JPH11502846A - ニトロキシドをバイオ和合性高分子と併用する組成物および方法 - Google Patents

ニトロキシドをバイオ和合性高分子と併用する組成物および方法

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JPH11502846A
JPH11502846A JP8529473A JP52947396A JPH11502846A JP H11502846 A JPH11502846 A JP H11502846A JP 8529473 A JP8529473 A JP 8529473A JP 52947396 A JP52947396 A JP 52947396A JP H11502846 A JPH11502846 A JP H11502846A
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Abstract

(57)【要約】 遊離基毒性を軽減するための組成物および方法を開示し、これは生理的に和合性の高分子と併用するニトロキシドの使用を基にする。特に、ヘモグロビンを基にする赤血球代用剤が記載され、これは、細胞を含まないヘモグロビン溶液、被包ヘモグロビン溶液、重合ヘモグロビン溶液、複合ヘモグロビン溶液、ニトロキシド標識アルブミンおよびニトロキシド標識免疫グロブリンにおける使用のための安定なニトロキシドを特徴とする。製剤は、インビボでニトロキシドを活性型で保持する抗酸化酵素様体として働いて、遊離基と相互作用をなす。用途には、血液代用剤、放射線保護剤、イメージング剤、虚血および再灌流損傷に対する保護剤、特に脳卒中の脳虚血において、および他の疾患におけるインビボ酵素様体が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 ニトロキシドをバイオ和合性高分子と併用する組成物および方法 発明の分野 本発明は、膜透過性ニトロキシドとニトロキシド標識高分子ニトロキシドとの 併用を含むニトロキシドの治療的および診断的使用に関する。該高分子には、ポ リペプチド、例えばヘモグロビン、アルブミン、免疫グロブリンおよびポリサッ カライド、例えば、デキストリン、ヒドロキシエチルデンプンおよび人工膜、例 えば液体二層体、ヘモグロビンおよびアルブミンミクロバブルがある。ニトロキ シド含有製剤は、生物体における酸素関連物質の毒性を軽減し、非常に多様な病 理的、生理的症状を診断および処置する能力を提供する。本発明はまた、ニトロ キシドのインビボ効果を保持するために、低分子量かつ膜透過性ニトロキシドと 併用されるニトロキシド、合成ニトロキシドポリマー、コポリマーおよびニトロ キシド標識高分子にも関する。本発明はまた、赤血球代用としての使用のための 生理的和合性で、細胞を含まない、被膜に囲まれたヘモグロビンの溶液と併用さ れるニトロキシドを特徴とする新規な化合物および方法に関する。さらに、本発 明は、皮膚の光線による老化の処置のため、および皮膚の抗皺剤として、膜不透 過性ニトロキシドの治療的濃度の細胞内蓄積をもたらす膜透過性型における膜不 透過性ニトロキシドの局所的分布のための方法および新規化合物も開示する。さ らに、本発明は、上記ニトロキシドが、遊離基による病理的損傷および酸化スト レスに対して保護するために、他のニトロキシドを含む他の生理的に活性な化合 物と併用されることを開示し、および疾患の診断および治療におけるこれらの使 用を開示する。 発明の背景 酸素代謝の生理的メカニズムは古くから知られているが、生理学および医学に おいて、酸素ストレスが果す役割は完全には分かっていない。生理および疾病に 対する酸素誘導遊離基の効果は、医学および生物学において重要性が増している 問題である。疾病および傷害によって、人体の自然抗酸化能力をはるかに越えた 遊離基のレベルに達し得ることが知られている。結果は酸化ストレスである。酸 化ストレスは、抑制し得ない遊離基の毒性の生理的発現であり、最も注目すべき は毒性のある酸素関連物質から生じることである。毒性遊離基は、心臓発作ある いは脳卒中に起因する虚血再灌流傷害、ショック、脱毛症、敗血症、アポトーシ ス（細胞消滅）、特定薬物毒性、肺の疾病の治療における酸素療法に起因する毒 性、電離性放射に対する臨床上あるいは事故的被曝、外傷、閉鎖性頭部外傷、火 傷、乾癬、老化など、多くのものを含む病理的症状における原因とされている。 従って、遊離基および関連毒性物質を解毒し、遊離基の濃度が増加したときに 、急激に消費されないで、人体において十分活性かつ持続性である組成物および 方法を必要としている。 さらに、遊離基が癌、潰瘍および他の胃腸状態、白内障、閉鎖性頭部外傷、腎 不全、神経組織傷害および心臓血管疾病などを含む、多くの他の疾病状態を悪化 させるとの証拠が増加している。高い反応性の結果として、遊離基は、核酸、生 物学的細胞膜および他の細胞構成要素を酸化して、重篤なあるいは致死的な細胞 の損傷、変異原性あるいは癌原性をもたらす。抗癌放射線治療は、多くの抗癌剤 と同様に腫瘍細胞にとって有害であり、正常な細胞にとっても有害である遊離基 を発生することによって作用し、正常な細胞は、細胞分裂が癌療法の望ましくな い副作用を起こす間、さらされている。さらに、多くの病理学的方法によると、 共通の最終経路として、観察される病理の直接あるいは実質的な原因である遊離 基の発生が考えられている。さらに、遊離基の濃度の劇的な増加は、しばしば影 響を受ける領域への酸化血液の再灌流が後に起こる、心臓発作あるいは脳卒中な どの、酸化血液の流れの中断によって始まるカスケードの部分として観察される 。生物組織におけるこのような酸化ストレスの重要性が評価されるにつれて、続 いて、抗酸化剤として作用することができ、生物学的組織、とくにヒトにおける 毒性を軽減するために、酸素誘導遊離基と相互作用し得る化合物および方法を必 要としている。他の効用において、毒性遊離基は癌の放射線療法の一部として投 与される放射線のような有益な治療法と一致することがあり得る。例えば、電離 性 放射が生理的損傷を生物に及ぼすメカニズムは、少なくともある程度、遊離基の 細胞との相互作用に関連しているので、遊離基を保持する、あるいは相互作用す る化合物は、治療処置による二次的損傷を抑制する放射線療法にさらされた組織 における局在性効果を発揮する。さらに、臨床的に有意義な作用とは別に、遊離 基物質における不対電子は分光法によって見つけることができるので、遊離基反 応はインビボで監視でき、遊離基と相互作用する化合物は分光学的技術によって 観察可能である。 いくつかの治療方法で遊離基の病理的レベルを下げるよう提案されている。理 想的には、安全で効果的な抗酸化剤が患者の抗酸化能力を増加し、遊離基の発生 段階で、多くの病理的な遊離基を基とする毒性を阻止するのに役立つであろう。 しかしながら、酸化ストレスあるいは酸化関連物質と関係する毒性に対する方法 と化合物の開発は限定的な成功しか収めていない。多くの抗酸化剤の有効性は、 インビボ作用の短い期間、有効な用量レベルでの毒性、多くの化合物が細胞膜を 通過し得ないことおよび遊離基の高レベル作用に抗し得ないことによって限られ ている。例えば、スーペルオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）酵素あるいはカタ ラーゼの投与は毒性遊離基関連物質の非毒性型への変換を促進する。しかしなが ら、これらの酵素は細胞内において効果的に作用しない。ビタミンおよび他の抗 酸化剤と同様に、ＧＳＨ先駆物質としてプロシステインは、人体の自然抗酸化能 力を高めるが、傷害および疾病における高レベルの遊離基を処置できず、急激に 体内で消費される。 遊離基物質は、反応性かつ短命であることはよく知られている。遊離基と人体 組織の間の有害な化学反応は、遊離基が発生する部位に非常に近接して起こるの で、このような反応性は生物組織において特に深刻な危険要素である。従って、 脳、表皮、消化管、心臓血管組織などの人体の特定領域、あるいは放射線投与の 部位のような別々の組織に治療効果を集中および局限し得ない限り、効果は臨床 的に有意義ではないだろうが、本来遊離基濃度を下げるように作用する化合物は ある程度有益な効果がある。 大量の静脈内投与に適した血液代用品をつくる際に直面する困難は、血管にお ける酸素関連物質によって起こる全身的毒性を防ぐあるいは軽減するのが困難な 急性例である。科学者および医師らは、何十年間ヒトに安全に輸血することので きる血液代用品の製造に取り組んできた。永続的な血液の不足、不適合な血液型 の問題、交叉試験法および疾病の感染によって、重大な生理的副作用がなく安全 に輸血できる大量の血液代用品をつくることのできる製剤の発見に、民間産業、 大学および政府は幅広い努力をしてきた。現在、数企業が試験的血液代用品の臨 床試験を行っている。しかしながら、有害な生理的反応および研究開発方法に固 有の複雑性が規則による承認段階からの進展と臨床的に有益な血液代用品の開発 を妨げている。 アメリカ海軍のある研究諮問委員会は、１９９２年８月、血液代用品を生産す るいくつかの団体の業績の概要、これら業績の状況を評価し、一般的に直面して いる毒性問題を記載した報告書を発行した。海軍研究諮問委員会報告書は、しば しば“ヘモグロビンを基とする酸素担体（ＨＢＯＣ）”と呼ばれる既存の血液代 用品製品が酸素輸送における効率を証明していても、ある毒性の問題点は未解決 であるとの科学界における最新の同意を反映している。既存のヘモグロビンを基 とする酸素担体（ＨＢＯＣ）の臨床研究において観察される有害な輸血反応は、 全身的高血圧および血管収縮を含む。これらの有害な反応によって多くの製薬会 社は、臨床実験を断念するか、あるいは低用量レベルで実施せざるを得なかった 。 既存のヘモグロビンを基とする血液代用品における毒性問題の解決は、米国政 府によって高い優先権を与えられてきた。海軍研究委員会の勧告は“ヘモグロビ ンを基とする酸素担体：毒性のメカニズム（Hemoglobin-based oxygen carriers ：mechanism of toxicity）”というテーマに関する計画要請（PA-93-23）とい う形で、国立衛生研究所（National Institute of Health）により実行されてき た。従って、医学および科学界は、既存ヘモグロビンを基とする酸素担体で観察 される副作用なしに使用できる血液代用品について深刻で差し迫った必要性に悩 んでいる。 赤血球は、血液の主な構成要素であり、人体の酸素輸送システムを担う。血液 代用品の最も重要な特製は酸素を運ぶ能力であることは長い間認識されてきた。 赤血球の主要構成要素が酸素担体として機能するヘモグロビンであるので、赤血 球は酸素を輸送することができる。 血液代用品として臨床試験を受けている製品の多くは、赤血球細胞膜と赤血球 の残留要素から分離され、すべての汚染物質を本質的に取り除くために精製され たヘモグロビンを含む。しかしながら、ヘモグロビンを赤血球から除去し、その もとの形態で溶液に入れると、不安定で急速に要素サブユニットに解離する。こ の理由から、ヘモグロビンを基とする酸素担体（ＨＢＯＣ）に使用されるヘモグ ロビンは、溶液に解離せずに安定でなければならない。科学的な労力と資本の多 くの出費が、溶液に安定で、酸素輸送機能が損なわれない方法において安定して いるヘモグロビンを基とする製品の開発のために必要であった。既存ヘモグロビ ンを基とする酸素担体の酸素輸送能力は十分立証されている（参照、米国特許第 ３,９２５,３４４；４,００１,２００；４,００１,４０１；４,０５３,５９０； ４,０６１,７３６；４,１３６,０９３；４,３０１,１４４；４,３３６,２４８； ４,３７６,０９５；４,３７７,５１２；４,４０１,６５２；４,４７３,４９４； ４,４７３,４９６；４,６００,５３１；４,５８４,１３０；４,８５７,６３６； ４,８２６,８１１；４,９１１,９２９および５,０６１,６８８）。 人体において、血液が肺を通るときに赤血球中のヘモグロビンは、酸素分子と 結合し、人体の正常な代謝機能の要求に応えるため、酸素分子を人体中に輸送す る。しかしながら、ほとんどの生物が生存のために呼吸しなければならない大気 中の酸素は、科学的および医学的に矛盾している。一方では、ほとんどすべての 生物が生きるために酸素を必要としている。もう一方では、様々な毒性酸素関連 化学物質が正常な酸素代謝の間に産出されている。 ヘモグロビンによる酸素輸送から生じる酸化ストレスに関して、酸素輸送過程 において、ヘモグロビン（Ｈｂ）分子それ自体が輸送している酸素（Ｏ2）分子 によって酸化され得ることは知られている。この自己酸化反応は２つの望ましく ない生産物を産出する。ｍｅｔ−ヘモグロビン（ｍｅｔ−Ｈｂ）およびスーペル オキシドアニオン（・Ｏ2 -）である。化学反応は下記のように記載される。 スーペルオキシドアニオン（・Ｏ2 -）は付加電子およびマイナス電荷を帯びた酸 素分子である。スーペルオキシドアニオンは高い反応性と毒性がある。 ここに詳細に記載されるように、スーペルオキシドアニオンのような遊離基物 質は細胞損傷薬剤として広範囲の病理学的方法において示唆されている。ヘモグ ロビンによる酸素輸送の場合において、潜在的に損傷を与える酸化ストレスは、 血管隙に現れ、ヘモグロビンの自己酸化によって発生するスーペルオキシドアニ オンに始まり、続いて下記の反応によるスーペルオキシドディスムターゼ酵素の 存在下でのスーペルアニオンの毒性過酸化水素への変換から生じる。 遊離基物質が毒性化学物質をインビボで発生し、あるいは細胞損傷を起こす反応 は、酸化ストレスが要因である病理的症状、特に心臓発作あるいは脳卒中のよう な、虚血再灌流傷害の場合において頻繁に見られる。赤血球のスーペルオキシド アニオンおよび過酸化水素の存在は、赤血球に関する酸化ストレスの主要源であ ると考えられている。 ここに含まれるヘモグロビンによる酸素輸送とは別に、赤血球のあまり認識さ れていない特性は、酸素代謝の副産物として産生した酸素関連化学物質を解毒す ることのできる特殊な酵素集合を含むことである。これらの特殊な酵素組織の保 護がなければ、ヘモグロビンの自己酸化によって赤血球は劣化および破壊される であろう。しかしながら、人体において、赤血球の酵素組織に蓄えられた能力は 、正常な代謝の間に発生するスーペルオキシドアニオンを非毒性種に変換するこ とによって酸素毒性から人体を保護し、それによって酸化ストレスのレベルを抑 制する。もしこの酵素組織が破壊されると、赤血球の完全な状態は損傷を受ける であろう。赤血球中の保護組織における酵素の一つを産生する遺伝子の機能障害 は、注目すべき病理的症状を引き起こす。例えば、赤血球の遺伝子障害、グルコ ース −６リン酸脱水素酵素欠乏は、溶血性貧血を引き起こす過酸化水素の原因となる 。この障害は、グルタチオンペルオキシダーゼを通して過酸化水素の不適切な解 毒をもたらす酸化グルタチオンを減少さすために充分なＮＡＤ（Ｐ）Ｈレベルを 維持する能力が関係細胞にないことによる（P.Hochstein,Free Radical Biology & Medicine,5:387(1988)）。 赤血球の保護酵素組織は、毒性スーペルオキシドアニオン分子を二段階の化学 的方法で非毒性型に変換する。方法の第一段階はスーペルオキシドディスムター ゼ（ＳＯＤ）酵素によってスーペルオキシドアニオンを過酸化水素に変換するこ とである（参照、化学式［２］）。過酸化水素は細胞にとっても毒性であるので 、赤血球は別の酵素であるカタラーゼを含み、この酵素が方法の第二段階として 過酸化水素を水に変換する（参照、化学式［３］）。 赤血球は、グルタチオンと反応して、過酸化水素と有機過酸化物を水に変換する グルタチオンペルオキシダーゼ酵素を用いて、過酸化水素および他の毒性有機過 酸化物を解毒する能力がある。赤血球はまた、ヘモグロビンの自己酸化によって 産生するｍｅｔ−ヘモグロビンの増加を阻害する酵素を含む。ｍｅｔ−ヘモグロ ビン還元酵素はｍｅｔ−ヘモグロビンをヘモグロビンの原型に戻す。従って、体 内において、ヘモグロビンの自己酸化の毒性作用は、酸素代謝による望ましくな い副産物を取り除く特殊酵素を基とする反応方法によって、防止されている。 正常な酸素輸送の間、酸素毒性から赤血球を保護するスーペルオキシドディス ムターゼ、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの酵素性酸素解毒機 能は、今まで開発されたヘモグロビンを基とする酸素担体（ＨＢＯＣ）には存在 しない。酸素解毒機能なしでは、存在するＨＢＯＣ溶液の安全性は、毒性酸素関 連物質の存在により危険になる。 既存のＨＢＯＣ溶液を製造する主な方法は、赤血球からヘモグロビンを除去し 、続いて輸血の間に有害な反応を起こし得るすべての非ヘモグロビンタンパク質 お よび他の不純物を除去するために精製することによる（参照、米国特許第４,７ ８０,２１０；４,８３１,０１２；および４,９２５,５７４）。酸素解毒酵素組 織の実質的破壊あるいは除去は、多くのＨＢＯＣに使用されている精製ヘモグロ ビンを取得する既存の分離および精製方法において避けられない結果である。別 法においては、赤血球からヘモグロビンを分離および精製する代わりに、純ヘモ グロビンを遺伝子組み換え技術を用いて生産してきた。しかしながら、遺伝子組 み換えヒトヘモグロビンは、高度に精製され、赤血球中の酸素解毒組織を含まな い。したがって、精製過程で有害な不純物と赤血球中に通常は存在する有益な酸 素解毒酵素を除去し、最終的に酸素関連毒性をもたらすので、高度に精製された ヘモグロビン溶液を製造する精巧な技術の開発は一概に恩恵とは言えない。 存在するＨＢＯＣの静脈内投与から生じ、観察される毒性副作用の一つは、血 管収縮すなわち高血圧症である。スーペルオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）酵 素は、インビトロで速くスーペルオキシドアニオンを除去し、一酸化窒素（ＮＯ ）の血圧降下効果を延ばすことはよく知られている。一酸化窒素は、単に内皮細 胞性弛緩因子（ＥＤＲＦ）として既に知られていた物質であることが最近発見さ れた分子である。ＳＯＤによる一酸化窒素の血圧降下効果の延長は、ＳＯＤのス ーペルオキシドアニオンと一酸化窒素との反応を阻止する能力に帰する。（M.E. Murphy et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10860(1991);Ignarro et.al.J.Phar macol.Exp.Ther.244:81(1988);Rubanyi Am.J.Physiol.250:H822(1986);Gryglews ki et al.Nature 320:454(1986)）。 しかしながら、インビボでスーペルオキシドアニオンによるＥＤＲＦの不活性 化は観察されず、一般的に有り得るとは考えられていない。それにもかかわらず 、ＳＯＤ活性を損なうある病理的、生理的条件はスーペルオキシドアニオンによ って生じる毒性に帰着し得る（Ignarro L.J.Annu Rev.Pharmacol.Toxicol.30:53 5(1990)）。既存ＨＢＯＣ溶液の前臨床動物研究において観察される高血圧効果 は、存在するＨＢＯＣの大量輸血におけるスーペルオキシドアニオンの濃度がＥ ＤＲＦの破壊および観察される血管収縮および全身的高血圧の原因であることを 示唆している。 従って、溢血から起きる一酸化窒素（ＮＯ）とスーペルオキシドアニオンとの 反応およびヘモグロビンによるＮＯの結合から生じる高血圧効果を考察すること は重要である。ＨＢＯＣの輸血中、一酸化窒素と反応して、対応するニトロシル ーヘム（ＮＯ−ｈｅｍｅ）付加物を得ることにより、ヘモグロビンは一酸化窒素 の血管弛緩作用を低下させることもできる。特に、デオキシ−ヘモグロビンは一 酸化窒素と一酸化炭素よりも数オーダー高い親和力で結合する。 これらのヘモグロビン−ＮＯ相互作用は、一酸化窒素の検定および一酸化窒素 の生物学的活性の研究のために使用されてきた。例えば、ヘモグロビンによる一 酸化窒素の血管弛緩効果の拮抗作用は、ヘモグロビンの細胞膜透過性に依存して いるらしい。無傷の血小板において、ヘモグロビンは一酸化窒素の先駆体である Ｌ−アルギニンの効果を変えなかった。逆に、溶解した血小板の細胞質ゾルにお いて、ヘモグロビンは、一酸化窒素により媒介される環式化合物−ＧＭＰ構成物 を誘発するＬ−アルギニンの最も効果的な抑制剤である。これらの実験は、ヘモ グロビンが血小板細胞膜に効果的に浸透しないことを証明した（Radomski et al .,Br.J.Pharmacol.101:325(1990)）。従って、望ましいＨＢＯＣの特性の一つは 、一酸化窒素とヘモグロビンの相互作用を除去することである。 ヘモグロビンは、ＮＯ−誘導血管平滑筋弛緩（Grueter C.A.et al.,J.Cyclic. Nucleotide Res.5:211(1979)）と同様に内皮依存性血管弛緩（Martin W.et al., J.Pharmacol.Exp.Ther.232:708(1985)）の両方を拮抗することでも知られている 。循環期間を延長するために、ＨＢＯＣ中のヘモグロビンを化学的に安定化し、 重合し、被膜で囲み、共役することによりヘモグロビンの溢血および高血圧効果 を制限する試みがなされた。従って、最新のＨＢＯＣは比較的膜不透過性であり 、酸素を輸送することができるが、ＨＢＯＣ溶液は輸血の際のスーペルオキシド アニオンと一酸化窒素との反応を阻止する能力はない。上記の例は、ヘモグロビ ン製品および製剤化方法の改善のための何十年の研究にもかかわらず、たとえ酸 素輸送反応メカニズムが適切に理解されていても、酸素毒性／ストレス問題の取 り組みの難しさを証明している。 存在する血液代用品の毒性問題に対する理想的な溶液は、存在するＨＢＯＣｓ の酸素輸送機能と赤血球の酸素解毒機能を結合せしめたヘモグロビンを基とする 製剤であろう。しかしながら、スーペルオキシドアニオンの濃度が減少すること によって、ヘモグロビンがｍｅｔ−ヘモグロビンに酸化される反応が促進され、 ｍｅｔ−ヘモグロビンの望ましくない増加につながるので、スーペルオキシドデ ィスムターゼ（ＳＯＤ）酵素を存在するＨＢＯＣ溶液に単独で加えることは望ま しくないであろう（参照、反応式［１］）。また、過酸化水素が毒性および反応 性であり、保存中に毒性ヒドロキシル基に分解あるいは他の毒性有機過酸化物を 形成するので、ヘモグロビン溶液においてスーペルオキシドアニオンの過酸化水 素への変換が促進されることは望ましくない。 合成血液代用品は理想的には大量の不溶解性であるから、遊離基と相互作用す る化合物は、インビボ機能が維持され、安定で非毒性でなければならない。本発 明に従って、ニトロキシドおよびヘモグロビン、アルブミンなどを含むニトロキ シド標識高分子は、生物体における遊離基種の毒性を軽減するために使用される 。 血管部分に生じる遊離基カスケードから生じる生理的損傷の別の例は、脳浮腫 、壊死、およびアポトーシスがあり、脳血管性閉塞および一般的には“脳卒中” として知られている虚血事象を含む多くの病理と関係がある。脳卒中による脳損 傷の重要な部分は、閉塞に続く再灌流事象からも生じる。 脳卒中から生じる脳損傷は多くの人と健康管理費用を要し、科学者および医師 は脳卒中傷害を阻止するための治療法を長く求めてきた。脳卒中における虚血／ 再灌流傷害に付随の脳損傷の主要な原因は、血管における遊離基の形成および細 胞損傷につながるカスケードである。酸素遊離基毒性は、例えば、形質転換（Ｔ ｇ）ＳＯＤ−１マウスに見られるように、脳卒中から生じる浮腫および神経傷害 へとつながる。Chan,P.H.,C.J.Epstein,H.Kinouchi,H.Kamii,S.Imaizumi,G.Yang ,S.F.Chen,J.Gafni,and E.Carlson(1994)。ＳＯＤ−１形質転換マウスは脳卒中 および脳傷害における神経保護研究のモデルである。Ann.N.Y.Acad.Sci.738:93- 103.Chan,P.H.,C.J.Epstein,H.Kinouchi,S.Imaizumi,E.Carlson,and S.F.Chen(1 993)。虚血性脳傷害におけるスーペルオキシドディスムターゼの役割：局所脳性 虚血に続く形質転換の浮腫および梗塞の減少。In Molecular Mechanisms of Isc he mic Brain Damage，K.Kogure and B.K.Siesjo,eds.Amsterdam:Elsevier.pp.96-1 04.Kinouchi,H.,C.J.Epstein,T.Mizui,E.Carlson,S.F.Chen，and P.H.Chan(1991 )。ＣｕＺｎスーペルオキシドディスムターゼを過度に発現している形質転換マ ウスにおける局所脳性虚血傷害の減退。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11158-1116 2。 ＳＯＤ−１形質転換マウスにおいて、ヒトＳＯＤ転換遺伝子はマウスの脳にお いて通常レベルの３倍まで発現し、局所虚血損傷に続いて、梗塞サイズ、浮腫お よび神経的劣勢によって測定されるように、脳卒中傷害に対して３０％の保護を 提供する。脳卒中における遊離基損傷は、（ａ）組織の細胞膜および機能質への 損傷、および（ｂ）特に血管内皮への損傷を反映して、細胞内および血管の両方 に局在している。Imaizumi,S.,V.Woolworth,and R.A．Fishman(1990)。リポソー ム被膜に覆われたスーペルオキシドディスムターゼは、ラットの脳性虚血におけ る脳梗塞を減少する。Stroke 21:1312-1317.Liu,T.H.,J.S.Beckman,B.A.Freeman ,E.L.Hogan,and C.Y.Hsu(1989)。ポリエチレングリコール共役スーペルオキシド ディスムターゼおよびカタラーゼは、虚血脳傷害を減少する。Am.J.Physiol.256 :H586-H593.Chen,P.H.,S.Longer,and R.A.Fishman(1987)。外傷後の脳浮腫に関 するリポソーム捕捉スーペルオキシドディスムターゼの保護機能。Ann.Neurol.2 1:540-547。 薬物療法で脳性虚血による脳損傷を阻害するのに完全に効果的であると証明さ れたものは未だにない。多数の試験的な神経保護剤、血栓溶解剤および抗凝固剤 が試験されてきたが、多くの該薬剤に関係する有害な副作用によって、使用がた めらわれている。また、虚血／再灌流傷害も、例えば、次のガス泡沫による塞栓 症に続いて、内因性あるいは外因性粒子による塞栓症から、あるいは低血圧症の エピソードから外科手術の間に起こり得る。これらの問題は抗凝固剤療法によっ て取り組めそうにない。本発明のニトロキシドを基とする化合物の抗酸化保護メ カニズムを考慮に入れると、本発明は、再灌流の間、細胞を損傷から守ることに よって再灌流傷害を実質的に軽減する能力を提供する。さらに、分光法で化合物 を検出する能力からして、本発明は、手術時脳卒中、手術時心臓損傷および腎臓 傷害の予防薬剤と同様に、脳卒中のための治療的および診断的薬剤として使用さ れ、また、例えば血栓溶解物、グルタミン酸塩放出阻害剤、カルシウム流入阻止 抗体およびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストのような、他の抗脳卒中薬物と併用し て使用されるであろう。 