MXPA01002062A - Diagnostico basado en compuestos de tetrazolio. - Google Patents

Diagnostico basado en compuestos de tetrazolio.

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MXPA01002062A
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Abstract

Se describe un reactivo que es adecuado para medir la concentracion de un analito en un fluido biologico que contiene hemoglobina, tal como sangre entera; el reactivo comprende una enzima dependiente de flavina que tiene especificidad por el analito, un cofactor de flavina si, y solamente si, una flavina no esta unida a la enzima, un precursor de colorante de tetrazolio, un agente de transferencia de electrones y una sal de nitrito; el reactivo provoca formacion de colorante que es una medida de la concentracion de analito; la sal de nitrito suprime la formacion de colorante de interferencia provocada de manera no enzimatica por la hemoglobina; de manera preferible, el reactivo se utiliza en una tira seca para medir glucosa en sangre entera.

Description

DIAGNOSTICO BASADO EN COMPUESTOS DE TETRAZOHO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD ANTERIOR Esta es una continuación en parte de la solicitud copendiente de E.U.A. con serie No. 09/282,083, presentada el 30 de marzo de 1999, la cual es una continuación en parte de la solicitud de E.U.A. con serie No. 09/161 ,876, presentada el 28 de septiembre de 1998, ahora la patente de E.U.A. No. 5,902,731.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a composiciones de diagnóstico que permiten la medición de concentraciones de analito en fluidos biológicos que contienen hemoglobina. Las composiciones se basan en precursores de colorante de tetrazolio e implican suprimir la reducción de ellos inducida por hemoglobina.
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El tejido adiposo es una de las formas más abundantes de almacenamiento de energía en el cuerpo. Libera ácidos grasos almacenados al sistema circulatorio para ser metabolizados principalmente por el hígado. En el procedimiento, se consume grasa y se libera energía y se hace disponible al cuerpo. Normalmente, se consume poca grasa, los ácidos grasos se metabolizan completamente a dióxido de carbono y agua, y la conversión no trastorna el delicado equilibrio de pH del cuerpo. Sin embargo, si están presentes cantidades insuficientes de carbohidratos en el cuerpo, debido, por ejemplo, a dietas, entonces el consumo de grasa y la producción de ácido graso puede incrementarse a niveles potencialmente perjudiciales. Además de las personas que hacen dietas, los pacientes dependientes de insulina son vulnerables, debido a su metabolismo de carbohidratos deteriorado. Cuando se utiliza ácido graso en exceso para suplir la demanda de energía del cuerpo, entonces se producen grandes cantidades de acetoacetato, acetona, y beta-hidroxibutirato. Esos intermediarios son referidos como cuerpos de cetona, y la condición es conocida como cetoacidosis. Los cuerpos de cetona normalmente pueden ser reciclados en otras formas por el cuerpo, con la condición de que no se abrume. Por lo tanto, un individuo saludable acumula una cantidad insignificante de esos analitos. Cuando una gran cantidad de grasas está siendo metabolizada en un periodo relativamente corto o cuando la mayoría de la energía se deriva de grasas, se producen cantidades masivas de cuerpos de cetona. La producción excesiva de esos metabolitos de grasa puede provocar ciertos trastornos neurológicos, si el problema no se corrige adecuadamente. Los cuerpos de cetona están presentes en la sangre y, si se excede un umbral, se excretan a través de la orina. Se detectan fácilmente mediante un analizador clínico moderno. En promedio, los porcentajes de beta-hidroxibutirato, acetoacetato, y acetona, son de 78%, 20% y 2%, respectivamente. Debido a su concentración relativamente baja y su alta volatilidad, la acetona se mide rara vez. En cambio, el acetoacetato se determina de manera cuantitativa mediante una reacción de nitroferricianuro y el beta-hidroxibutirato se cuantifica con un método enzimático. Las tiras de prueba de acetoacetato han estado disponibles durante décadas. Se basan en una reacción de acoplamiento de iones de nitroferricianuro con aldehidos y cetonas. Una muestra de orina alcalina o un espécimen de suero se deja reaccionar con el nitroferricianuro durante