビン非結合性変異体は、アミノ酸番号121-127 の領域中にα-Hb 配列の変化を有する変異体である。この配列はハプトグロビンの結合に関与することが示されていた(McCormickおよびAtorssi，1990，J.Prot.Chem．9:735)。グロビン変異体は当業界で知られている種々の方法により生産し得る。それらの生産をもたらす操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで起こり得る。グロビンは、当業界で知られている操作を使用して部位特異性突然変異誘発により遺伝子レベルで変化されてもよい。採用し得る一つのアプローチは、塩基置換を有する変異体グロビンを構築するための合成オリゴヌクレオチドの使用を伴う。一つの実施態様において、突然変異を含む短いオリゴヌクレオチドが合成され、そして野生型グロビン遺伝子(Zoller およびSmith，1984，DNA 3:479-488)の一本鎖型にアニールされる。得られる短いヘテロ二本鎖は、DNA ポリメラーゼによる第二鎖合成のプライマーとして利用できる。5'末端で、一本鎖ニックが形成され、これがDNA リガーゼにより閉じられる。別の実施態様において、二つの相補オリゴヌクレオチドが合成され、それぞれが変異体配列を含む。アニーリング後にこれらの相補オリゴヌクレオチドを形成する二重鎖がDNA リガーゼにより大きなDNA 分子に結合し得るが、但し、両方の分子の末端が相補一本鎖“付着”末端を有することを条件とする。採用し得る別のアプローチは、小さい一本鎖ギャップをDNA 分子に導入すること、続いて誤修復DNA 合成、即ち、ギャップ中の非相補ヌクレオチドのミスインコーポレーション(Botstein およびShortle，1985，Science 229:119 3)を伴う。ギャップ中へのチオールヌクレオチドのとり込みは非相補ヌクレオチドの切除を最小にし得る。また、グロビン変異体は、当業界で知られている操作（例えば、Froehler，1986，Nucl.Acids Res．14:5399-5407およびCaruthers ら，1982，Genetic Engineering，J.K．SetlowおよびA．Hollaender 編集，Plenum Press，ニューヨーク，４巻，1-17頁を参照のこと）を使用してグロビン変異体をコードするDNA を化学合成することにより調製し得る。好ましい実施態様において、変異体グロビンのフラグメントが化学合成され、続いてこれらのフラグメントが一緒につながれる。得られる変異体グロビンストランドが、当業界で知られている操作、例えば、PCR 技術を使用して増幅され、続いて上記のようにしてクローニングベクターに挿入し得る。特別な実施態様において、部位特異性変異体は、PCR 増幅を開始するのに使用されるオリゴヌクレオチドにミスマッチの塩基対合を導入することによりつくってもよい（JonesおよびHoward，1990，Biotechniques 8 :178-180)。グロビン配列の操作はタンパク質レベルで行ってもよい。多数の化学的修飾のいずれかが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH₄による特異的化学開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；等を含むが、これらに限定されない既知の技術により行ってもよい。また、変異体グロビンタンパク質は、当業界で知られている操作、例えば、市販のペプチド合成装置等を使用して化学合成してもよい。ポリペプチド合成のこのような通常の技術が、Merrifield，1963，J.Chem.Soc．85:2149-2154およびHunkapillar ら， 1984，Nature（ロンドン）310:105-111の如き刊行物中に記載されている。以上の変異体のいずれもが、例えば、下記の項目６および７に記載されたアッセイに従って、NO脱除活性につき試験し得る。使用されるヘモグロビンは哺乳類起源のものであることが好ましく、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、霊長類、例えば、サルおよびチンパンジーからのものであってもよく、ヒトからのものであることが最も好ましい。下記の特別な実施態様において、使用されるNOスカベンジャーはウシ起源の無細胞ヘモグロビンである。 5.2.NO合成の阻害剤本発明は、腫瘍血流および酸素化を減少するための抗腫瘍療法として、または低酸素性または酸性の細胞毒素の化学療法効果を強化または増進し、または高体温療法の効果を増進するための補助的療法としてのNOシンターゼの阻害剤の使用を意図している。本明細書に使用される“NOシンターゼ阻害剤”という用語はNO シンターゼの競合的または非競合的な阻害剤を表す。本発明の好ましい局面において、NOシンターゼ阻害剤はアルギニン類似体、例えば、アミノグアニジンまたはメチルグアニジン、およびＮ^G‐置換アルギニンまたはＮ^G，Ｎ^G‐二置換アルギニンである。置換アルギニンはＬ配置のものであることが好ましい。本発明のNOシンターゼ阻害剤として使用するための置換L-アルギニンの例として、Ｎ^G‐アミノ-L-アルギニン、Ｎ^G‐ニトロ-L-アルギニン、Ｎ^G‐アルキル-L-アルギニン、例えば、Ｎ^G‐メチル-L-アルギニンまたはＮ^G‐ モノメチル-L-アルギニン（しばしば、NMMA、L-NMA またはL-NMMAと略記される）、Ｎ^G‐エチル-L-アルギニン、Ｎ^G‐プロピル-L-アルギニン、またはＮ^G‐ブチル-L-アルギニン、Ｎ^G‐ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（しばしば、NAM EまたはL-NAMEと略記される）、およびＮ−イミノエチル-L-オルニチン（しばしば、NIO またはL-NIOと略記される）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの阻害剤は、市販元、例えば、Calbiochem、Sigma、およびAldrichから入手し得る。別の実施態様において、NOシンターゼコファクターテトラヒドロプテリンの阻害剤が使用し得る。このような阻害剤の一つとしてアミノプテリンがある。下記の特別な実施態様において、使用されるNOシンターゼ阻害剤はＮ^G‐モノメチル-L-アルギニン（L-NMA と略記される）である。 5.2.1.NO活性のその他の阻害剤 NOシンターゼの阻害剤の他に、本発明はNOにより活性化された第二メッセンジャー系、特に、第二メッセンジャー（下流のシグナル媒介物質）グアニル酸シクラーゼおよび環状GMP の阻害剤の使用を意図している。グアニル酸シクラーゼ抑制の非限定的な例はメチレンブルーである。環状GMP 活性はアミノグアニジン、例えば、M＆B 22948 により抑制し得る。 5.2.2.正常な組織中のNO合成抑制の反転また、本発明は、正常な組織に対する阻害剤の効果を選択的に反転するように、NOシンターゼ阻害剤（競合的阻害剤、例えば、基質類似体）の治療投与、続いてNOシンターゼ基質の投与を意図している。下記の例により示されるように、腫瘍組織に対する阻害剤の効果は不可逆的である。使用し得るNOシンターゼ基質として、グアニジノスクシネートおよびL-アルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。特別な実施態様において、使用されるNOシンターゼ基質はL-アルギニンである。 5.3.治療方法および組成物本発明は、腫瘍血流および酸素化を減少するための抗腫瘍療法として、または低酸素性または酸性の細胞毒素の化学療法効果を強化または増進し、または高体温療法の効果を増進するための補助的療法としてNO活性の阻害剤を投与することを特徴とする固形腫瘍を有する患者の治療方法に関する。また、本発明は正常な組織に対する阻害剤の効果を低減するようにNOシンターゼ阻害剤（競合的阻害剤、例えば、基質類似体）の投与、続いてNOシンターゼ基質の投与に関する。好ましくは、患者は、動物、更に好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。しかしながら、本発明はまた家畜、例えば、ネコまたはイヌの患者、並びに牧畜動物、例えば限定されないが、ウシ、ウマおよびブタの患者の腫瘍の治療に関する。下記の特別な実施態様において、本発明の治療方法はマウス中のヒト腫瘍異種移植片の増殖を抑制するのに有効である。本発明の治療方法は、腫瘍後退速度（応答速度）の増大、腫瘍の局所コントロールおよび／または転移の頻度の減少またはその増殖の排除をもたらすことが好ましい。