また、血管組織における酸化ストレスの防止は、心臓血管組織壁、特に、心臓 に近接する動脈における動脈斑およびアテローム性動脈硬化症を引き起こし得る 酸化脂質の進展を軽減あるいは減少させる。また、遊離基反応性のメカニズムは 血漿ＬＤＬの酸化を示唆し、そのような酸化脂質は脳および中枢神経組織におけ る再灌流傷害および心臓血管組織のいくつかの疾病および症状において役割を果 すとも考えられている。 ここに記載した発明のいくつかの態様により評価されるように、本発明に従っ て生物学的高分子とともに使用され、インビボで遊離基により起こされる損傷を 抑制するニトロキシドの能力は、広範囲の効用性を有する使用のための、治療的 および診断的ニトロキシド含有製剤および方法を設計することを可能にする。酸 素誘導遊離基が存在する多くの生理的状態および過程は、ここに記載された化合 物の使用により治療あるいは診断されるであろう。ヘモグロビン、アルブミンな どのようなバイオ和合性高分子と併用した膜透過性の低分子量ニトロキシドの使 用によってまた、研究者は関心のある特殊環境に合うようにニトロキシド含有製 剤を作ることができる。 ニトロキシドを基とする多成分系はまた、癌放射線治療および放射線被曝治療 における使用のための放射線保護剤としても機能する。臨床的適用において、放 射線療法の効果が高放射線量を安全に使用し得ることによって高まるであろう。 医学的放射線療法において、あるいは環境的放射線被曝の結果として、直面す る電離性放射の悪影響に対して保護できる薬剤は、長い間必要とされてきた。こ のような薬剤は、放射線細胞毒性のメカニズムの研究における有益な手段でもあ るだろう。硫黄含有化合物であるシステアミンは、最も早く認定された放射線保 護剤のひとつである。その発見によって、米国国防省は、より効果的な薬剤を発 見する試みにおいて、４０,０００以上の化合物の合成および組織的選別を引き 受けることとなった。この注目すべき事業の結果、ＷＲ−２７２１として知られ るアミノチオル化合物のような数種の放射線保護剤を発見した。最近、スーペル オキシドディスムターゼ、インターロイキンＩおよび顆粒球マクロファージコロ ニー刺激因子は、放射線保護活性を有することが示された。これらの薬剤と比較 して、ＷＲ−２７２１は正常組織の最も実質的かつ選択的保護を示した。しかし ながら、癌放射線療法を受ける患者に使用する際の、本来の毒性と腫瘍の非選別 的保護に対する懸念により、ＷＲ−２７２１の使用に対する強い関心は弱まった 。“電離性”放射から組織を保護する能力はまた、ＵＶ放射線にさらされる皮膚 組織の保護および治療能力を提供する。従って、本発明に従って製剤化される化 合物は、皮膚に適用し得るローションあるいはクリームのような投与媒体を供給 し得る。 ある種の安定なニトロキシドが抗酸化剤および放射線保護活性を有することは 分かっていた。しかしながら、これら膜透過性ニトロキシドはインビボで非活性 形態に急激に変わり、高用量で毒性になり得る。膜透過性ニトロキシドの投与の 実用性は、本発明によって実質的に高められる。 発明の要旨 本発明は、生物系における治療および診断のための安定なニトロキシドを開示 し、そのニトロキシドは他のニトロキシドを含む生物学的和合性の高分子と併用 される。特に本発明は、アルブミンおよびヘモグロビンなどの生物的和合性高分 子と高い分子比率で結合しているニトロキシドと併用される、低分子量の膜透過 性ニトロキシドを記載する。ある種の適用において、相違する遊離基の安定性を 有するニトロキシドの一つの形とニトロキシドの他の形との相互作用は、物質間 の電子またはスピンの移動を容易にする。相違する安定性は、物質の電子化学的 環境からまたは化合物の本来の性質から生じる。本発明はまた、安定なニトロキ シドの遊離基、前駆体および誘導体（これらは、総括的に“ニトロキシド”と呼 ぶ）の利用を意図している。ニトロキシドはヘモグロビンを基とする血液代用物 に赤血球の酸素解毒素機能を提供し、酸化ストレスを軽減し、そして炎症、放射 線、頭部損傷、ショック、虚血後再灌流損傷、脳卒中、腎不全、内皮損傷、脂質 過酸化、鎌状赤血球貧血、白血球活性化および増殖、アポトーシス、電離性放射 脱毛症、白内障、敗血症、乾癬潰瘍および老令化などを含む遊離基毒性に関連す る生物的障害を回避する。 一つの実施態様において、安定なニトロキシドまたはその誘導体は、赤血球の 酸素解毒機能を有するであろう血液代用物のためのいくつかの化合物をつくるの に用いられる。これらの化合物は、ヘモグロビンを基にした赤血球代用物（ＨＲ ＣＳ）と言い得る。何故ならヘモグロビンを基にした酸素担体（ＨＢＯＣ）の酸 素移送能力が体内の赤血球の酸素解毒作用を提供することにより高められるから である。このことは、多くのＨＢＯＣにみられる高血圧を回避する血管作用のな いヘモグロビンに基づく酸素担体をつくることを可能にする。 ニトロキシドのみの使用における欠点を克服するために、本発明の好ましい具 体的態様においては、Ｔｅｍｐｏ標識ヒト血清アルブミンなどのポリニトロキシ ド標識高分子を単独にあるいは遊離の膜透過性ニトロキシドと共に注入して、イ ンビトロでのニトロキシドの活性を拡大せしめる。かかる化合物の一つの利点は 、診断的および治療的に使用され得る改善された放射線保護剤であり、いかなる 源からの放射被曝に対しても保護作用がある。医学上の使用においては、放射線 量を増加せしめ得ることが放射線治療を成功せしめる可能性を改善する。この能 力は、脳腫瘍などのある種の腫瘍では特に意味が深く、そして、ここに記載する ようにイメージングおよび酸素運送と併用されて、特に低酸素領域を有する腫瘍 に有用である。 さらに、ニトロキシドは電子常磁性共鳴分光法および核磁気共鳴分光法によっ て検出される。造影機器の発達により、無傷の生物体の組織および臓器のイメー ジがニトロキシドの安定な遊離基の測定および検出を基にして行い得る。本発明 によると、体内における活性ニトロキシドレベルは、低分子膜透過性ニトロキシ ドのみにみられる場合に比してイメージの改善および長いシグナル持続を可能に する長時間で保持される。さらに、ある種の現存の造影向上剤と異なり、本発明 で開示する組成物は血液−脳関門を通過し得る。 さらに、その抗酸化活性により、本発明で開示される組成物は、診断的価値と 共に治療的価値を有し、多様な用途に有利に用いられる本発明の新規組成物およ び方法を可能にする。 いくつかの形態における安定なニトロキシドの製法および用法に関する材料お よび方法をも記載する。特に、膜透過性のニトロキシドの不活性な比較的非毒性 の前駆体または誘導体について記載し、これらは、ここに記載の他の化合物によ ってインビトロで生物学的に活性なニトロキシドまたは抗酸化酵素様体に転換し 得る。いずれの場合も、化学的に還化された（非活性の）ニトロキシドが種々の 安定性の他のニトロキシドまたはニトロキシド標識高分子物質により、有害な遊 離基を解毒する過程において還元された後に、再活性化され得る。その再生作用 の結果として、本発明のニトロキシドは、低分子量の膜透過性ニトロキシド単独 に比してインビトロで長い半減期を有する。このように、本発明は、ニトロキシ ドが効果的であるいかなる利用についても効力を高める組成物または方法を提供 する。 本発明の多成分システムを用いて、動的均衡が低分子量の膜透過性ニトロキシ ドと種々の安定性の膜透過性ニトロキシド含有物質との間に形成される。特に、 電子を他のニトロキシドから受け得るニトロオキシ基を特徴とするニトロキシド を基にする化合物、例えばヒドロキシアミン誘導体から電子を受け得る膜透過性 高分子結合ニトロキシドは、膜透過性ニトロキシドの活性機能を再生する酵素様 体として、あるいは逆に、ニトロキシドアミン型を遊離基型に転移する電子受容 体として作用し得る。 本発明によるインビボで活性ニトロキシドの濃度を保持する能力は、ニトロキ シドの投与が有益であるがその利用がインビボでの速い還元によって制限される いかなる適用、あるいは膜透過性ニトロキシドの最適有効量が毒性量であるいか なる適用においても利益を提供する。例えば、本発明によるニトロキシドの活性 半減期の増加は、低分子量膜透過性ニトロキシドの有効量が毒性量であったり、 または速く消失するような臨床的あるいは他の用途において放射線保護と改良さ れたイメージを提供する。 安定な不対電子によって常磁性であるニトロキシドは、核磁気共鳴イメージン グ（ＮＭＲ／ＭＲＩ）および電子常磁性共鳴イメージング（ＥＰＲ／ＥＲＩ）に おけるイメージング剤として機能する。しかし、ニトロキシドの分光法に不視の 物質、最も典型的にはヒドロキシアミン型への迅速な還元によって、これらのイ メージング剤の用途が制限される。遊離基物質は再灌流損傷に関連し、酸素代謝 を伴うことが知られているので、イメージング剤として本発明の組成物を用いて 虚血性組織損傷および低酸素状態が測定され得る。さらに、本発明の組成物の抗 酸化酵素様作用は、酸化障害からの保護に追加の利益をもたらす。 ニトロキシドに基づく多成分系の顕著な利点は、抗酸化、放射線保護、抗虚血 、イメージ向上、酵素様等の機能を、身体のいくつかの領域、例えば脈管区画、 間質性区間および細胞内領域に対し、あるいは生物組織の選択的透過性に基づき 、あるいは標的のまたは局在化作用を提供する既知の投与方法を用いて、特定の 領域に対してもたらす能力である。研究者あるいは臨床家は、ここに記載の多成 分系を用途に合わせて仕立て上げることができる。例えば、ここに記載の種々の 化合物は、相違する血圧降下作用レベルを有している。本発明の多成分系のニト ロキシド含有物質の選択がつくり上げる活性は、特定の疾患症状または状態を選 択的に処置または診断する能力またはニトロキシドの遊離基型の増加または低下 をもたらす能力を提供する。例えば、当業者が評価するであろうように、本発明 は、ここに記載の多成分系の１以上の成分を静脈注入することによって循環系に 用いることができる。同様に、皮膚の特定の部位が１つのニトロキシドの局所投 与によって選択され、一方、本発明の特定の利用に基づく局所、経口または静脈 投与によって他の物質が投与される。 基本的には、ある具体的態様において、一つのニトロキシド（前駆体および代 謝基質を含む）が、望ましい機能すなわち、放射線保護、イメージング、酵素様 、などをなすために選択的に提供され、他のニトロキシドに基づく物質が活性の 貯蔵庫として提供される。電子スピン移動の観点からは、１つの物質が“受容体 ”ニトロキシドであり、他のものが“供与体”ニトロキシドであると考えられる 。特定の具体的態様において、供与体および“受容体”はインビボで実質的に物 理的に分離されており、その遊離分子において相違する安定性を有さなければな らない。好ましい具体的態様において、受容体ニトロキシドは循環系に顕著に分 布 しそして活性の倉庫として働くポリニトロキシドアルブミンである。供与体物質 は典型的にはＴＰＬまたはＴＰＨなどの低分子量膜透過性物質である。別法とし て、供与体物質は膜不透過性であり、受容体物質は膜透過性であり、そして物質 はニトロキシドの活性を阻害するようなものから選択され得る。 当業者は、供与体または受容体として選択される個々の物質が、実質的な物理 的分離が保持されそして種々の安定性が達成される限り、変わり得ることが分か るであろう。例えば、同じニトロキシド物質が受容体と供与体の両方に働き得る 。このような例において、アルブミンのような高分子物質上の一連のアミノ基に 標識されたＴＰＬは、実質的な膜不透過性受容体ニトロキシドを提供する。高分 子結合ＴＰＬの相違する安定性は、残留するカルボキシル基がアルブミン結合Ｔ ＰＬ中の安定性の低い遊離基状態をもたらす酸性ミクロ環境をつくるようなアミ ノ基を標識することによって提供される。他方、異なる非結合ニトロキシド物質 が提供され、それは本来の化学的および電気的構造からして必要とする分離およ び相違する安定性を提供する。 本発明の化合物によりつくられる動的な平衡は、１つのニトロキシドの還元型 と酸化型との間にあって、１つが活性であり、他方が非活性のようにある。基本 的なメカニズムは、第１ニトロキシド、特にその還元ヒドロキシアミン誘導体か らの第２ニトロキシドのニトロキシル基による電子の受容である。第２ニトロキ シドは、遊離ニトロキシ基の相違する安定性によって、第１ニトロキシドと接触 したときに、電子を受容し得る。一つの例として、遊離基すなわち“酸化”型、 例えばＴＰＬは、ポリニトロキシドアルブミン（ＰＮＡ）によってＴＰＬに再生 されるまで、ＴＰＨにすばやく還元される。 生物的和合性の高分子に結合したニトロキシドを用いる望ましい組成物には、 様々なものがある。例えば、ヘモグロビンを基とする酸素担体などの注入用の生 理的和合性溶液と共に、組成物は、１）貯蔵保持体に加えられるかまたはフィル ター中に保持されたニトロキシド含有化合物；ニトロキシドフィルター中に用い られている不溶性マトリックスに化学的に結合しているかまたは貯蔵および投与 に適した方法としていくつか形態で含有されている、２）化学的または組換え的 架橋により安定化されたヘモグロビンと共有結合しているニトロキシド、３）重 合ヘモグロビンと共有結合しているニトロキシド、特にニトロキシドの２,４お よび８分子均等体、４）リポソームの両側に、ヘモグロビンと共に封入されるか 、またはヘモグロビン膜の間に入れたニトロキシド、５）抱合ヘモグロビンと共 有的に結合しているニトロキシド、６）高い分子比すなわち６−９５でアルブミ ンのいくつかの型と共有的に結合しているニトロキシド、７）免疫グロブリンと 共有的に結合しているニトロキシドおよび多成分系における上記のいかなる組み 合せを含有する。 記述したように、上記組成物は、使用に応じて独立的に、または低分子量の膜 透過性ニトロキシドと併用して用いられる。さらに、上記組成物は、他の化合物 と共に特別に調製されて、インビボでその反応性または安定性を変えることがで きる。特に、シクロデキストランおよび他の既知の安定剤がヘモグロビンを基と する溶液の安定性を高めるために用いることができる。また、必須栄養セレニウ ムは、スーペルオキシドを創生することが知られ、ポリニトロキシド高分子と用 いられて、その酸化を促進する。これらの製剤は、酸化ストレスからの保護を提 供して、イメージングを高め、放射に対する感受性を増加または減少する他の既 知化合物および臨床上または診断上の有用性のある他の既知化合物と共にも用い ることができる。 下記に示す実験結果によると、低分子量ニトロキシドは、還元不活性型からそ の活性型に本発明のニトロキシド標識高分子との相互作用によって再生され得る 。下記の実験結果および手法において、ニトロキシドが酸化ストレスに関する診 断、 治療および生理状態の測定のために、アルブミンおよび安定化、重合化、複合化 および封入ヘモグロビンなどのバイオ相同性の高分子に結合し得ることを示す。 ニトロキシド標識ヘモグロビンとニトロキシド標識アルブミンとの相互作用は、 両者のみでまたは遊離基を有する低分子量ニトロキシドと併用して、実質的な血 漿半減期を有する他の生物学的相同性の高分子がニトロキシドで標識されて、遊 離基の化学物質による酸化ストレスまたは毒性に対し抵抗性あるいは保護を有利 に提供するのに、本発明に従い用いられることを示唆している。 実験結果はまた、本発明の組成物および方法が、ＨＢＯＣ溶液の注入が血管作 用をもたらさないＨＢＯＣと共に注入されたときに、抗高血圧的であることを示 している。放射線保護作用は、致死量の放射線に照射された細胞培養およびマウ スの両方で明らかにされた。ラットの心臓のＥＰＲイメージは虚血の進行および 再灌流損傷を監視できて、イメージの向上に加えて、本発明で開示された組成物 が再灌流損傷から虚血心臓を保護することを示す。虚血／再灌流損傷からの保護 は、心血管系および脳血管系の両方で示され、実験結果によると、脂質酸化およ び白血球活性化の阻害における、および皮膚の処置および保護における本発明の 保護作用が明らかである。 図面の説明 図１Ａおよび１Ｂは、（Ａ）第１日および（Ｂ）第３０日に記載された４−ア ミノＴＥＭＰＯ標識Ｏ−ラフィノース重合ヘモグロビンの電子スピン共鳴スペク トル（ＴＥＭＰＯ：２,２,６,６テトラメチルピペリジン−１−オキシル）を示 す。図１Ｃは、第１日に記録された非標識ヘモグロビンの同量で希釈した図１Ａ のサンプルのスペクトルを示す。図１Ｄは、第３０日に記録された図１Ｃのサン プルである。 図２Ａおよび２Ｂは夫々、４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯがω− アミノヘキシルアガロースと、および４−アミノＴＥＭＰＯが１,４−ビス(２： ３−エポキシプロポキシ)ブタン−活性アガロースとうまく共有結合しているこ とを表わす電子スピン共鳴スペクトルである。 図３Ａおよび３Ｂは夫々、４−(２−ブロモアセタミド)−ＴＥＭＰＯおよび３ −マレイドプロキシルが３,５−ビス−ブロモシリシル−ビスフマレート（ＤＢ ＢＦ）橋かけ結合またはジアスピリン橋かけ結合ヒトヘモグロビン（ＨＢＯＣ） とうまく共有結合がしていることを表す電子スピン共鳴スペクトルである。 図４Ａは４−(２−ブロモアセタミド)−ＴＥＭＰＯのＥＳＲスペクトルである 。図４Ｂは４−(２−ブロモアセタミド)−ＴＥＭＰＯ標識ＨＢＯＣのＥＳＲであ る。図４Ｃは、室温で記録された乳酸化リンガー溶液中の15ＮＤ17のＥＳＲスペ クトルである。 図５は、相違する分子比率のニトロキシドを有する４−(２−ブロモアセタミ ド)−ＴＥＭＰＯ標識ＨＢＯＣのＥＳＲスペクトルである。図５Ａは２：１、図 ５Ｂは４：１、図５Ｃは８：１である。機器の感受性が図５Ａから図５Ｂ、図５ Ｃと割合に応じて低下し、中心ピーク（Ｍo）が同じピークの高さを有するであ ろうスペクトルを記録した。 図６は、４−(２−ブロモアセタミド)−ＴＥＭＰＯ標識ＨＢＯＣと15ＮＤ17− ＴＥＭＰＯＬとの混合物のＥＳＲスペクトルであって、前者の中心ピーク（下向 き矢印）および後者の高フィールドピーク（上向き矢印）が同じ強さに調整され た。これは、図４Ｂおよび図４ＣからのＥＳＲスペクトルの重ね写しである。 図７は、マウスでの４−(２−ブロモアセタミド)−ＴＥＭＰＯ標識ＨＢＯＣの 血漿半減期を示す。図７Ａは、図６に示されたサンプル０.５ml静注約１０分後 のマウス尾で記録したニトロキシドシグナルのＥＳＲスペクトルである。図７Ｂ は、機器感受性の１０倍で記録された図７Ａの中心ピーク（Ｍo）シグナル強度 における時間依存（間隙時間３０分）低下を示す。図７Ｃは、間隙の最後におけ る図７Ｂからの続きである。 図８は、４−(２−ブロモアセタミド)−ＴＥＭＰＯ標識ＨＢＯＣ（Ｈb ８g／d l、ＴＥＭＰＯ対Ｈb ８：１）および15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬ（マウス３２g中０ .５mg）の混合物の血漿半減期を示す。これは、注入ニトロキシドをすぐに記録 するためのカニューレをつけたマウスの尾から記録された。注入前のサンプルの ＳＥＲスペクトルは図６に示す。図８Ａは０.５分間隙で記録された５ＥＳＲス ペクトルであり、磁場強度は各スキャン間で２ガウス増大し、機能時間としての シ グナル強度における低下を表した。図８Ｂは、６ＥＳＲスペクトルのくり返し記 録の図８Ａからの続きであり、磁場強度が２ガウス低下する以外は各スキャン間 で同じ時間間隔である。 図９Ａおよび９Ｂは夫々、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ標識およびＯ−ラフィノー ス橋かけ結合および重合化ヒトヘモグロビンおよびグルタアルデヒドで重合化さ れた３−マレイミド−プロキシル標識ＤＢＢＦ−ヘモグロビンを示す電子スピン 共鳴スペクトルである。 図１０Ａおよび１０Ｂは夫々、（Ａ）３−ドキシルコレスタン含有および（Ｂ ）１６−ドキシルステアリン酸含有ヒトヘモグロビンを封入したリポソームの電 子スピン共鳴スペクトルである。 図１１は、４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識され、デキストランで橋かけ結合さ れたニトロキシド標識のヘモグロビンの電子スピン共鳴スペクトルである。 図１２は、ニトロキシドが結合し、ヘモグロビン含有溶液が通過する固体マト リックスを含むフィルターカートリッジの具体的態様である。 図１３は、覚醒ラットにおけるリンガー乳酸化溶液中の１０％v／vＤＢＢＦ− Ｈb ７.８g／dlおよび１０％v／vＤＢＢＦ−Ｈb ７.８g／dl＋ポリニトロキシド アルブミン（ＰＮＡ）５g／dl＋ＴＰＬ１００mＭ １０％v／v（実線）の静注に 対するマウスの平均動脈圧（ＭＡＰ）の反応を示す。ラットは試験の約７日前に 手術および麻酔から回復していた。 図１４は、静注後のＴＰＬ血漿濃度と時間の関係を示す。血漿サンプルは図１ ３で記述したラットから得た。濃度はＥＰＲスピン密度測定によった。 図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは夫々、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトル であり、１５Ａはリン酸ナトリウム緩衝液５０Ｍm中ＴＰＬ（２mＭ）、pＨ７.６ 、１５Ｂは同じ緩衝液中ＴＰＨ（２mＭ）、１５Ｃはポリニトロキシドアルブミ ン（ＰＮＡ）である。ＥＰＲ分光計の条件は次の通りである。マイクロウェーブ 力：８mＷ、リシーバー・ゲイン：１００e＋０３、変調振幅：０.５Ｇ、変調周 波数：１００ＫＨz、マイクロウェーブ周波数：９.４３ＧＨz、掃引幅：２００ Ｇ。 図１６は、１２Ｇray放射におけるチャイニーズハムスターＶ７９細胞の生存 分画を示す棒グラフである。Ｖ７９細胞はＸ線照射１０分前に前処置された。Ｔ ＰＨまたはＰＮＡ単独では放射線保護作用は観察されなかった（２％生存を示す 棒は非処置の対照と変わりがない）。ＴＰＨおよびＰＮＡの作用を含むサンプル についての棒によって放射線保護の増加が示された（８％生存）。 図１７は、ＰＮＡによるＴＰＨのＴＰＬへの変換を示す。一定濃度２５mＭの ＴＰＨに、リン酸ナトリウム緩衝液５０mＭ中、pＨ７.６でＰＮＡの濃度を増加 して混合した。ＴＰＬ／ＴＰＨの比率を２５mＭ ＰＮＡ濃度に対して表記した。 この比率は変換効率を示す。ＴＰＬ濃度は、ＴＰＨ２５mＭと７種の異なる濃度 のＰＮＡを室温で３０分間インキュベートし、次いで１時間５０００×gで１０ ＫＤ膜セントロコン（centrocon）分離を行って測定した。濾液におけるＴＰＬ の高フィールドＥＰＲピーク強度はＴＰＬ標準線で目盛をつけ、プロットして表 記した。 図１８は、スキャン間における約１Ｇでフィールド強度を増大せしめて記録し たマウスの尾の１５ＥＰＲスペクトルの継続的記録である。スキャン数は15Ｎ ＴＰＬの高フィールドピーク（Ｍ−１／２）で標記した。マウスは４０mＭ 15Ｎ ＴＰＬ０.５mlであらかじめ注射した。このＴＰＬは半減期２分間でＴＰＨに還 元した（結果は示していない）。ＰＮＡと15Ｎ ＴＰＬの混合物のマウス尾静脈 への第２回目の注射は、同じ速度の15Ｎ−ＴＰＬ消失（２分間までの半減期を有 する３０秒間隙で記録したピーク１−５参照）を示し、次いでピーク強度の同様 の速い回復（ピーク５−７参照）があった。ＴＰＬのピーク強度は半減期１３分 間に遅くなる（ピーク７−１５、１分間隙で記録、参照）。15Ｎ−ＴＰＬピーク （ＴＰＬ）のクラスター（Ｍ＋１／２およびＭ−１／２）間のポリニトロキシド アルブミン（ＰＮＡ）の中心（Ｍo）ブロード共鳴ピーク（Ａ）も半減期１３分 間に遅くなるようであった。このように、15Ｎ−ＴＰＬの使用はインビボにおけ るＴＰＨからＰＮＡ上の14Ｎニトロキシドへのスピン移送を明白に示す。図１８ Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、３種の相違するニトロキシド標識ヒトタンパク質に よるＴＤＰＳの活性化を示すＥＳＲスペクトルである。図１８Ｂおよび１８Ｄは ニトロキシドの相違する物質で標識したアルブミンによるＴＯＰＳ活性化を示す 。 図１８Ｃは、ニトロキシド標識ヘモグロビンを基にする酸素担体である。図１８ Ｂは、リン酸ナトリウム緩衝液pＨ７.８中２分間の（１）５０Ｍm ＴＯＰＳのみ 、（２）４３Ｍmのみ（３）ＴＯＰＳ（５０Ｍm）と混合したＰＮＡ（４３mＭ） を示す。図１８Ｃはリン酸ナトリウム緩衝液pＨ７.８中２分間の（１）５０Ｍm ＴＯＰＳのみ、（２）１５Ｍm ＰＮ−ＨＢＯＣ、（３）ＰＮ−ＨＢＯＣ（１５m Ｍ）を示す。図１８Ｄはリン酸ナトリウム緩衝液pＨ７.８中２分間の（１）５０ mＭのみ、（２）１０Ｍm Ｂ３Ｔ標識アルブミンのみ、（３）ＴＯＰＳ（５０mＭ ）との混合のＢ３Ｔ−標識アルブミン（１０mＭ）を示す。 図１９は、Ｃ５７マウスにおけるＰＮＡの存在下または非存在下においてのＴ ＰＬおよびＴＰＨの薬物動力学を示す。ＥＰＲ高磁場ピーク強度をモニターする ことにより測定した任意の単位におけるＴＰＬの血漿レベルを、静脈内投与によ るＴＰＬ（２ｍＭのみ）（□）、腹腔投与によるＴＰＬ２７５ｍｇ／ｋｇ（◇） 、および静脈投与によるＰＮＡに続けて腹腔投与によるＴＰＨ１００ｍｇ/ｋｇ( ○)を時間軸（分）の関数としてプロットした。 図２０は、静脈内投与によるＰＮＡ０.５ｍｌ／マウス処理に続けて１０分後 にＰＢＳ緩衝液で処理（■）、０.５ｍｌＰＢＳに続けて１０分後に腹腔（ｉｐ ）投与によるＴＰＬ２００ｍｇ／ｋｇ処理（●）、静脈内投与によるポリニトロ オキシドアルブミン０.５ｍｌ／マウス処理に続けて１０分後にＴＰＬ２００ｍ ｇ／ｋｇで処理（◆）した後に１０グレイの放射線にさらしたＣ５７マウス（１ ０匹／各グループ(Ｎ＝１０)）の３０日間の生存試験を示す。 図２１は、静脈内投与によるＰＮＡ０.５ｍｌ／マウス処理に続けて１０分後 にＰＢＳ緩衝液で処理（■）、０.５ｍｌＰＢＳに続けて１０分後に腹腔投与に よるＴＰＬ２００ｍｇ／ｋｇで処理（●）、静脈内投与によるポリニトロオキシ ドアルブミン０.５ｍｌ／マウスに続けて１０分後にＴＰＬ５０ｍｇ／ｋｇで処 理（◇）した後に１０グレイの放射線にさらしたＣ５７マウスの３０日間の生存 試験を示す。 図２２Ａは、ＴＰＬおよびポリニトロオキシドアルブミン充填ラット心臓の３ 次元の立体（２５×２５×２５ｍｍ3）ＥＰＲ像（全体像）である。像は虚血の ２.５時間後に得られた１４４の投影図を用いて再構成された。図２２Ｂは、同 じ像の分断図である。データ時のパラメーターは以下の通りであった：スペクト ル窓：７.０Ｇ；立体窓：２５ｍｍ；最大勾配：４９.３Ｇ／ｃｍ。 図２３は、３次元立体像から得られたＴＰＬおよびＰＮＡ充填ラット心臓のＥ ＰＲ像（２５×２５ｍｍ2）であり、虚血持続時間（１５６分）の指標として時 間が示されている。データ時のパラメーターは以下の通りであった：取得時間： １０分間；スペクトル窓：７.０Ｇ；立体窓：２５ｍｍ；最大勾配：４９.３Ｇ／ ｃｍ。 図２４は、２つの虚血心臓における15Ｎ−ＴｅｍｐｏｌＥＰＲの強度と、虚血 の持続時間を示す。上部の線は２ｍＭＴＰＬ＋ＰＮＡで処理（●）した心臓を示 し、下部の線は２ｍＭＴＰＬのみで処理（■）した心臓を示す。実線は、測定さ れた強度データに二乗指数的に一致する。半減期はそれぞれ０.４分、２.９分（ ■）、および３.３分、３０.１分（●）である。 図２５は、連続像において時間がデジタル（分：秒）で示された虚血の持続時 間の関数としての、ＴＰＬ＋ＰＮＡ充填ラット心臓の横断薄片の２次元横断面（ ２５×２５ｍｍ2）ＥＰＲ像である。