WO2003107011A1 - スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法 - Google Patents

スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2003107011A1
WO2003107011A1 PCT/JP2003/005486 JP0305486W WO03107011A1 WO 2003107011 A1 WO2003107011 A1 WO 2003107011A1 JP 0305486 W JP0305486 W JP 0305486W WO 03107011 A1 WO03107011 A1 WO 03107011A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
compound
sulfonic acid
measurement
hemoglobin
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/005486
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
米原　聡
香 石丸
平井　香
Original Assignee
アークレイ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29727998&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2003107011(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by アークレイ株式会社 filed Critical アークレイ株式会社
Priority to AU2003235974A priority Critical patent/AU2003235974A1/en
Priority to JP2004513779A priority patent/JP4061366B2/ja
Priority to EP03720984.8A priority patent/EP1515144B2/en
Priority to AT03720984T priority patent/ATE445844T1/de
Priority to US10/517,853 priority patent/US7354732B2/en
Priority to DE60329679T priority patent/DE60329679D1/de
Publication of WO2003107011A1 publication Critical patent/WO2003107011A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring an object to be measured in a sample using a redox reaction.
  • glycated proteins in blood especially glycated hemoglobin in erythrocytes, reflect past histories of living blood glucose levels and are therefore important indicators in the diagnosis and treatment of diabetes.
  • the glycated protein in such erythrocytes is measured using the redox reaction, for example, as described below.
  • a sample prepared by lysing erythrocytes is prepared, and the lysed sample is treated with fructosyl amino acid oxidase (hereinafter, referred to as “FAOD”). generate.
  • FOD fructosyl amino acid oxidase
  • This amount of hydrogen peroxide corresponds to the amount of glycated protein.
  • POD peroxidase
  • a substrate that develops color by oxidation a color-developing substrate
  • Allow a reduction reaction At this time, since the oxidation substrate develops color by oxidation, the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the color development. You can know the amount of glycated protein.
  • reducing substances such as ascorbic acid (AsA) and pyrilrubin are usually present in blood, and various reducing substances such as daltathione (GSH) are present in erythrocytes.
  • these reducing substances may reduce the hydrogen peroxide, inhibit the redox reaction, or reduce the color of the reducing agent after the reducing agent has developed color. For this reason, there was a problem that it was difficult to accurately measure the amount of glycated protein in red blood cells.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-151358 discloses a method using a halogen oxide such as iodic acid and periodic acid as an oxidizing agent. 1 3 3 5 7
  • JP-A-3-30697 disclose a method using a metal complex such as cobalt, iron, and cerium as an oxidizing agent.
  • an object of the present invention is to use an object to be measured in a sample by a redox reaction. It is an object of the present invention to provide a measurement method which can obtain a highly reliable measurement value.
  • a measurement method of the present invention is a method for measuring an object to be measured in a sample containing hemoglobin or a hemoglobin hydrolyzate by using a redox reaction, comprising: At least one of the oral compounds is added to the sample to eliminate the influence of the hemoglobin or hemoglobin degradation product contained in the sample.
  • the present inventors (i) In the conventional method, the influence of a low molecular weight reducing substance such as AsA or GSH is excluded, but the effect of a high molecular weight reducing substance such as a protein is not excluded. Further, (ii) if the sample is treated with a tetrazolium compound, not only the low molecular weight reducing substance but also the high molecular weight reducing substance, in particular, hemoglobin and a hemoglobin decomposed product (hereinafter, both of which are referred to as “hemoglobin”) We have found that the effects of redox substances can be eliminated. The applicant has filed a separate application for this.
  • the present inventors conducted further intensive research in order to eliminate the influence of hemoglobin without affecting the measurement system. As a result, they have found that by treating a sample with a sulfonate compound or a nitro compound, it is possible to prevent the effect of hemoglobin without affecting the measurement system, and reached the present invention. According to such a measuring method of the present invention, more accurate measurement can be performed at any time, and therefore, it is useful for various tests in clinical medicine and the like as described above.
  • the measurement method of the present invention is a method for measuring an object to be measured in a sample by using a redox reaction, wherein at least one of a sulfonic acid compound and a nitro compound is added to the sample.
  • a redox reaction wherein at least one of a sulfonic acid compound and a nitro compound is added to the sample.
  • at least one of a sulfonic acid compound and a nitric compound is added to the sample.
  • the influence of the hemagglutinating pin or hemoglobin hydrolyzate in the sample is eliminated, and then an oxidized substance or a reduced substance derived from the measurement target is generated, and the amount is measured by a redox reaction. It is preferable to determine the amount of the measurement object from the measured value.
  • the substance to be added to eliminate the influence of hemoglobin may be, for example, either one of a sulfonic acid compound and a nitro compound, but since the influence can be further eliminated, both the compounds are added to the sample. Is preferred.
  • the order of addition is not limited, and both may be added simultaneously or separately.
  • examples of the sulfonic acid compound include:
  • X is, for example, Na, K, Li, H, etc.
  • N in R is, for example, in the range of 1 to 20. It is an enclosure.
  • "H" may be substituted with an acyl group, a nitro group, a nitroso group, a phenyl group, an alkyl group, an alkyl ether group or the like.
  • the sulfonic acid compound include, for example, sodium lauryl sulfate (hereinafter, referred to as “SLS”), sodium sulphate (hereinafter, referred to as “SDBS”), lithium lauryl sulfate (hereinafter, referred to as “SDBS”).
  • SLS sodium lauryl sulfate
  • SDBS sodium sulphate
  • SDBS lithium lauryl sulfate
  • LiLS 4-Aminoazobenzene-sodium 4'-sulfonate
  • ABSA 4-Amino-4'-nitrostilbene-2,2'-sodium disulfonic acid
  • ANDS 4-Amino-4'-nitrostilbene-2,2'-sodium disulfonic acid
  • DADS 4,4'-Diazostilbenzene-2,2'-disulfonic acid disodium salt
  • N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonate
  • N-cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonate piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid
  • bathofena can be used, more preferably, SLS, SDBS, an L ILS.
  • the nitro compound is not particularly limited, and examples thereof include a dinitrobenzene compound and a dinitrobenzene compound.
  • These compounds, benzene ring, in addition to the nitro group, for example, one NH 2, - 0H, - C00H , - S0 3, - (CH 2) n CH 3 (n 2 ⁇ 9) substituent such as It is preferable to have a hydrophilic group as a substituent among these.
  • the substituent include a halogen group, an ether group, and a phenyl group.
  • nitro compound examples include, for example, 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP), 2,5-dinitrophenyl, 2,6-dinitophylphenyl, 4,6-dinitro-2-methyl Phenol, 2-amino-4-nitrophenol, 2-amino No-5-nitrophenol, 2-amino-4-12-trophenol, p-nitrophenol (p-NP), 2,4-dinitroaniline (2,4-DNA), p-nitroaniline ( P-NA), sodium nitrite (NaN0 2), potassium nitrite (KN0 2), 4 - Amino - 4 '- to Nitorosuchiru', down - 2,2' sheet ', sulfonic acid disodium (hereinafter, the rANPSj ), Nitrobenzene, etc. can be used. When a sulfonic acid compound and a nitro compound are used in combination, the combination thereof is not particularly limited.
  • the addition amount of the sulfonic acid compound or the nitro compound is not particularly limited, and is appropriately determined, for example, depending on the type of the sample, the amount of hemoglobin contained in the sample, the amount of other reduced substances, and the like. it can. Specific examples are shown below.
  • a sulfonic acid compound or a two-mouthed compound for example, add either compound so that it will be in the range of 0.01 to 100 mo 1 per 1/1 of sample And more preferably in the range of 0.03 to 200 mo 1, particularly preferably 0.05 to 4 mo
  • the oxidation-reduction reaction is a color-forming reaction in which an oxidizing enzyme reduces an oxidizing substance derived from the object to be measured and oxidizes a substrate (color-forming substrate) that develops color by oxidation. Is preferably a measure of the degree of color development by the color reaction. The measurement of the degree of color development can be performed, for example, by measuring absorbance at the detection wavelength of the substrate.
  • color-developing substrate examples include N- (carbo'ximethi) reaminocarbo "nyl) -4,4, -bis (c" methylamino "), sodium X-nilamine (hereinafter referred to as” DA-64 ").
  • DA-64 -bis (c" methylamino "), sodium X-nilamine
  • Mouth pill -4, 4,,, 4, , -Triaminotriphenylmethane hexasote ', dimethyl salt (hereinafter referred to as "TPM-PS"), ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ ', ⁇ ', ⁇ , '-hexa -3-sulfofol-propyl) -4, 4 ', 4' '-Triaminotrifyl-nylmethane dexamethasium salt (hereafter referred to as ⁇ -OSJ), 10- (Carho', xymethylaminocarho ') , Nil) 3,7-bis (methylamino) phenothiazine sodium salt (hereinafter referred to as “DA-67”), 10- (methylaminoamino "Nil) 3,7-bis (methylaminohafenothiacin) (hereinafter referred to as” MCDP "), 10- (carbo ', xya
  • Examples of the above-mentioned tricker reagent include phenol, a phenol derivative, aniline derivative, naphthol, naphthol derivative, naphthylamine, naphthylamine derivative and the like.
  • Examples of the compound to be combined with the above-mentioned Tinder reagent include, in addition to the above 4-aminoantipyrine, for example, an aminoantipyrine derivative, vanillin diamine sulfonic acid, methylamine Lupenzthiazolinone hydrazone (MBTH),
  • SMBTH Suthiazolinone hydrazone
  • the chromogenic substrate exemplified above usually has an absorption at 400 nm or more, when a tetrazolium compound as described above having an absorption at 400 nm is also used, the measured value depends on the presence of the tetrazolium compound. An error could occur. However, since the exemplified sulfonic acid compounds and nitro compounds do not absorb at more than 400 nm, there is no possibility that an error will occur in the absorbance measurement even when used together with these chromogenic substrates.
  • the combination of these color-forming substrates with the sulfonic acid compound and the nitro compound is not particularly limited, but the following combinations are preferable, for example, because the color-forming reaction is performed with high accuracy. The reason why the accuracy of the color reaction can be improved according to the combination of the chromogenic substrate with the sulfonic acid compound and the nitro compound is unknown.
  • the chromogenic substrate is M-64, a combination of a Trinder reagent and 4-aminoantipyrine, etc.
  • SLS, SDBS, and LiLS as the oxidized compound
  • 2,4-DNA, 2,4-DNP, PNA, and PNP as the nitro compound.
  • the chromogenic substrate is TPM-PS, TPM-OS, M-67, MCDP, MMX, or the like
  • a sulfonic acid compound to the sample, and more preferably, to add the sulfonic acid compound to the sample. Both of the mouth compounds are added.
  • the oxidizing substance derived from the measurement object is preferably hydrogen peroxide, and the oxidase is preferably peroxidase.
  • the measurement sample is not particularly limited.
  • the measurement object is not particularly limited as long as it utilizes an oxidation-reduction reaction, and examples thereof include whole blood components, red blood cell components, plasma components, and serum components. And preferably an intraerythrocyte component.
  • glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin, glycated peptides, glycated amino acids, glucose, uric acid, cholesterol, creatinine, sarcosine and glycerol, and more preferably glycated proteins.
  • glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin
  • glycated peptides such as glycated albumin
  • glycated peptides such as glycated amino acids, glucose, uric acid, cholesterol, creatinine, sarcosine and glycerol
  • glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin
  • glycated peptides such as glycated albumin
  • glycated amino acids such as glucose, uric acid, cholesterol, creatinine, sarcosine and glycerol
  • the measurement target is a glycated protein
  • hydrogen peroxide is generated as an acid compound substance derived from the measurement target by causing FAOD to act on the glycated protein.
  • the saccharified portion of the saccharified protein is oxidatively decomposed by FAOD, generating hydrogen peroxide.
  • glycated amines such as the glycated peptides and glycated amino acids also cause FAOD to act.
  • the glycated protein or glycated peptide is preferably treated with a protease before the FAOD treatment, if necessary.
  • the FAOD is a FAOD that catalyzes a reaction represented by the following formula (1). It is preferable that
  • R 1 represents a hydroxyl group or a residue (sugar residue) derived from a sugar before a saccharification reaction.
  • the sugar residue (R 1 ) is an aldose residue when the sugar before the reaction is aldose, and is a ketose residue when the sugar before the reaction is ketose.
  • the sugar residue (R 1 ) is a glucose residue (aldose residue).
  • This sugar residue (R 1 ) is, for example,
  • n is an integer of 0-6.
  • R 2 is not particularly limited.
  • a glycated amino acid a glycated peptide or a glycated protein
  • ⁇ amino group
  • other amino groups are glycated. Is different.
  • R 2 is an amino acid residue or a peptide residue represented by the following formula (2).
  • R 3 represents an amino acid side chain group.
  • R 4 represents a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (3), for example.
  • n is an integer of 0 or more.
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above.
  • R 5 represents a portion other than the glycated amino group in the amino acid side chain group. .
  • R 5 represents a portion other than the glycated amino group in the amino acid side chain group.
  • R 5 is
  • R 6 is hydrogen, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (5), for example.
  • n is an integer of 0 or more, and R 3 represents an amino acid side chain group as described above.
  • R 7 represents a hydroxyl group, an amino acid residue or It is a peptide residue and can be represented by, for example, the following formula (6).