治療アプローチは、血管形成されるのに充分に大きい腫瘍に関する。血管形成された腫瘍の増大された局所コントロールは、不可逆的な血管血行静止を生じることにより、そして増進された腫瘍細胞死滅により転移の可能性を減少する。治療アプローチは、上記の型の全身の化学療法と連係して、小さい転移につき同様に使用し得る。本発明によれば、上記の項目5.1 に記載されたNOスカベンジャー、もしくはNO シンターゼ阻害剤、またはNOシンターゼ基質は、非経口で、即ち、腹腔内、静脈内、口周囲、皮下、筋肉内、動脈内、等を経由して投与し得る。非経口投与の好ましい経路は静脈内である。NOスカベンジャーもしくはNOシンターゼ阻害剤またはNOシンターゼ基質は、医薬上許される担体と混合して調製されることが好ましい。“担体”という用語は、医薬組成物の混合物を調製するのに使用するための希釈剤、賦形剤等を表す。医薬上許される担体として、滅菌水、食塩液、食塩加緩衝液、デキストロース溶液、好ましくは生理適合性緩衝液、例えば、ハンクス液またはリンゲル液、生理食塩水、食塩水とグルコースからなる混合物、およびヘパリン処理されたクエン酸ナトリウム−クエン酸−デキストロース溶液等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用される“医薬上許される”という用語は、連邦政府または州政府の規制機関により認可され、または動物、更に特別にはヒトに使用するために米国薬局方またはその他の一般に認められた薬局方にリストされていることを意味する。組成物を投与するための技術および製剤化が、Remington's Pharmaceutical S cience、Meade Publishing Col．イーストン、PA、最終編に見られる。一般に、NOスカベンジャーもしくはNOシンターゼ阻害剤またはNOシンターゼ基質が、単独で、または化学療法もしくは高体温療法と連係して投与される場合に単一のボーラス投薬量で投与されるが、本発明はまた、例えば、IVドリップもしくはポンプによる持続投与、または複数回のボーラス投与を意図している。特別な局面において、本発明はまた容器中に医薬上許される形態、例えば、凍結乾燥形態または医薬上許される担体と混合したNOスカベンジャーもしくはNOシンターゼ阻害剤またはNOシンターゼ基質を含むキットを提供する。一つの実施態様において、キットは別個の容器中に有効量のNOシンターゼ阻害剤およびNOシンターゼ基質を含む。 5.3.1.NO活性の阻害剤の投与本発明は、腫瘍血流および酸素化を減少するための抗腫瘍療法としてのNO活性の阻害剤、例えば、一酸化窒素スカベンジャーまたはNOシンターゼ阻害剤の投与を意図している。本発明の治療方法は、腫瘍後退速度（応答速度）の増大、腫瘍の局所コントロールおよび／または転移の頻度の減少またはその増殖の排除をもたらすことが好ましい。治療アプローチは、血管形成されるのに充分に大きい腫瘍に関する。血管形成された腫瘍の増進された局所コントロールは、不可逆的な血管血行静止を生じることにより、そして増進された腫瘍細胞死滅により転移の可能性を減少する。投与されるNOスカベンジャーまたはNOシンターゼ阻害剤の投薬量は、腫瘍中の血流または酸素化のレベルを減少するのに有効な投薬量、例えば、インビボのこのような能力により検出されるような、またはインビトロアッセイまたは下記の項目６および７に記載されるような動物モデル系から外挿されるような投薬量である。例えば、NOスカベンジャーが無細胞ヘモグロビンである場合、一つの実施態様において、投薬量（患者の重量１ｋｇ当たりのスカベンジャーのg 数）は約 0.01 g/kg から約10 g/kg までであってもよい。下記の特別な実施態様において、投薬量は約0.1 g/kgであり、これは動物の全血液容積の５％未満に相当する。 NOシンターゼ阻害剤が置換アルギニンである場合、特別な実施態様において、投薬量は約0.1 mg/kg から約100 mg/kg までであってもよい。下記の特別な実施態様において、シンターゼ阻害剤は3.0 mg/kg の投薬量で投与されるL-NMA である。また、本発明は、正常な組織血流を回復する傾向がある間に、腫瘍血流および増大された腫瘍低酸素性細胞フラクションを選択的に減少させるように、NOシンターゼ阻害剤の投与、続いてNOシンターゼ基質の投与を意図している。NOシンターゼ基質は、NOシンターゼ阻害剤の投与後10分から４時間までに投与されることが好ましい。 5.3.2. 低酸素性及び酸性細胞毒と一緒の投与本発明は、ＮＯ（一酸化窒素）スカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤を本発明の低酸素性又は酸性化学療法剤とともに投与することを企図する。低酸素性細胞毒は、これに限定されるものではないが、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＣ類似体及びエタニダゾール(etanidazole)のようなニトロイミダゾール族の薬品を含む。この化学療法剤は、さらにその細胞毒性作用が酸性pH状態において、特には高体温の間に増強される剤でありうる。アシドーシス性の細胞毒は、これに限定されるものではないが、シスプラチン、シスプラチン類似体、ブレオマイシン、フラボン酢酸及びエタニダゾールを含む。本発明に従って、ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、低酸素性細胞毒又はアシドーシス性の細胞毒が腫瘍内に完全に浸出した後で管内の血行停止が生ずるようにして投与されるべきである。或る態様において、ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、化学療法剤の投与と同時に投与することができる。代わりに、化学療法剤は順次に、好適には最初に化学療法剤が投与され、次にＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤を投与できる。一般に、順次に投与される場合には、ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、化学療法剤の投与後約15分から約60分して投与される。しかしながら、もしＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤が極めてゆっくりと作用する場合には、その投与は細胞毒の投与の前に行うことができる。本発明は、又、通常の組織の血流が回復に向かっている間、腫瘍の血流量を選択的に減少させ、そして腫瘍の低酸素の細胞分画を増大させるように、ＮＯシンターゼ阻害剤を低酸素性又はアシドーシス性の化学療法剤と同時に又は順番に投与し、次いでＮＯシンターゼ基質（例えば、Ｌ−アルギニン）を投与することを企図する。好適には、ＮＯシンターゼ基質はＮＯシンターゼ阻害剤を投与した後、10分から４時間経過後に投与される。一般に、化学療法剤の用量は、化学療法に有効であることが見い出された量である。低酸素の腫瘍の治療にとり、化学療法剤の用量は化学療法のために投与される標準的な量よりも少量であるかもしれない。投与されるＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤の用量は、以下の第６及び７節に記載される、例えば、インビボ、インビトロアッセイ又は動物モデルシステムにおける活性により検出されるとおりの、腫瘍において血流又は酸素化のレベルを減少させるのに効果的な用量である。例えば、ＮＯスカベンジャーが無細胞ヘモグロビンであるならば、（個体重量kg当たりのスカベンジャーｇでの）用量は約0.01ｇ／kgから約10ｇ／kgとすることができ、後記する特別の例においてその用量は約0.1 ｇ／kgであり、これは動物の全血液量の５％以下であることを示す。もしＮＯシンターゼ阻害剤が置換されたアルギニンであるならば、その用量は約0.1 mg／kgから約 100mg／kgの間とすることができる。後記の特別の態様において、シンターゼ阻害剤は 3.0 mg／kgの用量で投与されるＬ−ＮＭＡである。ＮＯシンターゼ基質が投与される態様においては、ＮＯシンターゼ基質の用量は好適には30mg／kgから 300mg／kgの間にある。本発明の特定の局面において、ＮＯスカベンジャー、好適には無細胞ヘモグロビン、又はＮＯシンターゼ阻害剤、及び低酵素性又は酸性細胞毒は、製剤的に許容しうる担体とともに医薬組成物に調製され得る。 5.3.3. 