像は３次元の立体像から得られた。データ 時パラメーターは図２３と同様であった。 図２６は未処置の対照心臓（○）、２ｍＭＴＰＬで処置（●）、およびＰＮＡ （４ｇ／ｄｌ）＋２ｍＭＴＰＬ（▲）で処置したものにおける冠動脈血流の回復 の測定を示す。心臓を３０分間、全身虚血の状態とし、４５分間再灌流した。 図２７は未処置の対照心臓（○）、２ｍＭＴＰＬで処置したもの（●）、およ びＰＮＡ４ｇ／ｄｌ＋ＴＰＬ２ｍＭ（▲）における速度加圧生成物（ＲＰＰ）の 回復の測定を示す。心臓を３０分間、全身虚血の状態とし、ついで４５分間再灌 流させた。 図２８は、図２５で示される像から得られた15Ｎ−ＴＰＬ＋ＰＮＡで処置した ラット心臓におけるＴｅｍｐｏｌのＥＰＲシグナル強度と、虚血の持続時間との グラフである。強度値は、以下のように対応する３次元立体像の特定部位で得ら れた：ＬＡＤ（●），大動脈（■）、ＬＶ−尖（▼）および組織（▲）。 図２９は、意識下のラットにおける７．８ｇ／ｄｌ１０％ｖ／ｖＤＢＢＦ−Ｈ ｂ＋ＰＮＡ７．５ｇ／ｄｌ＋ＴＰＬ１００ｍＭ１０％ｖ／ｖ（ｎ＝４）の静脈内 注入に対応する平均動脈圧（ＭＡＰ）を示す。ラットは実験の約７日前に手術お よび麻酔から回復させた。 図３０は、ＰＮＡで処置したマウスにおける神経学的欠損の減少を示す。ＭＣ Ａ／ＣＣＡ閉塞により１時間、焦脳虚血とし、次いで再灌流させた。マウスを虚 血の開始前にＰＮＡ（プレＰＮＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で処置 するか、または再灌流後すぐに（ポストＰＮＡ、ポストＨＳＡ）処置し、再灌流 の２４時間後に神経状態を解析した。ＰＮＡまたはヒト血清アルブミンの用量は 、体重の０．５％（ｖ／ｗ）であった。 図３１は、ＰＮＡで処置したマウスにおける梗塞容積の減少を示す。ＭＣＡ／ ＣＣＡ閉塞により１時間、局所脳虚血とした後、ついで再灌流した。マウスを虚 血の開始前にＰＮＡ（プレＰＮＡ）またはヒト血清アルブミン（プレＨＳＡ）で 処置するか、または再灌流後すぐに処置し（ポストＰＮＡ、ポストＨＳＡ）、再 灌流の２４時間後に組織解析を行う。ＰＮＡまたはアルブミンの用量は、体重の ０.５％（ｖ／ｗ）であった。梗塞容積を、脳の前面先端から０.５ｍｍ間隔でと った連続頭頂部分における梗塞面積を総和することにより計測した。結果は平均 ±ＳＥＭ、ｎ＝７で示した。 図３２は、ＰＮＡで処置したマウスにおける梗塞の減少をパーセンテージで示 した。ＭＣＡ／ＣＣＡ閉塞により１時間局所脳虚血とし、ついで再灌流した。マ ウスを虚血の開始前にＰＮＡ（プレＰＮＡ）またはヒト血清アルブミン（プレＨ ＳＡ）で処置するか、または再灌流後すぐに処置し（ポストＰＮＡ、ポストＨＳ Ａ）、２４時間再灌流した後、組織学的解析を行った。ＰＮＡまたはアルブミン の用量は体重の０.５％（ｖ／ｗ）であった。梗塞のパーセントを（梗塞容積／ 同側大脳半球容積）×１００で計算した。結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝７で表記し た。 図３２Ａは、対照とＰＮＡ処置マウスの脳の連続断片における発作障害の測量 を示す。一連の２０μｍの厚さの頭頂組織断片を同じ脳の前頂から５００μｍ間 隔でとり、脳虚血を断片当たりの梗塞面積（ｍｍ2、平均±Ｓ.Ｄ.）として測量 した。対照（■）と比較して、ＰＮＡ処理マウス（●）における梗塞面積の相違 は２本の線の間の面積である（ｐ＜０.０５スチューデントのｔ−検定による） 。 図３３は、ＰＮＡで処置したマウスにおける大脳半球拡大の減少を示す。動物 を、ＭＣＡ／ＣＣＡ閉塞により１時間局所脳虚血とした後、再灌流を行った。動 物を、虚血の開始前にＰＮＡ（プレＰＮＡ）またはヒト血清アルブミン（プレＨ ＳＡ）で処置するか、または再灌流後すぐに処置し（ポストＰＮＡ、ポストＨＳ Ａ）、２４時間再灌流した後に組織学的解析を行った。ＰＮＡまたはアルブミン の用量は体重の０.５％（ｖ／ｗ）であった。パーセント大脳半球拡大を（同側 大脳半球容積−反対側の大脳半球容積反対側の大脳半球容積）×１００として計 算した。結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝７として表記した。 図３４Ａおよび３４Ｂは、局所脳虚血（１時間）および再灌流（２４時間）し たＰＮＡ処置マウスと対照マウスにおける脳梗塞の減少を示した代表的な頭頂断 片を示す。２０μｍの厚さの断片を、虚血組織にあまり取り込まれないクレシル バイオレットで染色した。図３４Ａは、未処置動物の脳断片であり、実質的に全 ての大脳半球における広範囲に及ぶ虚血障害（非染色部分）を示す。浮腫は、同 じ脳の反対側の大脳半球と比較して梗塞された大脳半球が拡大するに伴い出現す る。図３４Ｂは、ＰＮＡ処置動物の脳の断片であり、正常な組織構造および浮腫 がないことを示す。これは、ＰＮＡが発作障害を防御することを示す。図３４Ｃ は、ＰＮＡ処置マウスと対照マウスにおける発作障害の減少を示す代表的な組織 学的断片である。動物を脳虚血（１時間）および再灌流（２４時間）させた。処 置マウスに、虚血前および再灌流の開始時にＰＮＡを静脈内投与した。各用量は 体重の１％（ｖ／ｗ）に等しかった。虚血の解剖学的範囲を実証するために、２ ０μｍの厚さの頭頂断片を脳の前面先端から５００μｍの間隔で作成し、クレシ ルバイオレットで染色した。虚血組織は染色されなかった。未処置動物（左パネ ル）は、実質的に全ての大脳半球に虚血障害のあることを示す。顕著に対照的な ことには、ＰＮＡ処置動物（右パネル）は全脳を通じて正常な組織のあることを 示す。 図３５は、ＰＮＡに浸し、ＭＣＡ縫合閉塞の２時間後に染色した動物のラット 脳の一連の染色頭頂断片である。 図３６は、食塩水（対照）に浸し、ＭＣＡの縫合閉塞の２時間後に染色した一 連の動物のラット脳の染色頭頂断片である。 図３７Ａおよび３７Ｂは、一過性ＭＣＡ閉塞後および食塩水、ヒト血清アルブ ミンおよびＰＮＡ投与後のラットにおける梗塞容積および梗塞パーセンテージの 組織学的解析である。 図３８は、２時間間隔で３回ＰＮＡ注入を行う、時間の関数として測定したラ ット血液のスピン強度である。 図３９は、閉塞およびＭＣＡの再灌流の間のラット脳の拡散加重磁気共鳴像で ある。 図４０Ａ、４０Ｂおよび４０Ｃは、麻酔したマウスの背中の皮膚におけるＰＮ Ａおよび15Ｎ−ＴＰＬのＥＰＲスペクトルである。ＰＮＡ１００μｌを麻酔した マウスの背中の皮膚に皮内投与し、（Ａ）で示されるスペクトルを記録した。つ いで、15Ｎ−ＴＰＬ（１％ｖ／ｗ、２０ｍｇ／ｍｌ）を静脈内投与し、（Ｂ）で 示されるスペクトルを１分後に記録した。３０分後に（Ｃ）のスペクトルを記録 した。 図４１は、静脈内15Ｎ−ＴＰＬ（１％ｖ／ｗ）の薬物動力学を示し、ＰＮＡを 皮内注入したマウスの背中の皮膚の部分で測定した。低磁場15Ｎ−ＴＰＬピーク の強度を時間に対してプロットする。15Ｎ−ＴＰＬシグナルは注入後に上昇し、 ついで５分以内に急速に下降し、これは生物還元を反映している。ここで示され るようにＰＮＡの存在下においては、15Ｎ−ＴＰＬシグナルは５分後に安定し、 少なくとも３０分間は安定であり、これはＰＮＡによる酸化を反映している。 図４２Ａおよび４２Ｂは、マウス腹部の皮膚の部分で測定した静脈内15Ｎ−Ｔ ＰＬ（１％ｖ／ｗ）の薬物動力学を示す。（Ａ）低磁場ピーク強度は上昇および 下降し、15Ｎ−ＴＰＬの注入後５分以内に下降する。（Ｂ）１００μｌＰＮＡの 皮内投与後の時間関数としての15Ｎ−ＴＰＬシグナル強度の増加は、少なくとも ３０分間維持した。 図４３は、筋肉にグリセロールを注入し、次いでＴｅｍｐｏｌと共にポリニト ロオキシドを用いておよび対照としてアルブミンを用いて腎障害をおこした横紋 筋融解の動物モデルにおける１０日間の生存率を示す。 発明の詳細な説明 ニトロキシドは、抗酸化触媒活性を有することが示されている安定な遊離基で あって、この活性はスーペルオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の活性に類似し 、インビボにおいて他の物質との相互作用によってカタラーゼ様活性を発揮でき る。従来、ニトロキシドは、バイオ高分子の配座的および運動的性質を研究する ために“スピン標識”として電子スピン共鳴分光法において用いられている。ニ トロキシドはまた、その化学的構造がよく定義された超微細相互作用を有する安 定な不対電子を提供するので、活性遊離基の中間体を検出するために用いられて 来た。さらに、ニトロキシドは酵素様体として作用するがみられる。ある種の低 分子量ニトロキシドは、同定されており、スーペルオキシドディスムターゼ（Ｓ ＯＤ）（A.Samuni et al.J.Biol.Chem.263:17921(1988)）およびカタラーゼ（R. J.Mehlhorn et al.,Free Rad.Res.Comm.,17:157(1992)）の活性に類似する。多 くの研究によると、細胞膜透過性であるニトロキシドは、ヒポキサンチン／キサ ンチンオキシターゼによるスーペルオキシドアニオンおよび過酸化水素爆露によ る細胞毒性に対して、哺乳動物を短時間保護し得る。 用語“ニトロキシド”は、合成ポリマーなどのニトロキシ基含有の化合物、そ の前駆体（Ｎ−Ｈ型など）およびその誘導体を含み、安定なニトロキシド遊離基 である。この誘導体には酸素原子がヒドロキシル基で置換され、ハロゲン化水素 の形で存在する対応のヒドロキシルアミン誘導体（Ｎ−ＯＨ）を含む。本発明の 目的としてヒドロキシアミン誘導体のクロライド塩が一般的に好ましい。 ここに記載のニトロキシドにおいて、不対電子は、窒素核が強い電子供与体で 置換されている２つの炭素原子に結合しているので、部分的に安定である。Ｎ− Ｏ結合の酸素上の部分的負電荷を有し、２つの隣接炭素原子は一緒になって窒素 核上に不対電子を局在化する。 ニトロキシドは一般的にヘテロ環あるいは直鎖の両方の構造をとり得る。基本 的な標準は安定な遊離基である。構造的に、下記式のニトロキシドが好ましく、 Ｒ1−Ｒ4は電子供与体であり、Ａはヘテロ環の残りの部分である。 これらのヘテロ環構造において“Ａ”は５員（すなわち、ピロリジニル、また は１つの２重結合のあるプロキシル、すなわち、ピロリン）または６員（すなわ ちピペリジニルまたはＴＥＭＰＯ）ヘテロ環構造の残りの炭素を表し、その中で １つの炭素原子は１つの酸素原子で置換されていてもよく（オキサゾリニルまた はドキシル）、そしてある水素原子は２個までのブロム原子で置換されていても よい。α炭素における置換は、不対電子が実質的にπｐ軌道配置に保持されるよ うにある。Ｒ1からＲ4はアルキル（直鎖または分枝鎖）またはアリール基である が、好ましくはメチルまたはエチル基である。いかなるニトロキシドにおけるα 炭素上の置換基は、安定性を高めるために強い電子供与体であるべきで、従って メチル（ＣＨ3）基またはエチル（Ｃ2Ｈ5）基が好ましいが、他の長い炭素鎖も 用いられる。参照、例えば、米国特許第５,４６２,９４６。遊離基の反応性を保 持する他の構造は、当業者に自明であり、合成が続けられている。参照、例えば 、Bolton et al．“いくつかのテトラメチルイソインドリン−２−イルオキシル 遊離基についてのＥＰＲおよびＮＭＲ研究”J.Chem Soc.Perkin Trans.(1993)お よびGillies et al.いくつかの５−（ｎ−アルキル）−１，１，３，３−テトラ キス（トリドウテリオメチル）イソインドリン−２−イルオキシルのＥＰＲ超微 細カップリング定数のＮＭＲ測定 J.Chem.Soc.Faraday Trans.,90(16),2345-234 9(1994)。 本発明によるバイオ和合性高分子と結合しているとき、ニトロキシドの反応性 は微細な環境に従って変化する。この反応性は、標識図式を用いることにより、 およびセレニウムなどの、遊離基の安定性または反応性を変えることが知られて いる他の化合物との反応によりつくりあげることができる。実際には、充分な考 察が実際的で経済的なニトロキシド化合物の範囲を限定する。本発明で用いられ る好ましいニトロキシドは次の構造を有するニトロキシドを含む。 上記から明らかなように、最も適当なニトロキシド化合物は、下記式により基 本的に表現され、 Ｒ基は遊離基の安定性を保持する配置から選択される。 上記したように、ニトロキシドの構造形態は基本的な機能からはずれることな しに変わり得る。ニトロキシド機能基は、二量体、下記するＢ３Ｔなどの三量体 、オリゴマー、あるいは各々が少なくとも一つのニトロキシドを含有する複数の 繰り返しサブユニットを有するポリニトロキシド合成ポリマーにも合体し得る。 好ましい合成ポリマーは、ポリマーの各サブユニット中にニトロキシドおよびカ ルボキシル基を有する。例えば、下記の化合物は、既知の技術で、例えば米国特 許第５,４０７,６５７に記載のように、ジアミン化合物とジアンヒドリドから合 成される。 本発明の目的からすると、米国特許第５,４０７,６５７に示されるポリマーのニ トロキシド基はブロモ−ＴＥＭＰＯで置換されるのが望ましい。このような合成 ポリマーは、ヘモグロビン、特に元からのヘモグロビンをジアミンのやや過剰を 有する化合物の合成により標識し、ポリマーの端末に遊離のアミノ基を得るのに 利用される。端末のアミノ基は好中性基と反応し、例えば、ブロモアセタブロミ ドはブロモ−ＴＥＭＰＯのニトロキシドポリマー誘導体を生産し、ＰＮＡおよび ＰＮＨに類似するタンパク質上のアミノ基を標識するのを可能にする。 ヘモグロビン、アルブミン、免疫グロブリンおよびリポソームを含むバイオ高 分子へのニトロキシドの共有的結合について、多くの技術が発表されている。参 照、例えばMcConnell et al.,Quart.Rev.Biophys.3:p.91(1970);Hamilton et al .“構造化学と分子生物学”A.Rich et al.,eds.W.H.Freeman,San Francisco,p.1 15(1968);Griffith et al.,Acc.Chem.Res.2:p.17(1969);smith I.c.p．“電子ス ピン共鳴分光法の生物学的応用”Swarts,H.M.et al.,eds.,Wiley/Interscience, New York p.483(1972)。選択されたニトロキシドは、ヘモグロビンの共作用的酸 素結合メカニズムの研究目的のためにヘモグロビン分子と共有的に結合されてい る。 ここに記載された高分子に関して、ニトロキシドを高分子に結合させるために “ラベリング戦略”としてよく知られている少なくとも２つの技術が可能である 。特異的なラベリングの意義はミクロ環境にあり、その環境でニトロキシドは高 分 子と結合し、ニトロキシドが触媒活性を得る。特定のリガンド結合部位における 特異的なラベリングは、より調和的結合部位ミクロ環境を有するホモジェナスな 物およびニトロキシドの触媒的特異性および活性の点においてより信頼性の高い 化合物を生産する。 用語“ヘモグロビン”は、記述内容から別の意味である場合を除き、オキシ− 、カルボキシ−、カルボンモノオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンを意味す る。本発明で用いられるヘモグロビンは、起源がヒト、動物あるいは組換のいず れでもよく、既知の技法により取得され、精製される。ヘモグロビンは、ピリド キサル−５’−ホスフェートのピリドキサル基または開環アデノシントリホスフ ェート（Ｏ−ＡＴＰ）に、ヘモグロビンのアルデヒド基および橋かけ結合誘導体 との反応により、共有結合し得る。橋かけ結合誘導体には、ジアルデヒド、ポリ アルデヒド、ジエポキシド、ポリエポキシド、活性化ポリカルボキシルおよびジ カルボキシル基、例えば３，５−ビス−ブロモシリシル−ビスフマレートおよび ＴＥＭＰＯサクシネートまたはＴＯＰＳ、（参照、米国特許第４,２４０,７９７ ）シクロデキストランおよびそれらのアニオン性（例えばスルフェート）橋かけ 結合ヘモグロビンおよび重合化ヘモグロビンなどの多機能性、ヘテロ重機能性お よびホモ重機能性橋かけ結合剤が含まれる。安定化ヘモグロビンは、タンパク質 中の橋かけ結合システイン残基により産生される橋かけ外層を有するミクロスフ ェア中に形成され得る（VivoRx Pharmaceuticals,Inc.,Santa Monica,CA）。こ こに記載のすべてのヘモグロビン溶液および本発明の他の化合物中などの他のニ トロキシドの各溶液は、生理的に適合する形態で、例えば生理的に許容される溶 液あるいは許容される担体、溶媒または基剤に懸濁されて、投与される。ヘモグ ロビン溶液は、細胞を含まず、パイロジェン、エンドトキシンおよび他の夾雑物 が取り除かれている。 アルブミンと結合したニトロキシドを用いる望ましい組成物は次のものを含む 。 １）ニトロキシドによるアルブミンの非特異的ラベリング（例えば高ニトロキ シドでの４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ対アルブミンの比率） ２）特異的リガンド結合部位でのアルブミンの特異的ラベリング ３）ジスルフィド結合の還元およびアルキル化によるアルブミンの高められた ラベリング。 本発明で用いられるとき、用語アルブミンは、ヒト血清アルブミン、動物アル ブミン、組換アルブミンおよびそのフラグメントを含む。アルブミンは、利用さ れるラベリング部位を増加するために温められ、また化学的に処理される。さら に、アルブミンは単量体、二量体、ポリマーとして存在し、ミクロスフェア中に 包含され得る。ここに開示のアルブミンは既知技術によりポリエチレングリコー ル（ＰＥＧ）と処理して、その免疫和合性を増加することもできる。 体内の抗酸化能を増加することにより酸化ストレスを改善するための望ましい 方怯は、多成分ニトロキシドを基にするシステムの使用である。第１成分は、Ｔ ＥＭＰＯＬなどの膜透過性ニトロキシドである。これらの電荷性および小さい分 子サイズからして、他分子量非結合ニトロキシドは細胞膜を容易に透過し、細胞 内に入る。第２成分は、高分子比のニトロキシド（ポリニトロキシド）でバイオ 和合性高分子−標識、例えば分子比３０：１のＴＥＭＰＯＬで標識されたヒト血 清アルブミンなどの他のニトロキシド含有物質である。本発明の多成分ニトロキ シドシステムの使用は、低分子量膜透過性ニトロキシドの大きい、集中的また繰 り返し量から生じ得る毒性を軽減するのに役立つ。ニトロキシドのヒドロキシア ミン型は抗酸化剤として活性でなく、大量でのニトロキシド毒性は主に膜酸化還 元状態の混乱を引き起こす抗酸化剤の活性によると考えられているので、ヒドロ キシルアミン状態は対応する非還元ニトロキシドよりも低い毒性を示す。このよ うに、本発明の一つの実施態様において、非活性型に還元されたインビボニトロ キシドを活性化するために、高分子ポリニトロキシドと併用して膜透過性ニトロ キシドの非毒性量を使用することを開示する。同様に、ヒドロキシアミンは、イ ンビボで活性抗酸化剤に変換する非毒性ニトロキシド前駆体として投与され得る 。結果として、体内で強力な抗酸化剤の安定かつ持続的治療レベルがもたらされ る。 インビボの安全性に関して、本発明に従って投与され得るニトロキシドのレベ ルは、動物で耐容性に優れ、ニトロキシドは比較的安全であることが知られてい るのでヒトにおける優れた耐容性が期待される。例えば、マウスでのＴＥＭＰＯ の腹腔内最大耐容量は２７５ｍｇ／ｋｇであり、ＬＤ50は３４１ｍｇ／ｋｇであ る。さらに高分子結合ニトロキシドは、その活性型における遊離ニトロキシドよ りも安全である。遊離ニトロキシドと併用される本発明のニトロキシド標識高分 子は、抗酸化効果を達成するため投与されねばならないニトロキシドの全量を減 少する。抗酸化製剤において用いられるニトロキシド標識高分子の追加の利点は 、改善された安全性を有し、活性抗酸化状態におけるニトロキシドの高い活性レ ベルを達成する能力にある。 今日研究されている生体におけるニトロキシドの大部分は、細胞膜を通り、組 織へ容易に侵入し得る低分子量の化合物である。本発明の高分子結合ニトロキシ ドは静脈注入されて、高分子物質の膜不透過性によって脈管区画に止まり得る。 このような実施態様において、高分子と共有結合しているニトロキシドは、利用 性が最適である局所すなわち脈管区画にニトロキシドを止めて、遊離基の毒性を 軽減するのに作用する。 ＴＥＭＰＯＬは、注射されると細胞間に迅速に拡散し、そこで遊離基を解毒化 (酸化)する過程においてヒドロキシルアミンに還元される。毒性の遊離基から不 対電子を捕捉する過程において、ニトロキシドはオキソアンモニウム中間体に還 元される。次いでオキソアンモニウム中間体は２つの過程のいずれかで反応する 。これは、遊離基由来電子をある天然の化合物に自発的に与えることにより、ニ トロキシドに再酸化される。この工程は、正味の結果としてニトロキシドが不変 化であるので、酵素様と云える。他方オキソアンモニウム中間体はさらにヒドロ キシルアミンに還元される。ヒドロキシルアミンは、常磁性でなく(すなわち、 ＥＰＲ分光法で表われない)、ニトロキシドの抗酸化触媒能力を欠く。インビボ の反応平衡はヒドロキシルアミンへの還元に強くかたよる。その高い膜透過性お よび不活性な化学的基本構造によって、ヒドロキシルアミンも細胞内および細胞 外に自由に分布し、比較的長い時間体内に止まる。しかし、一旦ニトロキシドが ヒドロキシルアミンに還元されると抗酸化活性は消失する。 ＴＥＭＰＯＬすなわち４−ヒドロキシル−２,２,６,６−テトラメチルピペリ ドン−Ｎ−オキシルは、遊離基の解毒過程において迅速に消費される。ＴＥＭＰ ＯＬはオキソアンモニウム中間体に還元され、これは酸化されてニトロキシドに もどるか、またはさらに還元されてヒドロキシルアミンになる。このように、ニ トロキシドのバイオ変形(遊離基の解毒過程において)はヒドロキシルアミンを生 産する。ヒドロキシルアミンは、常磁性でなく(ＥＳＲ分光法で表われない)、ニ トロキシドの抗酸化触媒活性を欠く。ＴＥＭＰＯＬのみの使用は、ＴＥＭＰＯＬ がヒドロキシルアミンに迅速に変換し、意味のある抗酸化効果を発揮するのに要 する量では毒性があるので、医療的には好ましくない。 しかし、ヒドロキシルアミンは、化学的に安定であり、体内に比較的長く止ま り(ニトロキシド分子の基本骨格は比較的無活性)、そして本発明の教示に従って 、ニトロキシドの活性型に化学的変換してもどることができる。このインビボ変 換はニトロキシドの安全な臨床的使用を可能し、持続的な抗酸化活性を提供する 。上記したように、不対ニトロキシル電子はニトロキシドに抗酸化活性に加うる に他の有用な性質を与える。特に遊離基型のニトロキシドは常磁性のプローブで あり、そのＥＰＲ標識は生物系において代謝情報、例えば酸素緊張、および組織 の酸化還元状態の情報を反映し得る。自然に生じる不対電子はインビボでは基本 的に存在しないので、ＥＰＲイメージングは背景のノイズが基本的になく、さら に利点を有している。ニトロキシドはまた、水素核の緩和時間を低下し、プロト ンまたは核磁気共鳴イメージング(ＭＲＩ)における造影剤として有用である。ニ トロキシドはまた、ＭＲＩからすでに得られている形態学的データに代謝情報を 加えるために造影剤として作用する。例えば、ニトロキシド上の種々の機能基を 代えることにより、緩和性、溶解性、バイオ分布、インビボ安定性および耐容性 を含む性質を操作することが可能である。ニトロキシドから得られた高い造影は 、強さの等しい組織(しかし組織学的に同じでない)を識別することにより、病変 部位、例えば血液脳関門損傷、膿瘍および腫瘍などの局在化および特徴化により ＭＲＩの結果を改善することができる。 高分子ポリニトロキシドはその大きい分子量と低い膜透過性によって細胞外に 分布しやすく、生化学的環境中では容易に還元されない。しかし、高分子ポリニ トロキシドは、ビボ変換で活性抗酸化能を有するニトロキシドにもどることによ り、ヒドロキシルアミンから電子を受容することができることが見出された。 この工程は、細胞の外側の抗酸化活性の高能力高分子貯蔵庫より、抗酸化能を 高運動性膜透過性ニトロキシドに効果的に変換し、このニトロキシドは細胞膜を 通過して細胞内に抗酸化活性を提供する。細胞の内側で、ニトロキシドは、毒性 の遊離基の酸化によりヒドロキシルアミノに還元され、細胞外のサイクルに出て 、そこで高分子ポリニトロキシドにより再活性化される。さらに高分子ポリニト ロキシドの反応性は、セレニウムなどの他の化合物を加えることにより高められ 得る。 従って、特に有利なニトロキシド含有製剤は、大きい比率のニトロキシドが高 分子(ポリニトロキシド)に結合し、非結合の低分子量ニトロキシドの医療的活性 量にインビボで接触するのを可能にし、それによって触媒的活性ポリニトロキシ ド高分子を提供するときに、製造することができる。医療的に活性なニトロキシ ドと触媒的活性のニトロキシドとの相互作用は、まわりの組織において持続抗酸 化剤、放射線保護剤、イメージング剤を提供する。実際に、高分子物質は抗酸化 活性の受容体であり、この活性は膜を透過し得る低分子量物質の活性を再充電す る。ここに開示するこの共生的方法は、局在化した持続的抗酸化活性を得るため に、低分子量ニトロキシドの経口投与と併用した高分子ニトロキシドの局所使用 などの、有利な投与方法を提供する。 ここに開示する実験結果および製剤データに基づき、本発明のニトロキシド含 有物質の抗酸化、放射線保護、抗高血圧および分光活性は、種々の製剤でインビ トロおよびインビボで測定された。これらの結果を基にして、ポリニトロキシド 標識高分子および遊離ニトロキシドが遊離基酸化／還元反応に関与する反応メカ ニスムは、その能力が遊離基を解毒ずるために新しいＨＢＯＣおよび他のニトロ キシド含有高分子を製剤することに存することを存分に表わしている。これは非 常に多様な生理的状態の診断および処置に有利に使用される。 さらに本発明はニトロキシド含有化合物を、静注用液、局所剤などの医薬品の 貯蔵または投与のための容器に併せて、開示する。ニトロキシド含有化合物は固 体または液体で容器の内部に入れられ、また容器の内側表面に共有的に結合する 。 投与のための一つの有益な方法は、遊離ニトロキシドを有するまたは有しないニ トロキシド含有化合物を、投与液体中に用いられるインラインフィルターに加え ることである。例えば、ポリニトロキシドアルブミンは、患者に注入する前に毒 性酸素関連化合物を捕捉するために遊離ニトロキシドと共にフィルター内部に合 体され、またはフィルター中の不溶マトリック例えばＨＢＯＣと結合し得る。 下記するＨＢＯＣ製剤およびニトロキシド標識高分子は、ニトロキシドに“ス ーペルオキシドオキシダーゼ”として赤血球中で起きることが知られてない酵素 様反応を機能せしめて、毒性酸素関連物質の形成を遅滞せしめる。これらのＨＲ ＣＳ製剤において、ニトロキシドは、ヘモグロビンの自動酸化から生じる望まし くないスーペルオキシドアニオンの蓄積を防止する(参照、式[Ｉ])。アルブミン および免疫グロブリンなどのニトロキシド標識高分子は抗酸化酵素様として機能 し、この機能は脈管および間質性の区画に局在し、膜透過性ニトロキシドと反応 して細胞内保護を提供し得る。 免疫グロブリンと併用した望ましいニトロキシドの製剤には、ハプテンまたは 抗原に特異的な免疫グロブリンに結合したニトロキシド標識ハプテンまたは抗原 がある。 さらに、本発明によれば、ニトロキシド化合物の有益な治療的効力は調製し、 持続せしめることができる。