  • n is an integer of 0 or more, and R 3 represents an amino acid side chain group as described above. ⁇ (NH— CHR 3 -CO) n -OH... (6)
  • the whole blood is directly lysed, or a blood cell fraction is separated from the whole blood by a conventional method such as centrifugation and lysed to prepare a hemolyzed sample.
  • the hemolysis method is not particularly limited, and examples thereof include a method using a surfactant, a method using ultrasonic waves, and a method using a difference in osmotic pressure. Among them, the method using the surfactant is preferable because of the simplicity of the operation and the like.
  • the surfactant examples include e. Rigid xyethylene-p-butyl octylphenyl: C-ter (Triton-based surfactant, etc.), e. Lioxyethylene 'norbitan alkyl ester (Tween surfactant etc.), e. Non-ionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ethers (Brij-based surfactants and the like) can be used, and specifically, for example, Triton X-100, Tween-20, B rij 35 and the like.
  • the treatment conditions with the surfactant are usually such that when the blood cell concentration in the treatment solution is 1 to 10% by volume, the surface activity is adjusted so that the concentration in the treatment solution is 0.01 to 5% by weight.
  • a sulfonic acid compound and a nitro compound is added to the hemolyzed sample, and the hemolyzed sample is pretreated.
  • Either one of the sulfonic acid compound and the two-mouthed compound may be used, or both may be added. However, it is preferable that the sulfonic acid compound and the two-mouthed compound are appropriately determined depending on the type of the chromogenic substrate used in the subsequent step as described above.
  • the amount of addition is not particularly limited, and the above-described addition ratio can be used.
  • the concentration of the nitro compound is in the range of 0.05 to 500 mmo1 / L, preferably 0.2 to 10 mm01 / L. ZL range.
  • the concentration of the sulfonic acid compound is in the range of 0.05 to 20 Ommo 1 / L, preferably 0.2 to 40 Omo 1 ZL. Range.
  • the amount of addition is not particularly limited, and examples thereof include the above-described addition ratio.
  • the sulfonic acid compound concentration is in the range of 0.05 to 20 Ommo 1 ZL
  • the nitro compound concentration is in the range of 0.05 to 25 Ommo 1 ZL.
  • the sulfonic acid compound concentration is preferably in the range of 0.2 to 40 mmol ZL
  • the nitro compound concentration is in the range of 0.1 to 50 mmol / L.
  • the sulfonic acid compound and the nitro compound may be used as they are, but are preferably used as a sulfonic acid compound solution or a nitro compound solution dissolved in a solvent from the viewpoint of simplicity of operation and processing efficiency. .
  • the concentration of each of the above-mentioned solutions can be appropriately determined depending on the type and the like.
  • the sulfonic acid compound solution is in the range of 5 to 100 mmo 1 ZL, preferably 5 to 400 mmo 1 ZL
  • the nitro compound The solution is 0.5- It is in the range of 10 Ommo1 / L, preferably in the range of 1 to 50 mmo1 / L.
  • the solvent for example, distilled water, physiological saline, buffer, or the like can be used.
  • As the buffer for example, a buffer described below can be used. In addition, these two compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • This pretreatment is usually performed in a buffer solution.
  • a buffer solution for example, an amine buffer, a phosphate buffer, a borate buffer, and a good buffer such as MOPS, CHES, CAPS, and CAPSO can be used.
  • the buffer for the amine-based buffer include glycine, ethylamine, getylamine, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, trishydroxyaminomethane, triethanolamine, glycinamide and the like.
  • the pH of the buffer is preferably in the range of 7 to 12, more preferably: in the range of 8 to 11, particularly preferably in the range of 8 to 10.
  • the conditions for this pretreatment are not particularly limited, but are usually in a temperature range of 10 to 37 ° C and a treatment time in a range of 10 seconds to 60 minutes.
  • the pretreated hemolyzed sample is subjected to protease treatment. This is to make it easier for the FAOD used in the subsequent processing to act on the measurement object.
  • the type of the protease is not particularly limited, and for example, protease K, subtilisin, trypsin, aminopeptidase, meta-oral protease, and the like can be used. Protease treatment conditions are appropriately determined depending on the type of protease used, the type of glycated protein to be measured, its concentration, and the like.
  • the pretreated hemolyzed sample is treated using proteases as the protease
  • usually the proteases in the reaction solution are used.
  • This protease treatment is usually performed in a buffer solution.
  • the buffer for example, the same buffer as in the pretreatment can be used.
  • the decomposition product obtained by the protease treatment is treated with the FAOD. This FAOD treatment catalyzes the reaction represented by the above formula (1).
  • This FAOD treatment is preferably performed in a buffer as in the protease treatment.
  • the treatment conditions are appropriately determined depending on the type of FAOD used, the type of glycated protein to be measured, its concentration, and the like.
  • the FAOD concentration in the reaction solution is 50 to 50,000 U / L
  • blood cell concentration in the reaction solution 0.01 to 1% by volume
  • reaction temperature 15 to 37 ° C
  • reaction time 1 to 60 minutes
  • the type of the buffer is not particularly limited, and the same buffer as used in the protease treatment can be used.
  • the hydrogen peroxide generated by the FAOD treatment was converted to POD and It is measured by an oxidation-reduction reaction using the coloring substrate.
  • the oxidation-reduction reaction is usually performed in a buffer, and the conditions are appropriately determined depending on the concentration of the generated hydrogen peroxide and the like.
  • the P00 concentration in the reaction solution is 10 to 100,000 IU / L
  • the chromogenic substrate concentration is 0.005 to 3 Ommo
  • the reaction temperature is 15 to 37
  • the reaction time is 0, ⁇ 30 minutes
  • the buffer is not particularly limited, and for example, the same buffer as used in the above-described protease treatment, FAD treatment and the like can be used.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the degree of color development (absorbance) of the reaction solution with a spectrophotometer. Then, the amount of glycated protein in the sample can be determined using the hydrogen peroxide concentration and the calibration curve and the like.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by, for example, an electrical method in addition to the enzymatic method using the POD or the like.
  • the pretreatment step with the sulfonic acid compound or the nitro compound is not particularly limited as long as the oxidation reduction reaction does not substantially occur, as described above. Therefore, it is preferable to perform the treatment before the FAOD treatment.
  • each processing step may be performed separately as described above. For example, there are processing steps that may be performed simultaneously in the following combinations.
  • the addition order of the sulfonic acid compound and the nitro compound and the addition order of the FAOD, POD and the chromogenic substrate are not particularly limited. According to such a method, by contacting a sulfonic acid compound or a nitro compound with the sample, only a low-molecular-weight reducing substance such as GSH, AsA, dithiothreitol, cysteine, and N-acetyl-cysteine can be used. In particular, the effects of hemoglobin and hemoglobin degradation products as reducing substances can be sufficiently eliminated.
  • the measurement can be performed with high accuracy without affecting the oxidation-reduction reaction or the absorbance measurement.
  • an oxidizing agent or an enzyme may be further used in combination.
  • examples thereof include halogen oxides such as sodium acetate, iodic acid, and periodic acid, EDTA-Fe, and the like.
  • the enzyme for example, ascorbate oxidase, bilirubin oxidase, and the like can be used.
  • the addition amount of such an oxidizing agent is, for example, in the range of 0.001 to 0.1 mg per 11 samples.
  • the measurement object is not particularly limited as long as it utilizes a redox reaction.
  • a glycated protein as described above, a glycated peptide, a glycated amino acid, glucose, cholesterol, Uric acid, creatinine, sarcosine, glycerol and the like.
  • hydrogen peroxide When hydrogen peroxide is generated to measure the amount of each of the measurement objects, for example, glucose is glucose oxidase, and cholesterol is Cholesterol oxidase on the roll, pericase on the uric acid, sarcosine oxidase on the creatinine, sarcosine oxidase on the sarcosine, glycerol oxidase on the glycerol, and hydrogen peroxide. Should be generated.
  • the method for measuring the amount of hydrogen peroxide can be performed in the same manner as described above.
  • the glycated peptide and glycated amino acid can be measured, for example, in the same manner as in the measurement of the glycated protein.
  • the measurement target is treated with the sulfonic acid compound or the nitro compound, a reducing substance derived from the measurement target is generated, and the amount is measured by an oxidation-reduction reaction.
  • the measurement can be performed as described below.
  • the measurement object is glucose
  • a reducing substance such as NADH or NADPH is generated using glucose dehydrogenase in the presence of NAD + or NADP +.
  • NAD H and NAD PH which are reducing substances derived from the measurement object, are measured by, for example, redox reaction using diaphorase and a substrate that develops color by reduction.
  • the amount of the measurement target in the sample can be determined using the concentration of the reducing substance derived from the measurement target and the calibration curve.
  • the measurement target is cholesterol
  • cholesterol dehydrogenase can be used
  • the measurement target is sarcosine
  • sarcosine dehydrogenase can be used.
  • the substrate that develops color by the reduction is not particularly limited, and for example, the above-described chromogenic tetrazolium compound, 2,6-dichlorophenol and phenol may be used.
  • a hemoglobin sample containing fructosyl valine (hereinafter referred to as “FV”) was treated with a sulfonic acid compound and a nitro compound using TPM-PS as a chromogenic substrate, and the FV amount was measured. It is.
  • the following shows the samples, reagents and methods used.
  • the hemoglobin frozen product was thawed with purified water to prepare a 50 gZL hemoglobin solution.
  • FV was produced according to Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-69644, and dissolved in purified water to prepare a 1 mM FV solution. Then, the hemoglobin solution 371, the FV solution 601, and purified water 2031 were mixed to prepare a measurement sample.
  • MOPS- MOPSNa buffer ( ⁇ 9.4) 15 mM
  • the sulfonic acid compound of the first reagent is SLS (manufactured by Nacalai Tesque), SDBS (manufactured by Wako Pure Chemical), AB SA (Tokyo Chemical) ), ANDS (Tokyo Kasei) and DADS (Tokyo Kasei) were used, respectively.
  • SLS manufactured by Nacalai Tesque
  • SDBS manufactured by Wako Pure Chemical
  • AB SA Tokyo Chemical
  • ANDS Tokyo Kasei
  • DADS Tokyo Kasei
  • MOPS-MOPS ⁇ buffer pH6.5
  • MOPS-MOPS ⁇ buffer pH6.5
  • the absorbance was measured in the same manner as in the above example, except that the sulfonic acid compound of the first reagent and the double-mouthed compound of the second reagent were not added.
  • the addition amount of the sulfonic acid compound per 1 L of the sample was 0.189 mol, 0.378 zmol, and 0.38 mol.
  • the amount was 755 ⁇ mo1
  • the addition amount of the nitro compound was 3.46 mo1.
  • Example 1 1-2 SLS (6.4) 2,4-DNA (0.9) 1 54 1-3 SLS (12.8) 2,4-DNA (0.9) 1 6 0 1-4 SDBS (6.4) 2, 4-DNA (0.9) 1 2 1 1-5 SLS (6.4) 1 54 1-6 ABSA (6.4) 1 3 2 1-7 ANDS (6.4) 1 1 3 1-8 DADS (6.4) 1 24 Comparative Example 1 3 0 As shown, as in Example 1, the use of various sulfonic acid compounds or the combined use of these with a nitro compound increased the absorbance indicating the amount of FV in the sample as compared to the comparative example. From this result, it can be seen that according to the present example, the effect of hemoglobin in the sample was eliminated by the sulfonic acid compound and the two-mouthed compound.
  • a hemoglobin sample containing FV was treated with a sulfonic acid compound and a nitro compound using DA-64 as a chromogenic substrate, and the amount of FV was measured.
  • the samples, reagents and methods used are shown below. (Preparation of measurement sample)
  • the hemoglobin solution 60 prepared in Example 1 was mixed with 37 L of the FV solution and 203 L of purified water to prepare a measurement sample.
  • Sulfonic acid compound Sulfonic acid compound (SLS: manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) 6.4 mM surfactant (e. Polyoxyethylene (9) lauryl ether) .85 g / L CHES-CHESNa buffer solution (pH 9.4) 40 mM MOPS-MOPSNa buffer (pH 9.4) 15 mM
  • MOPS- MOPS ⁇ Na buffer pH 6.5
  • 2,4-DNA manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • ⁇ -NA manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • p- NP manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Nacalai Tesque NaN0 2
  • 2,4- DNH manufactured by Wako Pure Chemical Industries Ltd.
  • the absorbance after 5 minutes was measured with a trade name of JCA-BM8 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • the measurement wavelength was 751 nm for the main wavelength and 805 nm for the sub wavelength.
  • Example 2 As shown in Table 2 above, in Example 2, the combined use of the sulfonic acid compound and the various nitro compounds increased the absorbance indicating the FV amount in the sample as compared to the Comparative Example. Furthermore, the absorbance was further increased by adding twice the amount of the nitro compound. From these results, it can be seen that according to the present example, the effect of hemoglobin in the sample was eliminated by the sulfonic acid compound and the nitro compound.
  • the measurement method of the present invention comprises the steps of: adding a sulfonic acid compound or a nitro compound to a sample to reduce a hemoglobin reducing substance in the sample; Since the effect of the measurement can be eliminated, highly reliable measurement can be performed. Therefore, the measurement method of the present invention can be applied to, for example, various analyzes in clinical medicine, and is particularly useful for measuring glycated proteins such as glycated hemoglobin in erythrocytes, which are important in diagnosing diabetes.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Abstract

