JP2001292795A - テトラゾリウム化合物に基づく診断 - Google Patents
テトラゾリウム化合物に基づく診断Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヘモグロビンの還元作用による分析物の測定
の障害をなくす。 【解決手段】 試薬は、全血等のヘモグロビンを含有す
る生物学的液体に含まれる分析物の濃度を測定するのに
適している。試薬は、分析物に対する特異性を有するフ
ラビン依存性酵素と、フラビンがフラビン依存性酵素に
結合していない場合のみ含まれるフラビン補因子と、テ
トラゾリウム染料前駆体と、電子転移剤と、亜硝酸塩と
を含む。試薬は、分析物濃度の判断基準となる色素形成
を生ずる。亜硝酸塩はヘモグロビンによって非酵素的に
生ずる邪魔な染料形成を抑制する。さらに、該試薬は全
血に含まれるグルコースを測定するための乾燥細片で使
用される。
の障害をなくす。 【解決手段】 試薬は、全血等のヘモグロビンを含有す
る生物学的液体に含まれる分析物の濃度を測定するのに
適している。試薬は、分析物に対する特異性を有するフ
ラビン依存性酵素と、フラビンがフラビン依存性酵素に
結合していない場合のみ含まれるフラビン補因子と、テ
トラゾリウム染料前駆体と、電子転移剤と、亜硝酸塩と
を含む。試薬は、分析物濃度の判断基準となる色素形成
を生ずる。亜硝酸塩はヘモグロビンによって非酵素的に
生ずる邪魔な染料形成を抑制する。さらに、該試薬は全
血に含まれるグルコースを測定するための乾燥細片で使
用される。
Description
【0001】先願との相互参照これは、同時係属米国特
許出願一連番号第09/282,083号(1999年
3月30日出願)の一部継続出願である。なお、米国特
許出願一連番号第09/282,083号(1999年
3月30日出願)は、現在は米国特許第5,902,7
31号となっている米国特許出願一連番号09/16
1,876(1998年9月28日出願)の一部継続出
願である。
許出願一連番号第09/282,083号(1999年
3月30日出願)の一部継続出願である。なお、米国特
許出願一連番号第09/282,083号(1999年
3月30日出願)は、現在は米国特許第5,902,7
31号となっている米国特許出願一連番号09/16
1,876(1998年9月28日出願)の一部継続出
願である。
【0002】
【発明の属する技術分野】この発明は、ヘモグロビンを
含有する生物学的液体の分析物濃度の測定を可能とする
診断組成物に関する。この組成物は、テトラゾリウム染
料前駆体を主成分とし、ヘモグロビンによって誘導され
る該組成物の還元を抑制する。
含有する生物学的液体の分析物濃度の測定を可能とする
診断組成物に関する。この組成物は、テトラゾリウム染
料前駆体を主成分とし、ヘモグロビンによって誘導され
る該組成物の還元を抑制する。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】脂肪組織は、体内にお
いてエネルギー貯蔵の最も豊富な形態の1つである。脂
肪組織に蓄えられた脂肪酸が循環器系に放出され、肝臓
によって主に代謝される。そのプロセスにおいて、脂肪
が消費されてエネルギーが放出され、該エネルギーが体
内で利用可能となる。一般に、脂肪はほとんど分解され
ず、脂肪酸は二酸化炭素と水とに完全に代謝されるが、
この変換によって身体のデリケートなpHバランスが崩
れるようなことはない。しかし、体内の炭水化物量が、
例えば食事制限で不十分である場合、脂肪が消費されて
脂肪酸の量が潜在的危険をはらむレベルまで増加可能と
なる。また食事制限者に加えて、インシュリン依存性の
患者が害を受けやすい。なぜならインシュリン依存性患
者は炭水化物代謝に欠陥を有するからである。体内のエ
ネルギー要求を満たすために過剰の脂肪酸が使用される
と、大量のアセトアセテート、アセトン、及びβ−ヒド
ロキシブチレートが生ずる。これらの中間体はケトン体
と呼ばれ、その症状はケトアシドーシスとして知られて
いる。
いてエネルギー貯蔵の最も豊富な形態の1つである。脂
肪組織に蓄えられた脂肪酸が循環器系に放出され、肝臓
によって主に代謝される。そのプロセスにおいて、脂肪
が消費されてエネルギーが放出され、該エネルギーが体
内で利用可能となる。一般に、脂肪はほとんど分解され
ず、脂肪酸は二酸化炭素と水とに完全に代謝されるが、
この変換によって身体のデリケートなpHバランスが崩
れるようなことはない。しかし、体内の炭水化物量が、
例えば食事制限で不十分である場合、脂肪が消費されて
脂肪酸の量が潜在的危険をはらむレベルまで増加可能と
なる。また食事制限者に加えて、インシュリン依存性の
患者が害を受けやすい。なぜならインシュリン依存性患
者は炭水化物代謝に欠陥を有するからである。体内のエ
ネルギー要求を満たすために過剰の脂肪酸が使用される
と、大量のアセトアセテート、アセトン、及びβ−ヒド
ロキシブチレートが生ずる。これらの中間体はケトン体
と呼ばれ、その症状はケトアシドーシスとして知られて
いる。
【0004】ケトン体は一般に身体によって他の形態に
再利用されるので、ケトン体が体内に溢れるわけではな
い。したがって、健康な個体では、それらの分析物の蓄
積は無視できる程度の量である。大量の脂肪が比較的短
期間で代謝されている場合、又は殆どのエネルギーが脂
肪に由来する場合、膨大な量のケトン体が産生される。
それらの脂肪代謝物の過剰な産生は、もしそのような異
常が速やかに正されなければ、ある種の神経疾患を引き
起こす。
再利用されるので、ケトン体が体内に溢れるわけではな
い。したがって、健康な個体では、それらの分析物の蓄
積は無視できる程度の量である。大量の脂肪が比較的短
期間で代謝されている場合、又は殆どのエネルギーが脂
肪に由来する場合、膨大な量のケトン体が産生される。
それらの脂肪代謝物の過剰な産生は、もしそのような異
常が速やかに正されなければ、ある種の神経疾患を引き
起こす。
【0005】ケトン体は血液中に存在し、もし閾値を超
えると尿を介して排出される。ケトン体は、現在の臨床
分析機器によって容易に検出される。平均して、β−ヒ
ドロキシブチレート、アセトアセテート、及びアセトン
の比率は、それぞれ78%、20%、及び2%である。
濃度が相対的に低く、かつ揮発性が高いことから、アセ
トンはめったに検出されない。その代わり、アセトアセ
テートはニトロプルシド反応によって定量的に判定さ
れ、またβ−ヒドロキシブチレートは酵素的方法によっ
て定量化される。アセトアセテート試験片が何十年にも
わたって利用されている。アセトアセテート試験片は、
アルデヒド及びケトンとのニトロプルシドイオン結合反
応にもとづいている。アルカリ性尿試料又は血清検体を
数分間にわたってニトロプルシドと反応させると紫色に
なる。この色の強度がアセトアセテートの濃度を示す。
しかし、アセトンがその試験を妨害するので、読み取ら
れる値が高くなる。さらに、患者がケトアシドーシス症
状の出現から回復すると、尿及び血中のアセトアセテー
ト濃度が増加するので診断が困難となる。
えると尿を介して排出される。ケトン体は、現在の臨床
分析機器によって容易に検出される。平均して、β−ヒ
ドロキシブチレート、アセトアセテート、及びアセトン
の比率は、それぞれ78%、20%、及び2%である。
濃度が相対的に低く、かつ揮発性が高いことから、アセ
トンはめったに検出されない。その代わり、アセトアセ
テートはニトロプルシド反応によって定量的に判定さ
れ、またβ−ヒドロキシブチレートは酵素的方法によっ
て定量化される。アセトアセテート試験片が何十年にも
わたって利用されている。アセトアセテート試験片は、
アルデヒド及びケトンとのニトロプルシドイオン結合反
応にもとづいている。アルカリ性尿試料又は血清検体を
数分間にわたってニトロプルシドと反応させると紫色に
なる。この色の強度がアセトアセテートの濃度を示す。