例えばニトロキシド２,２,６,６−テトラメチル− １−オキシル−４−ピペリジリデンコハク酸(ＴＯＰＳ)は、ヒト血清アルブミン の第１級ビリルビン結合部位に結合し得る。インビボでこの結合は、血清半減期 を延長し、ニトロキシドの細胞間への分散を遅らして、必要用量を減少し(そし て、起こり得る毒性を減じ)そして生物的作用を延長する。このように、ＴＯＰ Ｓなどニトロキシドは単独で、高分子ポリニトロキシドなしで、抗酸化剤として 利用性を有し得る。本発明によれば、治療上抗酸化活性を局在化せしめる手段と して、ニトロキシドを体内の特定の部位に運び得る担体を選択あるいは設計する ことができる。 ニトロキシドの安定な化学的本質から、本発明に開示する組成物は種々の経路 で投与することができる。膜透過性ニトロキシドは非経口および経口で投与され 得る。還元型においてヒドロキシルアミンはＧＩ系で局所的に作用して血液中に とりこまれ得る。このように、持続抗酸化剤活性はすべての体内区画で提供され る。高分子ポリニトロキシドは、非経口的に投与され、細胞外に局在して、還元 された遊離ニトロキシドを再活性し、経口または経皮的に投与され、循環してい る還元ニトロキシドを活性するのに作用し、それによって局在化した抗酸化作用 を提供する。 タンパク質を基とする高分子ポリニトロキシドおよび膜透過性ニトロキシドの 特定の反応性は、高分子の加熱およびポリペプチド鎖の第１級アミノ基でのラベ リングによって高められるようである。加熱は、高分子の配座を変えることが知 られており、アミノとカルボキシル基の間の水素結合を伸長し、そして高分子の 第４級構造を変化せしめる。続くアミノ基におけるニトロキシドによる共有ラベ リングは、加熱の結果として、さらされたタンパク質の比較的内部の箇所で起こ り得る。得られたニトロキシド標識高分子において、これらのニトロキシド分子 は溶媒でもって反応からより保護されている。また、ニトロキシドがタンパク質 上の多くのアミノ酸に結合していると、残留カルボキシル基の優位が結合ニトロ キシドのまわりの酸性ミクロ環境を創生する。酸性環境は、Ｎ−Ｏ結合における 不対電子を酸素原子の方に引っぱることによりニトロキシドの反応性を増加する 。 赤血球代用についての本発明の実施態様において、ニトロキシドの必要とされ る性質は、スーペルオキシドオキシターゼ、スーペルオキシドデイムスターゼお よびカタラーゼ活性を工程中に実質的に消費されることなく模倣することによっ て、ＨＲＣＳ中のスーペルオキシドアニオン・カスケード過程に影響を及ぼす能 力である。 “スーペルオキシドオキシダーゼ”反応において、スーペルオキシドアニオン は、過酸化水素の形成に進むことなしに、酸化されて分子酸素にもどる。これは 、ニトロキシドの濃度が酸素の濃度よりも非常に大きい貯蔵状態を形成すること によって部分的に達成される。ここに開示した方法を用いて、ニトロキシドはス ーペルオキシドアニオンの形成で始まる望ましくない酸化反応のカスケードを防 止する。さらに、ここに記載の生理的和合性のＨＲＣＳ溶液は、ニトロキシドが ここに記 載の製剤を患者に注入した後にスーペルオキシドデイスムターゼおよびカタラー ゼの酵素様活性を発揮するので、既存のＨＢＯＣ溶液を越える利点を提供する。 多様なニトロキシドが本発明で用いられるが、ニトロキシドは、酸素毒性の軽 減するのに要する最小濃度で生理的に許容されるものでなければならない。有効 な物質を評価する場合、ニトロキシドの比較的低毒性によってＮＭＲイメージン グにおける造影剤としての開発が促進されて来たことは注目すべきである(参照 、米国特許４,８３４,９６４;４,８６３,７１７;５,１０４,６４１)。 生理的に和合性のある様なヘモグロビン溶液を分離し、精製する多くの方法は 既知である。典型的には精製ヘモグロビン組成物は全タンパク質重量で少なくと も９９％のヘモグロビンを含み、全リン脂質含量は約３μg／ml以下であり、ホ スファティジルセリンまたはホスファティジルエタノールアミンのいずれかは１ μg／ml以下であり、不活性のヘム色素は６％以下である。本発明で有用な精製 ヘモグロビン溶液は、様々の既存の技術を用いて製造される。それには、限定す るものではないが、「Ｃheung et．al．,Ａnal Ｂiochem １３７:４８１−４ ８４(１９８４),Ｄe Ｖenuto et．al．,Ｊ．Ｌab．Ｃlin．flad．８９:５０９ −５１６(１９７７),and Ｌee,et．al．,Ｖith Ｉnternational Ｓymposium on Ｂlood Ｓubstitutes,Ｓan Ｄiego,ＣＡ Ｍar．１７−２０ Ａbstrac t Ｈ５１(１９９３)」に開示されている技術が含まれる。 本発明で用いられる精製ヘモグロビン溶液は基本的に酸素を含まないものでな ければならない。溶液中のヘモグロビンは、ヘモグロビンに酸素を放出せしめ、 実質的に酸素のない状態に保持せしめる化学的還元剤と混合することによって、 脱酸素せしめられる。ヘモグロビン溶液を脱酸素するのに好ましい方法は、窒素 または一酸化炭素などの無活性で基本的に酸素のない気体にヘモグロビン溶液を さらすことによって実施される。この気体はヘモグロビンから結合している酸素 をうばい、溶液中のヘモグロビンを酸素を欠くデオキシヘモグロビンまたはカル ボンモノキシヘモグロビンなどの形態に変換せしめる。別法として、ヘモグロビ ンは、酸素は通すが、ヘモグロビンを通さない膜で真空または気体にさらすこと がなされる。例えばヘモグロビン溶液を、ヘモグロビンを流すと、酸素は通過す るがヘモグロビンは通過しない膜壁を有する拡散細胞に通すことができる。膜壁 のヘモグロビン溶液とは反対側を不活性気体が循環して、酸素を除去し、溶液中 のヘモグロビンを脱酸素状態に変える。望ましくは、デオキシヘモグロビンは、 ニトロキシド−ラベリング、橋かけ結合重合化または共役化の間、基本的に酸素 のない環境に保持される。 すべての結合酸素の除去後、ニトロキシドはヘモグロビンと共有的に結合する 。通常は一つ、望ましくはそれ以上のニトロキシドが一つのヘモグロビン分子と 共有的に結合する。ニトロキシドは、下記を含むヘモグロビン分子のいくつかの 部分のいずれにおいてもヘモグロビンと共有的に結合し得る。 (a)１以上の遊離スルフヒドロ基(−ＳＨ)、例えばβ−９３部位において、 (b)いかなる活性アミノ基、例えば、β−鎖のＶal−１および／またはβ−鎖 のリジン−８２および／またはα−鎖のリジン−９９のＤＰＧ部位において、 (c)いかなる非特異的表面アミン(−ＮＨ2)またはカルボキシル(−ＣＯＯＨ)基 において。 ニトロキシドは、ヘモグロビンの橋かけ結合または重合に関与する二価または 多価の橋かけ結合剤のいかなるアルデヒド、エポキシまたは活性化カルボキシル 残基に、または、ヘモグロビンを共役するのに用いられるデキストラン(Ｄx)ま たはヒドロキシエチルでんぷん(ＨＥＳ)またはポリオキシエチレン(ＰＯＥ)など の物質上のいかなる反応性残基において、結合することができる。 上記の式[１]記載のように、貯蔵時期において、ＨＢＯＣ溶液中のヘモグロビ ンは酸素によって徐々に自家酸化されてmet−ヘモグロビンおよびスーペルオキ シドアニオンを形成する。しかし本発明の対象であるＨＲＣＳの貯蔵時期におい ては、形成されたスーペルオキシドアニオンはニトロキシドをヒドロキシルアミ ン誘導体に還元し、スーペルオキシドアニオンが酸化されて、下記の反応によっ て分子酸素を形成する。 式[４]記載のスーペルオキシドアニオンの分子酸素への変換は、スーペルオキ シドアニオンの蓄積および続く過酸化水素の形成を防止する。ここで“スーペル オキシドオキシダーゼ”活性と記載したこの活性は、組成物中の最初の酸素含量 が最少に保持され、組成物が基本的に酸素のない環境におかれ、ニトロキシド濃 度がスーペルオキシドアニオンおよび過酸化水素の形成を防止するのに充分であ るときに、最も効果的であり得る。従って、基本的に酸素のない容器でＨＲＣＳ が貯蔵されることが望まれる。 溶液を酸素のない環境に保持せしめる容器系は、多くの非ヘモグロビンを基に する静注用溶液が酸素に敏感であることから、よく知られている。例えば、充填 また閉封時に酸素を除去するガラス容器を用いることができる。また、柔かいプ ラスチック容器も酸素を排除して封入包含して利用し得る。基本的には、酸素が 溶液中のヘモグロビンと相互作用するのを防止し得るすべての容器が用いられる 。 ニトロキシドの“スーペルオキシドオキシターゼ活性を表わすために、溶液中 のニトロキシド標識ヘモグロビンのサンプルは、促進された酸化貯蔵条件に保た れ、ニトロキシドの酸化還元状態が電子スピン共鳴分光法によって試験される。 例えば、４−アミノＴＥＭＰＯで標識されたＯ−ラフィノーズ重合ヘモグロビン 溶液は、その酸化状態で密封ガラス容器に貯蔵される(図１Ａ)。このような状態 において、溶液中のスーペルオキシドアニオンおよびmet−ヘモグロビン形成の 速度は、ニトロキシドのヒドロキシルアミン誘導体への変換を適格に監視し得る のに充分な速さである(参照、反応式[４]および図１Ａと１Ｂの比較)。反応式４ は、ニトロキシドの反磁性ヒドロキシル誘導体への変換がスーペルオキシドアニ オンの分子酸素への変換と対になっていることを表わしている。このような変換 を支持する実験的証拠は、図１Ａおよび１Ｂに示される。ヘモグロビンに共有結 合しているＴＥＭＰＯの電子スピン共鳴スペクトル(図１Ａ)は、その反磁性誘導 体に変わり、そのことはサンプルの３０日間４℃での貯蔵後に共鳴ピークの完全 な消失をもたらす(図１Ｂ)。ニトロキシドは、そのヒドロキシルアミンにヘモグ ロビンの存在下で変換したときに、“スーペルオキシドオキシダーゼ”様活性を なしたものと考えられる。 ＨＢＯＣ溶液中のニトロキシドの“スーペルオキシドオキシダーゼ”活性は、 ヒドロキシルアミン誘導体のニトロキシドへの再変換によって明らかにされる( 参照、反応式[４]とともに式[５])。図１Ａおよび１Ｂに記載された実験条件の 下でニトロキシドはヒドロキシルアミンに完全に変換すること(参照反応式[４]) が知られており、ニトロキシドは反応式５に示すようにスーペルオキシドアニオ ンを単に提供することにより再製する。この反応メカニスムを表示するために、 ヘモグロビン(およびスーペルオキシドアニオン)のニトロキシドに対する比較濃 度は、図１Ａのサンプルを同量の非標識ヘモグロビンで希釈することにより、増 加する。図１Ａと１Ｃの比較は、希釈効果でニトロキシドのシグナル強度の約５ ０％の減少を示している。他方、３０日間４℃の冷貯蔵後に、ニトロキシドは式 [５]から予測されるように部分的に再生していた(参照図１Ｄ)。この結果は、ス ーペルオキシドアニオンからの過酸化水素の形成と対になっているヒドロキシル アミン誘導体のニトロキシドへの再変換と符号している。 式[４]および[５]を合わせると次のようになる。 これは、ニトロキシドがＨＢＯＣ溶液中で低分子量の、金属を含まないＳＯＤ様 体として働くことを表わしている。ニトロキシドの電子スピン共鳴スペクトルの 検定(図１Ｄ)は、ニトロキシド(Ｒ Ｎ−Ｏ)と過酸化水素(Ｈ2Ｏ2)の形成をもた らすスーペルオキシドアニオンのヒドロキシルアミン(Ｒ−Ｎ−ＯＨ)との反応に 合致している。最近、オキソアンモニウムカチオンがスーペルオキシドのニトロ キシド触媒ジスムタ化における一つの中間体として関与していることが云われて いる(Ｋrishna et al．,Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ８９ ５５３７− ５５４１(１９９２))。 本発明のＨＲＣＳ製剤は、既存のＨＢＯＣ溶液におけるスーペルオキシドアニ オンの生成による酸化ストレスを軽減し、輪注に際し、ニトロキシド、エンドセ リウム誘導弛緩因子(ＥＤＲＦ)の破壊を小さくする。ＥＤＲＦの破壊が防止され ると、既存のＨＢＯＣ溶液を患者の注入したときにみられる血管収縮および血圧 上昇の問題が実質的に改善される。 ヘモグロビン分子に対するニトロキシド分子の数は、約１−４０の範囲にあり 、その統合値または値の範囲はその間にあり、そして特異的ラベリングについて 、最も望ましくは２である。多成分系の一成分として用いたとき、ヘモグロビン に対するニトロキシドの分子比は約３−６０であり、その統合値または値の範囲 はその間にある。例えば、３−マレイミド−プロキシルなどのニトロキシドは、 まずエタノール中ニトロキシドの１００mＭ溶液を担体溶媒として製造すること により、溶液中でヘモグロビンと共有結合する。ヘモグロビンに対するニトロキ シドの２分子当量を乳酸化リンガー液中ＤＣＬ−Ｈb(８g／dl)に混合しながら直 接加える。反応混合物を２２℃で撹拌してニトロキシドの９０％以上を反応せし めると、通常１時間以内にＤＣＬ−Ｈbに共有結合した。未反応のニトロキシド は、３０,０００ダルトン分子量遮断の十字流膜濾過系で、乳酸化リンガー液１ ０容量で３回洗うことにより、除去した。retantateヘモグロビン濃度を７−１ ４g／dlに調整し、無菌濾過し、４℃に貯蔵する。注入後、ＨＲＣＳが完全に酸 化された後、ニトロキシドはＳＯＳ様体として、２次的にカタラーゼ様体として 機能すると期待される。ＳＯＤ様体としてニトロキシドはスーペルオキシドアニ オンを過酸化水素にジムスタ化し(参照、反応式[２])、従って、エンドセリウム 中の一酸化窒素の破壊から保護し、血管収縮を防止する。カタラーゼ様体として は、ニトロキシドは過酸化水素を無害な水に変えることにより、その毒性を防止 する(参照、反応式[３])。 上記したように、ニトロキシドをヘモグロビンと共有結合せしめて、ヘモグロ ビン分子自体の共同的酸素結合性質が研究されている。しかし、ニトロキシドは 、安定な、すなわち橋かけ結合、または重合、被膜、または複合のヘモグロビン 溶 液（生理的和合性である）と共に使用されたことはなかった。合成ニトロキシド 含有ポリマーが天然ヘモグロビンを標識するために用いられたことはなかった。 ヘモグロビンおよびニトロキシドについての既存の化学は、化学的に橋かけ結合 または組替え技術で橋かけ結合したヘモグロビンの類似のニトロキシドラベリン グを、ヘモグロビン分子を安定化、重合化または複合化するのに用いられた特定 の化合物でブロックされないヘモグロビン分子上の利用できる部位を選択するこ とによって、遂行し得ることを示唆している。下記するヘモグロビンの安定およ び重合型のあるものは、最近に臨床試験がなされているので、これらの安定およ び重合ヘモグロビンを基にする酸素担体へのニトロキシドの接合は、下記するよ うに、本発明の酸素解毒機能が既存のヘモグロビン溶液に利用されうることを示 す。 ニトロキシド−ＨＢＯＣの実施例中に表わされたニトロキシドラベリング技術 は、有用な抗酸化および酵素様活性を有する他のニトロキシド標識高分子、例え ば、ニトロキシド−標識血清アルブミンおよびニトロキシド標識免疫グロブリン の製造に容易に適用される。この技術によってニトロキシドで容易に標識され得 る血清アルブミンの型は、単量体(正常)アルブミン、およびアルブミンホモ２量 体、オリゴマー、および凝集体(ミクロスエアおよびミクロバブル)および各々の ポリペプチドフラグメントである。ここに記載するように、タンパク質または高 分子には、フラグメントすなわちタンパク質のポリペプチドフラグメントが含ま れる。 適用における相違によって、ここに記載の製剤は一緒にまたは別々に用いられ る。例えば、心灌流損傷あるいは脳血管系における虚血的損傷の治療と診断にお いて、本発明のいくつかの点の利点、すなわち酸素運搬、酸化ストレスからの全 身的保護、再灌流損傷からの局所的保護およびイメージングの上昇を利用するこ とが望ましい。その場合において、本発明の製剤は既存ＨＢＯＣ、ニトロキシド 標識アルブミンおよび低分子量ニトロキシドと併用され得る。これらは、治療お よび診断の目的に応じて、同時にまたは続けて投与され得る。 本発明の特定の製剤および投与方法を選ぶについて、投与の製剤および方法は 特定の適用によって定まる。特定の適用のために低分子量膜透過性物質から電子 を受容できるニトロキシドを基とする化合物は、特定の適用に望まれる部位特異 的保護に基づいて選択され得る。上記したようにヘモグロビンを基とする酸素担 体の注入からの酸化ストレスの回避は、本発明の投与製剤および方法を選択する 主要な例であり、遊離基毒性に対する特異的な保護を提供し、ＨＢＯＣ注入の毒 性副作用を回避する。部位特異性保護または活性が皮膚または皮膚層中で望まれ るところでは、ＴＰＯＳが比較的小さく、膜透過性であるので、望ましい化合物 である。特殊な保護および活性が消化管において望まれるところでは、ポリニト ロキシドデキストランが消化管にあるときに酵素消化に感受性が低いので、望ま しい。かかる適用においては、経口または直腸投与が望ましい。脳血管系または 心血管系などの静脈および脈管内領域に特殊な保護または活性が求められるとこ ろでは、アルブミンが主な血漿タンパク質であり、耐容性もよく、投与し易く、 長い血漿半減期を有するので、ポリニトロキシドアルブミンが望ましい。これら の適用において、ヘモグロビンを基にする酸素担体またはそのポリ誘導体も含ま れる。同じ根拠で腹腔内または皮膚内投与もなされ得る。 いくつかの例で示すごとく、本発明の化合物の投与は体内で局在化し、一群の 細胞または一つの臓器に向けることができる。特に、移植のための臓器の保存が 身体からその臓器を取り出す前あるいは後にポリニトロキシドアルブミンを注入 することにより達成される。例えば心臓移植において、ＰＮＡは、選択的に心臓 を灌流するのに、すなわち集中静脈投与次いで体から臓器を摘出して、用いられ る。臓器はまた、摘出されて、ＰＮＡ浴に保存されて、脂質過酸化、酸化ストレ スなどの過程による劣化を防ぐ。さらに、移植後に、臓器に酸化血を灌流したと きに、心臓および脳の虚血性再灌流損傷について示したのと同じ方法で臓器が保 護される。肺における特別の保護が望まれるときは、ポリニトロキシドアルブミ ンのエアゾル形態が肺の空気通路をコートできるので望ましい。当業者には明ら かなように、これらの望ましい製剤は特定の適用に応じて変更することができる 。 注意すべきは、上記製剤は電子受容化合物の望ましい実施態様である。膜透過 性の電子供与化合物について、望ましい化合物の選択は適用および投与方法に依 存している。投与の製剤および方法は、対象とする生理的条件またはイメージあ るいは処置する領域により生成するか、または対応した遊離基の範囲に相応した 全身的また組織特異的分布が達成されなければならない。例えば、敗血症におい ては、循環系の大きい虚脱が観察され、遊離基の生成について全身的な増加をと もなう。同様に、全身的照射は全身に遊離基の生成をもたらす。このような症状 において、ＴＥＭＰＯＬなどの小分子量、膜透過性、電子供与ニトロキシドが、 全身的な分布をなし得る量で経口また静脈に投与される。従って、かかる投与に は、ポリニトロキシドアルブミンの静脈投与のような広く分布する電子供与体の 投与が伴わなければならない。遊離基の生成がより局在化しているところでは、 電子受給体物質の選択的適用により局在化した保護または活性を提供することが 望まれる。なぜなら、膜透過性物質は投与に際し全身的に分布しやすく、皮膚へ の膜透過性物質の局所投与がより局所化した効果を生じるからである。 本発明での開示に基づき、当業者は、本発明が用いられるところの特定の適用 に最も効果的に応じられるように、投与の製剤および方法を選択することができ る。例えば、消化器系のイメージを向上するために、電子受容体としてポリニト ロキシドデキストランの経口投与および膜透過性ＴＥＭＰＯＬの経口または静脈 内投与が選ばれる。さらなる例として、遊離基の生成がはっきりしている皮膚症 状を示す乾燥の処置のためには、電子受容体としてのＴＯＰＳの局所適用と膜透 過性ＴＥＭＰＯＬの局所適用が選択される。すべての同様の根拠によって、部位 特異的保護または活性は、遊離基物質が存在している他の疾患状態、診断的また は治療的状態に本発明の製剤を用いて、提供され得る。従って、下記の実施例は 、本発明が適用に従って併用することができるいくつかの製剤の詳細な記載を開 示する。 実施例１ ニトロキシドおよびニトロキシド標識化合物を含む容器およびフィルター 既存の製剤を化学的に修飾することなく、本発明の酸素解毒機能を既存の静脈 内溶液、例えばＨＢＯＣ溶液に導入することが可能である。遊離ニトロキシドと 共に使用され得るポリニトロキシド高分子を含ませるか、またはＨＢＯＣが貯蔵 されている容器内側表面にニトロキシドを共有結合させることにより、既存製剤 の場合に観察される酸素毒性により誘発される有害な生理学的作用は軽減される 。 本発明の対象であるヘモグロビン含有溶液の場合に使用される容器は、静脈内 液の場合に使用される容器と類似した特性を有する生理学的に和合性のものであ るべきである。典型的には、ガラスまたは生物学的適合性プラスティックが適当 である。静脈内溶液をある程度の長さの時間容器に入れている本発明の態様の場 合、容器は酸素不含有であり、かつ密閉されて酸素を排除し得るものとすべきで ある。ガラス容器の場合、慣用的ストッパーおよび閉鎖手段であれば十分である 。しかしながら、現在利用され得る可とう性プラスチック容器の中には酸素透過 性のものもある。この場合、ホイルオーバーラップまたは他の密閉機構を用いる ことにより、酸素が溶液と接触するのを阻止し得る。 容器の内部表面にニトロキシドを適用するため、ニトロキシドポリマーまたは ニトロキシド-ドープ処理コポリマーの非浸出性層を内部表面に直接コーティン グする。遊離基の安定性がポリマー形成プロセスで維持されていれば、ニトロキ シド含有ポリマーは、一般的に知られているポリマー形成原理に基づいた若干の 技術により生成され得る。 また、ＨＢＯＣ容器の内部表面は、ニトロキシドと結合し得る物質、例えばニ トロキシドのケトンまたはアルデヒド基と反応して安定したヒドラゾン誘導体を 形成する親水性ヒドラジド基のコーティング層を含むように修飾され得る。コー ティング反応は直線的に進行する。例えば、ｐＨ５.０での酢酸緩衝液中ニトロ キシド（１００ミリモル）を、ヒドラジド活性化プラスチック容器に加えること により、ヒドラゾン結合の形成が容易に行われる。 一旦容器が製造されると、生理学的和合性溶液を加える。この溶液は、安定化 および精製ＨＢＯＣまたはここに開示されているＨＲＣＳであり得、またヘモグ ロビンと共に持続注入するのに望ましい静脈内コロイドまたは結晶体溶液を含み 得る。次いで、この溶液を本質的に酸素不含有の環境中に維持する。 容器内側表面の処理に加えて、ニトロキシドが固定されるゲルまたは固体マト リックスを含む、ルア（luer）ロックの入り口および出口を備えたフィルター型 カートリッジを使用すると、ヘモグロビン溶液がカートリッジ中を通過する間に 反応性酸素誘導物質が除去され得る。上記の投与技術の場合、患者へ直接注入す るために溶液が通過するフィルターのハウジング中へポリニトロキシド高分子を 加えることにより、それを注入前に溶液と反応させ得る。低分子量ニトロキシド も含まれ得る。これらの適用において、ニトロキシドはまた、軟または硬ゲルマ トリックスに結合されることにより、注入前に本質的に滅菌インラインフィルタ ーとして機能し得る。固体マトリックスに小リガンド、例えばニトロキシドを結 合させる様々な方法は、アフィニティークロマトグラフィー技術分野では周知で あり、例えばガラスおよびプラスチック表面を化学的に修飾する技術がある。滅 菌溶液と和合し得る幾つかのタイプのマトリックスは公知であり、例えばアガロ ースゲル、ポリスルホン基剤の材料、ラテックスなどがある。 フィルターカートリッジ方法では、固体マトリックスをニトロキシドと共有結 合させ、フィルターハウジングまたは他の同様の装置に内包させるが、この場合 、患者へ注入している間に溶液、例えばヘモグロビンが装置中を流れ抜け、ニト ロキシドと接触し得るようにする。実際的な方法では、マトリックスとして一般 的に利用可能な活性化アガロースゲルを使用し、滅菌ルアロックカートリッジ中 にゲルを内包させる。次いで、ヘモグロビン含有溶液の輸液中に、カートリッジ を流体投与ラインに単に挿入する。実際面では、ニトロキシドが含まれ、ヘモグ ロビンが通過し得るフィルターハウジングを含む構造は、様々な公知構造により 提供され得る。例えばアメリカ合衆国特許５１４９４２５参照。図１２を参照す ると、ハウジング１はニトロキシド標識アガロースゲルを含んでいる。例えば、 ４−ブロモアセトアミド−ＴＥＭＰＯ標識ω−アミノヘキシル−アガロース（図 ２Ａ参照）、４−アミノ−ＴＥＭＰＯと結合した１,４−ビス（２,３−エポキシ プ ロポキシ）ブタンアガロース（図２Ｂ参照）。他の化合物（図示せず）もフィル ターハウジングにより内包され得る。 輸液中、溶液を含む静脈内輸液ラインをルア入り口２に連結してハウジング１ へ入るようにすると、そこでヘモグロビン溶液は、ハウジング内に内包またはマ トリックス４に結合されたニトロキシド含有化合物と接触するが、このプロセス において、ニトロキシド含有組成物は、注入され、反応の結果、溶液から毒性酸 素に関連したものが除去され得る。次にヘモグロビン溶液は、ルア出口３を通っ てカートリッジから出て直接患者内へ輸注される。４−アミノ−ＴＥＭＰＯ標識 エポキシ−アガロースの電子共鳴スペクトルは図２Ａに示されている。別法とし て、ω−アミノヘキシル−アガロースは４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥ ＭＰＯと反応して、ＴＥＭＰＯ標識アガロースを形成し得る。電子スピン共鳴ス ペクトルは図２Ｂに示されている。また別の方法では、カルボアミド結合を介し てカルボジイミドにより４−カルボキシル−ＴＥＭＰＯをアミノ−アガロースに カップリングする。逆に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯは、カルボジイミド、例えば １−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドを用いて容 易にアガロースゲルのカルボキシル基に結合される。 ４−アミノ−ＴＥＭＰＯにより標識されたカートリッジは、室温で１時間アル デヒド・アヴィドクロムカートリッジ（ユニシン・テク．インコーポレイテッド ）を通して乳酸化リンガー溶液に１００ミリモルの４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（シ グマ・ケミカル・カンパニー）を循環させた後、６時間水素化シアノほう素ナト リウムで還元することにより製造される。カートリッジハウジング内部を乳酸化 リンガーにより徹底的に洗浄する。 ３−アミノ−プロキシルにより標識されたカートリッジは、上記方法に従い４ −アミノ−ＴＥＭＰＯを３−アミノ−プロキシルと置換することにより同様に製 造され得る。 実施例２ ニトロキシド標識安定化ヘモグロビン ヘモグロビンがその構成サブユニットに解離するのを阻止するため、ヘモグロ ビンを、そのサブユニットの化学的または組換え的橋かけにより分子内で安定化 させる。「安定化」ヘモグロビンとは、本明細書では化学的または組換え的橋か けにより安定化されたヘモグロビンモノマー並びに構成しているヘモグロビン分 子がシクロデキストランおよびそれらの硫酸化誘導体との橋かけにより安定化さ れている２量体、３量体および大型オリゴマーを指すものとして記載されている 。 