試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法を提供する。前記酸化還元反応に先立ち、スルホン酸化合物およびニトロ化合物の少なくとも一方を試料に添加して、前記試料中に含まれるヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定する。スルホン酸化合物としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ニトロ化合物としては、４−ニトロフェノール等が使用できる。

Description

スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
技術分野
本発明は、 試料中の測定対象物を、 酸化還元反応を用いて測定する方 法に関する。
明 田
背景技術
従来から、 酸化還元反応を利用して、 試料中の測定対象物の量を測定 することは、 広く実施されており、 例えば、 生化学分析や臨床検査等に おける糖化夕ンパク質の測定にも適用されている。
例えば、 血液中の糖化タンパク質、 特に赤血球中の糖化ヘモグロビン は、 生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、 糖尿病診断や治療等 における重要な指標とされている。 このような赤血球中の糖化タンパク 質は、 前記酸化還元反応を用いて、 例えば、 以下に示すようにして測定 されている。
まず、 赤血球を溶血させた試料を調製し、 この溶血試料をフルクトシ ルアミノ酸ォキシダ一ゼ （以下、 「F A O D」 という） で処理し、 前記 F A O Dを糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生さ せる。 この過酸化水素量は、 前記糖化タンパク質量に対応する。 そして 、 この試料に、 さらに、 ペルォキシダーゼ （以下、 「P O D」 という） および酸化により発色する基質 （発色基質） 等を添加し、 前記 P O Dを 触媒として前記過酸化水素と前記発色基質との間で酸化還元反応させる 。 この時、 酸化によって前記酸化基質が発色するため、 この発色を測定 することによって前記過酸化水素量を測定でき、 この結果、 赤血球中の 糖化タンパク質量を知ることができる。
しかし、 血液中には、 通常、 ァスコルビン酸 （A s A ) 、 ピリルビン 等の各種還元物質が存在し、 さらに、 赤血球中には、 ダルタチオン （G S H ) 等の各種還元物質が存在する。 これらの還元物質によって、 例え ば、 前記過酸化水素が還元されたり、 前記酸化還元反応が阻害されたり 、 前記還元剤が発色した後に還元され退色するおそれがある。 このため 、 赤血球中の糖化タンパク質量を正確に測定することが困難であるとい う問題があった。
また、 試料ごとによって、 含まれる還元物質の濃度も一定ではないた め、 測定精度が劣るという問題もあった。
このような問題を回避するために、 例えば、 種々の酸化剤を前記試料 に添加するという方法がある。 例えば、 特開昭 5 6— 1 5 1 3 5 8号公 報には、 酸化剤としてヨウ素酸、 過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物を用い る方法が開示されており、 特開昭 5 7 - 1 3 3 5 7号公報、 特開昭 5 7
- 1 6 1 6 5 0号公報、 特開昭 5 9— 1 9 3 3 5 4号公報、 特開昭 6 2
- 1 6 9 0 5 3号公報、 特開平 3 - 3 0 6 9 7号公報には、 酸化剤とし てコバルト、 鉄、 セリウム等の金属錯体を用いる方法が開示されている
発明の開示
しかしながら、 これら従来の方法では、 試料によっては測定精度が十 分に向上しない場合もある。 また、 前述のように、 血液中の糖化タンパ ク質は、 糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、 こ れを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、 更なる 測定精度の向上が望まれている。
そこで、 本発明の目的は、 試料中の測定対象物を、 酸化還元反応を用 いて測定する方法であって、 信頼性に優れる測定値が得られる測定方法 の提供である。 前記目的を達成するために、 本発明の測定方法は、 ヘモグロビンまた はヘモグロビン分解物を含む試料中の測定対象物を、 酸化還元反応を用 いて測定する方法であって、 スルホン酸化合物および二ト口化合物の少 なくとも一方を前記試料に添加して、 前記試料に含まれる前記へモグロ ビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除することを特徴とする。 本発明者らは、 （ i ) 前記従来の方法では、 前記 A s Aや G S Hのよ うな低分子量還元物質の影響は排除されるが、 タンパク質等のような高 分子量還元物質による影響が排除されないこと、 さらに、 （i i ) 試料を テトラゾリゥム化合物で処理すれば、 前記低分子量還元物質だけでなく 、 前記高分子量還元物質、 特にヘモグロビンやヘモグロビン分解物 （以 下、 両者あわせて 「ヘモグロビン」 という） の酸化還元物質としての影 響も排除できることを見出した。 なお、 これについて、 本出願人は別途 出願している。 しかしながら、 前記テトラゾリゥム化合物は、 溶解性が 低いため、 試料中に高濃度に含まれるヘモグロビンに対応させ難く、 ま た、 テトラゾリゥム化合物自体が酸化力を有するため、 酸化により発色 する前記基質に作用して、 誤発色を生じるおそれがあるという問題があ つた。 そこで、 本発明者らは、 測定系に影響を与えずにヘモグロビンの 影響を排除すべく、 さらに鋭意研究を行った。 その結果、 試料をスルホ ン酸化合物や二トロ化合物で処理することによって、 測定系に影響与え ることなくヘモグロビンの影響を防止できることを見出し、 本発明に到 達した。 このような本発明の測定方法によれば、 よりいつそう高精度な 測定が可能となるため、 前述のような臨床医療等における各種検査に有 用である。 発明を実施するための最良の形態
前述のように本発明の測定方法は、 試料中の測定対象物を、 酸化還元 反応を用いて測定する方法であって、 前記試料にスルホン酸化合物およ びニトロ化合物の少なくとも一方を添加することを特徵とし、 これによ つて試料中に含まれるヘモグロビンの測定系に対する影響が排除される 具体的には、 前記酸化還元反応に先立ち、 スルホン酸化合物および二 トロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して前記試料中のへ乇グ 口ピンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除し、 その後、 前記測定対 象物由来の酸化物質または還元物質を発生させ、 この量を酸化還元反応 により測定し、 この測定値から前記測定対象物の量を決定することが好 ましい。
本発明において、 へモグロビンの影響を排除するために添加する物質 は、 例えば、 スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方でも よいが、 より一層影響を排除できることから、 前記両化合物を前記試料 に添加することが好ましい。 なお、 スルホン酸化合物とニトロ化合物の 両方を添加する場合、 添加の順序は制限されず、 両方を同時に添加して もよいし、 別々に添加してもよい。 本発明において、 前記スルホン酸化合物としては、 例えば、
一般式 R— S 0 3 X
で表わされる化合物が使用できる。 前記式において、 Xは、 例えば、 N a、 K、 L i 、 H等であり、 Rは、 疎水基であることが好ましく、 例え ば、 CH3 (CH2) n - 、 CH3 (CH2) n-C 6 H4 - 、 C6H5 - 、 C6H5-N=N-C6H4- 、 C6H5-CH=C H-C6H4- 等があげられる。 前記 Rにおける nは、 例えば、 1〜 2 0の範 囲である。 なお、 前記 Rにおいて、 「H」は、 ァシル基、 ニトロ基、 ニト ロソ基、 フエニル基、 アルキル基、 アルキルエーテル基等で置換されて もよい。
前記スルホン酸化合物の具体例としては、 例えば、. ラウリル硫酸ナト リウム （以下、 「SLS」 という） 、 ドテ"シル Vンセ'、ンスルホン酸ナトリウム （以下、 「 SDBS」 という） 、 ラウリル硫酸リチウム （以下、 「L iLS」 という） 、 4- アミノアゾベンゼン— 4 ' -スルホン酸ナトリウム （以下、 「ABSA」 とい う） 、 4-ァミノ- 4' -ニトロスチルベン- 2， 2 ' -ジスルホン酸 2ナトリウ ム (以下、 「ANDS」 という） 、 , 4 ' -ジァゾスチルベンゼン- 2， 2 ' -ジ スルホン酸 2ナトリウム （以下、 「DADS」 という） 、 N-シクロへキシ ル- 2-アミノエタンスルホン酸、 N -シクロへキシル -3-ァミノプロパンス ルホン酸、 N-シクロへキシル -2-ハイ ドロキシ -3-アミノプロパンスルホ ン酸、 ピぺラジン- 1，4 -ビス （2 -エタンスルホン酸） 、 バソフェナント 口リンスルホン酸等が使用でき、 より好ましくは、 SLS、 SDBS、 L iLSで ある。 本発明において、 前記ニトロ化合物としては、 特に制限されないが、 例えば、 二トロベンゼン化合物ゃジニトロベンゼン化合物等があげられ る。 これらの化合物は、 ベンゼン環が、 ニトロ基の他に、 例えば、 一 NH 2、 - 0H、 - C00H、 - S03、 -（CH2 ) n CH3 ( n = 2〜9 ) 等の置換基を有する ことが好ましく、 これらの中でも親水基を置換基として有することが好 ましい。 前記置換基としては、 例えば、 ハロゲン基、 エーテル基、 フエ ニル基などがあげられる。