algunos minutos, y se desarrolla un color púrpura. La intensidad del color indica la concentración de acetoacetato. Sin embargo, la acetona interfiere con la prueba, resultando en lecturas más altas. Además, conforme el paciente se recupera de un episodio de cetoacidosis, el nivel de acetoacetato en la orina y en la sangre se incrementa, haciendo por lo tanto difícil el diagnóstico. La prueba de beta-hidroxibutirato es más útil para monitorear concentraciones de cuerpo de cetona. Se basa en la oxidación de beta-hidroxibutirato con la dehidrogenasa correspondiente en presencia de cofactor de dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD). (Estrictamente hablando, sólo D-beta-hidroxibutirato está presente en forma natural y en forma oxidada, pero se omite la "D" para fines de brevedad a través de esta especificación y las reivindicaciones anexas). Con la oxidación, se produce NADH, y su concentración se mide directamente con un espectrofotómetro de UV. Por lo tanto, el cambio de señal correspondiente en el espectro es proporcional a la concentración de analitos. Infortunadamente, la excitación de NADH ocurre en la región de UV; de esta manera, este modo de detección es adecuado solamente para instrumentos de laboratorio. Otro método para monitorear beta-hidroxibutirato es oxidizando el NADH con un compuesto de tetrazolio. Los compuestos de tetrazolio son en general muy sensibles a bases fuertes y a la luz. Por lo tanto, se debe ejercer especial cuidado para asegurar la integridad de esos compuestos. Sin embargo, los tetrazolios han jugado un papel importante en estudios de metabolismo de tejido. Por ejemplo, esta clase de compuestos ha sido utilizada para sondear oxidación anaeróbica y reacciones de reducción en células. Además, se utilizan comúnmente en diagnósticos clínicos. Los compuestos son típicamente compuestos de color claro o incoloros que sufren una reacción de reducción, en presencia de un agente reductor, para producir una formazana altamente teñida. Los agentes reductores tales como ascorbatos, sulfhidrilos o variantes de NADH, NADPH, PQQH2 (PQQ reducida, pirrolo-quinolina quinona) FMNH2 (FMN reducido, mononucleótido de flavina), y FADH (FAD reducido, dinucleótido de flavina-adenina) son capaces de formar el colorante.
En diagnósticos clínicos, se ha descubierto que esos colorantes son invaluables para monitorear la formación de NAD(P)H a partir de sus compuestos originales, NAD(P)+, en reacciones anaeróbicas. (Consultar, por ejemplo, patente de E.U:A. 5,360,595, expedida el 1o de noviembre de 1994 a D. Bell et al.). La reacción de óxido-reducción (redox) es rápida y no es sensible al oxígeno. El color del colorante resultante es muy intenso y tiene baja solubilidad en agua. En principio, los precursores de colorante de tetrazolio se pueden utilizar para medir cuerpos de cetona y glucosa en sangre entera. Sin embargo, el tetrazolio se puede reducir de manera no enzimática mediante hemoglobina (Fe(ll)) para formar una formazana teñida, si la hemoglobina no está contenida dentro de los glóbulos rojos de la sangre. De esta manera, la hemoglobina libre provoca una severa interferencia con las mediciones. De hecho, debido a hemolisis y la abundancia resultante de hemoglobina libre en relación con el analito de interés, en una medición típica de cuerpo de cetona, la señal de interferencia de la hemoglobina podría exceder la señal destinada. Las mediciones de glucosa, en particular en concentración normal o superior, no se afectan de manera tan adversa. Cuando la reacción se lleva a cabo en muestras de hematocrito alto o a una temperatura más alta, en donde la reacción de oxidación de hemoglobina es más rápida, la interferencia con mediciones de glucosa también es significativa. Puesto que la hemolisis de los glóbulos rojos que provoca que esté presente hemoglobina libre, no se puede evitar fácilmente, se deben remover los glóbulos rojos de las muestras antes de la prueba si se va a utilizar tetrazolio para el análisis. Los glóbulos rojos se pueden remover de las muestras filtrando con membranas y filtros, o atrapando con reactivos químicos, o mediante una combinación de ambos métodos. Los métodos de filtración para separar glóbulos rojos de sangre entera son costosos y requieren volúmenes de muestra más bien grandes. Un ejemplo de una prueba de cetona sanguínea (beta-hidroxibutirato) que utiliza filtración para eliminar glóbulos rojos de una muestra de sangre entera es la prueba KetoSite® disponible de GDS Diagnostics, Elkhart, IN. (Consultar Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2a Ed., ed. por C. Burtis et al, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1994, p. 974.). La "tarjeta de prueba" que se utiliza en esa prueba tiene dos capas de filtro, que hace a la tarjeta más bien costosa y necesita una muestra de sangre grande (25 µL). Además, la muestra no debe ser hemolizada. Una combinación de filtración y captura química se utiliza en la tira de glucosa de sangre Ames® Glucometer Encoré™ disponible de Miles. Esa tira utiliza una capa de material de filtro y un auxiliar de aglutinación (lecitina de papa) para eliminar interferencia de glóbulos rojos. (Consultar Chu et al., solicitud de patente Europea 0 638 805 A2, publ. Feb. 15 1995.) La introducción de un agente oxidante en un sistema, para oxidar la hemoglobina a methemoglobina, es otra manera de reducir la interferencia de hemoglobina. Aunque los ferricianuros son conocidos por transformar hemoglobina a methemoglobina, también destruyen el producto deseado, NADH. Palmer et al., EPO 0 330 517 B2, publicada el 30 de agosto de 1989, describe un método para medir analitos bioquímicos que implica hacer reaccionar el analito con una enzima oxidasa capaz de actividad de electrón transferasa con el analito para rendir enzima reducida. La enzima se analiza de manera colorimétrica para determinar la concentración de analito. La reacción de enzima no es dependiente de oxígeno. Freitag et al., WO 94/01544, publicada el 20 de enero de 1994, describe un reactivo estable para análisis de analito. El reactivo incluye una enzima, un derivado de fenazina, una sal de tetrazolio, y una sal de metal divalente para estabilizar el reactivo. Storhoff et al., WO 94/01578, publicada el 20 de enero de 1994, también describe un reactivo estable para análisis de analito. El reactivo incluye una enzima, un mediador, una sal de tetrazolio y un agente oxidante que estabiliza al reactivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un reactivo para medir la concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina. El reactivo comprende: a) una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina unida a ella y que tiene especificidad por el analito, b) un precursor de colorante de tetrazolio, c) un agente de transferencia de electrones, y d) una sal de nitrito. En una modalidad alterna de la invención, el reactivo comprende: a) una enzima dependiente de flavina que tiene especifidad por el analito y no tiene una flavina unida a ella, b) mononuclótido de flavina (FMN) o dinucleótido de flavina-adenina (FAD), c) un precursor de colorante de tetrazolio, d) un agente de transferencia de electrones, y e) una sal de nitrito. El reactivo es particularmente adecuado para recubrimiento sobre uno o más substratos para formar una tira de reactivo seca para medir una concentración de analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina. Una tira particularmente preferida comprende: a) una capa de soporte, b) sobre la capa de soporte, una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento que comprende: i) una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina unida a ella y que tiene especificidad por el analito, ii) un precursor de colorante de tetrazolio, y iii) un agente de transferencia de electrones, y c) sobre la almohadilla de prueba, una capa superior bibulosa que está recubierta con una sal de nitrito. Otra tira de la invención comprende: a) una capa de soporte, b) sobre la capa de soporte, una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento que comprende: i) una enzima dependiente de flavina que tiene especificidad por el analito y no tiene una flavina unida a ella, ii) FMN o FAD, iii) un precursor de colorante de tetrazolio, iv) un agente de transferencia de electrones, y c) sobre la almohadilla de prueba, una capa superior bibulosa que está recubierta con una sal de nitrito.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una vista en perspectiva de una tira de prueba de esta invención. La figura 2 es una vista con las partes separadas de otra tira de prueba de esta invención. La figura 3 es una vista con las partes separadas de otra tira de prueba de esta invención.