加温療法とともに行う投与他の局面において、本発明は、固形腫瘍の治療のため加温療法と組み合わせてＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤を投与することを企図する。加温療法は、これに限定されるものではないが、マイクロウェーブ、超音波、又は局部的、部分的加熱のための他の加熱要素(element)、又は体全体の加温療法のため輻射熱のような物理的な因子の使用に関する。一般に、腫瘍の血管系は正常な組織と同様に熱ストレスに対応できず、そして、腫瘍の血流量の減少は、この効果を高める。ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤の投与は、熱ストレスに対応する腫瘍の能力をさらに減少させる。加えて、本発明の方法は、腫瘍内の、殊に比較的高い血流量を持つ腫瘍の領域内での温度の非均一性から生じる加温療法の幾つかの制限を克服するのに役立つ。更に、腫瘍の血流量を減少させることにより、腫瘍内の代謝は一層嫌気性になり、乳酸を生成させ、またpHを減少させる。腫瘍内のpHを減少させると、加温療法の効果を有意に、例えば５倍ほど大きく増大させる。本発明に従って、ＮＯ活性の阻害は加温療法に先だって行われ、その結果、加温療法を適用する時までに、腫瘍の低酸素症及びアシドーシスが生じ、又は増大する。この様に、本発明の特別の局面において、ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、加温療法の前約10分から12時間に、好適には治療前約30分から約３時間、最も好ましくは加温治療の約１時間前に投与される。投与されるＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤の用量は、一般には低酸素性の又は酸性の細胞毒の化学療法を高めるために投与される用量とほぼ同じである。本発明の好適な局面において、ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、加温治療及び低酸素性の又は酸性細胞毒化学療法と協力して投与される。ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、好適には、腫瘍に細胞毒を浸出させた後で血流量の減少及び管の血行停止を生じさせるように、そして腫瘍の低酸素症及びアシドーシスが生じ又は増加するように加温療法の実施前に投与される。かかるアプローチは特に効果的であり、そして好ましい治療結果のチャンスを増加させるものと信じられる。ＮＯシンターゼ阻害剤が使用される時は、正常組織における正常の血液の流れの回復を促進させるように、適宜、引き続いてＮＯシンターゼ基質が投与される。 5.3.4．固形腫瘍本発明は、腫瘍の血流量及び酸素供給を減少させるための抗腫瘍治療として、又は、腫瘍殊に低酸素の又は酸性腫瘍に対する低酸素性又は酸性細胞毒の有効性を増大させるための付加的な治療法として、一酸化窒素スカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤のようなＮＯ活性阻害剤を使用することに向けられる。本発明は、さらに好気性の腫瘍、これは通常低酸素性又は酸性の細胞毒に抵抗性であるが、この治療処置に対して、かかる腫瘍における血流量を減少させ、そしてそのことによりかかる腫瘍の低酸素性の又は酸性の細胞毒に対する感受性を増大させることにより、影響を与えることを企図する。特別の態様において、この発明はさらに、ＮＯシンターゼ阻害剤を投与し、引き続きＮＯシンターゼの基質を投与することにより、腫瘍組織における選択的な血流量の減少を達成することを企図する。本発明に従って治療され得る固形腫瘍の例には、これに限定されるものではないが、以下の肉腫及び癌腫が含まれる：繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂肪腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢腫癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭管腫瘍、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴音神経腫、稀突起膠細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽腫。他の態様において、不快増殖性の（dysproliferative）変化（異形成(metapla sias)及びジスプラジー（dysplasias）のようなもの）は、頸、食道及び肺におけるような上皮組織において治療され又は防止される。こうして、本発明は腫瘍形成又は癌へのあらかじめの進行がわかっている又はそれが疑われる状態、特に、過形成(hyperplasia)、異形成、又は最も特異的にはジスプラジーから成る非新生物性の細胞増殖が生じた部位の治療を提供する（かかる異常な成長状態のレビューについては、ロビンス(Robbins)及びアンゲル(Angell)、1976、Basic Pat hology、第２版、W.B．サウンダー社 (Saunders)、フィラデルフィア、第68−79頁を参照）。過形成はその構造又は機能に有意の変化を起こすことなく、組織又は器官の細胞数の増加を含む、一種のコントロールされた細胞増殖である。一例として、エンドメトリアルな過形成は、しばしばエンドメトリアルな癌に進行する。異形成は、或る型の大人の又は完全に分化した細胞が他の型の大人の細胞で置換される一種のコントロールされた細胞成長である。異形成は、上皮又は結合組織細胞で生じうる。典型的ではない異形成は、やや無秩序の異形成性の上皮を含む。ジスプラジーは、しばしば癌の前兆であり、そして主に上皮で見い出される；それは最も無秩序な型の非新生物性の細胞増殖であり、個々の細胞の均一性における、および細胞の構造的配向性における損失を伴う。ジスプラスティック細胞は、しばしば異常に大きく、濃く染色される核を有し、多形態性を示す。ジスプラジーは、特徴として、慢性的な過敏または炎症が存在する部位で発生し、しばしば頸、呼吸経路、口腔、及び胆嚢で見い出される。かかる異常についてのレビューは、フィシュマン(Fishman) ら、1985、Medicine、第２版、J.B．リピンコット（Lippincott）社、フィラデルフィアを参照されたい。本発明は、さらに、不適切な組織の脈管化を含む異常を治療するための補助手段（付加的治療）として、ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤のような、ＮＯ活性の阻害剤の治療的に有効な量を投与することによる非悪性の腫瘍及び不適切な組織の脈管化を含む他の異常を治療することに向けられる。不適切な組織の脈管化には、血管数の増化又は肥大、これは血管の径の増大である、を含む。治療的に有効量のＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤とは、症状の消散を生ずるのに有効な量である。他の局面において、治療的に有効な量は、組織を通過する血流を減少させるのに効果的な量である。例えば、本発明は動静脈の（ＡＶ）奇形、殊に頭蓋内部におけるものを治療するのに有効であると思われる。放射線療法は、通常かかる手術不可能な病変部を治療するために使用される。ＮＯスカベンジャー及び／又はＮＯシンターゼ阻害剤の使用はこれらの病変部内での硬化又は血栓形成の増加した割合又は頻度及び血管造影法により検出される奇形の大きさの減少をもたらし、このことによりかかるアプローチの効果を増大させる。治療効果が表われる時間を減少させれば、患者の頭蓋内出血に対する連続する危険の状態下にある時間を減少させる。この場合、等角(conformol)放射治療プランは、ＡＶ奇形の量において優先的な治療効果をもたらす。加温療法は、炎症及び脈管の増殖により特徴づけられる皮膚の状態である乾癬を治療するのに使用されている。ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤は、変化の生ずる管内での血栓の割合を増加させることによりこの治療法の効果を増大させ、そして好ましくはその病変を消失させるために使用することができる。同様に、加温療法は、又、良性の前立腺肥大を治療するために使用されている。この状態も炎症あるいはおそらく血管増殖と関連している。ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤の投与は、この治療法の治療効果を増大させることができる。加温療法は、又、皮膚の細菌感染の治療のために使用されている。