前記ニトロ化合物の具体例としては、 例えば、 2, 4-ジニトロフエノー ル ( 2 , 4-DNP) 、 2， 5 -ジニトロフエニル、 2, 6-ジニト口フエニル、 4， 6- ジニトロ- 2-メチルフエノール、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 2-アミ ノ- 5-ニトロフエノール、 2—ァミノ- 4一二トロフエノール、 p—二トロフ ェノール （p- NP) 、 2,4-ジニトロア二リン （2，4-DNA) 、 p-二トロア二 リン （P-NA) 、 亜硝酸ナトリウム （NaN02) 、 亜硝酸カリウム （KN02) 、 4 -ァミノ- 4' -ニトロスチルへ'、ン- 2,2'-シ'、スルホン酸 2ナトリウム (以下、 rANPSj と いう） 、 ニトロベンゼン等が使用できる。 また、 スルホン酸化合物とニトロ化合物とを併用する場合、 これらの 組み合せは特に制限されない。
これらのスルホン酸化合物やニトロ化合物は、 例えば、 前述のような テトラゾリゥム化合物に比べて溶解性に優れるため、 試料中のへモグロ ビン濃度が高濃度であっても処理が容易であり、 また、 コス トの面でも 低価格であるため、 非常に有用である。 本発明の測定方法において、 前記スルホン酸化合物やニトロ化合物の 添加量は、 特に制限されず、 例えば、 試料の種類、 前記試料に含まれる ヘモグロビンの量やその他の還元物資の量等などによって適宜決定でき る。 具体的な例を以下に示す。
スルホン酸化合物および二ト口化合物のいずれか一方を添加する場合 は、 例えば、 試料 1 / 1当たり、 いずれかの化合物を、 0. 0 1〜 1 0 0 0 mo 1の範囲になるように添加することが好ましく、 より好まし くは 0. 0 3〜2 0 0 mo 1 の範囲、 特に好ましくは、 0. 0 5〜4
0 nrno I の範囲である。
また、 スルホン酸化合物および二ト口化合物の両方を添加する場合は
、 例えば、 試料 1 II 1当たり、 前記スルホン酸化合物 0. 0 0 5〜2 0 mo 1の範囲、 ニトロ化合物 0. 0 0 5〜 2 5 m o 1の範囲で添加 することが好ましく、 より好ましくはスルホン酸化合物 0. 0 2〜4 /x m o l の範囲、 ニトロ化合物 0 . 0 1〜 5 m o 1 の範囲である。 本発明において、 前記酸化還元反応は、 酸化酵素により、 前記測定対 象物由来の酸化物質を還元し、 かつ、 酸化により発色する基質 （発色基 質） を酸化させる発色反応であり、 前記酸化物質の量の測定が、 前記発 色反応による発色の程度の測定であることが好ましい。 前記発色程度の 測定は、 例えば、 前記基質の検出波長における吸光度測定によって行う ことができる。
前記発色基質としては、 例えば、 N- (カルホ'キシメチ)レアミノカルホ"ニル） -4， 4， -ビス (シ"メチルァミノ）シ、、フ Xニルァミンナトリウム （以下、 「DA- 64」 という） 、 トリンダー試 薬と 4—ァミノアンチピリ ンとの組み合せ、 Ν, Ν, Ν ' , Ν ' , Ν ' ' , Ν ' ， ，-へキサ（3 -スルホフ。口ピル） -4, 4， ，4， ， -トリアミノトリフエニルメタン へキサソテ'、ィゥム塩 （以下 、 「TPM-PS」 という） 、 Ν，Ν，Ν'，Ν' , Ν' ' , Ν， ' -へキサ （2-ヒド Dキシ- 3-スルホフ。ロピ ル） -4, 4'、 4' ' -トリアミノトリフ Iニルメタン Λキサソテ"ィゥム塩 （以下、 ΓΤΡΜ-OSJ という ) 、 10 -（カルホ'、キシメチルァミノカルホ'、ニル） 3, 7-ビス（シ"メチルァミノ）フエノチアシ' 'ン ナトリウム塩 (以 下、 「DA- 67」 という） 、 10- (メチルァミノカルホ"ニル） 3， 7-ビス（シ'メチルアミハフエノチアシ" ン （以下、 「MCDP」 という） 、 10 -（カルホ'、キシァミノメチル -4 -へ"ンソ"アミノカルホ'ニル） 3， 7_ビス（シ'メチルァミノ）フ Iノチアシ'ンナトリウム塩 （以下、 ΓΜΜΧ] という） 等が使用で きる。 これらの中でも、 例えば、 TPM_PS、 TPM- OS等のトリフエ二ルメ夕 ン系の発色基質が好ましく、 その中でも特にトリアミノ トリフエニルメ 夕ン系の発色基質が好ましい。
前記トリ ンダー試薬としては、 例えば、 フエノール、 フエノール誘導 体、 ァニリ ン誘導体、 ナフ トール、 ナフ トール誘導体、 ナフチルァミン 、 ナフチルァミン誘導体等があげられる。 また、 前記トリ ンダー試薬と 組み合わせる化合物としては、 前記 4ーァミノアンチピリンの他に、 例 えば、 アミノアンチピリン誘導体、 バニリンジァミンスルホン酸、 メチ ルペンズチアゾリノンヒドラゾン (M B T H ) 、
ズチアゾリノンヒドラゾン （S M B T H) 等も使用できる。
以上に例示する発色基質は、 通常、 4 0 0 n m以上に吸収を持っため 、 同様に 4 0 0 n mに吸収を持つ前述のようなテトラゾリゥム化合物を 使用した場合、 テトラゾリゥム化合物の存在によって測定値に誤差が生 じるおそれがあった。 しかし、 例示した前記スルホン酸化合物やニトロ 化合物は、 4 0 0 n m以上に吸収を持たないため、 これらの発色基質と 共に使用しても、 吸光度測定において誤差が生じるおそれがない。 また、 これらの発色基質と、 前記スルホン酸化合物およびニトロ化合 物との組み合せは、 特に制限されないが、 発色反応が精度良く行われる ことから、 例えば、 以下の組み合せが好ましい。 なお、 この発色基質と 、 スルホン酸化合物およびニトロ化合物との組み合せに応じて、 発色反 応の精度向上が見られることの理由'は不明である。
前記発色基質が、 M- 64、 トリンダー試薬と 4 —ァミノアンチピリン との組み合せ等の場合、 前記スルホン酸化合物および二ト口化合物の両 方を前記試料に添加することが好ましく、 例えば、 前記スルホン酸化合 物としては、 SLS、 SDBS、 L iLSを、 ニトロ化合物としては 2， 4-DNA、 2, 4- DNP、 PNA、 PNPを使用することが好ましい。
一方、 前記発色基質が、 TPM- PS、 TPM-OS, M- 67、 MCDP、 MMX等の場合 、 スルホン酸化合物を前記試料に添加することが好ましく、 より好まし くは、 スルホン酸化合物と二ト口化合物の両方を添加する。 本発明において、 前記測定対象物由来の酸化物質は、 過酸化水素であ ることが好ましく、 前記酸化酵素は、 ペルォキシダ一ゼであることが好 ましい。 本発明の測定方法において、 前記測定試料は、 特に制限されないが、 全血、 血漿、 血清、 血球等の血液試料の他に、 例えば、 尿、 髄液、 唾液 等の生体試料や、 ジュース等の飲料水、 醤油、 ソース等の食品類等もあ げられる。 本発明の測定方法において、 前記測定対象物は、 酸化還元反応を利用 するものであれば特に制限されないが、 例えば、 全血中成分、 赤血球内 成分、 血漿中成分、 血清中成分等もがあげられ、 好ましくは赤血球内成 分である。 また、 具体的には、 例えば、 糖化ヘモグロビンや糖化アルブ ミン等の糖化タンパク質、 糖化ペプチド、 糖化アミノ酸、 グルコース、 尿酸、 コレステロール、 クレアチニン、 サルコシン、 グリセロール等が あげられ、 より好ましくは糖化タンパク質である。 例えば、 前記赤血球 成分を測定する場合、 全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよ いし、 全血から赤血球を分離して、 前記赤血球を溶血させたものを試料 として用いてもよい。 本発明の測定方法において、 前記測定対象物が糖化タンパク質の場合 、 前記糖化タンパク質に FAODを作用させることによって、 前記測定 対象物由来の酸化合物物質として過酸化水素を発生させることが好まし レ 前記糖化タンパク質の糖化部分が FAODで酸化分解され、 過酸化 水素が生成するのである。 また、 前記糖化ペプチド、 糖化アミノ酸等の 糖化アミンも、 同様に FAODを作用させることが好ましい。 なお、 前 記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、 必要に応じて、 前記 FAOD処理 前に、 プロテアーゼ処理することが好ましい。
前記 FAODとしては、 下記式 （ 1) に示す反応を触媒する FAOD であることが好ましレ
R 1 ― CO— CH,— NH— R2 + HpO + 0
→R 1 - C O- CHO + NH R ( 1 ) 前記式 （ 1) において、 R1は、 水酸基もしくは糖化反応前の糖に由 来する残基 （糖残基） を示す。 前記糖残基 （R1) は、 反応前の糖がァ ルドースの場合はアルドース残基であり、 反応前の糖がケトースの場合 、 ケトース残基である。 例えば、 反応前の糖がグルコースの場合は、 ァ マドリ転位により、 反応後の構造はフルクト一ス構造をとるが、 この場 合、 糖残基 （R 1) は、 グルコース残基 （アルドース残基） となる。 こ の糖残基 （R1) は、 例えば、
- [CH (OH) ]n— CH2OH
で示すことができ、 nは、 0〜6の整数である。
前記式 （ 1) において、 R2は、 特に制限されないが、 例えば、 糖化 アミノ酸、 糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、 ο;—ァミノ基が 糖化されている場合と、 それ以外のァミノ基が糖化されている場合とで 異なる。
前記式 （ 1) において、 ひーァミノ基が糖化されている場合、 R2は 、 下記式 （2) で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
- CHR3- CO-R4 . . . (2) 前記式 （2) において、 R3はアミノ酸側鎖基を示す。 また、 R4は水 酸基、 アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、 例えば、 下記式 （3) で示すことができる。 下記式 （3) において、 nは、 0以上の整数であ り、 R3は、 前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
― (NH- CHR3- CO) n-OH . . . (3) また、 前記式 （ 1) において、 α—ァミノ基以外のァミノ基が糖化さ れている （アミノ酸側鎖基が糖化されている） 場合、 R 2は下記式 （4 ) で示すことができる。 一 R5— CH (NH- R6) - C O - R 7 · · · (4) 前記式 （4) において、 R5は、 アミノ酸側鎖基のうち、 糖化された アミノ基以外の部分を示す。 例えば、 糖化されたアミノ酸がリジンの場 合、 R5は
~ し H2―し H2—し riり ^ ~し riゥ 一