La figura 4 es una descripción gráfica de la química de un análisis de glucosa de esta invención. La figura 5 es una gráfica que muestra el efecto de nitrito como supresor de hemoglobina en un análisis de dos capas. La figura 6 es una gráfica que muestra el efecto de nitrito como un supresor de hemoglobina en un análisis de glucosa de una sola capa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un reactivo para medir la concentración de analito en fluidos biológicos que contienen hemoglobina (tales como sangre entera), mediante la producción de una concentración de la forma reducida de un cofactor, tal como NADH, NAD (P)H, PQQH2, FMNH2 o FADH2, que es una medida de la concentración de analito. La inclusión de nitrito en el reactivo supera la interferencia de hemoglobina con la medición de la concentración de cofactor reducido. Es particularmente útil para medición de cuerpos de cetona y glucosa, pero no se limita a éstos. La figura 1 ilustra una tira de prueba 10 típica de la invención, que consiste en una almohadilla de prueba 12 fija sobre un soporte 14. El soporte puede ser una lámina de plástico, por ejemplo, poliestireno, nylon, o poliester, o metálica o cualquier otro material adecuado conocido en la técnica. La almohadilla de prueba está recubierta con un reactivo que reacciona con el analito para provocar un cambio de color. La almohadilla de prueba comprende preferiblemente un material bibuloso, tal como un papel filtro o membrana de polímero. Sin embargo, debido a que la reacción no requiere oxígeno, la almohadilla de prueba puede ser un material no bibuloso, tal como una película de plástico. El reactivo incluye una enzima que es específica para el analito, un agente de transferencia de hidruro, un precursor de colorante de tetrazolio, un cofactor de enzima adecuado, y un supresor de hemoglobina. Opcionalmente, se incluye un regulador de pH y un estabilizador para mayor estabilidad. Como se muestra en la figura 2, la tira de prueba también puede ser una construcción de capas múltiples, con la capa superior 16 yaciendo sobre la almohadilla de prueba 12. En esta construcción, el reactivo se puede dividir entre las dos capas. Por ejemplo, el supresor de hemoglobina se puede recubrir sobre la capa superior 16 opcional y el resto del reactivo se puede recubrir sobre la almohadilla de prueba 12. Preferiblemente, la capa superior 16 es bibulosa y sirve como una capa de dispersión y como una capa absorbente para absorber el exceso de muestra. La muestra se aplica a la capa superior 16, y pasa a través de la almohadilla de prueba 12. La concentración de analito se determina midiendo ei cambio de color a través de la capa de soporte 14, o si la capa 14 no es transparente en donde se une al área de reacción, a través de una ventana o agujero con salida 18 opcional. En la modalidad alterna que se muestra en la figura 3, el espaciador 20 separa la capa superior 16 y la almohadilla de prueba 12. El espaciador 20 es preferiblemente una película de plástico no bibulosa que tiene un recubrimiento de adhesivo (no se muestra) sobre ambas caras. El canal 22 en el espaciador 20 provee una trayectoria capilar para que fluya la ' muestra desde la abertura 24 al área de medición 26. El flujo depende del aire que se ventila entre una superficie de la almohadilla de prueba 12 y una capa adjunta o, alternativamente, a través de una ventila opcional 18. El cambio de color en el área de medición 