ニトロキシドを安定化ヘモグロビンに結合させる好ましい技術は、安定化ヘモ グロビンの２つのβ鎖のβ−９３スルフヒドリル基へのニトロキシドの共有結合 によるものである。β−９３部位における特異標識は、立体配座試験におけるひ とヘモグロビンに関して立証されたが（McConnell et．al.，Quart.Rev.Biophys .3:91(1970)参照）、上記の橋かけヘモグロビンの特異標識については報告され ていない。上記の通り、化学的橋かけにより安定化された幾つかのタイプのヘモ グロビン基剤の酸素担体、例えばＤＢＢＦ−橋かけヘモグロビンおよびｏ−ラフ ィノースにより安定化およびオリゴマー化されたヘモグロビンが開発されている 。 本出願人の合衆国特許第４８５７６３６号に記載されている開環式糖類からは 、ジサッカリド、オリゴ糖類または好ましくはトリサッカリド、例えばｏ−ラフ ィノースから誘導される多価アルデヒドが得られる。これらの化合物が機能する ことにより、分子内安定化（橋かけ）および分子間ポリマー化の両方が行われる 。本出願人の初期特許に開示された反応を制御することにより、多価アルデヒド を使用すると、ポリマー化せずに上記の「安定化」ヘモグロビンが生成され得る 。別の例では、ニトロキシドは、安定化ヘモグロビンまたはポリマー化ヘモグロ ビンに共有結合され得る。従って、多価アルデヒドを用いて安定化されたヘモグ ロビン基剤の溶液は、この態様では「安定化」ヘモグロビンとして、後続の態様 ではポリマー化ヘモグロビンとしてみなされる。 化学的に修飾されたヘモグロビンのβ−９３部位が立体的にニトロキシド結合 に接近不能にされたわけではないことを立証するため、ニトロキシドがＤＢＢＦ −Ｈｂのβ−９３部位に共有結合され得ることを確認する結果が提示されている 。 この態様では、ＤＢＢＦ−Ｈｂを、２タイプのスルフヒドリル基特異官能基を 含み、下記構造式を有する２タイプのニトロキシド（ＴＥＭＰＯおよびプロキシ ル）と反応させる。 ＤＢＢＦ−Ｈｂは、公知技術によりビス（３,５ジブロモサリチル）フマレー トに溶解させた精製脱酸素化ヘモグロビンを橋かけすることにより製造され、生 成物をカラムクロマトグラフィーにより精製する。３−マレイミド（２,２,５, ５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル）［３−マレイミド−プロキシル］ の共有結合は、乳酸化リンガー中約８ｇ／ｄｌの濃度でのＤＢＢＦ−Ｈｂ１ｍｌ に、３−マレイミド−プロキシル約１００ミリモルの濃度で担体溶媒としてメタ ノールを用いて２モル当量のこのニトロキシドを加えることにより達成される。 ＤＢＢＦ−Ｈｂを約３０分間混合しながら２２−２３℃で反応させる。橋かけの 範囲を、未反応ニトロキシドの電子スピン共鳴シグナル強度の消失パーセントか ら推定する。未反応ニトロキシドを除去するため、３０キロダルトン-カットオ フ名目分子量限界（ＮＭＷＬ）ポリエチレンスルホン（ＰＥＳ）膜をもつフィル トロンスタイア（stire）セル（フィルトロン・テクノロジー・カンパニー）を 用いて、反応混合物を１０容量過剰の乳酸化リンガーにより３回洗浄した。ブル カーＥＳＲ分光計により、ニトロキシド標識ヘモグロビンの電子スピン共鳴測定 値を記録した。図３Ａは、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ標識Ｄ ＢＢＦ−Ｈｂの電子スピン共鳴スペクトルを示す。３−マレイミド−プロキシル により同様に標識されたＤＢＢＦ−Ｈｂの電子スピン共鳴スペクトルは、図３Ｂ に示されている。 この態様において、ニトロキシドは、ヘモグロビンの２本のβ−グロビン鎖に ある単独のスルフヒドロ基に共有結合される。すなわち、ヘモグロビンの２本の β−グロビン鎖に結合したニトロキシドが２つ存在するため、ニトロキシド対ヘ モグロビン結合酸素比は、９９.００％デオキシヘモグロビンで約２００対１で ある。しかしながら、輸注後、脱酸素化ＨＲＣＳは肺中の酸素を捕獲し、ヘモグ ロビンの４本のグロビン鎖に結合した４個の酸素分子が存在し、２つのニトロキ シドがβ−グロビン鎖に残っているため、ニトロキシド対ヘモグロビン結合酸素 比は１００％酸素化で約１対２になる。 １：２のヘモグロビン対ニトロキシド比を用いると、９０％を越える割合のニ トロキシドがＤＢＢＦ−Ｈｂに共有結合される。ＤＢＢＦ−Ｈｂはまた、図３Ｂ の場合と類似した共鳴スペクトルを呈するマレイミドおよびプロキシル部分（す なわち、３−マレイミドメチル−プロキシル）間のスペーサー基（例、余分のメ チル基）により共有結合的に標識され得る。他のニトロキシドは、ＤＰＧ結合部 位（例、β−Ｖａｌ−１ β−Ｌｙｓ−８２およびα−Ｌｙｓ−９９）における 特定アミノ基に共有結合され得るか、またはヘモグロビンにおける残りの４０プ ラス表面リジンε−アミノ基に結合され得ることは注目すべきである。ＴＥＭＰ Ｏおよびプロキシルニトロキシドのイソチオシアネート誘導体はまた、アミノ基 との反応性を示す。例えば、４−イソチオシアネート−ＴＥＭＰＯは、約１０： １のモル比でヘモグロビンに加えられ得る。他の部位でのこのニトロキシドによ り標識されたヘモグロビンの共鳴スペクトル（図示されず）は、図３Ａに示され たものと類似している。 ＤＢＢＦ−Ｈｂの幾つかの部位がニトロキシドと結合し得るということは、ア ルファ−グロビン２量体により安定化されている組換えヘモグロビン（D.Looker et.al．NATURE 356:258(1992)）がニトロキシドにより同様に標識され得ること を示唆している。また、ニトロキシド標識橋かけ剤、例えばＴＥＭＰＯ標識スク シネート（合衆国特許第４２４０７９７号参照）のＤＢＢＦ類似体を製造するこ とも可能である。 図４は、室温で記録された乳酸化リンガー溶液における（Ａ）２−（ブロモア セトアミド）−ＴＥＭＰＯ、（Ｂ）２−（ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ− 標識ＨＢＯＣおよび（Ｃ）15ＮＤ17ＴＥＭＰＯＬ（ＴＥＭＰＯＬ：４−ヒドロキ シ−２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）のＥＳＲスペクト ルである。図４Ａおよび４Ｂにおける差異は、小分子量ニトロキシドと巨大分子 、例えばヘモグロビンに共有結合したニトロキシドの移動度の差異を表す。図４ Ｃは、核スピンが１／２である安定した同位体窒素15Ｎでは２つの共鳴ピークが 得られること、および核スピンが１である天然同位体14Ｎでは３つの共鳴ピーク が得られることを示す（４Ａ〜４Ｃを比較）。ここに記載された一連の実験では 、これらの共鳴ピークの分離を用いることにより、小型および巨大分子量ニトロ キシドの酵素様的およびインビボおよびインビトロ酸化／還元反応を立証する。 ニトロキシドとヘモグロビンのモル比が異なるニトロキシド標識ＨＢＯＣは下 記の要領で製造される。２、４および８モル当量の４−（２−ブロモアセトアミ ド）−ＴＥＭＰＯを、清潔なフードにおいて３つの別々の１５ｍｌバキュテーナ ー中へ直接固体粉末として加えた。ゴム隔壁を戻した後、続いて４−（２−ブロ モアセトアミド）−ＴＥＭＰＯを２００μｌクロロホルムに溶かした。次いで、 ゴム隔壁に刺した２７ゲージ針によりバキュテーナーを高度減圧装置（５ｍｍＨ ｇ）に連結し、バキュテーナーの下半分を覆う４−（２−ブロモアセトアミド） −ＴＥＭＰＯの薄膜を残してクロロホルムを除去した。ゴム隔壁に刺した滅菌ト ランスファーを介して適量のＨＢＯＣを導入した後、１／２時間約５分間隔で断 続的に渦状混合しながら溶液を室温で反応させ（ニトロキシド対ヘモグロビンの モル比が４および８では必ずしも全ての固体が溶解したわけではなかった）、次 いでバキュテーナーを冷蔵庫中摂氏４度で一夜放置した。４−（２−ブロモアセ トアミド）−ＴＥＭＰＯの全固体がバキュテーナーの表面から視覚的に消えてし まうまで、室温での渦状混合を翌朝さらに１／２時間再開した。 次いで、反応混合物および対照を、滅菌透析管に移し、非標識遊離４−（２− ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ電子スピン共鳴（ＥＳＲ）シグナルが全く検 出されなくなるまで、乳酸化リンガーに対して透析した。Ｈｂに対し２、４およ び８モル当量４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯでの４−（２−ブロ モアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ標識ＨＢＯＣのＥＳＲスペクトルは、各々図５Ａ −５Ｃに示されている。ヘモグロビンに対し２モル当量の４−（２−ブロモアセ トアミド）−ＴＥＭＰＯでは、透析をしてもしなくてもＥＳＲスペクトルは本質 的に同じであり、共有結合標識が定量的であることを示している。βグロブリン 鎖の２個のＳＨ−基は、ＨＢＯＣの場合における共有結合部位であると思われる （これは、Ｎ−エチル−マレイミドによる４−（２−ブロモアセトアミド）−Ｔ ＥＭＰＯ標識の選択的遮断または逆相ＨＰＬＣによるグロブリン鎖分析により確 認され得る）。スペクトルが比例的に減少している器械感度で記録されたところ によると、２、４および８の場合のＥＳＲシグナル強度（ピークＭｏ）比が、ほ ぼ同じ比であることは注目に値する。 さらに、それ以上の４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯが、例えば インビボでの放射線防護剤としてさらに高いモル比でもＨｂに結合され得ると予 測される。 血液代用製剤におけるニトロキシド対ヘモグロビンの好ましいモル比は８：１ であり、特に好ましいモル比は約１８で、下記要領で製造され、ポリニトロキシ ドヘモグロビン（ＰＮＨ）が生成される。好ましいＰＮＨ製剤は一酸化炭素誘導 体、ＣＯ−ＰＮＨである。ＰＮＨヘム基へのＣＯ結合によりＰＮＨは安定化され た。すなわち、ＣＯ−ＰＮＨが６０℃加熱に対して安定していることが示された 。したがって、ＣＯ−ＰＮＨは冷蔵を必要とはせず、長期間室温で貯蔵され得る 。さらに、体内への注入時、ＣＯの存在により、ＰＮＨの血管拡張活性が高めら れることから、ＣＯはインビボで血管拡張剤として作用することが知られている 。ＣＯがＰＮＨから脱離された後、ＰＮＨは、組織への酸素送達およびそのニト ロキシド伝達による血管拡張作用の両方により治療剤として機能し続ける。 図６について述べると、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ標識Ｈ ＢＯＣおよび15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬの混合物のＥＳＲスペクトルが示されてお り、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯの中央ピーク（下向き矢印に より示されている）および15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬの高フィールドピーク（上向 き矢印により示されている）は似た強度に調節されていた。 共鳴ピークの分離により、インビトロおよびインビボ（ねずみ）の両反応にお ける小分子量ニトロキシド（ＴＥＭＰＯＬ）およびその高分子コンジュゲートを 含む遊離基または酵素様活性の同時モニターが可能となる。例えば、相異なるニ トロキシドの特有なスペクトル特性に注目することにより、２種のニトロキシド のインビボ血漿半減期を比較した。具体的には、マウスにおけるヘモグロビン基 剤溶液のインビボＥＳＲ試験は、８：１のニトロキシド対ヘモグロビン比を用い て（図５Ｃ参照）その高いＥＳＲシグナル強度を利用することにより行われた。 まず、小分子量ニトロキシド（15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬ、図４Ｃ参照）および大 分子量４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯＬ−標識ＨＢＯＣ（図４Ｂ 参照）のおよその血漿半減期は、２物質の混合物を製造し、ＥＳＲシグナル強度 をほぼ同じに調節する（図６参照）ことにより測定される。０.５ｍｌの混合物 を、赤外線灯下広げたマウス尾部静脈に麻酔下で注射した。マウスの尾をＥＳＲ 空洞中に挿入し、注射後１０分以内にスペクトルを記録した（図７Ａ参照）。 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに注目すると、15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬシグナルは検 出され得なかったが、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯＬ−標識Ｈ ＢＯＣは明確に分割された（血漿半減期試験については図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ 参照、ただし７Ｃは７Ｂの続きである）。ＨＢＯＣの血管収縮作用は、ラットに おけるＨＢＯＣのボーラス注射の最初の５−１５分中に十分発現されることが報 告されており、マウスでの輸注直後の遊離基レドックス反応におけるニトロキシ ド標識ＨＢＯＣの関与が測定された。雌ＣＨ３マウスの尾部静脈に、８０％一酸 化二窒素、２０％酸素および３％イソフルオランによる麻酔下カニューレを挿入 した。赤外線灯下、マウス尾部静脈を目に見えるように広げ、長さ１フィートの ポリエチレン管に連結した３０ゲージ皮下注射針から成るカニューレを、尾部静 脈中に挿入し、シアノアクリレート接着剤により適所を抑えた。インビボＥＳＲ 測定の場合、カニューレ挿入マウスを、麻酔下、尾が円錐端から突き出、管の開 口末端から麻酔ガスが連続して流れるように修正された５０ｍｌ円錐形遠心管に 移した。尾をプラスチック管中に挿入し、次いでＴＥ１２空洞中に適合させた。 カニューレをヘパリン（１００単位／ｍｌ）により定期的に洗い流して開通性を 確保した。カニューレは尾の付け根付近であり、ＥＳＲ空洞の外側に固定されて いたため、ボーラス注射直後に尾からの純粋なシグナルが測定され得た。０.５ ｍｌの試料（図８参照）をカニューレから注射し、分光計を１／２分間隔で反復 スキャンモードにセットした（図８Ａおよび８Ｂ参照）。図８Ａでは磁場を２ガ ウス増加させ、図８Ｂでは磁場を２ガウス減少させると、共鳴スペクトルは重ね 合わされた。15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬシグナルは注射後２.５分以内に消失した 。同じ期間中、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯＬ−標識ＨＢＯＣ もまた似た速度で減少した。 しかしながら、ニトロキシド−ＨＢＯＣシグナルは、血漿中で安定しているこ とが示された（図８Ｂ）。従って、図７からの結果と合わせると図８Ｂは、巨大 分子、例えばＨＢＯＣに対するニトロキシド標識が、小分子量ニトロキシド（例 、15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬ）の場合と比べてかなり長い血漿半減期を有すること を示している。 観察された遊離基反応の性質は次の２つの経路を含む。 １．急速相は、ニトロキシドからそのオキソアンモニウムカチオン中間体への 遊離基（例、スーパーオキシド）酸化、次いでオキソアンモニウムカチオンから ニトロキシドのその安定したヒドロキシルアミン誘導体への還元を含むと思われ る。上記還元は、血管区画に存在する１種または２種の還元性均等物質（例、Ｎ ＡＤＨ）のいずれかの関与を伴う。ニトロキシドからそのヒドロキシルアミンへ の還元によりＥＳＲシグナル強度は急速に減少し、８：１モル比の４−（２−ブ ロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ−標識HＢＯＣの場合、ＨＢＯＣにおいて約２ ５％の割合の４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯを示す。この相は小 分子および高分子ニトロキシドの両方を含む。 ２．緩慢相は、ニトロキシドが周期的遊離基反応、例えばＳＯＤ模擬反応に関 与している反応機構に従いＨＢＯＣにおける残りの７５％の４−（２−ブロモア セトアミド）−ＴＥＭＰＯの抗酸化的酵素様活性を示すと思われる(図８Ｂ参照) 。ニトロキシド遊離基が本質的にＳＯＤ模擬的なものとして消費されていない場 合、 ＥＳＲシグナル強度の緩慢な減少速度は、第一には上記反応機構、および第二に は、血漿半減期の関数として血管区画からゆっくりと排除されることからＨＢＯ Ｃ濃度の減少に起因すると考えられ得る。 この結果は、インビボでの遊離基解毒におけるポリニトロキシド高分子、この 実施例ではＴＥＭＰＯ−標識ＨＢＯＣの有用性を立証している。この有用性は、 インビボで酵素様的なものとして作用するニトロキシドによる遊離基の短期的（ 分）化学的除去および酸化反応に対する持続的（時）防御が行われることに関し て定義される。これおよびヘモグロビン含有溶液に関連する実施例の各々におい て、未結合低分子量ニトロキシドを製剤に加えることにより、血管膜を通って間 隙空間および周囲細胞環境中へ活性ニトロキシドの濃度が増加され得ることと理 解すべきである。ここに示された結果は、本発明のポリニトロキシド巨大分子か ら医薬組成物に低分子量ニトロキシドを単に加えた場合の効果を区別している。 分子量ニトロキシドと一緒にポリニトロキシド高分子を利用する本発明の多成分 系の特に有利な点は、下記に強調されている。 図８におけるスペクトル分析に基づくと、酸化／還元（レドックス）周期性反 応は、遊離基状態で残っている４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ標 識ＨＢＯＣの約７３％を含む。これは、ＴＥＭＰＯＬが血管空間範囲内でのイン ビボレドックス反応に関与していることを示している。 ヘモグロビン基剤の溶液の血管収縮効果を試験するため、修飾ヒトヘモグロビ ンの溶液を無傷ラットにおけるそれらの効果について試験する。いかなる研究動 物を使用する場合でも、常に人道にかなった方法を用いる。 試験の７日前、雄のスプラーグ-ドーリーラットに、ケタミン（４０ｍｇ／ｋ ｇ筋肉）およびアセチルプロマジン（０.７５ｍｇ）またはペントバルビタール ナトリウム（２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）による麻酔をかける。医薬用タイゴンミク ロボア（ＩＤで０.０５、ＯＤで０３）を大腿動脈および静脈中に挿入する。カ ニューレを体外に出し、ヘパリンで凝血防止したデキストロースで満たし、ステ ンレス綱の栓で密閉する。２−３日の回復期間後、意識のある動物をプラスチッ ク製拘束ケージに入れる。交換輸液前に切り口の治癒を確実にするには、外科的 方法から７日間の回復期間を要する。手術は少量の出血を誘発し得るため、手術 に関連した少量の出血が血液交換の副作用と混同されないように回復させること が重要である。５０％交換輸液は、注入ポンプを用いて試験溶液および血液を各 々２本の注射器から同時に注入および回収することにより行われる。除去される 血液容積（全血容積に基づくと１２−１５ｍｌ）を、約２０−３０分かけて試験 溶液と交換する。最終点は、ヘマトクリットがその初期値の半分に縮小するとこ ろである。チャート記録装置に連結した圧力変換器を用いて交換輸液後５時間、 動脈血圧をモニターおよび連続記録する。平均動脈圧は、パルス圧の１／３とし て計算される。心拍は血圧トレースから測定される。 実施例３ 安定化ヘモグロビンのニトロキシド標識ポリマー 橋かけ単量体から安定化ヘモグロビンの２量体を製造することは可能であるが 、安定化または天然ヘモグロビンからヘモグロビンポリマーを製造することも可 能である。ヘモグロビンポリマー溶液は、単量体、２量体、３量体、４量体およ び他のオリゴマーの混合物を包含する。一般にＨＢＯＣとして使用されるポリマ ー化ヘモグロビンを含む溶液は、安定化モノマーヘモグロビンと比べて長い血漿 循環時間および高い酸素担持能力を有する。かかるポリマー化ヘモグロビンは、 幾種類かの異なる重合剤を用いる若干の経路により製造され得る。（合衆国第４ ００１２００、４８５７６３６および４８２６８１１号参照）。ニトロキシドを ポリマー化ヘモグロビン溶液に導入する好ましい方法は、やはりニトロキシドを ヘモグロビンの２本のβ−グロビン鎖のβ−９３スルフヒドリル基に共有結合さ せることによるものである。これらのスルフヒドリル基は、安定化またはポリマ ー化プロセスに関与することは知られていない。従って、ニトロキシドは、好ま しくはヘモグロビンモノマーの安定化およびポリマー化前にヘモグロビンに共有 結合される。 例えば、上記第２態様記載の方法に従ってニトロキシドをＤＢＢＦ−Ｈｂに共 有結合させ、次いでセーガル等、合衆国特許第４８２６８１１号記載の方法に従 ってグルタルデヒドでポリマー化する。図４Ｂは、３−マレイミド−プロキシル に より標識され、グルタルデヒドによりポリマー化されたＤＢＢＦ−Ｈｂの電子ス ピン共鳴スペクトルである。同様に、グルタルデヒドによりポリマー化されるＤ ＢＢＦ−Ｈｂは、同じ方法によって４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰ Ｏにより標識され得る。 似た方法を用いると、未反応アルデヒド基を含むポリマー化ヘモグロビン中間 体、例えばグルタルデヒド−ポリマー化、ｏ−ラフィノース−ポリマー化、また はｏ−シクロデキストラン−ポリマー化ヘモグロビン中間体が、還元的アミノ化 による４−アミノ−ＴＥＭＰＯまたは３−アミノ−プロキシルの共有結合に使用 され、ニトロキシド標識ヘモグロビンポリマーが生成され得る。還元的アミノ化 の場合、反応の順序およびタイミングは重要である。４−アミノ−ＴＥＭＰＯは 、ポリマー化完了後ではあるが、ニトロキシドをポリマー化ヘモグロビンに共有 結合させることになる還元反応の前にグルタルデヒド−ポリマー化ヘモグロビン に付加される。同様に、ｏ−ラフィノースポリマー化ヘモグロビンのニトロキシ ド標識は、還元的アミノ化前に４−アミノ−ＴＥＭＰＯまたは３−アミノ−プロ キシルを加えることにより達成され得る。例えば、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ標識 ｏ−ラフィノースポリマー化ヘモグロビンは、本出願人の合衆国特許第４８５７ ６３６号記載の方法に従って製造されるが、ただし、ポリマー化完了後かつ２０ モル過剰のボラン・ジメチルアミン複合体による還元前に６モル当量の４−アミ ノ−ＴＥＭＰＯが加えられる。そこに記載されているところによると、ヘモグロ ビンは、ジサッカリドまたは開環糖類、例えばオリゴ糖または好ましくはトリサ ッカリド、例えばｏ−ラフィノースから誘導される多価アルデヒドを用いて橋か けおよびポリマー化され得る。同様に、高分子量糖類の方が好ましいが、単糖も ヘモグロビンの安定化およびポリマー化に使用され得る。透析および洗浄された ４−アミノ−ＴＥＭＰＯ標識ｏ−ラフィノースポリマー化ヘモグロビンの共鳴ス ペクトルは、図９Ａに示されている。 ポリマー化ヘモグロビンのヘモグロビンオリゴマー（Ｈｂn、ただしｎ＝２− ４）の収率を高めるためには、α−シクロデキストラン、β−シクロデキストラ ンおよびγ−シクロデキストラン並びにそれらの硫酸誘導体（６−、７−および ８−閉環グルコース分子に相当する）の使用により橋かけ剤のポリアルデヒドの ヴァランス（valance）を高めることが望ましく、開環状α−シクロデキストラ ン、β−シクロデキストランおよびγ−シクロデキストランは各々１２、１４お よび１６個の反応性アルデヒド基を有する。これらの開環状橋かけ剤をヘモグロ ビンの橋かけおよびポリマー形成に使用することにより、オリゴマーに富むポリ マー化ヘモグロビンが生成され得る。上記の未反応アルデヒドは、アミノニトロ キシド、例えば４−アミノ−ＴＥＭＰＯまたは３−アミノ−プロキシルへの共有 結合に利用され得る。 さらに、開環状硫酸誘導体、例えば硫酸化α−シクロデキストランは、次の２ つの追加理由により有効な橋かけ剤となる。すなわち、（１）硫酸基は、橋かけ ヘモグロビンの酸素親和力を低下させる場合にＤＰＧの活性を模倣するため、酸 素輸送特性が改善される、そして（２）硫酸基は、複数（例、ｎ＝２−４）のヘ モグロビンの複合体を形成し、初めに「クラスター」を形成させる親和性標識と して機能する。一旦「クラスター」複合体が形成されると、シクロデキストラン のアルデヒド基はＤＰＧ結合部位内でＮＨ2基と極めて接近することになるため 、ヘモグロビンの共有サブユニット内および分子間橋かけ形成を促進し、その結 果ヘモグロビンオリゴマーの収率が高められることになる。抗酸化的酵素様活性 に加えて、開環状シクロデキストラン重合およびニトロキシド標識ヘモグロビン はまた、ｏ−ラフィノースおよびグルタルデヒド重合ヘモグロビンの場合と比較 して改善された収率および組成を有する。 実施例４ ニトロキシド標識リポソーム封入ヘモグロビン リポソームは、両親媒性（amphophilic）分子の集合体から形成される粒子で あり、内部水区画および外部大量水に面する極性側面により中空球形状で２分子 層構造が形成される。当業界では、リポソームを形成するための幾つかの許容し 得る方法が知られている。典型的には、分子は、ジパルミトイルホスファチジル コリンのような水溶液中でリポソームを形成する。リポソームは、さらに安定さ せるためコレステロールにより製剤化され得、他の物質、例えば中性脂質、およ び表面修飾剤、例えば陽性または陰性荷電化合物を含み得る。好ましいリポソー ムは、小型単層−２分子層球形シェルである。 リポソームにヘモグロビンを封入する方法もまた公知である（ファーマーら、 合衆国特許第４９１１９２１号参照）。本発明の目的の場合、リポソーム封入ヘ モグロビン溶液にニトロキシドに基づく酸素解毒機能を導入するのには若干の方 法が使用され得る。例えば、出発物質としてニトロキシド標識天然ヘモグロビン 、または上記のニトロキシド標識安定化ヘモグロビンを使用し、次いで公知技術 によりニトロキシド標識ヘモグロビンのリポソーム封入方法を遂行することが可 能である。この態様では、精製ヘモグロビンはまた、膜不浸透性ニトロキシド、 例えばシアらの合衆国特許第４２３５７９２号でスピン膜免疫検定法について開 示されたＴＥＭＰＯ−コリンクロリドと共に封入され得る。 また、いずれの精製ヘモグロビンでも、ニトロキシド標識脂肪酸（例、７−ド キシル−ステアレート、１２−ドキシル−ステアリン酸、および１６−ドキシル −ステアレート）、コレスタン、コレステロールの類似体（例、３−ドキシル− コレスタン）または燐脂質（例、１２−ドキシル−ステアレート−標識ホスファ チジルコリン）から成るリポソームにより封入され得る。標識された３−ドキシ ル−コレスタンから成るリポソームに封入されたヘモグロビン製剤は、タブシら （J.Am.Chem.Soc.106:219(1984)）に記載された方法と類似した方法により製造 され得る。下記で詳述されているとおり、ドキシル標識ステアリン酸および／ま たはコレスタンを含む脂質組成物を含有する５ｍｌクロロホルム溶液を、まず窒 素気流中で乾燥することにより溶媒を除去した。