であり、
例えば、 糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、 R5は、
- C H 2 - C H 2 - C H 2 - N H - C H (NH2) - である。
また、 前記式 （4) において、 R6は、 水素、 アミノ酸残基またはべ プチド残基であり、 例えば、 下記式 （5) で示すことができる。 なお、 下記式 （5) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同様 にアミノ酸側鎖基を示す。 一 （CO - CHR3 - NH) n-H . . . (5) また、 前記式 （4) において、 R7は、 水酸基、 アミノ酸残基または ペプチド残基であり、 例えば、 下記式 （6) で示すことができる。 なお 、 下記式 （6) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同 様にアミノ酸側鎖基を示す。 ― (NH— CHR3 - CO) n-OH . . . (6)
(実施形態 1 )
つぎに、 本発明の測定方法について、 血球中の糖化タンパク質を測定 する例をあげて説明する。
まず、 全血をそのまま溶血し、 または全血から遠心分離等の常法によ り血球画分を分離してこれを溶血し、 溶血試料を調製する。 この溶血方 法は、 特に制限されず、 例えば、 界面活性剤を用いる方法、 超音波によ る方法、 浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。 この中でも、 操作 の簡便性等の理由から、 前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、 例えば、 ホ。リ才キシエチレン - p-卜才クチルフエニル ： C-テル ( T r i t o n系界面活性剤等） 、 ホ。リオキシエチレン 'ノルビタン アルキル エステル (Tw e e n系界面活性剤等） 、 ホ。リオキシエチレン アルキル ェ-テル （B r i j系界面活性 剤等） 等の非イオン性界面活性剤が使用でき、 具体的には、 例えば、 T r i t o n X- 1 0 0 , Twe e n— 2 0、 B r i j 3 5等があげられ る。 前記界面活性剤による処理条件は、 通常、 処理溶液中の血球濃度が 、 1〜 1 0体積％の場合、 前記処理溶液中の濃度が 0. 0 1〜 5重量％ となるように前記界面活性剤を添加し、 室温で、 数秒 （約 5秒） 〜 1 0 分程度攪拌すればよい。 つぎに、 前記溶血試料に対して、 スルホン酸化合物およびニトロ化合 物の少なくとも一方を添加し、 前記溶血試料の前処理を行う。 前記スルホン酸化合物と二ト口化合物は、 いずれか一方でもよいし、 両方を添加してもよいが、 前述のように後の工程で使用する発色基質の 種類によって、 適宜決定することが好ましい。
スルホン酸化合物およびニトロ化合物のいずれか一方を添加する場合 、 その添加量は特に制限されず、 前述の添加割合があげられる。 具体的 には、 この前処理溶液中の血球濃度が 1体積％の場合、 例えば、 ニトロ 化合物の濃度が 0. 05〜 500 mmo 1 /Lの範囲であり、 好ましく は 0. 2〜 10 Ommo 1 ZLの範囲である。 また、 この前処理溶液中 の血球濃度が 1体積％の場合、 例えば、 スルホン酸化合物の濃度が 0. 05〜20 Ommo 1 /Lの範囲であり、 好ましくは 0. 2〜40mm o 1 ZLの範囲である。
また、 スルホン酸化合物および二ト口化合物の両方を試料に添加する 場合も、 その添加量は特に制限されず、 例えば、 前述の添加割合があげ られる。 具体的には、 この前処理溶液中の血球濃度が、 1体積％の場合 、 例えば、 スルホン酸化合物濃度 0. 05〜20 Ommo 1 ZL、 ニト 口化合物濃度 0. 05〜 25 Ommo 1 ZLの範囲であり、 好ましくは スルホン酸化合物濃度 0. 2〜40mmo l ZL、 ニトロ化合物濃度 0 . 1〜 50 mmo 1 /Lの範囲である。 このようにスルホン酸化合物と ニトロ化合物との両方を添加する場合、 前述のように、 いずれを先に添 加してもよいし、 また同時に添加してもよい。
前記スルホン酸化合物および二ト口化合物は、 そのまま使用してもよ いが、 操作の簡便性や処理効率等の点から、 溶媒に溶解したスルホン酸 化合物溶液またはニトロ化合物溶液として使用することが好ましい。 前 記各溶液の濃度は、 その種類等により適宜決定でき、 例えば、 スルホン 酸化合物溶液は、 5〜100 Ommo 1 ZLの範囲であり、 好ましくは 5〜400 mmo 1 ZLの範囲であり、 ニトロ化合物溶液は、 0. 5〜 1 0 Ommo 1 /Lの範囲であり、 好ましくは 1〜 50 mmo 1 /Lの 範囲である。 前記溶媒としては、 例えば、 蒸留水、 生理食塩水、 緩衝液 等が使用でき、 前記緩衝液としては、 例えば、 後述の緩衝液等が使用で きる。 なお、 前記両化合物は、 それぞれ一種類でもよいし、 二種類以上 を併用してもよい。
この前処理は、 通常、 緩衝液中で行われる。 前記緩衝液としては、 例 えば、 アミン系緩衝液、 リン酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 ならびに MOP S、 CHES、 C AP Sおよび CAP S O等のグッド緩衝液等が使用で きる。 前記アミン系緩衝液の緩衝剤としては、 例えば、 グリシン、 ェチ ルァミン、 ジェチルァミン、 メチルァミン、 ジメチルァミン、 トリメチ ルァミン、 トリスヒドロキシァミノメタン、 トリエ夕ノールァミン、 グ リシンアミド等があげられる。
前記緩衝液の pHは、 pH7〜l 2の範囲が好ましく、 より好ましく は： H 8〜 1 1の範囲であり、 特に好ましくは pH 8〜 10の範囲であ る。
この前処理の条件は、 特に制限されないが、 通常、 温度 10〜37°C の範囲であり、 処理時間 10秒〜 60分の範囲である。
なお、 この前処理に使用するスルホン酸化合物として、 前述のような ラウリル硫酸ナトリウム等を使用する場合は、 これ自身が界面活性剤と しての作用を奏するため、 例えば、 前述のような溶血処理と、 'この前処 理とを同じ物質 （ラウリル硫酸ナトリウム等） の添加によって、 同時に 行うことが可能である。 つぎに、 この前処理済み溶血試料に対し、 プロテアーゼ処理を行う。 これは、 後の処理に使用する FAODを測定対象物に作用し易くするた めである。 前記プロテアーゼの種類は、 特に制限されず、 例えば、 プロテアーゼ K、 ズブチリシン、 トリプシン、 アミノぺプチダ一ゼ、 メタ口プロテア ーゼ等が使用できる。 プロテアーゼ処理の条件は、 使用するプロテア一 ゼの種類、 測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等に より適宜決定される。
具体的には、 例えば、 前記プロテアーゼとしてプロテア一ゼ Κを用い て前記前処理済み溶血試料を処理する場合、 通常、 反応液中のプロテア
—ゼ濃度 1 0〜3 0, 0 0 Omg/L、 反応液中の血球濃度 0. 0 5〜 1 5体積％、 反応温度 1 5〜37°C、 反応時間 1分〜 24時間、 pH 6 〜1 2の範囲である。 このプロテアーゼ処理は、 通常、 緩衝液中で行わ れる。 前記緩衝液としては、 例えば、 前記前処理と同様の緩衝液が使用 できる。 つぎに、 前記プロテア一ゼ処理により得られた分解物を、 前記 FAO Dで処理する。 この FAOD処理により、 前記式 （1) に示す反応が触 媒される。
この FAOD処理は、 前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行う ことが好ましい。 その処理条件は、 使用する FAODの種類、 測定対象 物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される 具体的には、 例えば、 反応液中の FAOD濃度 50〜 50, 00 0 U /L、 反応液中の血球濃度 0. 0 1〜1体積％、 反応温度 1 5〜3 7°C 、 反応時間 1〜6 0分、 pH 6〜9の範囲である。 前記緩衝液の種類も 特に制限されず、 前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。 つぎに、 前記 FAOD処理で生成した過酸化水素を、 PODおよび前 記発色基質を用いて酸化還元反応により測定する。
前記酸化還元反応は、 通常、 緩衝液中で行われ、 その条件は、 前記生 成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。 通常、 反応液中の P 00濃度1 0〜 1 0 0, 00 0 I U/L、 発色性基質濃度 0. 0 0 5〜 3 Ommo 1ノ 反応温度 1 5〜 3 7 、 反応時間 0. ；!〜 3 0分、 pH 5〜 9である。 また、 前記緩衝液は、 特に制限されず、 例えば、 前 記プロテアーゼ処理および F AO D処理等と同様の緩衝液等が使用でき る。
前記酸化還元反応において、 例えば、 前記発色性基質を用いた場合、 前記反応液の発色程度 （吸光度） を分光光度計で測定することにより、 過酸化水素の量を測定できる。 そして、 この過酸化水素濃度と検量線等 とを用いて、 試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。 なお、 前記過酸化水素量は、 前記 POD等を用いた酵素的手法の他に 、 例えば、 電気的手法により測定することもできる。 この測定方法において、 前記スルホン酸化合物や二トロ化合物による 前処理工程は、 前述のように、 酸化還元反応が実質的に生じる前であれ ば、 特に制限されないが、 前記 FAOD処理後に過酸化水素が発生する ことから、 前記 FAOD処理前に行うことが好ましい。 また、 各処理工 程は、 前述のように別々に行ってもよいが、 例えば、 以下に示すような 組み合せで同時に行ってもよい処理工程がある。
1 ：溶血処理 +前処理
2 ：溶血処理 +前処理 +プロテアーゼ処理
3 ·· プロテア一ゼ処理 + FAOD処理