しかし、アセトンがその試験を妨害するので、読み取ら
れる値が高くなる。さらに、患者がケトアシドーシス症
状の出現から回復すると、尿及び血中のアセトアセテー
ト濃度が増加するので診断が困難となる。
【0006】β−ヒドロキシブチレート試験は、ケトン
体濃度をモニタする上でより一層有用である。この試験
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)
補因子の存在下で、対応するデヒドロゲナーゼによるβ
−ヒドロキシブチレートの酸化に基づいている(厳密に
言えば、D−β−ヒドロキシブチレートだけが天然に存
在して酸化されるが、この明細書の発明の詳細な説明及
び特許請求の範囲においては記載を簡略化するためにD
−β−ヒドロキシブチレートからD−を省きβ−ヒドロ
キシブチレートと記すことにする)。酸化によってNA
DHが産生され、その濃度は紫外線スペクトルフォトメ
ータによって直接測定される。したがって、スペクトル
における対応する信号変化は、分析物の濃度に比例す
る。残念なことに、NADHの励起は紫外線領域で起こ
るため、このような検出方法は実験用測定機器のみに適
している。β−ヒドロキシブチレートをモニタするため
の別の方法は、NADHをテトラゾリウム化合物によっ
て酸化させる方法である。
体濃度をモニタする上でより一層有用である。この試験
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)
補因子の存在下で、対応するデヒドロゲナーゼによるβ
−ヒドロキシブチレートの酸化に基づいている(厳密に
言えば、D−β−ヒドロキシブチレートだけが天然に存
在して酸化されるが、この明細書の発明の詳細な説明及
び特許請求の範囲においては記載を簡略化するためにD
−β−ヒドロキシブチレートからD−を省きβ−ヒドロ
キシブチレートと記すことにする)。酸化によってNA
DHが産生され、その濃度は紫外線スペクトルフォトメ
ータによって直接測定される。したがって、スペクトル
における対応する信号変化は、分析物の濃度に比例す
る。残念なことに、NADHの励起は紫外線領域で起こ
るため、このような検出方法は実験用測定機器のみに適
している。β−ヒドロキシブチレートをモニタするため
の別の方法は、NADHをテトラゾリウム化合物によっ
て酸化させる方法である。
【0007】テトラゾリウム化合物は、一般に強塩基及
び光に対する感受性が高い。したがって、そのような化
合物の完全性を確かめるために特別の注意を払わなけれ
ばならない。しかし、テトラゾリウムは組織代謝の研究
において重要な役割を果たしてきた。例えば、この種の
化合物は細胞内での無気呼吸酸化及び還元反応に使用さ
れてきた。さらに、テトラゾリウム化合物は一般に臨床
診断に使用される。また、テトラゾリウム化合物は一般
に明るい色又は無色の化合物であり、還元剤の存在下で
還元反応を起こして、色が濃くなったホルマザンを生成
する。還元剤、例えばアスコルビン酸塩、スルフヒドリ
ル、又はNADHの変種、NADPHの変種、PQQH
2(還元PQQ−ピロロキノリンキノン)の変種、FM
NH2(還元FMN−フラビンモノヌクレオチド)、及
びFADH2(還元FAD−フラビンアデニンジヌクレ
オチド)の変種は染料を形成することが可能である。
び光に対する感受性が高い。したがって、そのような化
合物の完全性を確かめるために特別の注意を払わなけれ
ばならない。しかし、テトラゾリウムは組織代謝の研究
において重要な役割を果たしてきた。例えば、この種の
化合物は細胞内での無気呼吸酸化及び還元反応に使用さ
れてきた。さらに、テトラゾリウム化合物は一般に臨床
診断に使用される。また、テトラゾリウム化合物は一般
に明るい色又は無色の化合物であり、還元剤の存在下で
還元反応を起こして、色が濃くなったホルマザンを生成
する。還元剤、例えばアスコルビン酸塩、スルフヒドリ
ル、又はNADHの変種、NADPHの変種、PQQH
2(還元PQQ−ピロロキノリンキノン)の変種、FM
NH2(還元FMN−フラビンモノヌクレオチド)、及
びFADH2(還元FAD−フラビンアデニンジヌクレ
オチド)の変種は染料を形成することが可能である。
【0008】臨床診断では、嫌気性反応において親化合
物であるNAD(P)+からのNAD(P)Hの生成を
観察する上で、そのような染料が非常に重要であること
が知られている(例えば、D. Bell他に対して1994
年11月1日に発行された米国特許第5,360,59
5号を参照されたい)。酸化還元反応は急速に行われ、
また酸素に対する感度が低い。結果として生ずる染料の
色は非常に濃く、また水に対する溶解性が低い。
物であるNAD(P)+からのNAD(P)Hの生成を
観察する上で、そのような染料が非常に重要であること
が知られている(例えば、D. Bell他に対して1994
年11月1日に発行された米国特許第5,360,59
5号を参照されたい)。酸化還元反応は急速に行われ、
また酸素に対する感度が低い。結果として生ずる染料の
色は非常に濃く、また水に対する溶解性が低い。
【0009】基本的に、テトラゾリウム染料前駆体は全
血液中に含まれるケトン体及びグルコースの測定に使用
することができる。しかし、ヘモグロビンが血液の赤血
球に含まれていない場合、テトラゾリウムがヘモグロビ
ン(Fe(II))によって非酵素的に還元され、色が
付いたホルマザンが形成される。したがって、遊離ヘモ
グロビンは測定に対して深刻な影響を及ぼす。実際、溶
血及びそれによって生ずる遊離ヘモグロビンが対象分析
物に対して大量であるために、一般的なケトン体測定で
は、ヘモグロビンからの妨害信号が目的とする信号を上
回ることがある。これに対して、グルコース測定は、特
に通常の濃度では悪影響を受けることはない。ただし、
ヘモグロビン酸化反応が速くなるようなヘマトクリット
値が高い試料で、又は高温下で反応が起こると、上記と
同様に、グルコース測定に対する妨害が著しくなる。遊
離酸素が生ずる赤血球細胞の溶血を容易に避けることは
できないので、もし分析にテトラゾリウムを使用するな
らば、試験前に赤血球を除去しなければならない。
血液中に含まれるケトン体及びグルコースの測定に使用
することができる。しかし、ヘモグロビンが血液の赤血
球に含まれていない場合、テトラゾリウムがヘモグロビ
ン(Fe(II))によって非酵素的に還元され、色が
付いたホルマザンが形成される。したがって、遊離ヘモ
グロビンは測定に対して深刻な影響を及ぼす。実際、溶
血及びそれによって生ずる遊離ヘモグロビンが対象分析
物に対して大量であるために、一般的なケトン体測定で
は、ヘモグロビンからの妨害信号が目的とする信号を上
回ることがある。これに対して、グルコース測定は、特
に通常の濃度では悪影響を受けることはない。ただし、
ヘモグロビン酸化反応が速くなるようなヘマトクリット
値が高い試料で、又は高温下で反応が起こると、上記と
同様に、グルコース測定に対する妨害が著しくなる。遊
離酸素が生ずる赤血球細胞の溶血を容易に避けることは
できないので、もし分析にテトラゾリウムを使用するな
らば、試験前に赤血球を除去しなければならない。
【0010】膜及びフィルターによる濾過、化学試薬に
よる捕捉、又はそのような方法の組み合わせによって、
試料から赤血球を除去することができる。血液全体から
赤血球を分離するための濾過方法は、高価であり、また
試料の量も幾分多く必要とする。血液試料全体から赤血
球を除去するために濾過を用いる血液ケトン(β−ヒド
ロキシブチレート)試験の一例として、GDSダイアグ
ノスティックス(GDSDiagnostics, Elkhart, IN)から
入手可能であるケトサイト(KetoSite(登録商標))試
験が挙げられる(参考文献:Tietz Textbook of Clinic
al Chemistry 2 nd Ed., ed. by C. Burtis et al., W.