26 se monitorea a través de ia ventila/ventana opcional 18. El reactivo puede estar todo sobre la almohadilla de prueba 12 o, de manera alternativa, puede estar dividido entre la almohadilla de prueba y una o ambas de las capas no bibulosas 14 y 16. De esta manera, una primera parte del reactivo puede estar sobre la almohadilla de prueba y una segunda parte del reactivo puede estar sobre una o ambas de las capas no bibulosas. Cuando se hace referencia al reactivo como un "recubrimiento" o "sobre" una capa, se pretende incluir la posibilidad de que el reactivo se absorberá en la capa, particularmente si es bibulosa. Todas las enzimas dependientes de flavina son adecuadas para análisis con esta invención. Las enzimas oxidasa adecuadas y sus analitos correspondientes incluyen: alcohol oxidasa para alcohol, glucosa oxidasa para glucosa, galactosa oxidasa para galactosa, colesterol oxidasa para colesterol, L-lactato oxidasa para L-lactato, urato oxidasa para ácido úrico, bilirrubina oxidasa para bilirrubina, y colina oxidasa para colina. Las enzimas de hidrogenasa adecuadas y los analitos correspondientes incluyen: piruvato dehidrogenasa para piruvato, D-lactato dehidrogenasa para D-lactato, y succinato dehidrogenasa para succinato.
Cuando no está unido a la enzima, un cofactor se debe añadir para activar la enzima. Los cofactores que se pueden añadir a una enzima dependiente de flavina incluyen: mononucléotido de flavina (FMN) y dinucleótido de flavina-adenina (FAD). En presencia de la enzima, el analito reduce el cofactor. El siguiente paso en el procedimiento de formación de colorante es abstracción de hidruro a partir del cofactor reducido mediante un agente de transferencia de electrones. Los agentes de transferencia de electrones adecuados incluyen diaforasa, tal como lipoica dehidrogenasa, ferredoxin-NADP reductasa, y lipoamida dehidrogenasa. Son más preferidos, cuando se utiliza un cofactor de flavina, los agentes de transferencia de electrones no enzimáticos, tales como metosulfato de fenazina (PMS), etosulfato de fenazina (PES), metosulfato de 1-metoxifenazina, o Meldola Blue. Las cinéticas de reacción y la estabilidad son los factores principales para seleccionar un agente de transferencia de electrones o "abstractor de hidruro". Por ejemplo, PMS es el abstractor de hidruro universal, debido a que tiene cinéticas de reacción relativamente rápidas con la mayoría de los compuestos de tetrazolio listados enseguida. Por esa razón, se prefiere cuando el cofactor es PQQ. Sin embargo, PMS es más sensible a la luz que los abstractores de hidruro basados en enzima. La diaforasa es más estable y, por esa razón, se prefiere cuando el cofactor es NAD. El hidruro capturado se transfiere a un compuesto de tetrazolio (precursor de colorante) para formar una formazana coloreada. Los compuestos de tetrazolio que son los más adecuados para este dispositivo son: 2-(2'benzot¡azolil)-5-stiril-3-(4'-ftalhidrazidil)tetrazol¡o (BSPT), 2-benzotiazolil-(2)-3,5-difeniltetrazolio (BTDP), 2,3-di(4-nitrofenil)tetrazolio (NDP), 2,5-d¡fenil-3-(4-st¡rilfenil)tetrazolio (DPSP), distirilnitroazul de tetrazolio (DS-NBT), 3,3,-P,3,-dimetoxi-(1 ,1 ,-bifenil)-4,4,-diil]-bis[2-(4-nitrofen¡l)-5-fenil(2H-tetrazolio (NBT), 3-(4,5-dimetil-2-t¡azolil)-2,5-difen¡l-2H tetrazolio (MMT), 2-fenil-3-(4-carboxífenil)-5-metil tetrazolio (PCPM), azul de tetrazolio (TB), tiocarbamil nitroazul de tetrazolio (TCNBT), tetranítroazul