ＮＯスカベンジャー又はＮＯシンターゼ阻害剤の投与は、この治療法の治療効果を高めることができ、好適には病変の消失をもたらすことができる。他の過増殖の異常の治療も企図される。 5.3.5. 腫瘍の灌流の不可逆的減少本発明の一つの局面に従って、ＮＯシンターゼ阻害に引き続いて、Ｌ−アルギニン又は他のＮＯシンターゼ基質を投与すると、選択的な腫瘍の低酵素化として治療のゴールを達成するための手段が提供される。例えば、腫瘍の血流及び酵素化の選択的減少を達成するために、ＮＯシンターゼ阻害剤（競合的阻害剤、即ち基質類似体）を固形腫瘍を有する個体に投与し、引き続いてＮＯシンターゼ基質を投与することができる。特定の態様において、ＮＯシンターゼ阻害剤は、低酸素性又はアシドーシス性の増感剤の投与又は加温療法と同時に又は引き続いて投与され得る。この方法は、腫瘍の血流を減少させ、低酸素化の細胞フラクションを増加させ、そして、腫瘍内の薬物の保持を改善するために使用される。Ｌ−アルギニン又は他のＮＯシンターゼ基質の投与により、正常組織の血流はその後回復し（又は少なくとも正常なレベルに向けて増加し）、このことにより腫瘍における治療効果を落とすことなく、正常組織に対する毒性を減少させることができる。ＮＯシンターゼ阻害剤とその後のＬ−アルギニン又は他のＮＯシンターゼ基質の組み合わせは、又、流出を減少させることによる他の化学療法剤の腫瘍における保持を増大させ、並びに腫瘍の加温治療の間の熱流出を減少させるために使用され得る。本発明は、以下の実施例を参照することにより一層理解することができるが、これらは単に例示の方法によるものであって、本発明を限定するものではない。 6. 腫瘍灌流の薬理学的減少：バイオリダクティブな化学療法剤及び加温療法の治療効果を改善するメカニズム 6.1. 方法 6.1.1. 一般的な実験方法 150〜200gの体重で、８から10日のR3230AC（ラット乳アデノカルチノーマ）腫瘍を有する背面皮膚固定（skinfold）窓チェンバーをもつ、フィッシャー344ラットを、ペントバルビタールナトリウム（40mg／kg、腹腔内（ＩＰ））で麻酔した。大腿動脈及び静脈は、動脈の血圧及び薬物の静脈内（ＩＶ）注入を測定するためにカニューレ挿入した。このラットを、透過光及びエピ蛍光能力を備えたZe iss顕微鏡写真機IIの載物台上にのせた。窓調製物(window preparation)の腫瘍の中心部、腫瘍周辺、及び正常領域における選択された血管を、白黒ビデオカメラ又はシリコン増倍管カメラのいずれかを通して観察し、スーパーＶＨＳレコーダーを使用してビデオテープに録画した。同じ血管を、以下に記載のように処理前（基準線）及び処置後の両方で観察した。 6.1.2. ＮＯシンターゼ阻害剤の実験腫瘍の血流に対するＮＯシンターゼ阻害剤の効果を測定する実験において、窓チェンバーから背側ガラス窓を取りはずし、36℃に加熱され、95％Ｎ₂／５％ＣＯ₂でガス化されたエール(Earle)の平衡塩類溶液（ＢＳＳ）を窓調製物を通して注いだ。血流の基準線のビデオ録画に続いて、同じ血管のビデオ録画を行う少なくとも45分前に、腫瘍の露出面を通してＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ −ＮＭＡ、カルビオケムキャット（Calbiochem cat）♯475886；エールのＢＳＳ中で50及び 100μＭ、36℃のもの、95％Ｎ₂／５％ＣＯ₂で通気されていた）を1.5 から２ml／分で注いだ。別の実験において、ＮＯシンターゼ阻害剤のＬ−ＮＭＡを3.0 mg／kgでＩＶ投与し(キルボーン(Kilbourne)ら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3629-3 632)、そして平均動脈圧、心拍数並びに腫瘍及び正常の血管の血流をモニターした。 6.1.3. ＮＯ捕捉の実験腫瘍の血流に対するＮＯ捕捉の効果を調べる実験において、無細胞ヘモグロビン（ＣＦＨｂ、牛起源、バイオピュアーフォーミュラ（Biopure Formula 1）；0 ．1ｇ／kg）をＩＶ注入した。この投与は、150匹のラットの全血液量の５％以下であった。再度、ＣＦＨｂ処理する前（基準線）及び処理後に、基準線動脈圧、心拍数、及び血管の血流をビデオ録画した。 6.1.4. ＮＯ捕捉−低酸素の感作物質の実験低酸素性細胞の細胞毒と組みあわせたＮＯ捕捉の腫瘍増殖に対する効果を調べる実験を行った。ヒトの横紋筋肉腫キセノグラフ（xenographs）(DU-2l7P)をヌードマウスに移植した。ＣＦＨｂ（バイオピュアーフォーミュラ１，0.1 ｇ／ kg）をＩＶ投与し、60分後にマイトマイシンＣ（15.7mg／m²）を引き続き投与し、腫瘍の増殖の遅れを測定した。処理物とコントロールを比較するために、ウイルコクソン（Wilcoxon）ランクサム(rank sum)試験を使用した。 0.05以下のｐ値を有意のものと考えた。 6.2. 結果 6.2.1. ＮＯシンターゼの実験注入窓チェンバー表面への注入媒質によるＬ−ＮＭＡ投与は、平均動脈圧（ＭＡＰ）において観察された変化に示されているように、全身の心血管系の機能を変化させなかった。平均の基準線ＭＡＰは105mmHgであり、Ｌ−ＮＭＡ注入時の平均ＭＡＰは101mmHg であった。第１表は、腫瘍及び正常血管の血流に関する４個の注入実験の結果をまとめたものである。 6.2.2. ＮＯシンターゼ阻害剤の実験静脈内投与Ｌ−ＮＭＡを静脈内投与すると、ＭＡＰにおいて一時的に20mmHgの増加を起こし、投与後５分してピークに達し、30分までには注入前のレベルに戻り、心拍数にはほとんど又は全く変化がなかった（第１図）。第２表は、腫瘍の血液流に対する２個の静脈内Ｌ−ＮＭＡ投与実験の結果をまとめたものである： 6.2.3. ＮＯ捕捉の実験ＣＦＨｂを静脈内投与すると、平均ＭＡＰにおいて一時的に35mmHgの増加をもたらし、心拍数において256拍／分から243拍／分への圧反射（baroreflex）誘引性減少を伴っていた（第２図）。ＭＡＰはＣＦＨｂ注入後60分までに注入前のレベルに戻ったが、心拍数は減少したままであり、そのうちのいくつかが注入前のレベルへ向かう傾向を示した。第３表は、腫瘍及び正常血管流についての静脈内投与されたＣＦＨｂによる実験結果をまとめたものである。明らかなように、Ｌ −アルギニンの投与(100mg／kg IV)は、腫瘍血管流のＣＨＦｂ−誘引の減少を逆転させなかった。 6.2.4. ＮＯ捕捉−低酸素の感作物質低酸素の細胞毒感受性についてのＮＯスカベンジャーの効果を示すために企図された実験結果は、第４表に示される。マイトマイシンＣ処理のみのものは、コントロール（未処理）群に比較して腫瘍増殖において６日の遅れが示された(p〈 0.001)。ＣＦＨｂ処理のみのものは、コントロール群に比較して腫瘍増殖について有意の遅れを示さなかった(p=0.342)。ＣＦＨｂとマイトマイシンＣの組み合わせは、コントロール群に比較して腫瘍の増殖が10日遅れた(p〈0.001)。このデータは明らかに、マイトマイシンＣとＣＦＨｂの組み合わせは、マイトマイシン単独に比較して増殖の遅延を増大する傾向を示している（4.4日；p=0.09）。 6.3. 結論総括すると、腫瘍血流に対するＮＯ阻害の効果に関する一連の11の実験が行われ、59個の腫瘍の血管及び12個の正常の組織の血管がこれに含まれている。ＮＯシンターゼ阻害剤Ｌ−ＮＭＡ又はＮＯスカベンジャーＣＦＨｂによるＮＯレベルの調節は、検討した腫瘍の血管の61％において血流を減少させたのに対し、正常組織の血管では17％が血流を減少させた。ＮＯシンターゼ阻害剤又はＮＯスカベンジャーのいずれかの投与から生ずる完全な血行停止は、すべての腫瘍の血管の 27％において、そして、正常な組織の血管の8.3 ％において観測された。このように、ＮＯシンターゼ阻害剤又はＮＯスカベンジャーの投与の効果は、腫瘍組織だけのものではないが、腫瘍組織において優先的に生ずるように思われる。腫瘍の血管におけるＬ−ＮＭＡ及びＣＦＨｂ−誘引性の管の血行停止は、Ｌ− アルギニンでは逆転しなかった。この結果は、ＮＯ減少の効果は、腫瘍における血管運動神経のトーン以上のものに関連するかもしれないことを示唆している。例えば、血小板付着が主要な役割を果たしているかもしれない。ＮＯスカベンジャーＣＦＨｂと低酸素性細胞毒であるマイトマイシンＣの組み合わせは、ウイルコクソンランクサム分析を使用する今回の実験では統計的に有意ではない増大であるが、マイトマイシンＣのみのものに比較して腫瘍の増殖の遅延において明らかな増大が示されている。 7. 