B. Saunders Co., Philadelphia, PA,1994年、第9
74頁)。その試験で使用される「テストカード(Test
Card)」は2つのフィルター層を有するので幾分高価
であり、必要とする血液試料の量も多い(25μL)。
さらに、血液は溶血されたものであってはならない。
よる捕捉、又はそのような方法の組み合わせによって、
試料から赤血球を除去することができる。血液全体から
赤血球を分離するための濾過方法は、高価であり、また
試料の量も幾分多く必要とする。血液試料全体から赤血
球を除去するために濾過を用いる血液ケトン(β−ヒド
ロキシブチレート)試験の一例として、GDSダイアグ
ノスティックス(GDSDiagnostics, Elkhart, IN)から
入手可能であるケトサイト(KetoSite(登録商標))試
験が挙げられる(参考文献:Tietz Textbook of Clinic
al Chemistry 2 nd Ed., ed. by C. Burtis et al., W.
B. Saunders Co., Philadelphia, PA,1994年、第9
74頁)。その試験で使用される「テストカード(Test
Card)」は2つのフィルター層を有するので幾分高価
であり、必要とする血液試料の量も多い(25μL)。
さらに、血液は溶血されたものであってはならない。
【0011】濾過と化学的捕捉との組み合わせは、マイ
ルズ(Miles)から入手可能なアメスグルコメータエン
コア(Ames(登録商標) Glucometer Encore(商標))
血液グルコース細片で使用される。この細片は、フィル
ター材料からなる層と凝集助剤(ポテトレクチン)とを
用いて赤血球による妨害を排除する(チュー(Chu)等
のEP 0 638 805 A2(1995年2月1
5日発行)を参照されたい)。
ルズ(Miles)から入手可能なアメスグルコメータエン
コア(Ames(登録商標) Glucometer Encore(商標))
血液グルコース細片で使用される。この細片は、フィル
ター材料からなる層と凝集助剤(ポテトレクチン)とを
用いて赤血球による妨害を排除する(チュー(Chu)等
のEP 0 638 805 A2(1995年2月1
5日発行)を参照されたい)。
【0012】ヘモグロビンを酸化してメトヘモグロビン
にするためにシステムに酸化剤を導入することは、ヘモ
グロビンによる妨害を少なくするための別の方法であ
る。フェリシアニドがヘモグロビンをメトヘモグロビン
に変換することが知られているが、フェリシアニドは所
望の生成物であるNADHを破壊する。
にするためにシステムに酸化剤を導入することは、ヘモ
グロビンによる妨害を少なくするための別の方法であ
る。フェリシアニドがヘモグロビンをメトヘモグロビン
に変換することが知られているが、フェリシアニドは所
望の生成物であるNADHを破壊する。
【0013】パルマー(Palmer)等のEPO 0 33
0 517 B2(1989年8月20日発行)は、生
化学的分析物を測定するための方法を開示している。こ
の方法では分析物をある種の酸化酵素と反応させる。こ
の酸化酵素は分析物に対して電子転移酵素活性を有して
おり、還元された酵素を発生させる。この酵素を比色定
量分析することによって分析物の濃度が判定される。酵
素反応は酸素に依存性しない。
0 517 B2(1989年8月20日発行)は、生
化学的分析物を測定するための方法を開示している。こ
の方法では分析物をある種の酸化酵素と反応させる。こ
の酸化酵素は分析物に対して電子転移酵素活性を有して
おり、還元された酵素を発生させる。この酵素を比色定
量分析することによって分析物の濃度が判定される。酵
素反応は酸素に依存性しない。
【0014】1994年1月20日に発行されたフレイ
タグ(Freitag)等のWO 94/01544は、分析
物分析用の安定試薬を開示している。試薬は、酵素、フ
ェナジン誘導体、テトラゾリウム塩、及び該試薬を安定
化させる二価金属塩を含む。
タグ(Freitag)等のWO 94/01544は、分析
物分析用の安定試薬を開示している。試薬は、酵素、フ
ェナジン誘導体、テトラゾリウム塩、及び該試薬を安定
化させる二価金属塩を含む。
【0015】1994年1月20日に発行されたストル
ホッフ(Storhoff)等のWO 94/01578もま
た、分析物分析用の安定試薬を開示している。試薬は、
酵素、媒介物質、テトラゾリウム塩、及び該試薬を安定
化させる酸化剤を含む。
ホッフ(Storhoff)等のWO 94/01578もま
た、分析物分析用の安定試薬を開示している。試薬は、
酵素、媒介物質、テトラゾリウム塩、及び該試薬を安定
化させる酸化剤を含む。
【0016】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヘモグロビン
を含有する生物学的液体に含まれる分析物の濃度を測定
するための試薬を提供する。この試薬は、a)分析物に
対する特異性を有し、かつフラビンが結合したフラビン
依存性酵素と、b)テトラゾリウム染料前駆体と、c)
電子転移剤と、d)亜硝酸塩とを含む。
を含有する生物学的液体に含まれる分析物の濃度を測定
するための試薬を提供する。この試薬は、a)分析物に
対する特異性を有し、かつフラビンが結合したフラビン
依存性酵素と、b)テトラゾリウム染料前駆体と、c)
電子転移剤と、d)亜硝酸塩とを含む。
【0017】本発明の別の実施形態では、上記試薬は、
a)分析物に対する特異性を有し、かつフラビンが結合
していないフラビン依存性酵素と、b)フラビンモノヌ
クレオチド(FMN)又はフラビンアデニンジヌクレオ
チド(FAD)と、c)テトラゾリウム染料前駆体と、
d)電子転移剤と、e)亜硝酸塩とを含む。
a)分析物に対する特異性を有し、かつフラビンが結合
していないフラビン依存性酵素と、b)フラビンモノヌ
クレオチド(FMN)又はフラビンアデニンジヌクレオ
チド(FAD)と、c)テトラゾリウム染料前駆体と、
d)電子転移剤と、e)亜硝酸塩とを含む。
【0018】上記試薬は、ヘモグロビンを含有する生物
学的液体に含まれる分析物の濃度を測定するための乾燥
試薬細片を形成するために、1種類以上の基質に被覆さ
れるのに特に適している。特に好ましい細片は、a)支
持層と、b)i)分析物に対する特異性を有し、かつフ
ラビンが結合したフラビン依存性酵素、ii)テトラゾ
リウム染料前駆体、及びiii)電子転移剤を含む被覆
物を有し、かつ支持層上に設けられた試験用パッドと、
c)亜硝酸塩によって覆われ、かつ試験用パッド上に設
けられた吸収性の最上層とを含む。
学的液体に含まれる分析物の濃度を測定するための乾燥
試薬細片を形成するために、1種類以上の基質に被覆さ
れるのに特に適している。特に好ましい細片は、a)支
持層と、b)i)分析物に対する特異性を有し、かつフ
ラビンが結合したフラビン依存性酵素、ii)テトラゾ
リウム染料前駆体、及びiii)電子転移剤を含む被覆
物を有し、かつ支持層上に設けられた試験用パッドと、
c)亜硝酸塩によって覆われ、かつ試験用パッド上に設
けられた吸収性の最上層とを含む。
【0019】本発明の別の細片は、a)支持層と、b)
i)分析物に対する特異性を持ち、かつフラビンが結合
していないフラビン依存性酵素、ii)FMN又はFA
D、iii)テトラゾリウム染料前駆体、及びiv)電
子転移剤を含む被覆物を有し、かつ支持層上に設けられ