de tetrazolio (TNBT), violeta de tetrazolio (TV), 2-benzotiazotiazolil-3-(4-carboxi-2-metoxifenil)-5-[4-(2-sulfoetilcarbamoil)fenil]-2H-tetrazolio (WST-4), y sal de disodio de 2,2-dibenzotiazoIil-5,5,-bis[4-di(2-sulfoet¡I)carbamoilfen¡l]-3,3'-(3,3'-dimetoxi-4,4,-bifenileno)d¡tetrazolio (WST-5). Preferiblemente, los precursores de colorante hidrosolubles, más preferiblemente WST-5, se utilizan para ser compatibles con muestras biológicas. Además, cuando se utiliza WST-5, el compuesto de formazana resultante exhibe una fuerte absorción espectral en la región púrpura-azul, reduciendo por lo tanto la necesidad de corregir la señal de trasfondo de hemoglobina. Finalmente, está presente un supresor de hemoglobina en el reactivo para restringir la reacción de formación indeseable de colorante entre hemoglobina y el compuesto de tetrazolio. El papel del supresor de hemoglobina es oxidar la hemoglobina a methemogloblina, la cual no reacciona con el tetrazolio o formazana. De manera sorpresiva, las sales de nitrito, tales como nitrito de sodio, nitrito de potasio, y sus derivados, son muy efectivas para suprimir la hemoglobina, mientras que no destruyen el cofactor reducido (tales como NADH, PQQH2, FMNH2, o FADH2). Los nitritos son efectivos, también, a temperatura elevada y con muestras de hematocrito alto. Se prefiere el nitrito de sodio, debido a que tiene una alta solubilidad acuosa, es no tóxico, y es relativamente barato. Opcionalmente, el reactivo también puede incluir un estabilizador, tal como una sal de metal divalente. Aunque el reactivo de esta invención se puede utilizar en un modo químico húmedo, tal como en un recipiente (cuvette), en modalidades preferidas, la invención provee tiras secas para analizar beta-hidroxibutirato o glucosa en sangre entera. Las tiras pueden ser de una sola capa o de dos capas. Una tira de dos capas consiste de una almohadilla de membrana de prueba, preferiblemente de nylon, que se coloca entre un soporte y una capa superior. El soporte es preferiblemente una lámina de poliéster. La capa superior puede ser una rejilla o cualquier material bibuloso conocido en la técnica. Un material preferido es un polietileno poroso tratado con metiloleoil taurato de sodio, disponible de Porex Corp. de Fairbum, GA. Se hace referencia en la presente a este material como "Porex". Preferiblemente, la almohadilla de prueba tiene una superficie cargada positivamente. Más preferiblemente, la almohadilla de prueba es poliamida. La almohadilla de prueba contiene un reactivo que comprende glucosa oxidasa (que incluye un cofactor de flavina), PMS (o uno de sus análogos), y WST-5 (cuadro 1 enseguida). La capa superior de Porex contiene un reactivo de nitrito (cuadro 2). En una tira de una sola capa, la capa de Porex se omite, y todo el reactivo, incluyendo el nitrito (cuadro 3), se aplica a la almohadilla de prueba. Nótese que en las tiras de dos capas y de una sola capa, se pueden utilizar una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina unida a ella o una enzima dependiente de flavina que no tiene una flavina unida a ella. En el último caso, se añade un cofactor de flavina (por ejemplo FMN o FAD). Durante el funcionamiento, un usuario aplica una gota de sangre entera a la superficie superior de la capa superior de Porex. A medida que la sangre entera o la sangre lisada se pone en contacto con la Porex, el nitrito de sodio se reconstituye y reacciona con