次に、残留物を減圧乾燥し、生 成した膜を乳酸化リンガー溶液中２ｍｌのヘモグロビン（２４ｇ／ｄｌ）に懸濁 した。分散液中の脂質濃度は１００ミリモルである。次いで、リポソーム封入ヘ モグロビンを回転させ、脂質が全て分散して多重ラメラ小胞が形成されるまで、 好ましくは３７℃でインキュベーションする。次いで、生成した多重ラメラリポ ソーム封入ヘモグロビンおよび遊離未封入ヘモグロビンを含む溶液を、クックら の方法（合衆国特許第４５３３２５４号参照）に従い流動化装置に押し進めると 、０.２ミクロンのリポソームが形成される。リポソーム中におけるジパルミト イ ルホスファチジルコリン：コレステロール：ジパルミチジルホスファチジン酸： ３−ドキシル−コレスタンのモル比は、０.５：０.４：０.０２：０.０７である 。生成した３−ドキシル−コレスタン標識リポソーム−封入ヘモグロビンの共鳴 スペクトルは、図１０Ａに示されている。この立体配置では、ニトロキシドはリ ポソーム膜中に挟まれ、脂質二重層水界面の内部および外部表面の両方で見いだ され得る。図１０Ａに示されている脂質組成物において３−ドキシル−コレスタ ンを１６−ドキシル−ステアリン酸により置換すると、図１０Ｂに示されている 電子共鳴スペクトルが得られる。共鳴スペクトルから映し出されるニトロキシド の移動度は、ステアリン酸のドキシル−部分が脂質二重層の疎水性内部に主とし て位置するという解釈と一致する。３−ドキシル−コレスタンおよび１６−ドキ シル−ステアレートの両方を同じモル比で脂質組成物に加えた場合の、二重ニト ロキシド−標識リポソーム封入ヘモグロビンの共鳴スペクトルは、図１０Ｃに示 されている。この態様におけるニトロキシドが膜−水界面およびその疎水性脂質 二重層内部の両方に位置するため、図１０Ｃの共鳴スペクトルは図１０Ａおよび １０Ｂの合成である。両位置にニトロキシドを置くことにより、この態様では、 脂質二重層疎水性内部および膜−水界面の両方で酸素解毒機能が提供されるため 、封入ヘモグロビンに対する酸素解毒能力が追加確保されるというさらなる利点 が得られる。 実施例５ ニトロキシド標識複合ヘモグロビン 複合ヘモグロビンの生理学的和合性溶液は、ヘモグロビンおよび血漿増量剤と して使用される生物学的適合性高分子のコンジュゲートを形成することにより製 造される。血漿増量剤、例えばデキストラン（Ｄｘ）、ポリオキシエチレン（Ｐ ＯＥ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）を使用すると、体内でのヘモグロビン の循環半減期が延長される。この状態では、生物学的適合性高分子と一緒になっ たヘモグロビン分子は、集合的にヘモグロビン複合体として称される。ニトロキ シドをヘモグロビン複合体中に組み込ませる若干の慣用的方法が存在する。例え ば、コンジュゲートされるヘモグロビンを単にニトロキシド標識ヘモグロビン、 例えばＴＥＭＰＯ標識ＤＢＢＦ−Ｈｂと置き換えるだけでよい。これは、複合ヘ モグロビンの製造においてヘモグロビンまたはピリドキシル化ヘモグロビンを３ −マレイミド−プロキシル−ＤＢＢＦ−Ｈｂまたは４−（２−ブロモアセトアミ ド）−ＴＥＭＰＯ−ＤＢＢＦ−Ｈｂと置き換えることにより達成され得る。 ４−アミノ−ＴＥＭＰＯ標識デキストラン複合ヘモグロビンは、タムらにより 記載された方法（Proc.Natl.Acad.Sci.,73:2128(1976)）に従い製造される。最 初、０.１５モルＮａＣｌおよび５ミリモル燐酸緩衝液（ｐＨ７.４）中８％のヘ モグロビン溶液を、過よう素酸酸化デキストランにコンジュゲートすることによ り、シッフ塩基中間体が形成される。２０モル当量の４−アミノ−ＴＥＭＰＯを ヘモグロビンに加えると、デキストランのニトロキシドおよび残りの反応性アル デヒド基間にシッフ塩基が形成される。４℃で３０分のインキュベーション後、 水中５０モル当量のジメチルアミンボランを加える。溶液をさらに２時間４℃で インキュベーションする。その後、溶液を透析し、乳酸リンガー緩衝液により再 構成し、フィルトロン膜濾過ユニット（フィルトロン・テクノロジー・カンパニ ー）により滅菌濾過する。４−アミノ−ＴＥＭＰＯ標識デキストラン複合ヘモグ ロビンの電子スピン共鳴スペクトルは、移動の自由の高度さを表す鮮明な非対称 ３重線である（図１１参照）。デキストランに共有結合したＴＥＭＰＯの移動度 増加は、堅く折り畳まれたヘモグロビン分子の場合と比べて（図３Ａおよび３Ｂ 参照）柔軟な多糖類デキストラン鎖に結合したニトロキシドと一致する。すなわ ち、図１１における共鳴スペクトルは、新規ニトロキシド標識デキストラン複合 ヘモグロビンが生成されたことを立証している。 実施例６ ニトロキシド標識アルブミン 本発明の好ましい態様では、ニトロキシド標識生物学的適合性高分子を低分子 量膜透過性ニトロキシドと共に使用することにより、インビボので持続的抗酸化 活性が得られる。好ましくは、生物学的適合性タンパク質をニトロキシドで標識 し、ただし本明細書で使用されている「タンパク質」の語はフラグメントおよび その誘導体を包含するものとする。ニトロキシド標識蛋白質は、好ましくはタン パク質のアミノ基の大きな部分を標識することにより与えられる。かかる望まし い生物学的適合性高分子の一例は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。さら に、ジスルフィド結合を標識すると、ニトロキシド対タンパク質のモル比が高め られる。その方法でタンパク質を標識することにより、遊離ニトロキシドおよび 高分子結合ニトロキシド間の相互作用を促す酸性微環境が造られ、種類によって 安定性に差があるため電子スピン転移が促進される。それらの共有結合的標識ニ トロキシドは、分子量５０００〜７０００のジニトロキシド、トリニトロキシド またはポリニトロキシドカルボキシルコポリマーとして結合される。すなわち、 ニトロキシド対アルブミンのモル比は約４００に高められ得、ここに開示された 標識ストラテジーにより変動し、４００以下の値の整数値または範囲に達し得る 。アルブミンの場合、アルブミンの一次ビリルビン結合部位にニトロキシドを共 有結合させることも可能であり、その場合例えばその部位に対する特異的結合親 和力をもつニトロキシドの活性化誘導体、例えばＴＯＰＳを使用する。高分子上 の結合部位を選択することにより、ニトロキシドの反応性に修飾が加えられ、こ の修飾を用いることにより、化合物の反応性を改変することができる。 血清アルブミンは、多重リガンド結合部位をもつ血漿タンパク質であり、血液 中の多くのリガンドに関する輸送タンパク質である。ニトロキシドは、若干の特 異的リガンド結合部位でヒト血清アルブミンに特異的または非特異的に結合し得 る。この結合は、非共有結合的であるか、または活性化ニトロキシドの使用によ り共有結合的であり得る。ニトロキシド−アルブミンは、単独または低分子量ニ トロキシド化合物、例えばＴＥＭＰＯＬ、ＴＯＰＳおよびＴＯＰＳのモノ−およ びジエステルと組み合わせて経口、非経口および局所治療適用に使用され得る。 ニトロキシド標識アルブミンはまた、何らかの適用における有用性をもつアルブ ミンの「改善」版（すなわち、抗酸化活性を有することにより改善された）とし て利用可能であって、アルブミンは現在、例えば赤血球保存剤、非経口用コロイ ド溶液として、生体適合物質、生物適合性表面コーティングなどで、さらに酸化 防止適用で、例えば移植用臓器および輸血用赤血球の保存で用いられる例えば細 胞保存化合物を含め慣用的に使用されている。 アルブミンは血漿から得られるかまたは、組換え遺伝子手段により製造され得 る。ＨＳＡは、モノマー（正常血漿形態）、ホモダイマー、オリゴマーおよび集 合体（微小球およびアルブミン微泡沫）を含む様々な形態で使用され得る。さら に、アルブミンをポリエチレングリコールで処理することにより、その免疫原性 を減らすことができる。ニトロキシドによるアルブミンの特異標識は、タンパク 質上の関連部位に対する結合特異性を有するニトロキシド化合物の活性化誘導体 を用いることにより、ビリルビン、ＦＦＡ、インドールまたはＣｕ++結合部位を 含む幾つかの部位で達成され得る。好ましい例は、ＨＳＡの一次ビリルビン結合 部位に共有結合した２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジ リデンスクシネート（ＴＯＰＳ）ニトロキシドである。アルブミンの非特異的標 識は、約５０以下の利用可能なアミノ基で達成され得る。アルブミンの温度およ び化学的処理により、ニトロキシド対アルブミンのモル比が高められ得る。天然 アルブミンを用いると、７より大かつ６０以下のモル比も達成され得る。６０モ ル以下のニトロキシド標識アルブミンを用いると、追加のニトロキシドでアルブ ミンの３５の可能なスルフヒドリル基を標識することにより、９５以下のニトロ キシド対アルブミンのモル比が達成され得る。それらの共有結合標識ニトロキシ ドは、分子量５０００〜７０００のジニトロキシド、トリニトロキシドまたはポ リニトロキシドカルボキシルコポリマーとして結合される。すなわち、ニトロキ シド対アルブミンのモル比は、約４００に高められ得、ここに開示された標識ス トラテジーにより改変され、４００以下の値の整数値または範囲に達し得る。 インビボでの活性ニトロキシドの再生を立証するため、燐酸緩衝食塩水中４− ヒドロキシ−２,２,６,６−テトラメチル−ピペリジン−Ｎ−オキシル（Ｎ−Ｔ ＰＬ）を、対照として麻酔したマウス（体重４０ｇ）の尾部静脈中に注射した。 尾の先を、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光計の試料管中に挿入した。マウスの尾 は、注射前にはｅｓｒシグナルを全く示さなかった。０.５ｍｌの６ミリモルＴ ＥＭＰＯＬを注射した後、３０秒間隔でのスペクトルの３連続スキャンで見えた ところによると（図１８Ａ参照）、ｅｓｒシグナルが検出され、急速に減少する のが観察された。この結果は、ＴＥＭＰＯＬが、そのｅｓｒ−サイレントおよび 触媒反応不活性のＮ−ヒドロキシルアミン（Ｒ−ＮＯＨ）誘導体（ＴＥＭＰＯＬ −ＨまたはＴＰＨ）に還元されたことを示している。マウス尾部におけるＴＥＭ ＰＯＬの血漿半減期を測定するため、高フィールドピークの強度を８分間連続モ ニターした（図１９）。８分後、ＴＥＭＰＯＬの反復注射を行った。マウス尾部 においてＴＥＭＰＯＬ（ＴＰＬ）濃度に対応する最大ピーク強度が約１０秒で得 られた後、基準線まで急速に減少し、結果としてＴＰＬのインビボ半減期は約５ ０秒であった（図１９）。次の２つの記録方法によりＴＰＬの半減期を確認した 。すなわち、適当に間隔をおいた全スペクトルでのスキャンおよび高フィールド ピーク強度の連続記録である。両方法からの結果は一致した。 ポリニトロキシドアルブミン（ＰＮＡ）を製造するため、ひと血清アルブミン （ＨＳＡ、５％溶液、バクスター・ヘルスケア・コーポレイテッド）を、６０℃ で１０時間６０モル当量のＢｒ−ＴＥＭＰＯ（シグマ）と混合しながら反応させ た。バキュテーナー管中生成した１５ｍｌのＨＳＡおよび１６５ｍｇのＢｒ−Ｔ ＥＭＰＯを含む反応混合物を、０.２２ミクロンフィルターにより滅菌濾過し、 １０ｋｄａカットオフ限外濾過膜を備えた１５０ｍｌ撹拌セル（撹拌セル装置） （フィルトロン・テクノロジー・コーポレイテッド）中に移した。ｅｓｒ分光器 の使用による検出で濾液の含む遊離Ｂｒ−ＴＥＭＰＯが１マイクロモル未満にな るまで、濾過した反応混合物をリンガー溶液（マックゴー・インコーポレイテッ ド）で洗浄した。明オレンジ色保持物質を２５％ＨＳＡに濃縮し、再び０.２２ ミクロンフィルターにより１０ｍｌ滅菌ガラス瓶（アボット・ラボラトリーズ） 中へ滅菌濾過し、使用時まで４℃で貯蔵した。高分子量ポリニトロキシドのｅｓ ｒスペクトルは、図１５Ｃに示されている。 ポリニトロキシドアルブミンにおけるニトロキシドのモル比を高めるため、尿 素の存在下でジスルフィド基をチオグリコール酸（thioghycolate）ナトリウム に還元し、過剰のＢＲ−ＴＥＭＰＯを加えて崩壊されたジスルフィド結合を標識 した。この方法によると、約１０のモル比における平均増加が達成され、チャン らにより“Potential of Alubumin Labeled with Nitroxides as a Contrast Ag ent for Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy”、Bioconjugate Chem istry、１９９０、第１巻、３２−３６頁に記載された方法の場合と類似してい る。 ポリニトロキシドアルブミン溶液の濃度をフラスコ中で１７.５ｍｇ／ｍｌに 調節する。この溶液を尿素で８モルに希釈し、溶解するまで撹拌する。２％炭酸 ナトリウムを加えることにより、ｐＨを８.２に調節する。ｐＨ−調節溶液を１ ５分間完全に脱気し、次いでアルゴンガスでフラッシュする。別のフラスコでは 、チオグリコレートの３モル溶液を製造し、脱気し、アルゴンガスでフラッシュ する。チオグリコレート溶液をポリニトロキシドアルブミンに加えて最終濃度を ０.３モルとする。 生成した溶液を脱気し、アルゴンガスでフラッシュして混合し、アルゴンガス 下室温で２０時間暗所で放置した後、アルゴンガス下室温で５時間３リットルの 燐酸緩衝食塩水ｐＨ８.４（２％炭酸ナトリウムにより調節）に対して透析する 。過剰のＢｒ−ｔｅｍｐｏを加え、混合物をアルゴンガス下さらに２４時間室温 で撹拌する。 最終溶液をＰＢＳ（ｐＨ７.４）に対して５時間透析し、未反応のニトロキシ ドを除去する。ＥＰＲ分光器を用いることにより、スピン密度が測定され得、ビ ウレット法によりタンパク質濃度が測定され得る。 ３ロットの平均について典型的結果を下記に示す。 １．タンパク質濃度： アミノ基標識ポリニトロキシドアルブミン ５３.０ｍｇ／ｍｌ＝０.７８ミリモル アミノ＋ジスルフィド １３.９ｍｇ／ｍｌ＝０.２０ミリモル ２．スピン密度： アミノ基標識ポリニトロキシドアルブミン（ＰＮＡ） ３３ミリモル アミノ＋ジスルフィド １０.５ミリモル ３．タンパク質に結合したニトロキシドのモル比の計算。 アミノ基標識ポリニトロキシドアルブミン ３３ミリモル／０.７８ミリモル＝４２ニトロキシド／アルブミンアミ ノ＋ジスルフィド １０.５ミリモル／０.２０ミリモル＝５２ニトロキシド／アルブミン この実施例において、ジスルフィド基の還元により、ニトロキシド対アルブミ ンのモル比は１０倍増加した。 ここに記載されたＰＮＡの実例の製造に使用され、本発明のポリニトロオキシ ル化生体適合性分子の治療的、診断的および機能的有用性を立証する実施例で使 用された方法は、容易に他の化合物、例えばポリニトロオキシル化ＨＢＯＣ（ま たはＰＮＨ）、ポリニトロオキシル化デキストラン（ＰＮＤ）および多数の追加 的ＰＮＡ製剤の製造にも適用され得、それらは、ニトロキシドの種類、アルブミ ンタンパク質における利用可能な基の構造、タンパク質濃度、スピン密度および 結合パーセンテージを示す下記図表に示されている。 上記のポリニトロキシド−標識アルブミン製剤が、低分子量膜透過性ニトロキ シドのインビボ活性を高める働きを有することを立証するため、ひと血清アルブ ミンを、４−（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯ（ＢＲ−ＴＥＭＰＯ）に より共有結合的に標識し、１用量のＴＥＭＰＯＬが投与され、その還元状態に変 換されたことが観察された後に注射した。 上記実施例と同様ＴＥＭＰＯＬ注射の２時間後、マウス尾部からは検出可能な ｅｓｒシグナルは全く現れなかった。０.２ｍｌのポリニトロキシドアルブミン を尾部静脈から注射すると、ＴＥＭＰＯＬシグナルが４分以内に再び現れた。Ｔ ＥＭＰＯＬシグナル強度は２時間より長期間持続し、半減期は約４０分であった （図１８も参照）。ＴＥＭＰＯＬシグナルは、それらの特有なスペクトルプロフ ィールによってポリニトロキシドアルブミンシグナルとは区別された。その特徴 的高フィールドピークの強度としてＴＥＭＰＯＬシグナルを測定した。２７のニ トロキシド対アルブミンのモル比の場合、同じ反応性を示す。 ポリニトロキシドアルブミン注射後に検出されたｅｓｒシグナルが、単に高分 子から解離された高分子のニトロキシドに起因するものであるという可能性は、 次の実験により除外された。この実験は上記要領で遂行されたが、ただし、［15 Ｎ］−ＴＥＭＰＯＬおよびアルブミン−［14Ｎ］−ＴＥＭＰＯＬを使用した。異 なる種類の窒素化合物により、遊離および高分子ニトロキシドのｅｓｒシグナル を区別する方法が提供される。得られた結果（図１８Ａ）からは、再生ニトロキ シドからのｅｓｒシグナルが、15Ｎ同位体から誘導されること、従って、低分子 量膜透過性［15Ｎ］−ＴＥＭＰＯＬの抗酸化活性が高分子ニトロキシドを加えた 後に再生されたことが確認される。 ここに示されたところによると、２種のニトロキシドを含む物質の間における ドナー／アクセプター関係から、インビボでの持続的ニトロキシド防御能力が得 られる。態様の幾つかにより記載されているＰＮＡおよびＴＰＬの相互作用は、 本発明により提供される追加的組み合わせの唯一の例である。図１８Ｂ（１）、 （２）および（３）に関して述べると、ポリニトロキシル化アルブミン（ＰＮＡ ）は、ＴＯＰＳを活性化することが示されている。５０ミリモルＴＯＰＳ単独（ 図 １８Ｂ（１））および４３ミリモルＰＮＡ単独（図１８Ｂ（２））のＥＳＲスペ クトルは、比較的低いピーク強度を表しており、燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７ .８）中でのＴＯＰＳとＰＮＡの組み合わせは、かなり大きいピーク強度を示す （図１８Ｂ（３））。同様に、図１８Ｃでは、ポリニトロキシル化ＨＢＯＣが、 ＴＯＰＳを活性化することが示されており、図１８Ｄでは、Ｂ３Ｔ標識アルブミ ンがＴＯＰＳを活性化することが示されている。すなわち、本明細書の他の場合 について示されているとおり、多重成分を含む態様は、異なる遊離電子安定性を もつ異なるニトロキシドまたはニトロキシド基剤の化合物により製剤化され得る 。 実施例７ ニトロキシド標識免疫グロブリン 上記態様の場合と同様、ある種のニトロキシドは、静脈内注射されたとき血漿 半減期が非常に短くなることが示された。血漿半減期が長い抗酸化酵素様活性を 有することが要望されることから、ニトロキシド化合物を免疫グロブリンに結合 すると、持続時間の長い抗酸化酵素様活性が獲得され得る。 免疫グロブリンは、免疫系のＢ細胞で産生され、２つの特異的リガンド結合部 位（抗原結合部位）を特徴とする一種の血漿タンパク質である。ニトロキシドは 、過去に一次および二次免疫応答中における免疫グロブリンのハプテン結合特異 性および親和力に関する研究でプローブとして使用されたことがある。 ニトロキシド標識アルブミンについて記載している上記態様の場合と同様、上 記ニトロキシド−ＨＢＯＣの例で立証されているニトロキシド標識技術は、ニト ロキシド標識免疫グロブリンの製造に容易に適用される。免疫グロブリンにより 特異的結合性および長い循環半減期という利点が得られることから、本発明の化 合物の酵素様活性は、特定組織にとっての標的とされ、長い活性を呈し得る。 ニトロキシド標識免疫グロブリンはインビボで使用されると、反応性酸素物質 による細胞損傷に対して防御作用を呈し得る。ニトロキシド標識免疫グロブリン は、単独または低分子量ニトロキシド化合物を組み合わせて使用されると、血漿 半減期が延長された長い抗酸化活性を付与し得る。 ニトロキシド標識免疫グロブリンは、免疫グロブリン自体を特異標識するか、 またはハプテン結合部位を共有結合的に標識することにより製造され得る。人体 の自然な免疫応答の一部としてのニトロキシド標識免疫グロブリンの浄化を回避 するため、非特異的標識法による公知技術に従って免疫グロブリンを開裂するこ とにより生成される免疫グロブリンフラグメント、例えば（Ｆａｂ）2が使用さ れ得、この場合ニトロキシド：免疫グロブリンの好ましいモル比は６０：１以下 である。 ニトロキシド標識免疫グロブリンは、特定位置の酵素様作用を標的とするのに 使用される好ましい物質である。例えば炎症または他の病状に関与する抗原に特 異的な抗体を選択することによる場合がある。本発明のイメージ強調および治療 上の有益性は特定部位を標的として付与され得る。 実施例８ ＥＰＲによる生物学的構造および遊離基反応のイメージ化 たいていの環境下では、遊離基反応は非常に急速に行われるためＥＰＲイメー ジ診断（ＥＲＩ）は困難である。しかしながら、安定した遊離基が存在すること から、ニトロキシドは電子常磁性共鳴分光法により検出され得る。進歩したイメ ージ診断機器の開発により、無傷の生体組織および器官のイメージが遊離基濃度 の測定値に基づいて入手され得る。生体適合性ニトロキシドは、イメージ強調薬 剤の候補である。 ニトロキシドは投与の数分以内にインビボで不活性誘導体に還元されるため、 それらの効果は制限される。本発明によると、活性ニトロキシドの体内レベルが 長期間維持され得るため、低分子量膜透過性ニトロキシド単独で見られる場合よ りもイメージのコントラストは改善され、シグナル持続性は長くなり得る。 電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法は、磁場の存在下で不対電子のエネルギー状 態の変化を検出することにより遊離基の動きを観察する技術である。不対電子の み検出されるため、この技術は遊離基に特異的である。電子常磁性共鳴を測定す る入手可能な装置を用いると、生体組織を含め肉眼的対象の即時イメージが得ら れる。ＥＰＲイメージ診断（ＥＲＩ）により、診断または研究を目的とした多次 元イメージ（スペクトル−空間的イメージを含む）を入手できる可能性が提供さ れる。 ニトロキシド造影（コントラスト）剤による電子常磁性共鳴イメージ診断（Ｅ ＲＩ）は、原則として医学的イメージ診断、特に虚血組織のイメージ診断に関す る貴重な方法である。しかしながら、この技術の開発は、ニトロキシドがインビ ボで非常磁性の物質に急速に還元されるという事実により制限されてきた。 外部から導入されたニトロキシドに関する適用性は、比較的低い解像能のイン ビボＥＰＲ造影剤としての有用性を立証してきた。（L.J．Berliner，“Applica tions of In Vivo EPR,”pp.292-304、EPR IMAGING AND IN VIVO EPR中，G.R．E aton，S.S．Eaton，K．Ohno，編集者；CRC Press(1991)）。重要なことに、サブ ラメイニヤンおよび彼の協力者らは、遊離基に類する物質を検出し、インビボイ メージ診断するための放射線振動数フーリエ交換ＥＰＲ分光計を構築した。J.Bo urg et al.，J.Mag.Res.B102,112-115(1993)。 本発明に従い製造されたポリニトロキシドアルブミン（ＰＮＡ）は、投与され ると、血管および他の細胞外空間に分布される。本発明の組成物の濃度範囲は変 動し得るが、好ましい範囲は、１デシリットル当たり５−２５ｇの標識ＰＮＡお よび０.１〜２００ミリモルのＴＥＭＰＯＬである。抗酸化活性および電子常磁 性共鳴（ＥＰＲ）分光法による検出可能性はこの目的のみにとっても有用である 。さらに、適度の用量の小分子量膜透過性ニトロキシドを投与すると、ニトロキ シドは体内で長期間活性遊離基状態で維持される。 ＥＲＩイメージ診断に好ましい製剤は、高モル比のニトロキシド（７〜９５ニ トロキシド対アルブミン）で共有結合的に標識されたひと血清アルブミン（１. ０〜２５.０ｇ／ｄｌ）である。本明細書の他の場所に示されているとおり、ポ リニトロキシドアルブミン（ＰＮＡ）は、ニトロキシドのヒドロキシルアミン形 態（例、ＴＰＨ）から不対電子を受け入れ、ニトロキシドの活性をその遊離基状 態（例、ＴＰＬ）に再生させ得る。この多重成分システムの根本的利点は、高分 子またはそれに類する物質が細胞外空間に残存している間、小さな膜透過性ニト ロキシドおよびその還元（ヒドロキシルアミン）誘導体が、細胞内および細胞外 空間の間で自由に分布することである。これにより、ニトロキシド遊離基が還元 される前に細胞内で検出され、次いで高分子（細胞外）に類する物質により再生 され得る周期が作り出される。すなわち、所望の濃度の分光器により検出可能な ニトロキシドが長期間にわたってインビボで維持され得る。 インビボでのニトロキシドの短い半減期を延長することは、ニトロキシドに基 づくイメージ診断方法および医学的治療の開発における主たる障害を克服する上 で助けとなる。イメージ診断に関しては、ジョーンズ・ホプキンス大学のＥＰＲ 研究室が、造影剤としてニトロキシドを利用する連続波ＥＲＩ器械を開発し、心 臓虚血および再潅流の経過について試験してきた。しかしながら、ニトロキシド 単独の場合半減期が制限されるということは、再潅流相については試験され得な いということを意味している。これらの試験では、ラット心臓におけるニトロキ シドの３次元スペクトル−空間的ＥＰＲイメージ診断には、ニトロキシドの還元 に起因する遊離基シグナルの急速な減少という欠点が伴う。ラット心臓の断面横 断２−Ｄ空間ＥＰＲイメージは３−Ｄスペクトル−空間データから再構築された が、これは、１２分の捕捉期間中連続的に減少しているＥＰＲシグナルに基づい ていた。虚血の持続時間の関数として、心外膜、中心筋（midmyocardium）およ び心内膜におけるニトロキシド還元の速度が異なるため、心臓の断面イメージの 鮮明度もさらに低下する。本発明に従うと、ＥＲＩイメージは改善され得る。イ ンビボニトロキシドの活性半減期が延長されたため、再潅流相のイメージ診断も 可能となり、組織および器官への虚血損傷の進行に関する追加的情報も提供され る。本発明の組成物により、投与後１０分以内でのイメージ診断に適した安定し たニトロキシドシグナルが提供され、少なくとも２.０時間は持続する（図２５ 参照）。比較すると、遊離ニトロキシド単独からのシグナルは、投与後２０分以 内に実際上消失する（図２４）。治療的有用性に関して述べると、長い期間活性 ニトロキシドレベルが安全に維持され得るということは、虚血／再潅流損傷、す なわち毒性酸素誘導遊離基が細胞損傷の源である病的プロセスを阻止する上で有 用な長期の抗酸化作用が提供され得ることを示している（図２６および図２７参 照）。 本質的にKuppusamy et al．Proc．Natl．Act．Sci.，USA Vol.91，3388-3392 頁(1994)に記載された方法を用いると、ラット心臓は、４ｇアルブミン／ｄｌお よび２ミリモル15Ｎ−ＴＥＭＰＯＬ濃度でのポリニトロキシドアルブミン（ＰＮ Ａ）を用いてイメージ診断された。 図２４に関して述べると、ポリニトロキシドアルブミンの存在下における15Ｎ −ＴＥＭＰＯＬのシグナル強度は、摘出ラット心臓で見いだされ得る。ＥＰＲシ グナルは安定しており、強度が２相性で徐々に減衰していた。これは、低分子量 膜透過性ニトロキシド（ＴＰＬ）単独を用いた場合におけるシグナル強度の２相 性の急速な減衰とは対照的である（図２４）。 ＥＰＲイメージ診断試験では、ラット心臓をポリニトロキシドアルブミン含有 または不含有のニトロキシド含有溶液により潅流した後、潅流液の流れを止める ことにより虚血を誘発した。図２４は、ポリニトロキシドアルブミンの存在また は非存在下での虚血中の摘出ラット心臓における［15Ｎ］−ＴＥＭＰＯＬの全シ グナル強度を示す。