た試験用パッドと、c)亜硝酸塩によって覆われ、かつ
試験用パッド上に設けられた吸収性の最上層とを含む。
i)分析物に対する特異性を持ち、かつフラビンが結合
していないフラビン依存性酵素、ii)FMN又はFA
D、iii)テトラゾリウム染料前駆体、及びiv)電
子転移剤を含む被覆物を有し、かつ支持層上に設けられ
た試験用パッドと、c)亜硝酸塩によって覆われ、かつ
試験用パッド上に設けられた吸収性の最上層とを含む。
【0020】
【発明の実施の形態】本発明は、分析物濃度の判断基準
となるNADH、NAD(P)H、PQQH 2、FMN
H2、又はFADH2といった補助因子の還元体の濃度
を提示することによって、ヘモグロビンを含有する生物
学的液体(例えば、全血)に含まれる分析物の濃度を測
定するための試薬を提供する。この試薬に亜硝酸塩が含
まれることで、還元補助因子の濃度の測定に対するヘモ
グロビンの妨害を克服する。この試薬は、限定されるも
のではないが、ケトン体及びグルコースの測定に特に有
用である。
となるNADH、NAD(P)H、PQQH 2、FMN
H2、又はFADH2といった補助因子の還元体の濃度
を提示することによって、ヘモグロビンを含有する生物
学的液体(例えば、全血)に含まれる分析物の濃度を測
定するための試薬を提供する。この試薬に亜硝酸塩が含
まれることで、還元補助因子の濃度の測定に対するヘモ
グロビンの妨害を克服する。この試薬は、限定されるも
のではないが、ケトン体及びグルコースの測定に特に有
用である。
【0021】図1は、本発明の典型的な試験用細片10
を示すもので、該試験用細片10は支持体14上に固定
された試験用パッド12を有する。支持体14は、ポリ
スチレン、ナイロン、又はポリエステル等のプラスチッ
ク、又は金属シート、又は当業者に知られている他の適
当な材料のいずれかであってもよい。試験用パッド12
は、分析物と反応して色の変化を生じさせる試薬によっ
て被覆されている。試験用パッド12は、好ましくは吸
収性材料、例えば濾紙又はポリマー膜である。しかし、
反応が酸素を必要としないことから、試験用パッド12
はプラスチックフィルム等の非吸収性材料であってもよ
い。試薬は、分析物に対して特異的な酵素、水素化物転
移酵素、テトラゾリウム染料前駆体、適当な酵素補助因
子、及びヘモグロビン抑制剤を含む。より一層安定化さ
せるために、緩衝剤及び安定化剤が任意に含まれる。
を示すもので、該試験用細片10は支持体14上に固定
された試験用パッド12を有する。支持体14は、ポリ
スチレン、ナイロン、又はポリエステル等のプラスチッ
ク、又は金属シート、又は当業者に知られている他の適
当な材料のいずれかであってもよい。試験用パッド12
は、分析物と反応して色の変化を生じさせる試薬によっ
て被覆されている。試験用パッド12は、好ましくは吸
収性材料、例えば濾紙又はポリマー膜である。しかし、
反応が酸素を必要としないことから、試験用パッド12
はプラスチックフィルム等の非吸収性材料であってもよ
い。試薬は、分析物に対して特異的な酵素、水素化物転
移酵素、テトラゾリウム染料前駆体、適当な酵素補助因
子、及びヘモグロビン抑制剤を含む。より一層安定化さ
せるために、緩衝剤及び安定化剤が任意に含まれる。
【0022】図2に示すように、試験用パッド12上に
最上層16を積層することで、試験用細片を多層構造と
することもできる。そのような構造では、試薬を二つの
層に分けることも可能である。例えば、ヘモグロビン抑
制剤で任意の最上層16を被覆し、該試薬の残りで試験
用パッド12を被覆してもよい。好ましくは、最上層1
6は吸収性であり、過剰の試料を吸収するための吸収層
及び塗布層として作用する。試料は最上層16に塗布さ
れ、さらに該最上層16を通過して試験用パッド12に
達する。分析物濃度は、支持層14を介して色の変化を
測定することによって判定される。あるいは、もし反応
領域に隣接する支持層14が透明でなければ、任意の窓
又はスルーホール18を介して色の変化を測定すること
によって判定される。
最上層16を積層することで、試験用細片を多層構造と
することもできる。そのような構造では、試薬を二つの
層に分けることも可能である。例えば、ヘモグロビン抑
制剤で任意の最上層16を被覆し、該試薬の残りで試験
用パッド12を被覆してもよい。好ましくは、最上層1
6は吸収性であり、過剰の試料を吸収するための吸収層
及び塗布層として作用する。試料は最上層16に塗布さ
れ、さらに該最上層16を通過して試験用パッド12に
達する。分析物濃度は、支持層14を介して色の変化を
測定することによって判定される。あるいは、もし反応
領域に隣接する支持層14が透明でなければ、任意の窓
又はスルーホール18を介して色の変化を測定すること
によって判定される。
【0023】図3に示す別の実施形態では、スペーサ2
0によって最上層16と試験用パッド12とが隔てられ
ている。スペーサ20は、好ましくは両面に接着性被覆
物(図示せず)を有する非吸収性プラスチックフィルム
である。スペーサ20の溝22は、試料が毛細管現象に
よって開口部24から測定領域26へ流れる経路を提供
する。この試料の流れは、試験用パッド12の一面と隣
接する層との間、あるいは任意の窓又は通気孔18から
抜ける空気に依存する。測定領域26における色の変化
は、任意の窓又は通気孔18を介して観察される。試薬
は、全量が試験用パッド12上にあってもよく、あるい
は試験用パッド12と非吸収性層14及び16の少なく
とも一方と配分されてもよい。したがって、試薬の第1
の部分が試験用パッド12にあり、該試薬の第2の部分
が非吸収性層14及び16の少なくとも一方にあっても
よい。なお、試薬が層の「上」又は層に「被覆」されて
いると言及する場合、試薬が層に吸収される可能性(特
に層が吸収性である場合)が含まれることを意図してい
る。
0によって最上層16と試験用パッド12とが隔てられ
ている。スペーサ20は、好ましくは両面に接着性被覆
物(図示せず)を有する非吸収性プラスチックフィルム
である。スペーサ20の溝22は、試料が毛細管現象に
よって開口部24から測定領域26へ流れる経路を提供
する。この試料の流れは、試験用パッド12の一面と隣
接する層との間、あるいは任意の窓又は通気孔18から
抜ける空気に依存する。測定領域26における色の変化
は、任意の窓又は通気孔18を介して観察される。試薬
は、全量が試験用パッド12上にあってもよく、あるい
は試験用パッド12と非吸収性層14及び16の少なく
とも一方と配分されてもよい。したがって、試薬の第1
の部分が試験用パッド12にあり、該試薬の第2の部分
が非吸収性層14及び16の少なくとも一方にあっても
よい。なお、試薬が層の「上」又は層に「被覆」されて
いると言及する場合、試薬が層に吸収される可能性(特
に層が吸収性である場合)が含まれることを意図してい
る。
【0024】全てのフラビン依存性酵素がこの発明によ
る分析に適している。適当な酸化酵素及びそれらに対応
する分析物として、例えばアルコールに対してアルコー
ル酸化酵素、グルコースに対してグルコース酸化酵素、
ガラクトースに対してガラクトース酸化酵素、コレステ
ロールに対してコレステロール酸化酵素、L−ラクテー
トに対してラクテート酸化酵素、尿酸に対して尿酸酸化
酵素、ビリルビンに対してビリルビン酸化酵素、さらに
コリンに対してコリン酸化酵素が挙げられる。適当な脱
水素酵素及びそれらに対応する分析物として、例えばピ
ルビン酸塩に対してピルビン酸脱水素酵素、D−乳酸塩