実施例：ストローマフリーヘモグロビンの投与による組織及び腫瘍の酸素化の変化この実施例は、正常組織及び腫瘍の酸素化に対するストローマフリーヘモグロビン投与の効果についての生理学的な研究を報告する。結果は、各実験グループごとに３匹の動物に基づくものである。 7.1．材料及び方法３個の実験グループは、（１）9.0 mmHgのｐ50、（２）32.0mmHgのｐ50及び（３）アルブミンであった。投与時の３個の溶液の濃度はすべて100ml当たり10ｇであった。用量は、10分に亘るゆっくりとした注入による、投与されたものの体重125gm当たり、1.5 mlであった。すべての動物は、動脈圧を連続的にモニターするために載置された大腿部用動脈カテーテルを保持していた。心拍は、また、圧力をトレースすることにより得られた。種々の溶液の投与後の組織の酸素化をモニターするために、クラーク型の微少電極が筋及び２個の R3230AC腫瘍部位に置かれた。 R3230AC腫瘍は、ラットの乳腺癌である（上記6.1.1節を参照）。腫瘍は、動物の足部に移植された。すべての動物は、実験前にフェノバルビタールで麻酔された。体温は、サーモスタットでコントロールされた加熱毛布で37℃に維持された。 7.2. 結果全身の心血管系の機能の変化は、第３図に示される。３個のすべての注入溶液について、軽い頻脈が見られ、アルブミンにおいて最も顕著であった。頻脈は実験開始後60分迄持続した（第３図）。60分のサンプリングを行った間中いずれの注入溶液についても、収縮期−拡張期の圧力差に差はなかった。このことは、ストローク量に差異がないことを反映しているものと解釈される。アルブミン溶液注入後には、基準線(100mmHg)から平均約85から90mmHgの示度までの平均動脈圧のゆるやかな減少があった。我々は、この型の反応を以前、フルオソール(Fluos ol)及びリンガー溶液について観察しており、これは圧受容器反射によるものであった。対照的に、２個のヘモグロビン溶液に対する平均動脈圧は、投与後に増加した（第４図）。この効果は、投与後60分まで持続した。この結果、ヘモグロビン溶液は圧受容器の反射を相殺するように思われる。これは、ヘモグロビン溶液の一酸化窒素捕捉力によるものかもしれない。このような捕捉力はアルブミン溶液には存在しない。３個のすべての溶液が、ヘマトクリットにおける降下により反映されるように、血液希釈をもたらした。ヘマトクリットは一度注入が完了するとかなり安定であるように思われ、この結果、溶液は等張性であることを示している（第５図）。これらの溶液の注入の間及びその後の組織及び腫瘍の酸素張力（tension）の変化は、第６から９図に記録されている。アルブミン投与は、筋の pO₂に何ら影響しないように思われる（第６図）。筋で得られた結果とは対照的に、アルブミン投与は溶液投与の完了後まもなく腫瘍の酸素化を改善するように見える（第７図）。この結果は単に、血液レオロジーに対する効果を介しての腫瘍血流の改善でありうる血液希釈効果によるものであるかもしれない。これとは対照に、ヘモグロビン溶液は両方とも腫瘍の酸素化において降下を生じた。興味あることに、最も顕著な降下は、32mmHgヘモグロビン投与後に生じた（第７，８、及び９図）。ヘモグロビンは筋の酸素化には有意に影響を与えなかった。 7.3. 考察ヘモグロビンの投与から生ずる腫瘍の酸素化における降下は、選択的に低酸素化細胞を殺すストラテジーにおける明白な治療上の含みを有する。ヘモグロビンは筋の酸素化において有意な降下を引き起こさなかったが、ストローマフリーヘモグロビンの投与は、選択的に腫瘍組織の酸素化に影響を与え、正常組織には影響しない。酸素化におけるヘモグロビン誘引の減少という選択的性質は、低酸素の腫瘍の治療におけるアジュバントとしての価値を増大させる。ストローマフリーヘモグロビンは、圧受容器反射を相殺しうる能力に示されるように、一酸化窒素を捕捉する。ＮＯの捕捉は、同じく腫瘍の酸素化において観察された降下を引き起こすものと信じられる。 8. 一酸化窒素シンターゼ阻害剤による腫瘍潅流の選択的減少本明細書に記載されているように、我々はＬ−アルギニンによる管のＮＯの薬理学的阻害は選択的かつ非可逆的な腫瘍の流量の減少を生じ、腫瘍の流れは不可能であるが、正常な組織流はＬ−アルギニンの投与により引き続き回復させることができることを発見した。非特異的なＮＯシンターゼ阻害剤であるＮ^GモルメチルＬ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＡ、50μＭ）を60分間注入し、続いてＮＯ生成のための真の基質であるＬ−アルギニンを60分間注入したときの微少血管の効果を、背部皮膚弁窓チェンバー及び R3230Ac乳腺癌を移植した雌フィッシャー 344ラットにおいて、ビデオ顕微鏡法を使用して測定した。Ｌ−ＮＭＡは腫瘍調製物の血流を43％、及びコントロール調製物の血流を83％の減少を、小静脈直径の減少並びに赤血球細胞（ＲＢＣ）速度の減少により生じさせ、微少血管の長さ密度を減少させ、そして、間けつ的な管流及び血行停止を示す腫瘍の管の割合を増大させた。これらの変化はＬ−アルギニンによりコントロール値に反転させたが、腫瘍の小静脈直径、ＲＢＣ速度、及び管の長さ密度は回復しなかった。 8.1．材料及び方法 8.1.1．動物モデル粒状化している皮下組織の微小血管を見えるようにし、そして、腫瘍の増殖に対する基質を提供するために、150から200gの重量の雌フィッシャー 344ラット（チャールズリバーラボラトリー、Raleich NC）に外科的に皮下の窓チェンバーを移植した。チェンバーのデザイン及び外科的手法の詳細は、他に記載されている（Pappenfusら、1979、Microvasc．Res．18:311-318）。簡単に述べると、背側の皮膚弁の対向する表面を通して1.0 cmの直径の穴を無菌的な外科切開により形成させ、２又は３個の動−静脈対を有する１個の筋膜性の平面を残す。腫瘍生成調製物において、手術時に筋膜性の平面に0.1mm³ の片の腫瘍(R3230Ac 乳腺癌、Hilfら、1965、Cancer Res．25:286-299)を置き、一方、コントロールのチェンバーには腫瘍を移植しなかった。外科的移植に続いて、動物は34℃、50％の湿度で、いつでも食べ物及び水にアクセスできるようにした環境下の室内で別々に維持した。手術後のすべての準備は、９−11日要した。その時腫瘍は、直径３〜４mmになっていた。 8.1.2．小静脈の管腔内の直径及びＲＢＣ速度の測定２個の軸線形測定システム（2-LM.5，Boeckeler Instruments，Tucson AZ）を備えた 200倍のツァイス光学顕微鏡の顕微鏡台で（Carl Zeiss，Photomicroscop e III，New York，NY）40ワットのタングステン光源で光を通過させながら、窓チェンバー調製物のビデオ顕微鏡を使用して小静脈直径及びＲＢＣ速度を測定した。映像はビデオカメラ（MTI CCD-72，Dage-MTI，Michigan，MI）でとらえ、管の直径を後で分析するためにＳ−ＶＨＳテープに記録した（SVO-9500MD，アメリカ−ソニー社，San Jose，CA）。個々の血管の同定及び位置、並びにＲＢＣ速度の測定の正確な位置は、ビデオモニター上に置かれたアセテートシート上で当該それぞれの領域に対する血管床をトレースすることと、フィールドのＸ−Ｙ位置を記録することにより、記録された。血管の直径は、ＲＢＣ速度を測定した部位でフレームグラバー(PC Visiont，Imaging Technology社、Woburn MA)及びイメージ分析ソフトウェアー（Java，Jandel Scientific，Conte Madera，CA）を使用して測定した。デュアルウインドー手法がＲＢＣ速度を測定するために使用された(IPM Model 204 Video Analyzer及び 102B Velocity Tracker，San Die go CA)(To mpkinsら、1974，Rev．Sci．Instrum．45:647-649)。処理に関するビデオテープ記録の時間を記載するために、ビデオタイマーシグナルの重ね合わせを使用した（CTG-55ビデオタイマー、For．A Co.，Ltd.，Los Angeles，CA）。横断面と速度の間の相互作用を示すために、相対流が導かれ、これは以下のとおりである：相対流＝（直径の微小変化）² ＊（ＲＢＣ速度の微小変化） 8.1.3. 管の長さ密度と間けつ流比の測定処理前（基準線）、続いてＬ−ＮＭＡで処理、そして再びＬ−アルギニンで処理した各々の実験のビデオテープ化した部分を使用して、形態計測の指標である管の長さ密度を得た(Chenら、1981，Am.J．Physiol．241:H306-H310)。