la hemoglobina libre disponible, haciendo por lo tanto a la hemoglobina inofensiva para el análisis. La muestra resultante, sustancialmente libre de hemoglobina, se transfiere a la almohadilla de prueba que está abajo, a través de fuerza capilar o gravitacional. Sobre la almohadilla de prueba, la muestra inicia la reacción de cascada para producir un colorante, cuya concentración es proporcional a la concentración de analito en la muestra y se puede determinar directamente con un fotómetro. La figura 4 describe la reacción para glucosa, utilizando glucosa oxidasa y PMS. La figura 5 describe el cambio en densidad óptica con el tiempo de muestras de sangre, que tienen todas 60% de hematocrito y que contienen 0 y 100 mg/dl de glucosa, con y sin nitrito. La gráfica superior exhibe resultados a 35°C. La gráfica inferior exhibe resultados a temperatura ambiente (RT). En cada caso, la concentración de nitrito fue de 5 g/dl. En ausencia de nitrito, la hemoglobina reduce el tetrazolio para formar una concentración de colorante que se incrementa continuamente, con un incremento correspondiente en densidad óptica. El nitrito, mediante remoción de la hemoglobina (por oxidación), limita la formación de color a aquel que resulta únicamente de la glucosa en la muestra. La preparación de la tira de dos capas que se utilizó para generar los datos descritos en las gráficas, se describe en el ejemplo 1 , enseguida. La figura 6 muestra el efecto de nitrito sobre la reacción de formación de color en el sistema de glucosa/glucosa oxidasa para una tira de una sola capa. Las muestras de sangre, que tienen todas 60% de hematocrito, contienen 0 ó 200 mg/dl de glucosa y 0 ó 20 mg/ml de nitrito. Las muestras se analizaron a temperatura ambiente. La gráfica muestra que el sistema presente es efectivo a temperatura ambiente y hematocritos hasta 60%. La preparación de la tira de una sola capa que se utilizó se describe en el ejemplo 2 enseguida. Los siguientes ejemplos demuestran modalidades preferidas de la presente invención. En el ejemplo 1 , se utilizó una tira de dos capas, el analito es glucosa, y la enzima es glucosa oxidasa. En el ejemplo 2 se utilizó una tira de una sola capa. Como anteriormente, el analito es glucosa y la enzima es glucosa oxidasa. Las composiciones se pueden modificar fácilmente para aplicación a otras combinaciones de analito/enzima listadas inicialmente. (Consultar, por ejemplo Tietz Textbook of Clinical Chemistrí, 2a Ed., ed. por C. Burtis et al., W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, pp 976-978 y 1174-1175.). Los ejemplos no están diseñados para ser limitativos de ninguna manera.
EJEMPLO 1 Una membrana de nilón de 0.8 µm obtenida de Pall Corporation (East Hills, NY) se sumergió en el reactivo del cuadro 1 hasta que se saturó. El reactivo en exceso se desprendió suavemente con una varilla de vidrio. La membrana resultante se colgó para secar en un horno a 56°C durante 10 minutos. Porex (0.6 mm de grueso) se remojó en la solución de nitrito del cuadro 2 y después se colgó para secarse en un horno a 100°C durante 10 horas. Finalmente, la membrana se laminó entre un material de poliéster (poliéster Melenex® de 0.4 mm de ICI America, Wilmington, DE) y la Porex impregnada de nitrito.
EJEMPLO 2 Se repitió el procedimiento del ejemplo 1 , excepto que la primera inmersión fue en el reactivo del cuadro 3, y no hubo segunda inmersión, debido a que no se necesitó la Porex.