に対して乳酸脱水素酵素、さらにコハク酸塩に対してコ
ハク酸脱水素酵素が挙げられる。
る分析に適している。適当な酸化酵素及びそれらに対応
する分析物として、例えばアルコールに対してアルコー
ル酸化酵素、グルコースに対してグルコース酸化酵素、
ガラクトースに対してガラクトース酸化酵素、コレステ
ロールに対してコレステロール酸化酵素、L−ラクテー
トに対してラクテート酸化酵素、尿酸に対して尿酸酸化
酵素、ビリルビンに対してビリルビン酸化酵素、さらに
コリンに対してコリン酸化酵素が挙げられる。適当な脱
水素酵素及びそれらに対応する分析物として、例えばピ
ルビン酸塩に対してピルビン酸脱水素酵素、D−乳酸塩
に対して乳酸脱水素酵素、さらにコハク酸塩に対してコ
ハク酸脱水素酵素が挙げられる。
【0025】酵素に結合していない場合、該酵素を活性
化させるために補助因子が加えられなければならない。
フラビン依存性酵素に対して加えられるべき補助因子と
して、例えばフラビンモノヌクレオチド(FMN)及び
フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)が挙げられ
る。酵素の存在下、分析物によって補助因子が還元され
る。
化させるために補助因子が加えられなければならない。
フラビン依存性酵素に対して加えられるべき補助因子と
して、例えばフラビンモノヌクレオチド(FMN)及び
フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)が挙げられ
る。酵素の存在下、分析物によって補助因子が還元され
る。
【0026】染色プロセスの次のステップは、電子転移
剤による還元補助因子からの水素化物の分離である。適
当な電子転移剤として、リポ酸脱水素酵素、フェレドキ
シン−NADP還元酵素、及びリポアミド脱水素酵素等
のジアフォラーゼが挙げられる。フラビン補助因子が用
いられる場合、より好ましいものは、フェナジンメト硫
酸塩(PMS)、フェナジンエト硫酸塩(PES)、1
−メトキシフェナジンメト硫酸塩、又はメルドラブルー
(Meldola Blue)といった酵素によらない電子転移剤で
ある。反応速度及び安定性は、電子転移剤又は「水素化
物分離剤」を選択するための本源的要素である。例え
ば、PMSは普遍的な水素化物分離剤である。なぜな
ら、PMSは以下に挙げたテトラゾリウム化合物の殆ど
に対して、比較的速い反応速度を有するからである。そ
のことから、補助因子がPQQである場合はPMSが好
ましい。しかし、PMSは酵素を主成分とする水素化物
分離剤よりも光に対してより一層感受性が高い。ジアフ
ォラーゼはより一層安定しており、そのことから補助因
子がNADである場合はジアフォラーゼが好ましい。
剤による還元補助因子からの水素化物の分離である。適
当な電子転移剤として、リポ酸脱水素酵素、フェレドキ
シン−NADP還元酵素、及びリポアミド脱水素酵素等
のジアフォラーゼが挙げられる。フラビン補助因子が用
いられる場合、より好ましいものは、フェナジンメト硫
酸塩(PMS)、フェナジンエト硫酸塩(PES)、1
−メトキシフェナジンメト硫酸塩、又はメルドラブルー
(Meldola Blue)といった酵素によらない電子転移剤で
ある。反応速度及び安定性は、電子転移剤又は「水素化
物分離剤」を選択するための本源的要素である。例え
ば、PMSは普遍的な水素化物分離剤である。なぜな
ら、PMSは以下に挙げたテトラゾリウム化合物の殆ど
に対して、比較的速い反応速度を有するからである。そ
のことから、補助因子がPQQである場合はPMSが好
ましい。しかし、PMSは酵素を主成分とする水素化物
分離剤よりも光に対してより一層感受性が高い。ジアフ
ォラーゼはより一層安定しており、そのことから補助因
子がNADである場合はジアフォラーゼが好ましい。
【0027】捕捉された水素化物は、テトラゾリウム化
合物(染料前駆体)に受け渡されて、色付いたホルマザ
ンを形成する。この装置にとって最も好ましいテトラゾ
リウム化合物として、例えば2−(2’ベンゾチアゾリ
ル)−5−スチリル−3−(4’−フタルヒドラジジ
ル)テトラゾリウム(BSPT)、2−ベンゾチアゾリ
ル−(2)−3,5−ジフェニルテトラゾリウム(BT
DP)、2,3−ジ(4−ニトロフェニル)テトラゾリ
ウム(DNP)、2,5−ジフェニル−3−(4−スチ
リルフェニル)テトラゾリウム(DPSP)、ジスチリ
ルニトロブルーテトラゾリウム(DSNBT)、3,
3’−[3,3’−ジメトキシ−(1,1’−ビフェニ
ル)−4,4’−ジイル]−ビス[2−(4−ニトロフ
ェニル)−5−フェニル(−2Hテトラゾリウム(NB
T)、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−
2,5−ジフェニル−2Hテトラゾリウム(MTT)、
2−フェニル−3−(4−カルボキシフェニル)−5−
メチルテトラゾリウム(PCPM)、テトラゾリウムブ
ルー(TB)、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリ
ウム(TCNBT)、テトラニトロブルーテトラゾリウ
ム(TNBT)、テトラゾリウムバイオレット(T
V)、2−ベンゾチアゾチアゾリル−3−(4−カルボ
キシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−スル
フォエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾ
リウム(WST−4)、及び2,2’−ジベンゾチアゾ
リル−5,5’−ビス[4−ジ(2−スルホエチル)カ
ルバモイルフェニル]−3,3’−(3,3’−ジメト
キシ−4,4’−ビフェニレン)ジテトラゾリウム、ジ
ナトリウム塩(WST−5)がある。生物学的試料と適
合するように、好ましくは水溶性染料前駆体、より好ま
しくはWST−5が用いられる。さらに、WST−5が
使用される場合、結果として生ずるホルマザン化合物は
紫−青領域で強いスペクトル吸収を示すので、ヘモグロ
ビンからのバックグラウンド信号を補正する必要性を減
少させる。
合物(染料前駆体)に受け渡されて、色付いたホルマザ
ンを形成する。この装置にとって最も好ましいテトラゾ
リウム化合物として、例えば2−(2’ベンゾチアゾリ
ル)−5−スチリル−3−(4’−フタルヒドラジジ
ル)テトラゾリウム(BSPT)、2−ベンゾチアゾリ
ル−(2)−3,5−ジフェニルテトラゾリウム(BT
DP)、2,3−ジ(4−ニトロフェニル)テトラゾリ
ウム(DNP)、2,5−ジフェニル−3−(4−スチ
リルフェニル)テトラゾリウム(DPSP)、ジスチリ
ルニトロブルーテトラゾリウム(DSNBT)、3,
3’−[3,3’−ジメトキシ−(1,1’−ビフェニ
ル)−4,4’−ジイル]−ビス[2−(4−ニトロフ
ェニル)−5−フェニル(−2Hテトラゾリウム(NB
T)、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−
2,5−ジフェニル−2Hテトラゾリウム(MTT)、
2−フェニル−3−(4−カルボキシフェニル)−5−
メチルテトラゾリウム(PCPM)、テトラゾリウムブ
ルー(TB)、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリ
ウム(TCNBT)、テトラニトロブルーテトラゾリウ
ム(TNBT)、テトラゾリウムバイオレット(T