4 ： FAOD処理 + P〇D酸化還元処理 5 ： プロテア一ゼ処理 +FAOD処理 +P〇D酸化還元処理 また、 スルホン酸化合物やニトロ化合物の添加順序や、 前記 FAOD 、 P O Dおよび発色性基質の添加順序も特に制限されない。 このような方法によれば、 前記試料にスルホン酸化合物やニトロ化合 物を接触させることにより、 GSH、 A s A、 ジチオスレイト一ル、 シ スティン、 N—ァセチル-システィン等の低分子量還元物質だけでなく 、 特にヘモグロビンおよびヘモグロビン分解物の還元物質としての影響 を十分に排除することができる。 このため、 例えば、 酸化還元反応反応 や吸光度測定になんら影響与えることなく、 高精度で測定を行うことが できる。 また、 本発明の測定方法の前記前処理工程において、 例えば、 前記ス ルホン酸化合物やニトロ化の他に、 さらに酸化剤や酵素を併用してもよ レ^ 前記酸化剤としては、 例えば、 ョード酢酸ナトリウム、 ヨウ素酸、 過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物、 EDTA— F e等があげられ、 酵素と しては、 例えば、 ァスコルビン酸ォキシダーゼ、 ビリルビンォキシダー ゼ等が使用できる。 このような酸化剤の添加量は、 例えば、 試料 1 1 当たり 0. 00 1〜0. lmgの範囲である。 本発明の測定方法において、 測定対象物は、 酸化還元反応を利用する ものであれば、 特に制限されず、 前記糖化タンパク質の他に、 前述のよ うに、 糖化ペプチド、 糖化アミノ酸、 グルコース、 コレステロール、 尿 酸、 クレアチニン、 サルコシン、 グリセロール等があげられる。
過酸化水素を発生させて、 前記各測定対象物の量を測定する場合は、 例えば、 前記グルコースにはグルコースォキシダーゼを、 前記コレステ ロールにはコレステロールォキシダーゼを、 前記尿酸にはゥリカーゼを 、 前記クレアチニンにはサルコシンォキシダーゼを、 前記サルコシンに はサルコシンォキシダーゼを、 前記グリセロールにはグリセロールォキ シダーゼを、 それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。 この 過酸化水素量の測定方法は、 前述と同様にして行うことができる。 また 、 糖化ペプチド、 糖化アミノ酸は、 例えば、 前記糖化タンパク質の測定 と同様にして測定できる。 また、 前記スルホン酸化合物やニトロ化合物による試料中のへモグロ ビンおよびヘモグロビン分解物の処理後、 測定対象物由来の還元物質を 発生させ、 この量を酸化還元反応により測定し、 この測定値から、 前記 測定対象物の量を決定する場合は、 例えば、 以下に示すようにして測定 を行うことができる。
例えば、 前記測定対象物がグルコースの場合、 例えば、 NAD+や N ADP+等の存在下、 グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、 NADH や NADPH等の還元物質を発生させる。 そして、 前記測定対象物由来 の還元物質である NAD Hや NAD PHを、 例えば、 ジァホラーゼと、 還元により発色する基質とを用いて、 酸化還元反応により測定する。 そ して、 前述のように、 この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等 とを用いて、 試料中の測定対象物の量を求めることができる。 また、 例 えば、 測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲ ナーゼを、 サルコシンの場合は、 サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞ れ使用できる。
前記還元により発色する基質としては、 特に制限されないが、 例えば 、 前記発色性のテトラゾリゥム化合物や、 2, 6—ジクロロフエノ一ル ィンドフエノ一ル等が使用できる。 実施例
つぎに、 実施例について比較例と併せて説明する。 (実施例 1 )
この実施例は、 発色性基質として TPM- PSを使用して、 フルク トシルバ リン （以下、 「FV」 という） を含むヘモグロビン試料を、 スルホン酸 化合物およびニトロ化合物で処理し、 FV量を測定した例である。 以下 に、 使用した試料、 試薬および方法を示す。
(測定試料の調製）
ヘモグロビン凍結品を精製水で溶解し、 5 0 gZLのヘモグロビン溶 液を調製した。 一方、 FVを、 特開平 2— 6 9 644号公報にしたがつ て製造し、 これを精製水に溶解して 1 mMの FV溶液を調製した。 そし て、 前記ヘモグロビン溶液 3 7 1、 F V溶液 6 0 1および精製水 2 0 3 1 を混合して、 測定試料とした。
(第 1試薬）
スルホン酸化合物 3.2mM> 6.4mMまたは 12.8mM 界面活性剤 （ホ °リオキシエチレン (9)ド τ シル； t-テル） 1. 8 5 gノ L
CHES-CHES · Na緩衝液 （pH9.4) 40 mM
MOPS- MOPS · Na緩衝液 （ρΗ9·4) 1 5mM 前記第 1試薬のスルホン酸化合物としては、 S L S (ナカライテスク社製). 、 S DB S (和光純薬社製） 、 AB SA (東京化成社製） 、 AND S ( 東京化成社製） 、 DAD S (東京化成社製） をそれぞれ使用した。 (第 2試薬）
ニトロ化合物 （2,4-DNA：和光純薬社製） OmM 又は 6.4mM メタ口プロテアーゼ （アークレイ社製） 2. OMU/L
ctし 12 ' 2.5mM
N a C 1 5 OmM
MOPS-MOPS■ 緩衝液 (pH6.5) 1. OmM
(第 3試薬）
F AOD (アークレイ社製） 18KU/L
POD (キッコーマン社製） 67KU/L
Figure imgf000021_0001
TPM-PS (同仁化学社製) 0.25mM
ADA緩衝液 （pH7.0) 300mM
(方法）
前記測定試料 0. 14 ii Lに前記第 1試薬 8. 2 6 Lを添加した後 、 さらに、 前記第 2試薬 7 5. 6 x Lを混合して、 3 7 °Cで 5分間放置 した。 そして、 この混合液に前記第 3試薬 1 8. 9 Lを混合し、 3 7 °Cでインキュベートして発色反応を行った。 そして、 5分後の吸光度を 商品名 J CA— BM8 (日本電子社製） で測定した。 測定波長は、 主波 長 5 7 1 nm、 副波長 8 0 5 nmとした。 一方、 比較例としては、 第 1 試薬のスルホン酸化合物、 第 2試薬の二ト口化合物を添加してない以外 は、 前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。 なお、 試料に第 1 試薬および第 2試薬を混合した時点での、 試料 1 Lに対するスルホン 酸化合物の添加量は、 0. 1 8 9 mo l、 0. 3 7 8 zmo l、 0. 7 5 5 ^mo 1であり、 ニトロ化合物の添加量は、 3. 4 6 mo 1で あった。
(表 1)
スルホン酸化合物（raM) —ニト D化合物（mM) —吸光度 OnAbs) 実施例 1-1 SLS (3.2) 2, 4-DNA (0.9) 149
1-2 SLS (6.4) 2,4-DNA (0.9) 1 54 1-3 SLS (12.8) 2, 4-DNA (0.9) 1 6 0 1-4 SDBS (6.4) 2, 4-DNA (0.9) 1 2 1 1-5 SLS (6.4) 1 54 1-6 ABSA (6.4) 1 3 2 1-7 ANDS (6.4) 1 1 3 1-8 DADS (6.4) 1 24 比較例 1 3 0 前記表 1に示すように、 実施例 1のように、 各種スルホン酸化合物ま たはこれらとニトロ化合物との併用によって、 比較例に比べて、 試料中 の FV量を示す吸光度が増加した。 この結果から、 本実施例によれば、 前記スルホン酸化合物および二ト口化合物によって、 試料中のへモグロ ビンの影響が排除されたことがわかる。
(実施例 2 )
この実施例は、 発色性基質として DA-64を使用して、 FVを含むへモ グロビン試料を、 スルホン酸化合物およびニトロ化合物で処理し、 FV 量を測定した例である。 以下に、 使用した試料、 試薬および方法を示す (測定試料の調製）
前記実施例 1において調製したヘモグロビン溶液 6 0 と、 前記 F V溶液 3 7 Lおよび精製水 2 0 3 Lを混合して、 測定試料とした。
(第 1試薬）
スルホン酸化合物 (SLS：ナカライテスク社製) 6. 4 mM 界面活性剤 (ホ。リオキシエチレン (9)ラウリルエ-テル) . 8 5 g/L CHES- CHES · Na緩衝液 (pH9.4) 40 mM MOPS-MOPS · Na緩衝液 (pH9.4) 1 5 mM
(第 2試薬）
ニトロ化合物 0. 9 mM メタ口プロテア一ゼ （アークレイ社製） 2. 0 MU/L C a C 1 2 2. 5 mM N a C 1 5 0 mM
MOPS- MOPS · Na緩衝液 (pH6.5) 1. 0 mM 前記ニトロ化合物としては、 2， 4—DNA (和光純薬工業社製） 、 ρ - NA (和光純薬工業社製） 、 p-NP (和光純薬工業社製） 、 NaN02 (ナカライ テスク社製） 、 2,4- DNH (和光純薬工業社製） をそれぞれ使用した。 な お、 ニトロ化合物を二種類添加する場合は、 それぞれ 0. 9mMとし、 合計 1. 8mMとした。 (第 3試薬）
FAOD (アークレイ社製） 1 7. 5 KU/L
POD (キッコーマン社製） 67 KUZL
DA-64 (和光純薬工業社製） 70 M Tris- HC1緩衝液 （pH7.0) 3 0 OmM
(方法）
前記測定試料 0. 14 ^ Lに前記第 1試薬 8. 26 Lを添加した後 、 さらに、 前記第 2試薬 7 5. 6 Lを混合して、 37 °Cで 5分間放置 した。 そして、 この混合液に前記第 3試薬 1 8. 9 Lを混合し、 3 7 °Cでインキュベートして発色反応を行った。 そして、 5分後の吸光度を 商品名 J CA— BM8 (日本電子社製） で測定した。 測定波長は、 主波 長 7 5 1 nm、 副波長 80 5 nmとした。 一方、 比較例としては、 第 1 試薬のスルホン酸化合物、 第 2試薬のニトロ化合物を添加してない以外 は、 前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。 これらの結果を下 記表 2に示す。
(表 2)