同様に間けつ的な流れ及び血行停止の頻度を得た。管の長さ密度を測定するために、ビデオスクリーン上にスクウェアー（square）グリッドを重ね合わせ、グリッドとＲＢＣ流をもつすべての管の間の交差の数を１分間計測した。ビデオフィールド当たりのグリッドスクウェアーの数は 408であった。典型的には、交差の数はビデオフィールド当たり 150から 300の範囲にあった。mm／mm³組織における管の長さ−密度は以下により計算される：長さ密度＝Ｎ交差／( 4 gtd)，式中、Ｎ交差＝血管とグリッド線の間の交差の数、ｇ＝グリッド(408)におけるブロックの数、ｄ＝拡大のために補正した１個のグリッドスクウェアーサイドの長さ（0.0193mm）、及びｔ＝微小管が識別できるフィールドの測定された深さ（ 0.15mm）。処理による管の長さ密度の変化は、処理物の長さ密度を基準線の長さ密度で割り算することにより測定された。間けつ流又は血行停止、ここで間けつ流とは≧５秒の間停止するか又は逆流を生ずるものと定義されるが、を示す小静脈のパーセントも、また、ビデオテープ化された実験から測定された。最初にフィールド（映像面）あたりの血管の全数が計測された。血管は分枝点の間の部分として定義した。間けつ流又は血行停止を示す管を計測した。流れを有すると明らかに確認できない管は別個に記録した。間けつ流又は血行停止を示す管のパーセントは、１分間の観察間隔の間のいずれかの時点で観察された間けつ流及び流れの停止を有する０の数をフィールドの管の全数から未確定の流れの状態を有する管の数を引いたもので割り算することにより計算された。間けつ流を有する各々の管は、例え１分の観察間隔の間で１回以上停止したとしても、唯一回としてかぞえた。間けつ流又は血行停止を示す小静脈のパーセントは、Ｌ−ＮＭＡ及びＬ−アルギニン処理の双方について測定した。 8.1.4. 実験プロトコール動物は、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し(40mg/kg，i.p.)、直腸温度を37℃にしてサーモスタットでコントロールされた毛布の中に維持した(モデル 50-7503 Homeothermic Blanket，Harvard Bioscience，S．Natick，MA)。大腿の動脈及び静脈は、動脈血圧を測定し、薬物をi.v.注入するためにカニューレを行った。動脈圧の波形(Gould P23XL，Gould Instrument Systems，Cleveland OH) 及びＲＢＣ速度は、脈うつ動脈の波形から測定された心拍数及び平均動脈圧とともに、200Hzでそれぞれデジタル化し、その後の分析のためにディスクに記録した（AT-Codas，Data Instruments，Akron OH）。ラットを顕微鏡台上の側部もたれ部(lateral recum-bency)に載置し、上部ウインドーを取り除いた。95％Ｎ₂／５％ＣＯ₂で通気したＥＢＳＳ（Gibco ca t ♯450-1100EB，Life Technologies Inc.，Grand Island，NY）を１〜２ml／分で表面上に注入した。組織表面における媒質の温度は32℃であった。腫瘍の中心、血管過多性の腫瘍の周辺において、及び腫瘍からとり出された粒状化しており又は治癒した皮下組織の周辺の“正常な”領域において、小静脈の選ばれたフィールドが観察された。粒状化した組織におけるポストキャピラリー (postcapi- llary)小静脈が同様に腫瘍を生じないコントロールの窓チャンバーにおいて検査された。同じ管が治療前及び治療後に観察された。処理前の観察に続いて、腫瘍の露出された面部を通して60分間50μＭのＬ−ＮＭＡ（Calbiochem cat ♯475886; EBSS中）を注入し、測定を繰り返した。次に、同じ管で測定を再び行う前に、さらに60分間チェンバーを通してＬ−アルギニン(Calbiochem ca t ♯1820; EBSS中)200 μＭを注入した。 8.1.5. 統計的分析基準線直径からの相対的変化、ＲＢＣ速度、平均動脈圧、並びにコントロール及び腫瘍生成調製物についての心拍数を、混合された効果（mixedeffects）線状モデルを使用して評価した(Crowder，M.J.，Hand，D.J．Analysis of Repeated Measures，London; Chap- man及びHall，1990)。このモデルは、分析時の変動の動物内及び動物間ソースを使用して、各々の動物において多重測定で計測する。平均及び標準誤差（及び９５％の信頼間隔）はモデルから計算され、これはSAS ／STAT方法 PROC MIXED を使用して大きさを決定した (SAS Institute，Inc．SAS Technical Report P-229，SAS/STAT ソフトウェア： Changes and Enhancements，Release 6.07．Cary NC:SAS Institute，Ins.，199 2)。すべての有意差の統計的試験は、２面の試験に基づいており、有意差レベルは0.05であった。 8.2. 結果 8.2.1. 基準線パラメータコントロール（n=3）及び腫瘍生成（n=15）窓チェンバー実験に関する治療前の直径及びＲＢＣ速度（平均及び標準誤差［SEM］）は第５表に示されている。多重比較のために調整された、３つのカテゴリーの腫瘍血管の間の平均直径及び平均ＲＢＣ速度におけるペアー間（pairwise）差異は存在しなかった。腫瘍チェンバーにおける正常の小静脈についての処理前の直径及びＲＢＣ速度は、コントロールのチェンバーの小静脈のそれと同様であった。Ｌ−ＮＭＡ及びＬ−アルギニンの注入は、平均動脈血圧及び心拍数についての相対変化に影響を与えなかった（第６表）。血管の間の平均直径及び平均回転率において、有意のペアー間の差異はなかった（p〈0.05、多重比較のために調整した）。腫瘍生成チェンバー正常血管は、コントロールチェンバーの正常血管と有意の差はなかった。処理した、血管の型別、又は腫瘍とコントロール調製物の間で、平均動脈圧又は心拍数に有意な差異はなかった。 8.2.2. 血管の直径Ｌ−ＮＭＡの注入は、すべての型の腫瘍調製物の小静脈並びに非−腫瘍のコントロール調製物中の小静脈に対して、基準線の直径を有意に減少させた(第10図；すべてp〈0.05)。Ｌ−ＮＭＡ投与後の相対直径変化に関して、個々の血管型の間で有意なペアー間の差異はなかった。しかしながら、腫瘍生成調製物においてよりも非−腫瘍の血管直径において一層大きな減少が存在した（p=0.02）。腫瘍調製物においてＬ−アルギニンの注入は、小静脈の直径を基準線の方向に回復させることを無視できるほどの作用しか有しない。しかしながら、コントロール調製物における小静脈は、Ｌ−アルギニンの後では処理前の直径に戻った。Ｌ−アルギニンの後で直径の相対変化に関し、腫瘍調製物血管の間で有意のペアー間の差異を生じなかった。しかしながら、Ｌ−アルギニン投与後の腫瘍とコントロールウインドー調製物の間で小静脈の直径に有意の差を生じた（p=0.01）。 8.2.3. ＲＢＣ速度正常のコントロール小静脈と腫瘍中心の小静脈の双方が処理前のＲＢＣ速度、続いてのＬ−ＮＭＡから有意の減少を示した(第11図；いずれも p〈0.05)。腫瘍の近部の正常な小静脈と比較すると、腫瘍中心の小静脈及び腫瘍周辺の小静脈についてのＲＢＣ速度はいずれもＬ−ＮＭＡの後では有意に減少した(それぞれ p 〈0.001，p=0.005)。Ｌ−ＮＭＡは腫瘍生成調製物と比較すると、コントロール調製物におけるＲＢＣ速度において有意に大きな減少を起こした(p〈0.004)。Ｌ −アルギニンはコントロール調製物においてＲＢＣ速度を処理前のレベルに戻し、そして、周辺腫瘍小静脈及び腫瘍の近部の正常な小静脈の両方においてＲＢＣ速度を回復した。しかしながら、Ｌ−アルギニンの後では腫瘍中心の小静脈におけるＲＢＣ速度は、さらに基準線から減少した（p〈0.05）。腫瘍中心小静脈のＲＢＣ速度は、Ｌ−アルギニンの後では、周辺腫瘍小静脈及び腫瘍近部の正常小静脈の双方のそれよりも有意に低く維持された(それぞれ、p=0.05 及び p=0.03)。 8.2.4. 小静脈流Ｌ−ＮＭＡの注入は、腫瘍中心及び周辺腫瘍小静脈の両方において流量を43％減少させ、腫瘍近部の正常小静脈において流量を17％減少させたのに対し、非− 腫瘍のコントロール小静脈の流れは83％減少させた（第12図）。Ｌ−アルギニンは非−腫瘍コントロールの小静脈流、周辺腫瘍小静脈の流れ、及び腫瘍近部の正常小静脈流を処理前のほぼ65％増加させた。しかしながら、腫瘍中心の小静脈流は、Ｌ−アルギニンの存在下で基準線の48％に減少した。