V)、2−ベンゾチアゾチアゾリル−3−(4−カルボ
キシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−スル
フォエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾ
リウム(WST−4)、及び2,2’−ジベンゾチアゾ
リル−5,5’−ビス[4−ジ(2−スルホエチル)カ
ルバモイルフェニル]−3,3’−(3,3’−ジメト
キシ−4,4’−ビフェニレン)ジテトラゾリウム、ジ
ナトリウム塩(WST−5)がある。生物学的試料と適
合するように、好ましくは水溶性染料前駆体、より好ま
しくはWST−5が用いられる。さらに、WST−5が
使用される場合、結果として生ずるホルマザン化合物は
紫−青領域で強いスペクトル吸収を示すので、ヘモグロ
ビンからのバックグラウンド信号を補正する必要性を減
少させる。
【0028】最後に、ヘモグロビンとテトラゾリウム化
合物との間の不要な染料形成反応を抑えるために、ヘモ
グロビン抑制剤が試薬に存在する。ヘモグロビン抑制剤
の役割は、ヘモグロビンを酸化してメトヘモグロビンに
することであり、メトヘモグロビンはテトラゾリウム又
はホルマザンと反応しない。驚くべきことに、亜硝酸ナ
トリウム、亜硝酸カリウム、及びそれらの誘導体等の亜
硝酸塩はヘモグロビンを抑制する点で非常に効果的であ
り、その一方で還元された補助因子(例えばNADH、
PQQH2、FMNH2、又はFADH2)を破壊する
ことはない。同様に、高温下及び高ヘマトクリット試料
に対して亜硝酸塩が効果的である。亜硝酸ナトリウムは
高水溶性を有し、毒性がなく、さらに比較的安価である
ことから、亜硝酸ナトリウムが好ましい。
合物との間の不要な染料形成反応を抑えるために、ヘモ
グロビン抑制剤が試薬に存在する。ヘモグロビン抑制剤
の役割は、ヘモグロビンを酸化してメトヘモグロビンに
することであり、メトヘモグロビンはテトラゾリウム又
はホルマザンと反応しない。驚くべきことに、亜硝酸ナ
トリウム、亜硝酸カリウム、及びそれらの誘導体等の亜
硝酸塩はヘモグロビンを抑制する点で非常に効果的であ
り、その一方で還元された補助因子(例えばNADH、
PQQH2、FMNH2、又はFADH2)を破壊する
ことはない。同様に、高温下及び高ヘマトクリット試料
に対して亜硝酸塩が効果的である。亜硝酸ナトリウムは
高水溶性を有し、毒性がなく、さらに比較的安価である
ことから、亜硝酸ナトリウムが好ましい。
【0029】任意に、試薬は安定剤を含むものであって
もよい。安定剤としては、例えば二価の金属塩が挙げら
れる。
もよい。安定剤としては、例えば二価の金属塩が挙げら
れる。
【0030】好ましい実施形態において、この発明の試
薬はキュウベット等のウェットケミカルモードで使用す
ることもできるが、本発明は全血内のβ−ヒドロキシブ
チレート又はグルコースを分析するための乾燥細片を提
供する。細片は、単一層構造又は2層構造のいずれであ
ってもよい。2層構造の細片は、好ましくはナイロンか
らなる膜の試験用パッドを有しており、このパッドは支
持体と最上層との間に置かれる。支持体は、好ましくは
ポリエステルシートからなる。最上層は、メッシュ又は
当業者に知られている任意の吸収性材料とすることがで
きる。好ましい材料は、メチルオレオイルタウレートナ
トリウムで処理された多孔性ポリエチレンであり、ポレ
ックス社(Porex Corp., Fairburn, GA)から入手可能
である。この材料を我々は「ポレックス(Porex)」と
呼ぶ。好ましくは、試験用パッドはプラスに帯電した面
を有する。より好ましくは、試験用パッドはポリアミド
である。試験用パッドは、グルコース酸化酵素(フラビ
ン補助因子を含む)、PMS(又はその類似体の1
つ)、及びWST−5で構成される試薬を含有する(以
下の表1を参照されたい)。ポアレックスからなる最上
層は亜硝酸塩試薬を含む(以下の表2を参照された
い)。
薬はキュウベット等のウェットケミカルモードで使用す
ることもできるが、本発明は全血内のβ−ヒドロキシブ
チレート又はグルコースを分析するための乾燥細片を提
供する。細片は、単一層構造又は2層構造のいずれであ
ってもよい。2層構造の細片は、好ましくはナイロンか
らなる膜の試験用パッドを有しており、このパッドは支
持体と最上層との間に置かれる。支持体は、好ましくは
ポリエステルシートからなる。最上層は、メッシュ又は
当業者に知られている任意の吸収性材料とすることがで
きる。好ましい材料は、メチルオレオイルタウレートナ
トリウムで処理された多孔性ポリエチレンであり、ポレ
ックス社(Porex Corp., Fairburn, GA)から入手可能
である。この材料を我々は「ポレックス(Porex)」と
呼ぶ。好ましくは、試験用パッドはプラスに帯電した面
を有する。より好ましくは、試験用パッドはポリアミド
である。試験用パッドは、グルコース酸化酵素(フラビ
ン補助因子を含む)、PMS(又はその類似体の1
つ)、及びWST−5で構成される試薬を含有する(以
下の表1を参照されたい)。ポアレックスからなる最上
層は亜硝酸塩試薬を含む(以下の表2を参照された
い)。
【0031】単一層構造の細片では、ポアレックスから
なる層が除かれており、また亜硝酸塩を含む試薬全体
(以下の表3を参照されたい)が試験用パッドに適用さ
れている。ここで注目すべきことは、2層構造の細片及
び単一層構造の細片の両方において、フラビンが結合し
ているフラビン依存性酵素又はフラビンが結合していな
いフラビン依存性酵素のいずれを使用してもよい。後者
の場合、フラビン補助因子(例えば、FMN又はFA
D)が添加される。
なる層が除かれており、また亜硝酸塩を含む試薬全体
(以下の表3を参照されたい)が試験用パッドに適用さ
れている。ここで注目すべきことは、2層構造の細片及
び単一層構造の細片の両方において、フラビンが結合し
ているフラビン依存性酵素又はフラビンが結合していな
いフラビン依存性酵素のいずれを使用してもよい。後者
の場合、フラビン補助因子(例えば、FMN又はFA
D)が添加される。
【0032】試験への使用においては、ユーザは一滴の
全血をポアレックス最上層の上面に塗布する。全血又は
溶血した血液がポアレックス最上層の上面と接触する
と、亜硝酸ナトリウムが再構成されて、反応可能な遊離
ヘモグロビンと反応し、それにより分析に対してヘモグ
ロビンの悪影響がなくなる。結果として生ずる、実質的
にヘモグロビン無しの試料が毛細管現象又は重力によっ
て下方の試験用パッドに移される。試験用パッド上で
は、試料がカスケード反応を開始し、色付いた染料を生
成する。この染料の濃度は試料中に含まれる分析物濃度
に比例し、光度計によって直接測定することができる。
図4は、グルコース酸化酵素及びPMSを用いたグルコ
ースに対する反応を示すグラフである。
全血をポアレックス最上層の上面に塗布する。全血又は
溶血した血液がポアレックス最上層の上面と接触する
と、亜硝酸ナトリウムが再構成されて、反応可能な遊離
ヘモグロビンと反応し、それにより分析に対してヘモグ
ロビンの悪影響がなくなる。結果として生ずる、実質的
にヘモグロビン無しの試料が毛細管現象又は重力によっ
て下方の試験用パッドに移される。試験用パッド上で
は、試料がカスケード反応を開始し、色付いた染料を生
成する。この染料の濃度は試料中に含まれる分析物濃度
に比例し、光度計によって直接測定することができる。