CUADRO 1 Reactivo para una almohadilla de prueba de glucosa CUADRO 2 Reactivo de nitrito CUADRO 3 Reactivo para una almohadilla de prueba de glucosa Gantrez AN-139 (anhídrido polimetilvinileter-alt-maleico, PM 1 ,080,000, Cat # 41632-0, Aldrich Chemicals, Milwaukee, Wl, E.U.A.) Hacer Gantrez al 6% en agua, calentar a 95°C durante menos de 45 minutos para obtener Gantrez al 6% que está listo para utilizarse.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un reactivo para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende a) una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina unida a ella y que tiene una especificidad para el analito, b) un precursor de colorante de tetrazolio, c) un agente de transferencia de electrones, y d) una sal de nitrito. 2.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el analito es glucosa y la enzima es glucosa oxidasa. 3.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el precursor de colorante es hidrosoluble. 4.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente de transferencia de electrones comprende metosulfato de fenazina (PMS) o un análogo del mismo. 5.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente un estabilizador de metal divalente. 6.- Un reactivo para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende, a) una enzima dependiente de flavina que tiene una especificidad para el analito y no tiene una flavina unida a ella, b) mononucleótido de flavina (FMN) o dinucleótido de flavina-adenina (FAD), c) un precursor de colorante de tetrazolio, d) un agente de transferencia de electrones, y e) una sal de nitrito. 7.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el precursor de colorante es hidrosoluble. 8.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el agente de transferencia de electrones comprende (PMS) o un análogo del mismo. 9.- El reactivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende adicionalmente un estabilizador de metal divalente. 10.- Una tira de reactivo seca para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende una capa de soporte sobre la cual está una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento del reactivo de conformidad con la reivindicación 1. 1.- Una tira de reactivo seca para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende una capa de soporte sobre la cual está una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento del reactivo de conformidad con la reivindicación 6. 12.- La tira de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la almohadilla de prueba tiene una superficie cargada positivamente. 13.- La tira de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la almohadilla de prueba comprende una poliamida. 14.- La tira de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende adicionalmente una capa superior bibulosa que yace sobre la almohadilla de prueba. 15.- Una tira de reactivo seca para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende una capa de soporte sobre la cual está una almohadilla de prueba y una capa t superior que yace sobre la almohadilla de prueba en la cual una primera parte del reactivo de conformidad con la reivindicación 1 está sobre la almohadilla de prueba y una segunda parte del reactivo está sobre el soporte y/o capa superior. 16.- Una tira de reactivo seca para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende una capa de soporte sobre la cual está una almohadilla de prueba y una capa superior que yace encima de la almohadilla de prueba en la cual una primera parte del reactivo de conformidad con la reivindicación 6 está sobre la almohadilla de prueba y una segunda parte del reactivo está sobre el soporte y/o capa superior. 17.- La tira de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la capa superior es bibulosa. 18.- La tira de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque comprende adicionalmente un espaciador y un canal entre la capa superior y la almohadilla de prueba para proveer una trayectoria capilar entre la capa superior y la almohadilla. 19.- La tira de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el analito es glucosa y la enzima es glucosa oxidasa. 20.- La tira de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el precursor de colorante de tetrazolio es la sal de disodio de 2,2'-dibenzotiazolil-5,5,-bis[4-di(2-sulfoet¡l)carbamoilfenil]-3,3'-(S.S'-dimetoxM^'-bifenilen^itetrazolio íWST-d). 21.- Una tira seca para prueba de reactivo para medir una concentración de glucosa en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende a) una capa de soporte, b) sobre la capa de soporte, una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento que comprende i) glucosa oxidasa que tiene una flavina unida a ella, ii) un precursor de colorante de tetrazolio, y iii) PMS o un análogo del mismo, y c) sobre la almohadilla de prueba, una capa superior bibulosa que está recubierta con una sal de nitrito. 22.- Una tira seca para prueba de reactivo para medir una concentración de glucosa en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende a) una capa de soporte, b) sobre la capa de soporte, una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento que comprende, i) una enzima dependiente de flavina que no tiene una flavina unida a ella, ¡i) FMN o FAD, iii) un precursor de colorante de tetrazolio, y iv) PMS o un análogo del mismo, y c) sobre la almohadilla de prueba, una capa superior bibulosa que está recubierta con una sal de nitrito.
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