直径及びＲＢＣ速度の両方を測定する際に固有の誤差の増幅を回避するために、統計分析は相対流のデータについては実施しなかった。 8.2.5. 血管の長さ密度統計的に有意ではないが、腫瘍調製物は、Ｌ−ＮＭＡ処理により基準線に比較して、血管の長さ密度において減少する傾向を示した（第13図；ここで腫瘍中心の小静脈に対してp=0.07 であり、そして、周辺腫瘍小静脈及び腫瘍近部の正常小静脈の両方に対してp=0.08 である。）。血管の長さ密度は、腫瘍中心及び周辺腫瘍血管の両方に対して、Ｌ−アルギニンの後では基準線に比較して、さらに減少した(それぞれ、p=0.01 及び p=0.05)。 8.2.6. 間けつ的な血管流及び血行停止Ｌ−ＮＭＡは腫瘍中心血管において基準線に対して間けつ的血流及び血行停止を増加させた（第14図；p-0.03）。同様に、間けつ的血流及び血行停止は、周辺腫瘍小静脈において及び腫瘍近部の正常小静脈において増加の傾向を示した(双方の比較において p=0.06)。Ｌ−アルギニン処理は、すべての管の型において間けつ的管流及び血行停止を処理前のレベルに戻した。 8.3. 結論我々は、ＮＯシンターゼ阻害が選択的かつ非可逆的な腫瘍流の減少を生ずること及び正常組織流、腫瘍流ではない、はＬ−アルギニンによりその後回復されることを示した。本発明は、ここに記載された特定の態様によりその範囲を限定されるべきではない。実際、ここに記載したものに加えて、本発明の種々の修正は前記の記載及び付属の図面から当業者には明らかであろう。そのような修正は、ここに掲げられたクレームの範囲に入れるつもりである。種々の刊行物がここで引用されたが、それらの開示はそっくりそのまま参考として組み入れられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｎ 5/02 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/14 ＡＥＤ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (71)出願人ノースカロライナステイトユニバーシティーアメリカ合衆国 27695 ノースカロライナ州ラレイ，ボックス 7003，ホラデイホール１番地 (72)発明者デフィルスト，マークダブリュ. アメリカ合衆国 27514 ノースカロライナ州チャペルヒル，フォックスウッドドライブ 2509番地 (72)発明者ミーヤー，ロバートイー. アメリカ合衆国 27513 ノースカロライナ州ケアリー，ハイパインコート 104番地 (72)発明者ボナヴェンチュラ，ジョセフアメリカ合衆国 28516 ノースカロライナ州ボーフォード，サークルドライブ 127番地 (72)発明者デアンゲロ，ジョセフアメリカ合衆国 48212 ミシガン州ハムトランク，イェーマンズ 2249番地

Claims

【特許請求の範囲】１．固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素スカベンジャー(scavenger)および治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒を投与することを含んでなる、固形腫瘍を有する動物の治療方法。２．一酸化窒素スカベンジャーが低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒と同時に投与される、請求項１に記載の方法。３．一酸化窒素スカベンジャーが低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒の投与後１５分から６０分の間に投与される、請求項１に記載の方法。４．一酸化窒素スカベンジャーが無細胞ヘモグロビンである、請求項１に記載の方法。５．無細胞ヘモグロビンが約0.01 g/kgから約10 g/kgの範囲の用量で投与される、請求項４に記載の方法。６．治療上有効量の低酸素性細胞毒マイトマイシンＣを投与することを含む、請求項１に記載の方法。７．動物がヒトである、請求項１に記載の方法。８．固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤および治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒を投与することを含んでなる、固形腫瘍を有する動物の治療方法。９．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒と同時に投与される、請求項８に記載の方法。１０．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒の投与後１５分から６０分の間に投与される、請求項８に記載の方法。１１．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項８に記載の方法。１２．置換Ｌ−アルギニンが約0.1 mg/mlから約100 mg/mlの範囲の用量で投与される、請求項１１に記載の方法。１３．置換Ｌ−アルギニンがＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンである、請求項１１に記載の方法。１４．治療上有効量の低酸素性細胞毒マイトマイシンＣを投与することを含む、請求項８に記載の方法。１５．動物がヒトである、請求項８に記載の方法。１６．固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素スカベンジャーを投与し、かつ加温療法を施すことを含んでなる、固形腫瘍を有する動物の治療方法。１７．加温療法が一酸化窒素スカベンジャー投与の約１時間後に施される、請求項１６に記載の方法。１８．一酸化窒素スカベンジャーが無細胞ヘモグロビンである、請求項１６に記載の方法。１９．加温療法がマイクロ波放射、超音波、加熱エレメント(element)および放射エネルギーよりなる群から選択される物理的作用物質を用いる治療よりなる、請求項１６に記載の方法。２０．動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。２１．固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤を投与し、かつ加温療法を施すことを含んでなる、固形腫瘍を有する動物の治療方法。２２．加温療法が一酸化窒素シンターゼ阻害剤投与の約１時間後に施される、請求項２１に記載の方法。２３．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項２１に記載の方法。２４．置換Ｌ−アルギニンがＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンである、請求項２３に記載の方法。２５．加温療法がマイクロ波放射、超音波、加熱エレメントおよび放射エネルギーよりなる群から選択される物理的作用物質を用いる治療よりなる、請求項２１に記載の方法。２６．動物がヒトである、請求項２１に記載の方法。２７．不適当な組織血管新生に関連する障害を有する動物の治療方法であって、上記障害の治療の補助として治療上有効量の一酸化窒素スカベンジャーを投与することを含んでなる該方法。２８．一酸化窒素スカベンジャーが無細胞ヘモグロビンである、請求項３１に記載の方法。２９．動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。３０．障害の治療が加温療法である、請求項２７に記載の方法。３１．不適当な組織血管新生に関連する障害を有する動物の治療方法であって、上記障害の治療の補助として治療上有効量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤を投与することを含んでなる該方法。３２．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項３１に記載の方法。３３．動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。３４．障害の治療が加温療法である、請求項３１に記載の方法。３５．固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量のグアニル酸シクラーゼまたはサイクリックＧＭＰの阻害剤、および治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒を投与することを含んでなる、固形腫瘍を有する動物の治療方法。