図4は、グルコース酸化酵素及びPMSを用いたグルコ
ースに対する反応を示すグラフである。
【0033】図5及び図6は、60%ヘマトクリットを
有する血液試料の時間経過に伴う光学濃度の変化を示す
グラフであり、血液試料はグルコース含有量が0mg/
dlの血液試料と100mg/dlの血液試料とを用
い、さらにどちらの場合も亜硝酸塩を含むものと含まな
いものとを用いた。図5のグラフに示す結果は、35℃
で得られたものである。また、図6のグラフに示す結果
は、室温(RT)で得られたものである。各々の場合に
おいて、亜硝酸塩濃度を5g/dlとした。亜硝酸塩が
血液試料に含まれない場合、ヘモグロビンによってテト
ラゾリウムが還元され、染料の濃度が連続的に増加し、
それに対応して光学濃度が増加する。亜硝酸塩がヘモグ
ロビン(酸化によって)を除去することによって、試料
中に含まれるグルコースからのみに色形成を制限する。
図5及び図6のグラフに示すデータの生成に使用した2
層構造の細片の調製は、後述の実施例1で説明する。
有する血液試料の時間経過に伴う光学濃度の変化を示す
グラフであり、血液試料はグルコース含有量が0mg/
dlの血液試料と100mg/dlの血液試料とを用
い、さらにどちらの場合も亜硝酸塩を含むものと含まな
いものとを用いた。図5のグラフに示す結果は、35℃
で得られたものである。また、図6のグラフに示す結果
は、室温(RT)で得られたものである。各々の場合に
おいて、亜硝酸塩濃度を5g/dlとした。亜硝酸塩が
血液試料に含まれない場合、ヘモグロビンによってテト
ラゾリウムが還元され、染料の濃度が連続的に増加し、
それに対応して光学濃度が増加する。亜硝酸塩がヘモグ
ロビン(酸化によって)を除去することによって、試料
中に含まれるグルコースからのみに色形成を制限する。
図5及び図6のグラフに示すデータの生成に使用した2
層構造の細片の調製は、後述の実施例1で説明する。
【0034】図7は、単一層構造の細片に対するグルコ
ース/グルコース酸化酵素系での色形成反応に対する亜
硝酸塩の効果を示すグラフである。血液試料は、どれも
60%ヘマトクリットを有し、グルコースの濃度が0m
g/dl又は200mg/dl、さらに亜硝酸塩が0m
g/dl又は20mg/dlである。これらの試料は、
室温で実験した。図7のグラフによれば、この系は室温
で有効であり、ヘマトクリットは最高60%である。使
用した単一層構造の細片の調製は、後述の実施例2に示
す。
ース/グルコース酸化酵素系での色形成反応に対する亜
硝酸塩の効果を示すグラフである。血液試料は、どれも
60%ヘマトクリットを有し、グルコースの濃度が0m
g/dl又は200mg/dl、さらに亜硝酸塩が0m
g/dl又は20mg/dlである。これらの試料は、
室温で実験した。図7のグラフによれば、この系は室温
で有効であり、ヘマトクリットは最高60%である。使
用した単一層構造の細片の調製は、後述の実施例2に示
す。
【0035】以下の実施例は本発明の好ましい実施形態
を実証する。実施例1では、2層構造の細片を使用し、
分析物はグルコース、さらに酵素はグルコース酸化酵素
を用いた。実施例2では、単一層構造の細片を使用し
た。既に述べたように、分析物はグルコース、さらに酵
素はグルコース酸化酵素を用いた。いずれの場合も既に
挙げた他の分析物と酵素との組み合わせ(例えば、文
献:Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed.,
ed. by C. Burtis et al., W. B. Sauders Co., Phila
delphia, PA,1994年,第976頁乃至第978頁及
び第1174頁乃至第1175頁を参照されたい)に適
用させるために組成の変更を容易に行うことができる。
なお、実施例1及び実施例2は本発明を限定することを
意図したものではない。
を実証する。実施例1では、2層構造の細片を使用し、
分析物はグルコース、さらに酵素はグルコース酸化酵素
を用いた。実施例2では、単一層構造の細片を使用し
た。既に述べたように、分析物はグルコース、さらに酵
素はグルコース酸化酵素を用いた。いずれの場合も既に
挙げた他の分析物と酵素との組み合わせ(例えば、文
献:Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed.,
ed. by C. Burtis et al., W. B. Sauders Co., Phila
delphia, PA,1994年,第976頁乃至第978頁及
び第1174頁乃至第1175頁を参照されたい)に適
用させるために組成の変更を容易に行うことができる。
なお、実施例1及び実施例2は本発明を限定することを
意図したものではない。
【0036】
【実施例】実施例1 パルコーポレーション(Pall Corporation, East Hill
s, NY)から得た0.8μmのナイロン膜を十分にしみ
込むまで表1の試薬に浸した。過剰の試薬はガラス棒に
よって優しくこすり取った。得られた膜を56℃のオー
ブンに10分間置くことによって乾燥させた。ポレック
ス(0.6mm厚)を表2の亜硝酸溶液に浸し、続いて
100℃のオーブンに10時間置くことによって乾燥さ
せた。最後に、膜をポリエステルストック(0.4mm
メレネックス(Melenex(登録商標))ポリエステル、
ICIアメリカ(ICI America, Wilmington, DE)から
入手)と亜硝酸塩を含浸したポレックスとの間に積層し
た。
s, NY)から得た0.8μmのナイロン膜を十分にしみ
込むまで表1の試薬に浸した。過剰の試薬はガラス棒に
よって優しくこすり取った。得られた膜を56℃のオー
ブンに10分間置くことによって乾燥させた。ポレック
ス(0.6mm厚)を表2の亜硝酸溶液に浸し、続いて
100℃のオーブンに10時間置くことによって乾燥さ
せた。最後に、膜をポリエステルストック(0.4mm
メレネックス(Melenex(登録商標))ポリエステル、
ICIアメリカ(ICI America, Wilmington, DE)から
入手)と亜硝酸塩を含浸したポレックスとの間に積層し
た。
【0037】実施例2 最初に表3の試薬に浸す点と、ポレックスが不要である
ことから第2の浸漬は行わない点とを除いて、実施例1
の手順を繰り返した。
ことから第2の浸漬は行わない点とを除いて、実施例1
の手順を繰り返した。
【0038】
【表1】
【0039】
【表2】
【0040】
【表3】
【0041】好ましい実施態様は以下の通りである。 (1)前記分析物はグルコースであり、また前記酵素は
グルコース酸化酵素である請求項1に記載の試薬。 (2)前記染料前駆体は水溶性である請求項1に記載の
試薬。 (3)前記電子転移剤はフェナジンメト硫酸塩(PM
S)又はその類似体を含む請求項1に記載の試薬。 (4)二価の金属安定化剤をさらに含む請求項1に記載
の試薬。 (5)前記染料前駆体は水溶性である請求項2に記載の
試薬。
グルコース酸化酵素である請求項1に記載の試薬。 (2)前記染料前駆体は水溶性である請求項1に記載の
試薬。 (3)前記電子転移剤はフェナジンメト硫酸塩(PM
S)又はその類似体を含む請求項1に記載の試薬。 (4)二価の金属安定化剤をさらに含む請求項1に記載
の試薬。 (5)前記染料前駆体は水溶性である請求項2に記載の
試薬。
【0042】(6)前記染料前駆体はフェナジンメト硫
酸塩(PMS)又はその類似体を含む請求項2に記載の