スルホン酸化合物 OnM) こトロ化合物（mM) 吸光度（mAbs) 実施例 2-1 SLS (6.4) 2,4-DNA (0.9) 5 1. 3
2-2 SLS (6.4) p-NA (0.9) 41. 0 2-3 SLS (6.4) P-NP (0.9) 41. 5 2-4 SLS (6.4) NaN02 (0.9) 41. 5 2-5 SLS (6.4) 2,4-DNA (0.9) 2 7 7. 0
P-NP (0.9)
2-6 SLS (6.4) 2,4-DNA (0.9) 2 7 9. 0
P-NA (0.9)
2-7 SLS (6.4) p-NP (0.9) 2 6 7. 0
P-NA (0.9)
2-8 SLS (6.4) 2,4-DNA (0.9) 2 5 7. 0
NaN3 (0.9)
比較例 1 2 前記表 2に示すように、 実施例 2は、 スルホン酸化合物および各種二 トロ化合物の併用によって、 比較例に比べて、 試料中の FV量を示す吸 光度が増加した。 さらに、 ニトロ化合物を二倍量添加することによって 、 より一層吸光度が増加した。 これらの結果から、 本実施例によれば、 前記スルホン酸化合物おょぴニト口化合物によって、 試料中のへモグロ ビンの影響が排除されたことがわかる。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明の測定方法は、 前記スルホン酸化合物やニトロ 化合物を試料に添加することにより、 試料中のヘモグロビンの還元物質 としての影響を排除できるため、 信頼性に優れた測定を行うことができ る。 したがって、 本発明の測定方法は、 例えば、 臨床医療における各種 分析に適用でき、 特に、 糖尿病診断において重要である、 赤血球中の糖 化ヘモグロビン等の糖化タンパク質の測定に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物を含む試料中の測定対象物 を、 酸化還元反応を用いて測定する方法であって、 スルホン酸化合物お よびニトロ化合物の少なくとも一方を前記試料に添加して、 前記試料に 含まれる前記ヘモグロビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除する ことを特徴とする測定方法。
2. 前記酸化還元反応に先立ち、 スルホン酸化合物およびニトロ化合 物の少なくとも一方を前記試料に添加して前記試料に含まれるへモグロ ビンまたはヘモグロビン分解物の影響を排除し、 その後、 前記測定対象 物由来の酸化物質または還元物質を発生させ、 この量を前記酸化還元反 応により測定し、 この測定値から前記測定対象物の量を決定する請求の 範囲 1記載の測定方法。
3. スルホン酸化合物および二トロ化合物の両方を前記試料に添加す る請求の範囲 1記載の測定方法。
4. 前記スルホン酸化合物が、 ラウリル硫酸ナトリウム （S L S) 、 ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム （SDB S) 、 ラウリル硫酸リ チウム （L i L S ) 、 4-アミノアゾベンゼン一 4， -スルホン酸ナトリウ ム （AB SA) 、 4 -ァミノ- 4' -ニトロスチルベン - 2, 2， -ジスルホン酸 2ナトリウム (AND S) および 4， 4' -ジァゾスチルベンゼン- 2， 2' - ジスルホン酸 2ナトリウム （DAD S) からなる群から選択された少な くとも一つである請求の範囲 1記載の測定方法。
5 . 前記ニトロ化合物が、 2， 4-ジニトロフエノール （2, 4-DNP) 、 p —ニトロフエノ一ル （P- NP) 、 2, 4-ジニトロア二リン （2, 4- DNA) 、 p - 二トロア二リン （p-N 0 、 亜硝酸ナトリウム （NaN02 ) 、 亜硝酸力リウ ム （KN02 ) 、 4-ァミノ- 4' -二トロスチル Vン- 2，2' -シ'、スルホン酸 2ナトリウム （ANPS) および二トロベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである 請求の範囲 1記載の測定方法。
6 . 前記酸化還元反応が、 酸化酵素により、 前記測定対象物由来の酸 化物質を還元し、 かつ、 酸化により発色する基質を酸化させる発色反応 であり、 前記酸化物質の量の測定が、 前記発色反応による発色程度の測 定である請求の範囲 2記載の測定方法。
7 . 前記発色程度の測定が、 前記基質の検出波長における吸光度測定 である請求の範囲 6記載の測定方法。
8 . 前記測定対象物由来の酸化物質が、 過酸化水素である請求の範囲 2記載の測定方法。
9 . 前記酸化酵素が、 ペルォキシダ一ゼである請求の範囲 6記載の測 定方法。
1 0 . 測定対象物が、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドおよび糖化アミ ノ酸からなる群から選択された少なくとも一つであって、 前記測定対象 物にフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼを作用させることによって、 前 記測定対象物の酸化物質として過酸化水素を発生させる請求の範囲 2記 載の測定方法。
1 1. 前記測定対象物に前記フルク トシルアミノ酸ォキシダーゼを作 用させる前に、 前記試料にスルホン酸化合物および二ト口化合物の少な く とも一方を添加する請求の範囲 1 0記載の測定方法。
1 2. 前記酸化により発色する基質が、 - (カルホ'キシメチルアミゾカルホ'ニル) -4 ,4' -ビス (シ'、メチルァミノ） フェニルァミンナトリウム、 トリ ンダー試薬と 4-アミノアンチピリン との組み合せ、 Ν,Ν, Ν'，Ν' ,Ν' ' ,Ν' ' -へキサ (2 -ヒト"口キシ- 3 -スルホフ。 Πピル) -4,4'
、 ' ' -トリアミノトリフエニル タン へキサリテ"ィゥム塩、 10- (カルホ'、キシメチルァミノカルホ'、ニル） 3， 7—ビス ( シ'メチルァミノ）フエノチアシ'ン ナトリウム塩、 10 -（メチルァミノカルホ"ニル） 3， 7 -ビス（シ"メチルァミノ）フエノ チアシ"ンおよび 10- (カルホ"キシアミノメチル- 4-へ'ン'ノ"ァミノカルホ'、ニル) 3, 7-ビス（シ"メチルァミノ）フエ ノチアシ"ンナトリウム塩からなる群から選択された少なく とも一つの化合物であ つて、 スルホン酸化合物およびニトロ化合物の両方を前記試料に添加す る請求の範囲 1記載の測定方法。
1 3. 前記酸化により発色する基質が、 Ν,Ν,Ν' ,Ν' ,Ν' ' ，Ν' ' ， -へキ サ（3 -スルホフ。 Dピル）- 4， 4' ，4， ' -トリアミノトリフエニルメタン Λキサリテ'、ィゥム塩、 Ν,Ν,Ν' ,Ν' ,Ν，'，Ν'， -へキサ （2-ヒドロキシ- 3-スルホフ。口ピル） _4， 4'、 4' ' -トリアミノトリフエニルメタン へキサ リテ"ィゥム塩、 10 -（カルホ'キシメチ)レアミノカルホ'ニル） 3, 7-ビス（シ" ミハフエノチアシ"ン ナトリウム 塩、 10 -（メチルァミノカルホ"ニル） 3， 7-ビス（シ"メチルァミノ）フエノチアシ'、ンおよび 10- (カルホ"キシアミ ノメチル- 4 - ン',アミノカルホ"ニル） 3, 7_ビス（シ'、メチル Πノ）フエノチアシ"ンナトリウム塩からなる群 から選択された少なく とも一つの化合物であって、 少なく ともスルホン 酸化合物を前記試料に添加する請求の範囲 1に記載の測定方法。
1 4. 測定対象物が、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドおよび糖化アミ ノ酸からなる群から選択された少なく とも一つである請求の範囲 1記載 の測定方法。
1 5. 糖化タンパク質が、 糖化ヘモグロビンである請求の範囲 14記 載の測定方法。
1 6. 前記試料が、 赤血球の溶血試料である請求の範囲 1記載の測定 方法。
1 7. .前記試料に対するスルホン酸化合物の添加割合が、 血球 1体積 %に対して 0. 0 5〜2 0 Ommo 1 /Lである請求の範囲 1 6記載の 測定方法。
1 8. 前記試料に対するニトロ化合物の添加割合が、 血球 1体積％に 対して 0. 0 5〜 5 0 Ommo 1 /Lである請求の範囲 1 6記載の測定 方法。
1 9. 前記試料に対するスルホン酸化合物およびニトロ化合物の添加 割合が、 血球 1体積％に対してスルホン酸化合物 0. 0 5〜 2 00 mm o 1 /L、 ニトロ化合物 0. 0 5〜2 5 Ommo 1/Lである請求の範囲 1 6記載の測定方法。
PCT/JP2003/005486 2002-06-14 2003-04-28 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法 WO2003107011A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003235974A AU2003235974A1 (en) 2002-06-14 2003-04-28 Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound
JP2004513779A JP4061366B2 (ja) 2002-06-14 2003-04-28 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
EP03720984.8A EP1515144B2 (en) 2002-06-14 2003-04-28 Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound
AT03720984T ATE445844T1 (de) 2002-06-14 2003-04-28 Testverfahren mit einer sulfonsäure- und einer nitroverbindung
US10/517,853 US7354732B2 (en) 2002-06-14 2003-04-28 Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound
DE60329679T DE60329679D1 (de) 2002-06-14 2003-04-28 Testverfahren mit einer sulfonsäure- und einer nitroverbindung