シグナル強度に見られる減衰は２相性であり、ポリニトロキ シドアルブミンの存在は減衰を非常に緩慢にすることがわかる。すなわちＴＥＭ ＰＯＬシグナルを安定化させることにより、ポリニトロキシドアルブミンは、長 期間にわたって高品質ＥＰＲイメージを供することを可能にする。図２２−２３ に関して述べると、虚血心臓の３次元ＥＰＲイメージは全体的虚血の１５６分後 でもまだ得られる。図２２Ａはイメージを分断して見たところを示す。図２３で 説明されているとおり、３次元イメージはまた断面から見ることもできる。これ は、虚血心臓内におけるＴＥＭＰＯＬシグナルの分布差異を示す。これは図２８ で数量化されている。図２５は、１２５分の全体的虚血中における一連の継続的 特定時点で得られた、例えば図２３における一連のイメージを示す。これは、Ｐ ＮＡが存在すると、解像能およびシグナル持続性の両方の点で、ＴＥＭＰＯＬ単 独で可能となるものよりもかなり優れたイメージ診断が行えることを説明してい る。 本発明の特別な利点は、興味の対象である構造において選択的に分布される組 成物を選択することにより、および／または特定構造または系のイメージ向上を 助長する投与手段を選択することによりイメージ向上を局在化し得ることである 。 例えば、心臓血管系のイメージは、長い血漿半減期を有するポリニトロキシド高 分子の静脈内注入および好ましくは低分子量膜透過性ニトロキシドの静脈内注入 により高められ得る。別法として、胃腸管内のイメージを向上させるために、こ れらの化合物の一つは経口投与され得る。同様に、皮膚の別々の領域のイメージ は、追加のニトロキシドに類する物質の経口または静脈内投与と組み合わせて、 適当な担体に懸濁したポリニトロキシド高分子を局所投与することにより改善さ れ得る。別法として、適用法により異なるが、本発明による多重ニトロキシド基 剤組成物は皮膚投与され得る。 実施例９ 放射線防護 電離放射線に曝されている生活有機体は、高放射線量により致命的となり得る 有害な影響を被る。最近の証拠によると、放射線がＤＮＡへの損傷による細胞傷 害を誘発することが示されている。ＤＮＡへの全損傷のうち、８０％ほどが放射 線誘発による水誘導遊離基および二次炭素主成分基から生じ得る。国防総省は、 インビボ放射線防護剤を求めて４００００のアミノチオール化合物についてスク リーニングした。一薬剤（ＷＲ−２７２１）が選択的放射線防護作用を示したが 、ＷＲ−２７２１はひと臨床試験では放射線防護作用を呈し得なかった。ニトロ キシド化合物（例、ＴＰＬ）は、非チオール放射線防護剤であったが、ここに示 されているとおり、（ＴＰＬ）はインビボ半減期が非常に短い。他の化合物は、 天然起源の高分子（超酸化物不均化酵素ＩＬ−１およびＧＭ−ＣＳＦ）であった 。しかしながら、それらの分子サイズ故に、これらの各々が有する、細胞内遊離 基を化学的に除去する能力は制限されている。 ナショナル・キャンサー・インスティテュートは、癌患者の放射線治療の線量 レベルを高くできるように放射線防護剤としてのニトロキシド化合物Ｔｅｍｐｏ ｌの使用を試みた。研究者らは、低分子量ニトロキシドが急速に不活性形態に還 元され、安全な用量では投与され得ないことをすぐに見いだした。 本明細書に開示された発明に基づき、酵素様物質として高分子化合物に結合し たニトロキシドを低分子量ニトロキシドと一緒に使用すると、膜透過性ニトロキ シド化合物との相互作用によって細胞内の遊離基が解毒されることにより血管空 間における酸素基が解毒され得る。本発明により放射線防護作用の持続時間を延 ばすと、ニトロキシド化合物の使用により、医学的適用、例えば癌治療および有 害な放射線源に偶然曝された場合における制御された放射線の有害な作用に対す る防護効果が得られる。 ナショナル・キャンサー・インスティテュートにより開発された放射線量尺度 に基づき、チャイニーズハムスター細胞培養物を放射線防護化学薬剤の存在下で 電離放射線に曝す。図１６は、１２グレイの放射線でのチャイニーズ・ハムスタ ーＶ７９細胞の生存率を示す。対照、高分子結合ニトロキシド（ＰＮＡ）および 還元ニトロキシド（ＴＰＨ）の場合も似た生存率を示す。しかしながら、ＴＰＨ をＰＮＡと予め混合すると、Ｖ７９細胞の生存率を高める（図１６参照）放射線 防護性ＴＰＬ（図１７参照）に変換される。 低分子量膜透過性ニトロキシド、例えばＴＰＬは、Ｃ３Ｈマウスにおいてイン ビボ放射線防護作用を呈することが立証された。これらの試験では、腹膜内投与 されたＴＰＬの最大耐容用量は２７５ｍｇ／ｋｇであることが見いだされ、注射 の５−１０分後に全血中で最大ＴＰＬレベル（〜１５０μｇ／ｍｌ）となった。 マウスを、投与の５−１０分後ＴＰＬ（２７５ｍｇ／ｋｇ）の非存在または存在 下で全身放射線に曝した。３０日以内にＴＰＬ処理マウスの５０％が死ぬ放射線 量は、９.９７グレイであり、それに対して対照マウスの場合は７.８４グレイで あった。 ＴＰＬの放射線防護効果は不対電子の反応性から誘導されるため、ＴＰＬがそ の不対電子を失うことによりヒドロキシルアミンに還元されると、それは不活性 になる。本発明による有効な放射線防護剤は、活性（遊離基）状態にあるＴＰＬ の治療濃度をインビボで維持することから、ＴＰＬが単独投与された場合治療レ ベルの維持に要求される用量は高く、有毒であるという事実は克服される。 図１９は、２７５ｍｇ／ｋｇのＴＰＬ（◇）の腹膜内注射、静脈内投与による ２ミリモルＴＰＬ単独（□）、およびＴＰＨ１００ｍｇ／ｋｇ＋ＰＮＡ１ｍｌ（ ○）投与後のＴＰＬの最大血漿レベルを示す。結果は、ＴＰＬの最大血漿レベル が、 ＰＮＡ（２０ｇ／ｄｌのアルブミン濃度で０.５ｍｌ／マウスおよびアルブミン １モル当たり４２モルＴＰＬ）の存在下約１００ｍｇ／ｋｇのＴＥＭＰＯＬの腹 膜内注射後に観察されるレベルの約５分の１であることを示している。従って、 ＴＰＬの血漿レベルは、ＰＮＡの存在下では１０倍より大きく高められる。この 高められたＰＴＬ血漿レベルは、細胞および核レベルで放射線防護に関与するＴ ＰＬの細胞内レベルに影響する。 この高められた防護能は、マウスでの３０日生存モデルに基づいた全身放射線 で立証されている。図２０は、一定ＴＰＬ濃度（２００ｍｇ／ｋｇ）でＰＮＡを 加えることによる放射線防護能の向上を示す。 結果は、ＰＮＡの存在下におけるＴＰＬが十分な放射線防護作用を有すること を示している。ＴＰＬ単独の場合の１０匹中１匹（１０％）と比べて、１０匹中 ８匹（８０％）のマウスが１０グレイの致死放射線にもかかわらず生きていた。 ＴＰＬ非使用またはＰＮＡ単独による対照実験では、全マウスが１５日前後に死 ぬ。従って、膜不透過性ＰＮＡは、放射線防護効果を全く示さず、細胞内レベル での放射線損傷に対しても防護しない。 図２１に関して述べると、実験データは、ＰＮＡによって、ＴＰＬ用量を低減 化しても同様の放射線防護効果が得られることを示している。この実験では、Ｐ ＮＡ（０.５ｍｌ／マウス）を単独で使用した場合、１０匹の全マウスが１５日 目に死んだ。図２０で使用されたＴＰＬの用量の４分の１で、ＴＰＬ濃度は２０ ０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇに減らされ、ＰＮＡの存在により致命的放射線 （１０グレイ）から１０匹中２匹のマウスを防護することができた。これらの結 果は、ＰＮＡを用いることにより、同じかまたはそれより優れた放射線防護効果 を獲得するのに４の係数でＴＰＬの用量を低減化し得ることを証明している。 全身的または身体局所的放射線防護効果をもたらし得ることから、本発明の組 成物の使用は、治療的放射線処置を受けている患者を防護する上で特に有益であ る。例えば、膜透過性ニトロキシドの全身または局在的局所投与を、放射線フラ ックスが体内に入る部位におけるポリニトロキシドアルブミンの局所投与と組み 合わせることができる。 一特定適用では、ポリニトロキシドアルブミン含有局所用軟膏を、頭蓋腫瘍の 処置を受けている患者の頭皮に適用する。それと同時に、膜透過性ニトロキシド を、例えば局所用軟膏での懸濁液を含む適当な手段により投与する。放射線量を 適用するとき、皮膚および毛包は、完全な有害線から防護され、酸素担体の代謝 に伴う酸化的ストレスは緩和される。ニトロキシド含有化合物から誘導される上 記活性の生物学的効果には、酸化的ストレスを減らすことによる反応性酸素類の 細胞傷害性に対する保護作用への寄与が含まれる。ニトロキシドは、本発明に従 いインビボ投与されると、追加の複雑な抗酸化性酵素様活性を示す。 上記で示された通り、静脈内投与されると、ＴＥＭＰＯＬは、非常に短い血漿 半減期を有することが示された。その分子サイズおよび電荷特性故に、それは血 管空間から容易に離れる。多くの医学適用において、血管空間に存続する酵素様 活性を有するのが望ましい場合が有り得る。これは、本発明に従い、ニトロキシ ド化合物を、生物学的に安全で望ましい血漿半減期を有する高分子、例えばヘモ グロビンおよびアルブミンに結合することにより達成される。 遊離基状態での膜透過性ニトロキシド、例えばＴＰＬは、インビボおよびイン ビトロの両方で酵素様活性を有することが示された。しかしながら、インビボ、 主として細胞内空間では、それは、生体還元剤、例えばＮＡＤＨによりその不活 性ヒドロキシルアミン誘導体（ＴＰＨ）へ急速に還元される。以前には、活性Ｔ ＰＬから不活性ＴＰＨへの還元は、化学量論に基づくと本質的に不可逆的であっ た。すなわち、治療および診断手段としてのその有効性は限定されている。 本発明によると、多重成分ニトロキシド含有組成物は、第１成分として、ＴＰ Ｌ（活性）およびＴＰＨ（不活性）間における動的平衡状態で存在する膜透過性 ニトロキシドを有する。 インビボでは、不活性ＴＰＨが優勢である（＞９０％）。両物質の分子（ＴＰ ＬおよびＴＰＨ）は、容易に細胞膜を横切り、細胞内および細胞外空間中へ分布 する。 第２成分は、細胞外空間、主として血管空間に分布する膜不透過性高分子ポリ ニトロキシドである。第１および第２成分は、インビボで以前には知られていな かった別の酵素疑似機能、すなわち合成還元ニトロキシドオキシダーゼの疑似機 能を呈する。例えば、多重成分系の一部としてここに記載されているポリニトロ キシドアルブミンは、スピン転移反応を介してＴＰＨおよびＴＰＬを酸化するこ とにより還元ニトロキシドオキシダーゼとして作用する。すなわち、高分子ニト ロキシドアルブミンは、細胞内外の両空間において〜９０％ＴＰＬ以下にＴＰＬ ／ＴＰＨ平衡をシフトする模擬的酵素として機能する。放射線、虚血などからの 必要レベルの防護能を得るのに必要な高用量のＴＰＬが、細胞の酸化還元機構を 圧倒することにより細胞にとって有害となる場合、この酵素様機能は特に有用で ある。 例えば、１線量のγ放射線の例では、線量が高くなると、有効な放射線防護効 果を与えるのに必要な低分子量膜透過性ニトロキシドの量も非常に増大し得るた め、細胞レドックス状態が崩壊されることにより、傷害性が誘発される。 傷害性誘発という障害を克服するため、本発明の多重成分系は、還元ＴＰＨを ＴＰＬに再生させる。この系は、活性ニトロキシドがインビボで望ましい場合で あればいずれの適応法にも使用され得る。 ＴＰＬ、ＴＰＨおよびポリニトロキシドアルブミンのＥＰＲスペクトルは、各 々図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃに示されている。還元ニトロキシドオキシダー ゼ活性の証拠は、ＴＰＨ（ＥＰＲサイレント図１５Ｂ）から高分子ポリニトロキ シド（図１５Ｃ）への再酸化（スピン転移）により示されており、ＴＰＬ（ＥＰ Ｒ活性）（図１５Ａ）へのその変換は次の要領で行われる。すなわち、（１）当 モル比のＴＰＨと高分子ポリニトロキシドを室温で３０分間インキュベーション する、（２）反応混合物を１０ｋｄカットオフ膜により遠心分離する、および（ ３）濾液のＥＰＲスペクトルは記録され、図１５Ｂに示されている。ＴＰＨから Ｔ ＰＬへの定量的変換は、図１７に示されている。 合成還元ニトロキシドオキシダーゼ（ポリニトロキシドアルブミン）は、ひと 血清アルブミン（ＨＳＡ）２５％バクスター・ヘルスケア）を４０モル当量の４ −（２−ブロモアセトアミド）−ＴＥＭＰＯまたはＢｒ−ＴＥＭＰＯと１０時間 ６０℃で混合しながら反応させることにより製造される。バキュテーナー管中１ ５ｍｌのＨＳＡおよび１６５ｍｇまたはＢｒ−ＴＥＭＰＯを含む、生成した混合 物を、０.２２ミクロンフィルターで滅菌し、１０ｋｄカットオフ膜を備えた１ ５０ｍｌ撹拌セル（フィルトロン・テクノロジー・コーポレイテッド）中に移す 。反応混合物を濾過し、ＥＳＲ分光器により検出される濾液が含む遊離ＴＥＭＰ Ｏが１マイクロモル未満になるまでリンガー溶液で洗浄する。明オレンジ色に着 色した保持物質（retenate）を２５％ＨＳＡに濃縮し、１０ｍｌガラス瓶中へ再 滅菌濾過し、使用時まで４℃で貯蔵する。ＴＰＨからＴＰＬへのインビボ酵素様 変換を立証するため、ＴＰＬの15Ｎ安定同位元素類似体を、カニューレ挿入マウ スの尾部静脈に注射し、ＥＰＲシグナルを尾部で直接モニターする。麻酔したマ ウスにおける０.５ｍｌのＴＰＬ（４０ミリモル）溶液の直接静脈注射により、 ＴＰＬの血漿半減期が約２分であることが証明される。図１８に関して述べると 、高分子ポリニトロキシドおよび安定同位元素15Ｎ ＴＰＬを含む混合物の追続 注射（〜３０分後）を行ったため、15Ｎ ＴＰＬのピーク強度における２相性変 化が存在する。最初、15Ｎ ＴＰＬシグナル強度の減少は、血管空間からのＴＰ Ｌの拡散、次いでその細胞内還元に起因すると考えられる。この拡散速度は、図 １８における15Ｎ ＴＰＬシグナル強度のより緩慢な再現に基づくとＴＰＨから ＴＰＬへの再酸化速度よりも最初は速い。ＴＰＨからＴＰＬへの再酸化は初期拡 散／還元速度よりも緩慢であるが、それはＴＰＬの定常状態細胞内還元速度より も速い。すなわち、図１８に示されたＴＰＬシグナルの再現により、ＴＰＨから ＴＰＬへの再酸化が検出されるため、マウスにおけるインビボでの合成的に製造 された還元ニトロキシドオキシダーゼ活性が立証される。図１８Ｂ−１８Ｄも参 照。 実施例１１ 虚血および再潅流損傷--卒中での脳血管虚血 上記で示した通り、ニトロキシド含有化合物は、医学的イメージ診断で使用さ れ得る。酸素代謝および再潅流損傷に関する貴重な情報が得られるため、特に有 用な適用例は、心臓およびその他の場所における虚血組織のイメージを得る場合 である。しかしながら、インビボでの遊離ニトロキシドの急速な還元により、こ の適用例における遊離ニトロキシドの有用性は制限される。しかしながら、本発 明によると、心臓における虚血組織を空間的に分割し、心筋虚血の発生状況をモ ニターし、心筋再潅流相の発生結果を試験し、組織または器官の低酸素状態を同 時に観察することは可能である。図２２、２３および２５に関して述べると、15 Ｎ−ＴＥＭＰＯＬおよびポリニトロキシドアルブミンを注入した摘出ラット心臓 のＥＲＩイメージが示されている。 図２４では、ＥＰＲシグナルの強度が虚血の持続時間の関数として示されてい る。下方の曲線では、２ミリモルのＴＥＭＰＯＬを虚血心臓に注入している。上 部曲線は、ポリニトロキシドアルブミンと一緒の場合の２ミリモルＴＥＭＰＯＬ （アルブミン１モル当たり４２モルのＴＥＭＰＯＬで４ｇ／ｄｌのアルブミン） の本来の強度を追跡している。データは、本発明の組成物をしようすると、シグ ナル強度がかなり大きく、かつ維持されていることを証明している。図２５は、 ３−Ｄ空間イメージからの虚血組織におけるイメージ診断の実行可能性を示す。 イメージの経過は、約１２５分間にわたる虚血の進行を追跡している。 診断有用性を証明することに加えて、ポリニトロキシドアルブミンおよびＴＥ ＭＰＯＬの組み合わせは、虚血再潅流損傷から心臓を保護する。図２６は、ニト ロキシドのみをＰＮＡと組み合わせても、冠状動脈流の回復は影響されないこと を示している。しかしながら、図２７は、両方の存在下では、３０分の全体的虚 血、次いで４５分の血液流動後にＲＰＰ（速度加圧産物、rate pressure produc t）の回復の実質的な改善が観察されるのみであることを示している。さらに、 虚血／再潅流損傷の結果としての心臓浮腫が予防された。 図１５に関して述べると、虚血心臓の様々な解剖領域における15Ｎ−ＴＰＬ濃 度は、１００分にわたる虚血の間中高められている。ＴＰＬ組織濃度の上昇は、 ＰＮＡによる心臓機能（図２７）の保護に有利にはたらき得る。 ＰＮＡによって脳および中枢神経系並びに心臓および心臓血管系における虚血 ／再潅流損傷からの保護作用が与えられることを立証するため（上記の通り）、 ３カ月令で体重３５−４０ｇのＣＤ−１マウスに、３０％酸素／７０％一酸化二 窒素の連続気流中１.５％イソフルランによる麻酔をかけた。動物を、同側共通 頚動脈（ＣＣＡ）を閉鎖するヤングらの方法（Stroke 25: 165-170,1994）によ り中間脳動脈（ＭＣＡ）閉鎖および再潅流に付した。ＭＣＡ閉鎖のちょうど１時 間前（前虚血群）または１時間の虚血後の再潅流直後（再潅流後群）に、ＰＮＡ またはひと血清アルブミンの対照溶液を静脈内注射した。用量は体重の０.５％ （ｖ／ｗ）であった。手術中体温を３６.５−３７.５℃の範囲内に維持した。平 均動脈圧および血中気体を４動物で測定し、有効な対照群を確保した。 再潅流の２４時間後、ベダーソンらにより記載された（Stroke 17: 472-476,1 986）神経学的欠損について動物を評価した。神経学的欠損を次の尺度により評 価した：０＋観察可能な欠損は無し、１＋右前足を伸ばせない、２＋右へ回転す る、３＋右へ倒れる、４＋自然歩行できない。神経学的評価後、動物を断頭し、 脳を迅速に摘出し、組織分析用に冷凍した。２０μｍ厚さの冠状縫合切片を脳の 前方先端部から０.５ｍｍ間隔で切断し、クレシルバイオレットで染色すること により、梗塞を評価した（ｎ＋動物）。連続切片において梗塞部の大きさ（ｍｍ2 で測定）を総和することにより、梗塞部容積を計算した。 図３０に関して述べると、虚血開始前または再潅流直後のいずれかにＰＮＡで 処置した場合、再潅流の２４時間後に測定された（ｎ＝７）神経学的欠損は顕著 に低減化されている。図３１に関して述べると、脳虚血前または再潅流直後のい ずれかにＰＮＡで処置した場合、再潅流の２４時間後に測定された梗塞容積は顕 著に減少していた。虚血開始前に処置された動物では、梗塞容積は、対照動物で の７０.３７８ｍｍ3±１２.８１２に対してＰＮＡ処置動物では６.９５６ｍｍ3 ±４.９１０であった。再潅流直後に処置された動物の場合、梗塞容積は、対照 動物での６２.６３６ｍｍ3±１２.３７２に対してＰＮＡ処置動物では１３.７１ ０ｍｍ3±６.６４４であった。 図３２および３２Ａは、梗塞容積および同側脳半球容積から計算された梗塞％ 値および梗塞領域をそれぞれ示す。ＰＮＡ前虚血処置された動物の場合、梗塞％ 値は、虚血前対照での４２.４６２％±５.００１と比べて、５.１４８％±３.２ ３７であった。再潅流直後に処置された動物の場合、これらの値はＰＮＡ処置動 物では９.２１０％±４.０８０および対照動物では３７.７８２％±８.０３０で あった（平均±ＳＥＭ、Ｎ＋７）。図３３は、虚血開始前または再潅流直後のい ずれかにＰＮＡ処置を行うと、再潅流の２４時間後に測定したところ、脳半球拡 大は顕著に低減化されたことを示している。虚血前処置された動物は本質的に全 く拡大を示さなかったが（０.０９４％±０.０９４）、虚血前対照は１３.９１ ６％±３.４９１の拡大を示した。再潅流開始時にＰＮＡで処置された動物は、 ２２.９９４％±８.５６２の対照値と比べて３.０５６％±２.０５３の拡大を示 した。 図３０−３３におけるデータは、局所脳虚血開始前または再潅流直後のいずれ かにＰＮＡで処置した場合、神経学的欠損、梗塞容積、梗塞％および脳半球拡大 により測定したところ、卒中損傷に対する統計学的に有意な保護効果が得られた ことを示している。一目瞭然であるが、神経学的欠損評価は脳浮腫および梗塞の 組織学的測定値と明確に相関していた。 血管空間において遊離基カスケードを緩和することにより機能する別の化合物 の場合と比べた、ＰＮＡにより与えられる保護効果の比較レベルを測定するため 、正常マウスにおいてＰＮＡがもたらす保護効果を、ＳＯＤ−１ Ｔｇマウスに おいて過剰発現されたＳＯＤによりもたらされる比較的高度の保護効果とを比較 する試験を行った。Chan，P.H.，C.J．Epstein，H．Kinouchi，H．Kamii，G．Ya ng, S.F．Chen，J．Gafni，およびE．Carlson(1994)。卒中および脳外傷におけ る神経保護効果の試験用モデルとしてＳＯＤ−１形質転換マウス。Ann．N.Y．Ac ad.Sci．738:93-103。Chan，P.H.，C.J．Epstein，H．Kinouchi，S．Imaizumi， E.Carlson，およびS.F．Chen(1993)。虚血性脳損傷における超酸化物不均化酵素 の役割：局所脳虚血後の形質転換マウスにおける浮腫および梗塞の縮小。Molecu lar Mechanisms of Ischemic Brain Damage，K．Kogure およびB.K．Siesjo，ed s. Amsterdam: Elsevier．pp．97-104中。Kinouchi，H.，C.J．Epstein，T．Miz ui, E．Carlson，S.F．Chen およびP.H.Chan(1991)。ＣｕＺｎスーパーオキサイド ・ディスムターゼを過剰発現する形質転換マウスにおける局所脳虚血損傷の減衰 。Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:11158-11162。Imaizumi，S.，V．Woolworth, およびR.A．Fishman(1990)。リポソーム封入スーパーオキサイド・ディスムター ゼは、ラットでの脳虚血における脳梗塞を低減化させる。Stroke 21: 1312-1317 。Liu，T.H.，J.S．Beckman，B.A．Freeman，E.L．Hogan，およびC.Y．Hsu(1989 )。ポリエチレングリコール−複合スーパーオキサイド・ディスムターゼおよび カタラーゼは、虚血性脳損傷を低減化する。Am．J．Physiol．256:H586-H593。C han, P.H.，S．Longar，およびR.A．Fishman(1987)。外傷後脳浮腫に対するリポ ソーム包括スーパーオキサイド・ディスムターゼの保護効果。Ann．Neurol．21: 540-547。体重の１％ｖ／ｗ割合のＰＮＡ（２０ｇマウスでは２００μｌ）を、 麻酔した動物に静脈内注射した。１０分後、ナイロン縫糸を用いてルミナール遮 断により、中間冠状動脈（ＭＣＡ）を閉塞させた。虚血、再潅流の１時間後、お よび再潅流の２４時間後、動物を神経学的機能について評価し、梗塞および浮腫 の組織学的測定のために殺した。図３４Ａおよび３４Ｂに関して述べると、対照 マウス処置マウスの脳から取った典型的冠状縫合切片を、虚血損傷領域は染料を 吸収しないため正常組織のみを染色するクレシルバイオレットで染色した。対照 脳は、関与した脳半球の広範囲におよぶ虚血損傷を示し、その脳半球を同じ脳の 反対側半球と比べるとかなりの浮腫が見られる。反対に、処置マウスの脳では、 関与した脳半球は正常であり、大きさ、形状および染色密度の点で反対側半球と 対称である。図３４Ｃに示されている連続切片は、典型的対照動物の脳全体にお よぶ虚血損傷の解剖学的分布、および典型的処置動物の脳の正常な様相を示す。 対照動物対ＰＮＡ処置動物における梗塞領域は図３２Ａに定量されており、この モデルではＰＮＡ処置により梗塞に対して本質的に完全な保護効果が得られるこ とを示している。下表は、処置動物における神経学的欠損、梗塞パーセント（連 続切片における梗塞領域から算出）、および脳半球拡大に関するデータを要約し ている。すなわち、ＰＮＡを注入すると、３倍過剰発現された形質転換ＳＯＤの 場合よりもかなり高度の保護効果が得られる。 また、塞栓および／または血圧低下から生じる心肺バイパスおよび他の外科的 方法が施されている外科患者における虚血損傷、およびそれに伴う後続の再潅流 損傷のかなりの発生の証拠が増加している。主たる標的臓器は、脳、心臓および 腎臓である。 外科手術／周囲手術による卒中設定における予防的治療のモデルとして、ＭＣ Ａ閉塞前および再潅流後の両方でＰＮＡをマウスに投与した。アルブミン単独で も脳虚血に対して中程度の保護作用を呈し得るため、ＰＮＡを対照としてＨＳＡ および食塩水の両方により試験した。図３５および３６に関して述べると、図３ ５の食塩水処置ラットは広範囲におよぶ梗塞を示すが、図３６のＰＮＡラットの 場合総体的に目立った梗塞は全く示さない。組織分析（図３７Ａおよび３７Ｂ） は、食塩水処置ラットが１９２±１７ｍｍ3の平均梗塞容積を有したことを示し ている。アルブミンで処置すると、８１±２６ｍｍ3の著しく小さい（ｐ＜０.０ １）平均梗塞容積が得られ、ＰＮＡで処置すると、アルブミン単独の場合の約２ 倍もの縮小が認められ、平均梗塞容積は１８±２２3であった（ｐ＜０.０５対ア ルブミン、ｐ＜０.０１対食塩水）。 ラットＭＣＡＯモデルにおける組織分析と平行して、磁気共鳴イメージ診断試 験は、ＭＣＡ閉塞開始時に存在するとき、ＰＮＡは、脳虚血中に拡散加重イメー ジ診断（ＤＷＩ）過強度の出現を遅らせることを示している（図３９）。さらに 、再潅流損傷に対してＰＮＡが呈する保護作用は、再潅流後のＤＷＩ過強度の急 速な消失により示される。 マウスにおける脳虚血に関する保護作用を立証するこれらの結果に加えて、本 発明の化合物は、卒中のラットモデルにおいて効力を示した。 図３５ａおよび３５ｂに関して述べると、規定食塩水で処置されたラット（図 ３５）およびＰＮＡで処置されたラット（図３６）の脳の典型的冠状縫合切片に おいて、食塩水群では重大な組織壊死を示し、ＰＮＡ処置群での壊死は顕著に少 ない。ラットに対し、２時間のＭＣＡ縫合閉塞、次いで２２時間の再潅流を行っ た。薬剤または食塩水を体重の１％（ｖ／ｗ）の全用量で投与（IV）し、その際 次の要領で分割した。すなわち、全用量の１／２はＭＣＡ閉塞の５分前に与えら れ、全用量の１／４は抜糸してＭＣＡを再潅流させる５分前に与えられ、全用量 の最後の１／４は再潅流の２時間後に与えられた。脳切片をＴＴＣで染色した。 図３７Ａおよび３７Ｂに関して述べると、一時的ＭＣＡ閉塞に見舞われ、食塩 水、ヒト血清アルブミン（２５ｇ／ｄｌ溶液として投与、体重の１％の全用量） またはＰＮＡで処置されたラットにおける梗塞容積および梗塞％の組織分析によ り、虚血／再潅流損傷に対する脳組織の保護効果が示される。ＰＮＡで処置され た動物は約２±３％梗塞を示し、アルブミンで処置された動物は約１１±４％梗 塞を示し、食塩水で処理された動物は約２２±４％梗塞を示した。アルブミン単 独ではＰＮＡの場合と比べて保護効果は約５０％であるという事実は、卒中治療 における血漿膨張の潜在的役割を示唆している。従って、高張食塩水にＰＮＡを 溶かすと、卒中治療におけるその効力はさらに改善され得る。この実験でアルブ ミンがかなりの保護効果を呈したという事実は、卒中治療における血漿膨張に潜 在的に有益な役割を果たしていることを示唆している。ＰＮＡがアルブミンの約 ２倍の保護作用を呈したという事実は、卒中における高張性または高浸透性療法 の効力を高める場合にポリニトロオキシル化合物が有用であり得ることを示して いる。 図３８に関して述べると、かなりの量の自然発生常磁性物質がインビボでは存 在しないため、活性ＰＮＡ結合ニトロキシドの濃度はインビボＥＰＲ分光法によ り測定され得る。