試薬。 (7)前記電子転移剤は二価金属安定化剤を含む請求項
2に記載の試薬。 (8)前記試験用パッドはプラスに帯電した面を有する
請求項3に記載の乾燥試薬細片。 (9)前記試験用パッドはポリアミドを含む請求項3に
記載の乾燥試薬細片。 (10)前記試験用パッドを覆う吸収性の最上層をさら
に有する請求項3の乾燥試薬細片。
酸塩(PMS)又はその類似体を含む請求項2に記載の
試薬。 (7)前記電子転移剤は二価金属安定化剤を含む請求項
2に記載の試薬。 (8)前記試験用パッドはプラスに帯電した面を有する
請求項3に記載の乾燥試薬細片。 (9)前記試験用パッドはポリアミドを含む請求項3に
記載の乾燥試薬細片。 (10)前記試験用パッドを覆う吸収性の最上層をさら
に有する請求項3の乾燥試薬細片。
【0043】(11)前記最上層は吸収性である請求項
5に記載の乾燥試薬細片。 (12)前記最上層と前記試験用パッドとの間に、スペ
ーサと、毛管現象経路をなす溝とをさらに有する請求項
5に記載の乾燥試薬細片。 (13)前記分析物はグルコースであり、前記酵素はグ
ルコース酸化物である請求項5の乾燥試薬細片。 (14)前記テトラゾリウム染料前駆体は、2,2’−
ジベンゾチアゾリル−5,5’−ビス[4−ジ(2−ス
ルホエチル)カルバモイルフェニル]−3,3’−
(3,3’−ジメトキシ−4,4’−ビフェニレン)ジ
テトラゾリウム、ジナトリウム塩(WST−5)である
請求項5に記載の乾燥試薬細片。
5に記載の乾燥試薬細片。 (12)前記最上層と前記試験用パッドとの間に、スペ
ーサと、毛管現象経路をなす溝とをさらに有する請求項
5に記載の乾燥試薬細片。 (13)前記分析物はグルコースであり、前記酵素はグ
ルコース酸化物である請求項5の乾燥試薬細片。 (14)前記テトラゾリウム染料前駆体は、2,2’−
ジベンゾチアゾリル−5,5’−ビス[4−ジ(2−ス
ルホエチル)カルバモイルフェニル]−3,3’−
(3,3’−ジメトキシ−4,4’−ビフェニレン)ジ
テトラゾリウム、ジナトリウム塩(WST−5)である
請求項5に記載の乾燥試薬細片。
【図1】本発明にもとづく試験用細片の斜視図である。
【図2】本発明にもとづく別の試験用細片の分解組立図
である。
である。
【図3】本発明にもとづくさらに別の試験用細片の分解
組立図である。
組立図である。
【図4】本発明にもとづくグルコース分析の化学反応を
説明するための模式図である。
説明するための模式図である。
【図5】2層構造の試験用細片を用いた分析(35℃)
によるヘモグロビン抑制剤としての亜硝酸塩の効果を示
すグラフである。
によるヘモグロビン抑制剤としての亜硝酸塩の効果を示
すグラフである。
【図6】2層構造の試験用細片を用いた分析(室温)に
よるヘモグロビン抑制剤としての亜硝酸塩の効果を示す
グラフである。
よるヘモグロビン抑制剤としての亜硝酸塩の効果を示す
グラフである。
【図7】1層構造の試験用細片を用いた分析(室温)に
よるヘモグロビン抑制剤としての亜硝酸塩の効果を示す
グラフである。
よるヘモグロビン抑制剤としての亜硝酸塩の効果を示す
グラフである。
10 試験用細片 12 試験用パッド 14 支持体(非吸収性層) 16 最上層(非吸収性層) 18 窓又はスルーホール 20 スペーサ 22 溝 24 開口部 26 測定領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 596159500 1000 Gibraltar Drive, Milpitas,California 95035,United States of America (72)発明者 イェン・シュ・ユ アメリカ合衆国、94506 カリフォルニア 州、プレザントン、パセオ・ロブルズ 3158
Claims (8)
- 【請求項1】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれる分析物の濃度を測定するための試薬であって、 a)前記分析物に対する特異性を有し、かつフラビンが
結合したフラビン依存性酵素と、 b)テトラゾリウム染料前駆体と、 c)電子転移剤と、 d)亜硝酸塩とを含むことを特徴とする試薬。 - 【請求項2】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれる分析物の濃度を測定するための試薬であって、 a)前記分析物に対する特異性を有し、かつフラビンが
結合していないフラビン依存性酵素と、 b)フラビンモノヌクレオチド(FMN)又はフラビン
アデニンジヌクレオチド(FAD)と、 c)テトラゾリウム染料前駆体と、 d)電子転移剤と、 e)亜硝酸塩とを含むことを特徴とする試薬。 - 【請求項3】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれる分析物の濃度を測定するための乾燥試薬細片で
あって、請求項1の試薬からなる被覆物を有する試験用
パッドが設けられた支持層を有する乾燥試薬細片。 - 【請求項4】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれる分析物の濃度を測定するための乾燥試薬細片で
あって、請求項2の試薬からなる被覆物を有する試験用
パッドが設けられた支持層を有する乾燥試薬細片。 - 【請求項5】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれる分析物の濃度を測定するための乾燥試薬細片で
あって、 試験用パッドと該試験用パッドに積層された最上層とが
設けられた支持層を備え、請求項1の試薬の第1の部分
が前記試験用パッド上にあり、前記試薬の第2の部分が
前記支持層及び/又は前記最上層上にあることを特徴と
する乾燥試薬細片。 - 【請求項6】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれる分析物の濃度を測定するための乾燥試薬細片で
あって、試験用パッドと該試験用パッド上に積層された
最上層とが設けられた支持層を有し、請求項2の試薬の
第1の部分が前記試験用パッド上にあり、また前記試薬
の第2の部分が前記支持層及び/又は前記最上層上にあ
る乾燥試薬細片。 - 【請求項7】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれるグルコースの濃度を測定するための乾燥試薬細
片であって、 a)支持層と、 b)前記支持層上に設けられ、かつ、 i)フラビンが結合したグルコース酸化酵素と、 ii)テトラゾリウム染料前駆体と、 iii)PMS又は該PMSの類似体とを含む被覆物を
有する試験用パッドと、 c)前記試験用パッド上に設けられ、かつ亜硝酸塩によ
って被覆された吸収性の最上層とを含むことを特徴とす
る乾燥試薬細片。 - 【請求項8】 ヘモグロビンを含有する生物学的液体に
含まれるグルコースの濃度を測定するための乾燥試薬細
片であって、 a)支持層と、 b)前記支持層上に設けられ、かつ、 i)フラビンが結合していないフラビン依存性酵素と、 ii)FMN又はFADと、 iii)テトラゾリウム染料前駆体と、 iv)PMS又は該PMSの類似体とを含む被覆物を有
する試験用パッドと c)前記試験用パッド上に設けられ、かつ亜硝酸塩によ
って被覆された吸収性の最上層とを含むことを特徴とす
る乾燥試薬細片。
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