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002174896 2002-06-14
JP2002-174896 2002-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003107011A1 true WO2003107011A1 (ja) 2003-12-24

Family

ID=29727998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/005486 WO2003107011A1 (ja) 2002-06-14 2003-04-28 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7354732B2 (ja)
EP (1) EP1515144B2 (ja)
JP (1) JP4061366B2 (ja)
CN (1) CN100394187C (ja)
AT (1) ATE445844T1 (ja)
AU (1) AU2003235974A1 (ja)
DE (1) DE60329679D1 (ja)
WO (1) WO2003107011A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080423B2 (en) 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
WO2012020745A1 (ja) 2010-08-11 2012-02-16 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
WO2012020744A1 (ja) 2010-08-11 2012-02-16 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
US8268017B2 (en) 2007-02-22 2012-09-18 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing leuco-type colorant
WO2012173185A1 (ja) 2011-06-17 2012-12-20 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット
WO2013118743A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 協和メデックス株式会社 アスコルビン酸の影響抑制方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003235975A1 (en) * 2002-07-17 2004-02-02 Arkray, Inc. Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
KR20070026404A (ko) * 2004-03-17 2007-03-08 다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤 피산화성 정색시약의 안정화 방법
US20090075284A1 (en) * 2006-09-19 2009-03-19 The Regents Of The University Of Michigan Metabolomic profiling of prostate cancer
KR101207418B1 (ko) * 2012-02-10 2012-12-04 주식회사 아이센스 효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석용 용혈시약 조성물
CN103483229B (zh) * 2013-09-12 2015-06-17 杭州隆基生物技术有限公司 一种atp释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂
KR102646392B1 (ko) * 2015-03-31 2024-03-11 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법
CN105295441B (zh) * 2015-11-20 2018-05-08 三诺生物传感股份有限公司 一种显色剂的稳定剂及其应用
EP3492529A4 (en) * 2016-07-29 2020-12-16 Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. PROCESS FOR PRESERVING AN AQUEOUS SOLUTION CONTAINING A LEUCO-TYPE CHROMOGEN
JP7056577B2 (ja) * 2016-11-30 2022-04-19 東洋紡株式会社 ヘモグロビンの糖化率測定方法
CN113311465B (zh) * 2021-04-08 2022-04-19 中国辐射防护研究院 一种样品中Pu同位素和Np-237含量的联合分析方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54123096A (en) * 1978-02-13 1979-09-25 Miles Lab Method and test implement for measuring oxidizable substanceand method of making said test implement
JPS6184A (ja) * 1984-06-09 1986-01-06 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規なテトラゾリウム化合物
JP2000093199A (ja) * 1998-09-28 2000-04-04 Lifescan Inc テトラゾリウム化合物に基づく診断
JP2001292795A (ja) * 2000-02-25 2001-10-23 Lifescan Inc テトラゾリウム化合物に基づく診断

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1114411A (en) * 1912-02-27 1914-10-20 Stephen T Stuver Shredding-machine.
US2271175A (en) * 1938-12-30 1942-01-27 Mantelet & Boucher Portable rotary grater
US2487597A (en) * 1946-09-13 1949-11-08 Archer M Sampson Rotary disk shaver with axially manually fed pusher
FR2230320B3 (ja) * 1973-05-23 1976-05-14 Moulinex Sa
US4081145A (en) * 1977-04-18 1978-03-28 Diker-Moe Associates Food cutting machine
US4214715A (en) * 1978-08-15 1980-07-29 M. H. Graham Corporation Rotary food cutting apparatus
US4219165A (en) * 1978-10-10 1980-08-26 Saladmaster, Inc. Attachment for food cutters
US4227656A (en) * 1978-12-22 1980-10-14 Hobart Corporation Vegetable slicer
DE3012368C2 (de) * 1980-03-29 1982-04-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen
US4310626A (en) 1980-06-02 1982-01-12 Miles Laboratories, Inc. Interference-resistant composition, device and method for determining a peroxidatively active substance in a test sample
JPS57161650A (en) 1981-03-16 1982-10-05 Miles Lab Test device for measuring peroxidizing active material in sample and manufacture thereof
ZA841185B (en) 1983-03-28 1984-09-26 Miles Lab Ascorbate interference-resistant composition,device and method for the determination of peroxidatively active substances
US4587220A (en) * 1983-03-28 1986-05-06 Miles Laboratories, Inc. Ascorbate interference-resistant composition, device and method for the determination of peroxidatively active substances
JPS60168050A (ja) 1984-02-10 1985-08-31 Wako Pure Chem Ind Ltd ヘモグロビンの影響回避方法
US4755472A (en) * 1986-01-16 1988-07-05 Miles Inc. Stable composition for the determination of peroxidatively active substances
US4884755A (en) * 1988-08-30 1989-12-05 Presto Industries, Inc. Food processor
JPH0269644A (ja) 1988-09-05 1990-03-08 Toshiba Corp セラミックス体の非破壊検査方法
US4954451A (en) * 1989-06-26 1990-09-04 Miles Inc. Agent for diminishing ascorbate interference in reagent systems and method relating thereto
US5148995A (en) * 1991-08-01 1992-09-22 Hurst Richard F Apparatus for decomposting compressed tablets
US5840701A (en) * 1993-08-16 1998-11-24 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
BR9407833A (pt) * 1993-10-14 1997-05-13 Procter & Gamble Composições alvejantes compreendendo enzimas protease
DE59507049D1 (de) * 1995-03-01 1999-11-18 Weigert Chem Fab Reinigungsmittel für chirurgische Instrumente
JP2945861B2 (ja) * 1995-11-30 1999-09-06 タナシン電機株式会社 テープレコーダの動作切換装置
JPH09185021A (ja) 1995-12-28 1997-07-15 Toray Ind Inc コンタクトレンズ用洗浄保存液
US5660341A (en) * 1996-02-15 1997-08-26 The Pampered Chef, Ltd. Rotary grater
JPH10210967A (ja) 1996-11-29 1998-08-11 Ajinomoto Co Inc 高活性変異株及びそれを用いる蛋白加水分解物の製造法
EP0921198B1 (en) * 1997-04-24 2006-07-19 ARKRAY, Inc Method for enzymatically assaying saccharification protein
JPH11196897A (ja) 1998-01-09 1999-07-27 Kdk Corp 糖化タンパク質の測定方法及び測定装置
US6352835B1 (en) 1998-11-17 2002-03-05 Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. Method of measuring substance in sample using a redox reaction
USRE46105E1 (en) * 2000-07-14 2016-08-16 Arkray, Inc. Method of selectively determining glycated hemoglobin
US6790665B2 (en) * 2000-09-28 2004-09-14 Arkray, Inc. Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin
WO2002027331A1 (fr) 2000-09-28 2002-04-04 Arkray, Inc. Methode d'analyse utilisant une reaction d'oxydo-reduction
US20020173043A1 (en) * 2001-04-04 2002-11-21 Eddine Merabet Cyanide-free reagent, and method for detecting hemoglobin

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54123096A (en) * 1978-02-13 1979-09-25 Miles Lab Method and test implement for measuring oxidizable substanceand method of making said test implement
JPS6184A (ja) * 1984-06-09 1986-01-06 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規なテトラゾリウム化合物
JP2000093199A (ja) * 1998-09-28 2000-04-04 Lifescan Inc テトラゾリウム化合物に基づく診断
JP2001292795A (ja) * 2000-02-25 2001-10-23 Lifescan Inc テトラゾリウム化合物に基づく診断

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080423B2 (en) 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
US8268017B2 (en) 2007-02-22 2012-09-18 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing leuco-type colorant
WO2012020745A1 (ja) 2010-08-11 2012-02-16 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
WO2012020744A1 (ja) 2010-08-11 2012-02-16 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
US9090931B2 (en) 2010-08-11 2015-07-28 Kyowa Medex Co., Ltd Method for measuring glycated hemoglobin
WO2012173185A1 (ja) 2011-06-17 2012-12-20 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット
JPWO2012173185A1 (ja) * 2011-06-17 2015-02-23 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット
WO2013118743A1 (ja) * 2012-02-09 2013-08-15 協和メデックス株式会社 アスコルビン酸の影響抑制方法
CN104093852A (zh) * 2012-02-09 2014-10-08 协和梅迪克斯株式会社 抑制抗坏血酸的影响的方法
JPWO2013118743A1 (ja) * 2012-02-09 2015-05-11 協和メデックス株式会社 アスコルビン酸の影響抑制方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003235974A1 (en) 2003-12-31
EP1515144B2 (en) 2013-04-24
EP1515144B1 (en) 2009-10-14
DE60329679D1 (de) 2009-11-26
ATE445844T1 (de) 2009-10-15
EP1515144A4 (en) 2006-05-17
US7354732B2 (en) 2008-04-08
EP1515144A1 (en) 2005-03-16
CN100394187C (zh) 2008-06-11
CN1662818A (zh) 2005-08-31
US20050221415A1 (en) 2005-10-06
JPWO2003107011A1 (ja) 2005-10-13
JP4061366B2 (ja) 2008-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1002874B1 (en) Redox reactions for analyte determination using tetrazolium compounds
WO2003107011A1 (ja) スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
JP2010011876A (ja) 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット
EP1329722A1 (en) Assay method with the use of redox reaction
JP4045322B2 (ja) 酸化還元反応を用いた測定方法
WO2002027330A1 (fr) Procede de quantification d'hemoglobine et procede de mesure du taux de glycation d'hemoglobine
JP2007147630A (ja) スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
US8021855B2 (en) Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
WO2002027012A1 (fr) Procede de production de produits de degradation de proteines
EP1515143B1 (en) Method of assay by oxidation-reduction reaction with formazan
US7226790B2 (en) Method for measurement using sodium azide
JP4250693B2 (ja) 酸化還元反応を用いた測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004513779

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038138220

Country of ref document: CN

Ref document number: 10517853

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003720984

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003720984

Country of ref document: EP