３６．固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量のグアニル酸シクラーゼまたはサイクリックＧＭＰの阻害剤を投与し、かつ加温療法を施すことを含んでなる、固形腫瘍を有する動物の治療方法。３７．腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素スカベンジャーおよび治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒を含んでなる、固形腫瘍を有する動物を治療するための医薬組成物。３８．一酸化窒素スカベンジャーがヘモグロビンである、請求項３７に記載の医薬組成物。３９．治療上有効量の低酸素性細胞毒マイトマイシンＣを含む、請求項３７に記載の医薬組成物。４０．製薬上許容されるキャリヤーをさらに含んでなる、請求項３７に記載の医薬組成物。４１．腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤および治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒を含んでなる、固形腫瘍を有する動物を治療するための医薬組成物。４２．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項４１に記載の医薬組成物。４３．置換Ｌ−アルギニンがＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンである、請求項４２に記載の医薬組成物。４４．治療上有効量の低酸素性細胞毒マイトマイシンＣを含む、請求項４１に記載の医薬組成物。４５．製薬上許容されるキャリヤーをさらに含んでなる、請求項４１に記載の医薬組成物。４６．腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤の投与を受けた被験者の血流減少または正常組織の酸素化減少を緩和するに十分な量の一酸化窒素シンターゼ基質を含んでなる、固形腫瘍を有する動物を治療するための医薬組成物。４７．一酸化窒素シンターゼ基質がＬ−アルギニンまたはグアニジノスクシネートである、請求項４６に記載の医薬組成物。４８．製薬上許容されるキャリヤーをさらに含んでなる、請求項４６に記載の医薬組成物。４９．下記の工程を記載された順序で含んでなる、固形腫瘍を有する動物を治療するための方法：（ａ）固形腫瘍を有する動物に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤を投与し；そして（ｂ）工程（ａ）によって生じる血流減少または正常組織の酸素化減少を緩和するに十分な量の一酸化窒素シンターゼ基質を上記動物に投与する。５０．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒と共に投与される、請求項４９に記載の方法。５１．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒と同時に投与される、請求項５０に記載の方法。５２．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒の投与後１５分から６０分の間に投与される、請求項５０に記載の方法。５３．一酸化窒素シンターゼ基質が一酸化窒素シンターゼ阻害剤の投与後１０分から４時間の間に投与される、請求項４９に記載の方法。５４．一酸化窒素シンターゼ基質が一酸化窒素シンターゼ阻害剤の投与後１０分から４時間の間に投与される、請求項５４に記載の方法。５５．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項４９に記載の方法。５６．置換Ｌ−アルギニンが約0.1 mg/mlから約100 mg/mlの範囲の用量で投与される、請求項５５に記載の方法。５７．一酸化窒素シンターゼ基質がＬ−アルギニンである、請求項４９に記載の方法。５８．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が治療上有効量のマイトマイシンＣと共に投与される、請求項５０に記載の方法。５９．動物がヒトである、請求項４９に記載の方法。６０．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が加温療法と共に投与される、請求項４９に記載の方法。６１．加温療法が一酸化窒素シンターゼ阻害剤投与の約１時間後に施される、請求項６０に記載の方法。６２．一酸化窒素シンターゼ基質が一酸化窒素シンターゼ阻害剤投与後１０分から４時間の間に投与される、請求項６０に記載の方法。６３．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項６０に記載の方法。６４．置換Ｌ−アルギニンがＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンである、請求項６０に記載の方法。６５．一酸化窒素シンターゼ基質がＬ−アルギニンである、請求項６０に記載の方法。６６．一酸化窒素シンターゼ基質が約30 mg/kgから300 mg/kgの範囲の用量で投与される、請求項６０に記載の方法。６７．加温療法がマイクロ波放射、超音波、加熱エレメントおよび放射エネルギーよりなる群から選択される物理的作用物質を用いる治療よりなる、請求項６０に記載の方法。６８．動物がヒトである、請求項６０に記載の方法。６９．固形腫瘍を有する動物の治療方法であって、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤を前もって投与した固形腫瘍を有する動物に、上記一酸化窒素シンターゼ阻害剤の投与によって生じる血流減少または正常組織の酸素化減少を緩和するに十分な量の一酸化窒素シンターゼ基質を投与することを含んでなる、該方法。７０．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンであり、かつ一酸化窒素シンターゼ基質がＬ−アルギニンまたはグアニジノスクシネートである、請求項６９に記載の方法。７１．動物が前もって加温療法も施されているか、または治療上有効量の低酸素性細胞毒またはアシドーシス性細胞毒の投与も受けている、請求項６９に記載の方法。７２．別々の容器内に収められた下記のものを含んでなるキット：（ａ）被験者の腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の、製薬上許容される形態の一酸化窒素シンターゼ阻害剤；および（ｂ）一酸化窒素シンターゼ阻害剤の投与を受けた被験者の血流減少または正常組織の酸素化減少を緩和するに十分な量の、製薬上許容される形態の一酸化窒素シンターゼ基質。７３．腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素スカベンジャーおよび製薬上許容されるキャリヤーを含んでなる、固形腫瘍を有する被験者を治療するための医薬組成物。７４．一酸化窒素スカベンジャーが無細胞ヘモグロビンである、請求項７３に記載の医薬組成物。７５．腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤および製薬上許容されるキャリヤーを含んでなる、固形腫瘍を有する被験者を治療するための医薬組成物。７６．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項７５に記載の医薬組成物。７７．置換Ｌ−アルギニンがＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンである、請求項７６に記載の医薬組成物。７８．固形腫瘍を有する被験者に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素シンターゼ阻害剤を投与することを含んでなる、固形腫瘍を有する被験者の治療方法。７９．一酸化窒素シンターゼ阻害剤が置換Ｌ−アルギニンである、請求項７８に記載の方法。８０．置換Ｌ−アルギニンがＮ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニンである、請求項７９に記載の方法。８１．固形腫瘍を有する被験者に、腫瘍血流を減少させるか、または腫瘍酸素化を減少させるに十分な量の一酸化窒素スカベンジャーを投与することを含んでなる、固形腫瘍を有する被験者の治療方法。８２．一酸化窒素スカベンジャーが無細胞ヘモグロビンである、請求項８１に記載の方法。