この実験では、ラットにおいてＰＥ５０ポリエチレン管を用い て大腿動静脈シャントを設けた。管の一部をＥＰＲ分光計の空洞に入れることに より、シャントを通って流れる血液のスピン密度の測定をした。反対側の大腿静 脈でカテーテルによりＰＮＡを注入し、ＰＮＡ注射後の時間の関数として血液の スピン密度を測定した。標準曲線（図示せず）と比較すると、２時間間隔で３回 注射すると、ＰＮＡのＥＰＲシグナルは、５時間ニトロキシド１−６ミリモルの 範囲のレベルで血液中で維持されることが示された。 図３９に関して述べると、拡散加重磁気共鳴イメージ診断（ＤＷＩ）は、水の 見かけ上の拡散係数（ＡＤＣ）の変化を表すことが示された。卒中では、ＤＷＩ における過強度が、虚血中における脳損傷の経過の即時指標であると考えられる 。この実験では潅流加重イメージ診断（ＰＷＩ）を使用することにより、ＭＣＡ の閉塞および再潅流が確認された（イメージは示さず）。この図は、ラットにお ける１.５時間にわたるＭＣＡ閉塞の前、最中および後に得られたＤＷＩイメー ジを示し、各列は同じ脳の３平面で得られたイメージを示す。列Ａは、ＭＣＡ閉 塞前にはＤＷＩ過強度が全く存在しないことを示している。列Ｂは、ＭＣＡ閉塞 の３０分後、ＤＷＩ過強度領域が出現し始め、ＭＣＡ閉塞１時間で明確に特定さ れることを示している（列Ｃ）。比較した場合、対照イメージ（図示せず）では 、明確なＤＷＩイメージは典型的にはＭＣＡ閉塞の５−１０分以内に現れる。す なわち、虚血開始前に存在するとき、ＰＮＡは実質的に脳での虚血性損傷の進行 を減速させ得る。列Ｄは、再潅流の８分後に得られたイメージを示す。ＤＷＩイ メージが本質的に消失してしまうことから、虚血中に生じるＡＤＣ変化がＰＮＡ の 存在下では再潅流時に急速に消散したことを示している。比較した場合、対照イ メージは典型的には再潅流後にＤＷＩイメージの進行を示しており、これは再潅 流損傷を表すものである。列ＥおよびＦは、各々再潅流の１および２時間後に得 られたイメージを示し、ＤＷＩイメージが存在しないことを確認している。この 動物をＭＣＡ閉塞２４時間後に殺すと、皮質梗塞は全く無く、基底神経節に小さ な梗塞を有することが組織学的に見いだされた。 実施例１２ ヘモグロブリンを基剤とする赤血球代用物質（ＨＲＣＳ）の血管拡張およびバ ソニュートラル製剤 図１３は、ヘモグロビン基剤の酸素担体（ＨＢＯＣ）、具体的にはＤＢＢＦ− Ｈｂの血管収縮効果に対する本発明の組成物の効果を示す。この血管収縮作用は 、この溶液の１０％ｖ／ｖ最高負荷注入時における平均動脈圧（ＭＡＰ）の増加 を測定することにより、意識のあるラットモデルにおいて証明される。図１３に 関して述べると、点線は、ＨＢＯＣ注入後の時間の関数として平均動脈圧を示す 。本発明によると、放射線防護、ＥＲＩおよび虚血／再潅流損傷保護に使用され る同じＰＮＡおよびＴＰＬ溶液は、広い範囲の酵素様およびラジカル解毒機能を 有することが示される。ＰＮＡまたはＴＰＬは、ＨＢＯＣと単独で注射されると 、抗高血圧作用を全く有しないことが見いだされた。さらに、意識のあるラット では、ＰＮＡ（５ｇ／ｄｌ）またはＴＰＬ（１００ミリモル）単独、１０％ｖ／ ｖ最高負荷により大した血管拡張効果は得られない。しかしながら、１０％ｖ／ ｖで最高負荷されたＰＮＡ（５％／ｄｌ）／ＴＰＬ（１００ミリモル）からは、 顕著で持続的な血管拡張効果が得られることが観察された（図２９）。この血管 拡張効果は、これらのラットにおける持続的血漿ＴＰＬレベルと一致する(図１ ４)。ＰＮＡが存在しない場合、これらのラットにおけるＴＰＬの血漿半減期は ６０秒未満である。従って、等容量のＰＮＡ（５ｇ／ｄｌ）／１００ミリモルＴ ＰＬをＤＢＢＦ−Ｈｂ７.８ｇ／ｄｌおよびこれらのラットにおける最高負荷２ ０％ｖ／ｖを混合することにより、血管作用のないＨＲＣＳ製剤が生成される( 図１３)。図２９で観察される血圧降下作用は血管平滑筋におけるＴＰＬの持続 的上昇（図 １４）と一致し、一酸化窒素の破壊を阻止するため（すなわち、超酸化物による 内皮誘導弛緩因子（ＥＤＲＦ））、ラットにおいて血管拡張を促進し、ＭＡＰを 低下させる（図２９）。血管作用のないＨＲＣＳ製剤の場合（図１３）、ＨＢＯ ＣおよびＰＮＡ／ＴＰＬの血管収縮および血管拡張活性は、インビボでの一酸化 窒素レベルに対する互いの効果を相殺した。従って、ＨＲＣＳのこの血管作用の ない製剤は、遊離基および酸化的ストレスの全体的保護作用に基づき、目下臨床 開発においてＨＢＯＣの顕著に改善されたものである。 実施例１３ 脂質酸化の阻害 脂質の酸化は、脳および中枢神経系に対する再潅流損傷およびアテローム性動 脈硬化並びに組織損傷に関与する。本発明のニトロキシド標識高分子は、脂質酸 化を緩和することが証明されている。 ヘパリンで凝血防止した血液約６０ｍｌを、健康な非喫煙者から採取した。４ ℃で２０分間２０００ｇで血液を遠心分離後、ＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍＬ）−抗凝 血化静脈血から血漿ＬＤＬを製造した。血液、血漿およびＬＤＬ試料を、氷上弱 い光の下で処理することにより、ＬＤＬ抗酸化剤の光酸化を阻止した。レートゾ ーン密度勾配超遠心分離により、ＬＤＬを血漿から単離した。５ｇのＫｂｒを１ ０ｍＬの血漿に加えることにより、血漿密度を１.３ｇ／ｍＬに上昇させた。１ ０〜１５分ティッパーで間穏やかに混合することにより、ＫＢｒを血漿に溶かし た。各ＫＢｒ−血漿試料を、イージーシールのポリアロマー超遠心分離管中２３ ｍＬの氷冷０.９％ＮａＣｌ下で層状に重ねた。密閉した管を、４℃で３時間５ ００００ｒｐｍ（３０２０００ｇ）で遠心分離した。遠心分離後、針で管の底に 穴をあけ、５ｍＬ／分の速度で管中にフルオリネートをポンプ注入することによ り、密度勾配を分画した。内容物を管の上部から集め、分画採取器に移した。非 常に低密度のリポタンパク質を含有する勾配の最初の１２ｍＬを廃棄した。それ に続いて、各々１.２ｍＬの６分画を集めた。４番目の分画からは、暗黄色ＬＤ Ｌピークが全般的に見いだされた。ＬＤＬを、ピーク分画＋ピーク後の１分画お よびピーク前の２分画からプールした。このＬＤＬからは、アガロース電気泳動 後に単一β−泳動帯が得られ、ＬＤＬが他のリポタンパク質による汚染を伴わな いことを示していた。使用前に３回、ＬＤＬ試料を６ＬのＨＢＳＳ緩衝液に対し て透析した。単離されたＬＤＬ試料を暗所で氷上貯蔵した。ＬＤＬタンパク質含 有量を、標準物質として牛血清アルブミンを用いるペーターソン−ロウリー法に より測定した。 ヘミンおよびＨ2Ｏ2でのＬＤＬの酸化により脂質酸化を測定した。ＬＤＬ２０ ０μｇ／ｍＬを、５マイクロモルのヘミンおよび５０マイクロモルのＨ2Ｏ2を含 むキュベットに加えた。最終検定容量は、ｐＨ７.４のＨＢＳＳ緩衝液中２〜３ ｍＬであった。Ｈ2Ｏ2を加えることにより、検定を開始させた。実験によっては 、ＲＮＡ＋ＴＰＬを、ＨＢＳＳ中１：１００、１：１０００および１：１０００ ０で希釈した。様々な時点で試料を除去し、チオバルビツロン酸還元性物質（Ｔ ＢＡＲＳ）の測定を行った。チオバルビツロン酸、塩酸、トリクロロ酢酸（tric hlorocetic acid）および蒸留水を含む５００μＬのチオバルビツロン酸試薬に 試料を加えることにより、これは行われた。ＤＳＭＯ中ブチル化ヒドロキシトル エンを０.１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加えることにより、後続の加熱段階中にお けるＴＢＡＲＳの自然形成を阻止した。１００°で１５分間加熱後、試料を室温 に冷却し、１００００ｇで１０分間遠心分離した。澄明上清を、吸光係数１.５ ６×１０5モル／Ｌ-1ｃｍ-1で５３２ｎｍでの分光測光法により分析し、ＬＤＬ タンパク質１ミリグラム当たりのＴＢＡＲＳのナノモル数として結果を表す。図 ３５ａ−３５ｄは、ヘミンＨ2Ｏ2に応じたＬＤＬ酸化の時間推移を説明している 。これら４種の独立実験では、１：１００、１：１０００、１：１００００での ＰＮＡ＋ＴＰＬの存在下におけるＬＤＬの酸化までの時間は強力に抑制されてい る。ＴＢＡＲＳ形成を反映する光学密度の増加は、１：１００および１：１００ ００ＰＮＡ＋ＴＰＬにより実験１および２で遮断されている。 実施例１４ 白血球活性化の阻害 白血球と内皮細胞および血小板との相互作用は、局所および全身的虚血／再潅 流損傷から臓器移植の拒絶におよぶ範囲の幾つかの有害な生理学的条件に対する 微循環的応答、および様々な酸化性新種（novae）に対する生体応答の指標であ る。Lehrら、ＰＮＡＳ、７９１：７６８８（１９８４年８月）も参照。反応性酸 素物質の伝達物質的役割については、多くのインビトロおよびインビボモデルで 詳細に記録されているため、抗酸化剤およびラジカルスカヴェンジャーを適用す ることにより、白血球活性化、集合および内皮接着およびそれに続く微循環的機 能不全は打ち消された。シリアンゴールデンハムスターにおける背面スキンフォ ールドチャンバーモデルを用いて、タバコの煙に誘発された白血球回転および小 動脈および小静脈の内皮細胞への接着並びに血流中における白血球／血小板集合 体の形成に対する２種の異なるポリニトロオキシル化担体の阻害作用を試験する と（Lehr et al.，PNAS 91:7688，1994）、ＨＢＯＣ（ＤＢＢＦ−橋かけヘモグ ロビン）は、食塩水処置対照と比べた場合白血球活性化に対する効果を全く有し なかったことが証明されている。しかしながら、ポリニトロオキシル化ＨＢＯＣ は、本質的に完全に白血球活性化を阻止した。使用された用量で活性化が阻止さ れている下表において観察されるところによると、アルブミンがある程度の保護 作用を呈することは分かる。しかしながら、その表は、ＰＮＡもまた活性化を阻 止したことを示しでおり、表に示されたＨＢＯＣおよびポリニトロオキシル−Ｈ ＢＯＣ結果から、ＰＮＡの方が低蛋白質濃度でもアルブミンよりも優れた保護作 用を呈することが予測される。上記の通り、ポリニトロオキシル化アルブミンお よびポリニトロオキシル化安定化ヘモグロビンに基づく酸素担体は、下表に示さ れているように内皮細胞および血小板との有害な白血球相互作用を有効に阻止す る。 実施例１５ 皮膚病、特に乾癬への局所適用 遊離基レベルが高い場合または遊離基カスケードが真皮で現れている場合の皮 膚における幾つかの疾患の根元的な原因に向けて多くの研究が為されてきた。乾 癬の場合、原因は多面的であるが、炎症プロセスの最終作用物質は、スーパーオ キサイドおよび他の傷害性酸素基であると思われる。皮膚細胞および白血球は、 両方とも乾癬における病的遊離基レベルの一因となっていることが報告されてい る。乾癬患者の病変および非関連皮膚からの皮膚線維芽細胞は、正常対照よりも 高い（各々１５０％および１００％）ことが報告された。Er-Raki A，Charveron M，および Bonafe JL 1993。乾癬患者の皮膚線維芽細胞におけるスーパーオキ サイドアニオン生産の増加。Skin Pharmacol．6:253-258。乾癬血清は、多形核 白血球（ＰＭＮｓ）によるスーパーオキサイド発生を増加させることが報告され た。Miyachi Y および Niwa Y 1983。多形核白血球による酸素中間体の生成に対 する乾癬血清の効果。Arch．Dermatol．Res．275:23-26。乾癬患者からのＰＭＮ ｓにおけるＳＯＤレベルは、正常よりも顕著に低いことが報告された。Doganp， soyuer U，およびTanrikuli G 1989。乾癬における、多形核白血球でのスーパー オキサイド・ディスムターゼおよびミエロペルオキシダーゼ活性、および血清セ ルロプラスミンおよび銅レベル。Br．J．Dermatol．120:239-244。スーパーオキ サイド・ディスムターゼｍＲＮＡおよび免疫反応性酵素は、乾癬皮膚で増加され ることが報告されたが、遊離基レベルの上昇を補う試みの表れであると思われる 。Kobayashi T，Matsumoto M，Iizuka H，Suzuki K，および Taniguchi N 1991 。乾癬、へん平上皮細胞癌腫および基底細胞上皮腫におけるスーパーオキサイド ・ディスムターゼ：免疫組織化学試験。Br．J．Dermatol．124:555-559。遊離基 スカベンジャーは、乾癬に関する実験的試験で有益に作用することが報告された ため、遊離基を無毒化する薬剤であれば、乾癬病変部位で遊離基の傷害性効果を 阻止することにより炎症プロセスを遮断し得ることになる。Haseloff RF，Blasi o IE，Meffert H，および Ebert B．1990。安息香酸および誘導体のヒドロキシ ル基スカベンジングおよび抗乾癬活性。Free Radical Biol．Med．9:111-11 5。 マウスにおけるインビボＥＰＲ分光法を用いることにより、本発明の化合物の 有効性が、皮内ＰＮＡおよび静脈内15Ｎ−ＴＰＬの薬物動態分析から測定され得 る。 特注の橋絡式ループ-ギャップ表面共鳴器、吸収マイクロ波ブリッジを、マウ スにおける１.２５ＧＨｚ（Ｌ−帯）でのインビボＥＰＲ分光法に使用した。こ の機器を用いることにより、マウスの体における特異部位での局所ＴＰＬおよび ＰＮＡ濃度を測定した。麻酔されたマウスを２つの鋳型に挟んで「サンドイッチ 」にし、後頭部の分光測光用には仰向け姿勢または腹部の分光測光用にはうつ伏 せ姿勢でループ-ギャップ表面共鳴器、吸収マイクロ波ブリッジに配置させた。1 5 Ｎ−ＴＥＭＰＯＬの静脈内注射には尾部静脈カニューレを使用した。この注射 部位は共鳴器からは遠位にあった。 図４０Ａは、動物の背部における注射部位で測定された、皮内注射されたＰＮ Ａ（１００μｌの１０ｇ／ｄｌ ＰＮＡ溶液）のＥＰＲスペクトルを示す。 図４０Ｂは、動物背部における皮内ＰＮＡ注射部位で測定された、皮内ＰＮＡ および静脈内15Ｎ−ＴＰＬの混成スペクトルを示す。広い不斉中心ピークはＰＮ Ａ濃度のみを表し、左方への鮮明な低視野ピークは15Ｎ−ＴＰＬ濃度のみを表す 。スペクトルは、15Ｎ−ＴＰＬが尾部静脈から注射された１分後に得られた。15 Ｎ−ＴＰＬ用量は、体重の１％（ｗ／ｗ）割合の15Ｎ−ＴＰＬストック溶液（２ ０ｍｇ／ｍｌまたは〜１１５ミリモル、乳酸化リンガー溶液中）であり、約１. １５ミリモルの血液濃度が得られた。図４０Ｂは、15Ｎ−ＴＰＬシグナルを適応 させるために図４０Ａで使用された機器利得の約１／５で記録された。図４０Ｃ は、5Ｎ−ＴＰＬの尾部静脈注射３０分後に得られたＥＰＲスペクトルを示す。 特異的15Ｎ−ＴＰＬおよびＰＮＡピークは、明らかに区別可能なままである。 皮内ＰＮＡ注射部位での15Ｎ−ＴＰＬの薬物動態は、図４１に示されており、 これは15Ｎ−ＴＰＬ特異的ピークの強度対時間のプロットである。15Ｎ−ＴＰＬ シグナルは尾部静脈注射直後に増加し、注射後２分未満で最大値に達し、次いで 定常状態レベルに減衰した。残留定常状態レベルは、初期15Ｎ−ＴＰＬ濃度の１ ７％に相当し、全身水分に完全分布していると思われる。初期減衰は、ＴＰＬか ら反磁性（ＥＰＲ−サイレント）ＴＰＨへの熟知された還元を表している。残留15 Ｎ−ＴＰＬシグナルの持続性は、皮内ＰＮＡによる15Ｎ−ＴＰＨから15Ｎ−Ｔ ＰＬへの再酸化に起因すると考えられる。 図４２Ａおよび４２Ｂに関して述べると、ＰＮＡによる皮内再酸化を証明する ため、15Ｎ−ＴＰＬの局所薬物動態が試験され、３０秒の半減期を示した。皮内 ＰＮＡが存在しない場合、15Ｎ−ＴＰＬから15Ｎ−ＴＰＨへの減衰は完全である 。 皮膚における15Ｎ−ＴＰＨの存在は、腹部でのＰＮＡの皮内注射により証明さ れる。皮内ＰＮＡ（１００μｌ、１０ｇ／ｄｌ）は、注射部位において局所的に15 Ｎ−ＴＰＬを再生および持続させる。15Ｎ−ＴＰＨのインビボ再酸化の薬物動 態は、図４２Ａおよび４２Ｂを比較することにより示される。ＰＮＡの皮内注射 後＋５分で、15Ｎ−ＴＰＨの再酸化は本質的に完全になる。 実施例１６ 遊離基傷害性--腎臓損傷 横紋筋融解の動物モデルにおいて、グリセリンのボーラス注射を主要筋中に行 うことにより、ヘム誘導腎臓損傷を誘発する。ポリニトロキシドアルブミンは、 対照としてアルブミンによる生存試験でグリセリン誘発腎臓損傷を低減化させる ことが示されている。体重約２７５ｇの雄スプラーグ-ドーリーラットを、基線 血清クレアチニンを測定させた後、一夜（１６時間）脱水状態にした。翌朝、１ .２５ｍｌのポリニトロキシドアルブミンおよびＴＥＭＰＯＬ（１０ｇ／ｄｌ） またはアルブミン（１０ｇ／ｄｌ）を、尾部静脈注射により投与した。注射直後 、グリセリンのＩＭ注射（水中５０％ｖ／ｖ、１０ｍｌ／Ｋｇ）を行い、用量の １／２を各腹側大腿筋に投与した。最初の注射の２時間後、さらに同一用量を尾 部静脈注射により投与した。図４３に関して述べると、次の１０日間、生存およ び血清クレアチニンをモニターした。この期間の最後に、試験された全ラットは 、死に瀕しているかまたは回復の徴候を示していた（下降する血清クレアチニン ）。 ここに記載されている特定実施例は、教示的なものであって、通常熟練者が本 発明を適用し得る適用法に対する限定として解されるべきではない。修正および 他の用途も当業界の熟練者に利用可能であり、それらは後記請求の範囲により特 定されている本発明の意図するものに包含される。上記に示された参考文献およ び出版物を具体的に引用して説明の一部とする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＨ Ｃ０７Ｄ 207/46 ＡＢＬ 209/42 ＡＣＶ 211/94 ＡＥＤ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＶ 38/16 ＡＤＡ 37/14 ＡＤＡ 49/00 37/02 ＡＢＨ // Ｃ０７Ｄ 207/46 ＡＥＤ 209/42 ＡＢＥ 211/94 ＡＢＬ (31)優先権主張番号 ０８／６０５，５３１ (32)優先日 1996年２月22日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＣＡ ，ＣＮ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＧ， ＵＳ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ヒドロキシルアミン型の第１ニトロキシドをヒドロキシルアミンオキシダ ーゼとして酵素様活性を提供する第２ニトロキシド（酵素様化合物はその遊離基 型において第１ニトロキシドよりも安定が低いニトロキシ基を有するニトロキシ ド含有化合物である）と反応せしめることを含む、ニトロキシドのヒドロキシル アミン型の常磁性型へのインビボ変換を促進する方法。 ２．酵素様化合物がバイオ和合性ポリニトロキシド高分子である、請求項１の 方法。 ３．ポリニトロキシド高分子が合成ニトロキシドポリマーである、請求項２の 方法。 ４．ポリニトロキシド高分子がデキストラン、ヒドロキシルエチルデンプン、 リポソーム、ヘモグロビンまたはアルブミンからなる群より選択される、請求項 ３の方法。 ５．膜透過性第１ニトロキシドを投与し、第１ニトロキシドのヒドロキシルア ミン型から電子を受容できるニトロキシ基を有する第２ニトロキシドの局在性量 を投与することよりなる、ニトロキシドの遊離基型のインビボ濃度について局在 性増加を提供する方法。 ６．第２ニトロキシドがアルブミン、ヘモグロビン、リポソーム、デキストラ ンまたはヒドロキシエチルデンプンの群のポリニトロキシド標識バイオ和合性高 分子を含む化合物である、請求項５の方法。 ７．ポリニトロキシド高分子が分子比率約７−９５で標識されたポリニトロキ シドアルブミンである、請求項６の方法。 ８．第１ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルからなる群 より選択され、標識高分子の第２ニトロキシドが同じ群より選択される、請求項 ７の方法。 ９．投与のために薬学的に許容される賦形剤中のバイオ和合性ポリニトロキシ ド高分子を含む組成物。 １０．バイオ和合性分子がヘモグロビン、アルブミン、ヒドロキシルエチルデ ンプン、デキストランまたはシクロデキストランからなる群より選択される、請 求項９の組成物。 １１．ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルからなる群よ り選択される、請求項１０の組成物。 １２．組成物がニトロキシドのアルブミンに対する分子比約７−９５を有する ポリニトロキシドアルブミンである、請求項１１の組成物。 １３．膜透過性の第１ニトロキシドおよび第１ニトロキシドから電子を受容で きるニトロキシ基を有する第２ニトロキシドを含む、バイオ和合性組成物。 １４．第２ニトロキシドが実質的な膜不透過性ポリニトロキシドバイオ和合性 高分子である、請求項１３の組成物。 １５．ポリニトロキシドバイオ和合性高分子がポリニトロキシドアルブミンで ある、請求項１４の組成物。 １６．ニトロキシドのアルブミンに対する分子比が約７−９５である、請求項 １５の組成物。 １７．第１ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルからなる 群から選択される、請求項１４の組成物。 １８．ニトロキシドがそのヒドロキシルアミン誘導体である、請求項１７の組 成物。 １９．ポリニトロキシドバイオ和合性高分子が天然ヘモグロビン、橋かけ結合 ヘモグロビン、重合ヘモグロビン、複合ヘモグロビン、リポソーム被包ヘモグロ ビン、ヒドロキシルエチルデンプン、デキストランまたはシクロデキストランか らなる群より選択される、請求項１４の組成物。 ２０．膜透過性第１ニトロキシドを投与し、第１ニトロキシドのヒドロキシル アミン型から電子を受容できるニトロキシ基を有する第２ニトロキシドの局在性 量を投与し、生物の構造のイメージを得ることを含む、生物の構造の電子常磁性 共鳴または核磁気共鳴イメージを高める方法。 ２１．膜透過性ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルから なる群にあり、第２ニトロキシドがヘモグロビン、アルブミン、デキストラン、 シクロデキストラン、ヒドロキシエチルデンプンまたはリポソームの群のバイオ 和合性高分子である、請求項２０の方法。 ２２．ポリニトロキシド高分子がニトロキシドのアルブミンに対する分子比率 約７−９５を有するアルブミンである、請求項２１の方法。 ２３．第２ニトロキシド高分子の投与方法が膜透過性第１ニトロキシドと第２ ニトロキシドとの相互作用に最も近い部位でイメージ向上を局在化するのに効果 的である、請求項２０の方法。 ２４．膜不透過性ポリニトロキシド高分子の静脈投与からなる、心臓または脳 での虚血のＥＰＲまたはＭＲＩイメージを得る方法。 ２５．膜不透過性ニトロキシドがヘモグロビン、アルブミン、ヒドロキシエチ ルデンプン、リポソーム、デキストランまたはシクロデキストランからなる群よ り選択され、ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルの群であ る、請求項２４の方法。 ２６．ポリニトロキシド膜不透過性高分子がポリニトロキシドヘモグロビンを 基にする酸素担体である、請求項２５の方法。 ２７．ポリニトロキシド高分子の治療量を投与することよりなる、虚血再灌流 損傷を軽減する方法。 ２８．ポリニトロキシド高分子がアルブミン、ヘモグロビン、デキストラン、 シクロデキストラン、ヒドロキシエチルデンプンまたはリポソームの群にあり、 ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルの群である、請求項２ ７の方法。 ２９．ポリニトロキシド高分子がニトロキシドのアルブミンに対する分子比率 約７−９５を有するポリニトロキシドアルブミンである、請求項２８の方法。 ３０．膜透過性ニトロキシドの投与をさらに含む、請求項２７の方法。 ３１．ポリニトロキシド高分子が脳血管系または心血管系における虚血または 再灌流損傷の処置のために静脈投与される、請求項２７の方法。 ３２．第１および第２ニトロキシドの少なくとも一つが皮膚層の虚血または再 灌流損傷の処置のために局所的に投与される、請求項２７の方法。 ３３．膜透過性第１ニトロキシドを投与し、第１ニトロキシドのヒドロキシル アミン型から電子を受容できるニトロキシ基を有する第２ニトロキシドの局在性 量を投与することよりなる、電離性放射より生物体を保護する方法。 ３４．第２ニトロキシドがアルブミン、ヘモグロビン、デキストラン、ヒドロ キシエチルデンプン、リポソームまたはシクロデキストランからなる群より選択 されるニトロキシド標識高分子である、請求項３３の方法。 ３５．ポリニトロキシド高分子が分子比率約７−９５でＴＥＭＰＯＬ，プロキ シルまたはドキシルからなる群より選択されるニトロキシドで標識されたアルブ ミンである、請求項３４の方法。 ３６．膜透過性第１ニトロキシドを投与し、第１ニトロキシドのヒドロキシル アミン型から電子を受容できるニトロキシ基を有する第２ニトロキシドの局在性 量を投与し、そして生物体を電離性放射に被曝せしめることよりなる、電離性放 射の医療量を用いて生理的状態を有する生物体を処置する方法。 ３７．膜透過性ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルから なる群より選択され、第２ニトロキシドがヒドロキシエチルデンプン、アルブミ ン、ヘモグロビン、リポソーム、デキストランまたはシクロデキストランからな る群より選択されるニトロキシド標識高分子である、請求項３６の方法。 ３８．ニトロキシド標識高分子がニトロキシドのアルブミンに対する分子比率 が約７−９５のポリニトロキシドアルブミンである、請求項３７の方法。 ３９．電離性放射量が第２ニトロキシドの濃度に合致する部位に運ばれる、請 求項３６の方法。 ４０．ポリニトロキシドアルブミンが局所使用に適した担体中にあり、そして 放射被曝の部位でポリニトロキシドを局所的に使用することをさらに含む、請求 項３９の方法。 ４１．膜透過性ニトロキシドまたはポリニトロキシドアルブミンの少なくとも 一つが放射治療を行う前に静脈投与される、請求項４０の方法。 ４２．膜透過性第１ニトロキシドの治療活性量を投与し、第２ニトロキシドの 触媒活性量（第２ニトロキシドは第１ニトロキシドから電子を受容できるニトロ キシル基を有する）を投与することよりなる、生物系における遊離基毒性効果を 減少する方法。 ４３．第１ニトロキシドがＴＥＭＰＯＬ，プロキシルまたはドキシルからなる 群より選択され、第２ニトロキシドがアルブミン、ヒドロキシルエチルデンプン 、デキストラン、リポソーム、ヘモグロビンまたは免疫グロブリンからなる基よ り選択されるポリニトロキシド高分子である、請求項４２の方法。 ４４．ポリニトロキシド高分子がニトロキシドのアルブミンに対する分子比率 約７−９５のポリニトロキシドアルブミンである、請求項４３の方法。 ４５．効果が敗血症、潰瘍、白内障、放射被曝、炎症、脱毛症、虚血／再灌流 損傷、閉鎖性頭部損傷、外傷、火傷、乾癬、加齢、脳卒中または腎不全からなる 群より選択される疾患状態に関連する、請求項４２の方法。 ４６．ヘモグロビンを基にする酸素担体を投与することを含む、請求項４２の 方法。
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