MXPA99002507A - Agente de diagnostico a base de compuestos de tetrazolio - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un reactivo es adecuado para medir la concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, tal como sangre completa;el reactivo comprende enzima deshidrogenasa que tiene especificidad por el analito, dinucleótido de nicotinamida-adenina o un derivado de dinucleótido de nicotinamida-adenina, un precursor de colorante de tetrazolio, una enzima diaforasa o un análogo de la misma, y una sal de nitrito, el reactivo ocasiona la formación de colorante, que es una medida de la concentración de analito;la sal de nitrito suprime la interferencia de formación de colorante causada no enzimáticamente por la hemoglobina;de preferencia, se usa el reactivo en una tira seca para medir cuerpos cetónicos tales como beta-hidroxibutirato.

Description

AGENTE DE DIAGNOSTICO A BASE DE COMPUESTOS DE TETRAZOLIO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a composiciones de diagnóstico que permiten la medición de concentraciones de analito en fluidos biológicos que contienen -hemoglobina. Las composiciones están basadas en precursores de colorante de tetrazolio e incluyen la supresión de su reducción inducida por hemoglobina . 2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El tejido adiposo es una de las formas más abundantes de almacenamiento de energía en el cuerpo. Libera ácidos grasos almacenados hacia el sistema circulatorio para ser metabolizados principalmente por el hígado. En el proceso, se consume la grasa y se libera energía que se hace disponible para el cuerpo. Normalmente, se consume poca grasa, los ácidos grasos son metabolizados completamente a dióxido de carbono y agua, y la conversión no perturba el delicado balance de pH del cuerpo. Sin embargo, si están presentes cantidades insuficientes de carbohidratos en el cuerpo, debido por ejemplo a la dieta, entonces el consumo de grasa y la producción de ácido graso pueden aumentar a niveles potencialmente peligrosos. Además de las personas a dieta, los pacientes dependientes de insulina son vulnerables, debido al deterioro de su metabolismo de carbohidratos . Cuando es usado ácido graso en exceso para abastecer una demanda de energía del cuerpo, entonces se producen grandes cantidades de acetoacetato, acetona y beta-hidroxibutirato . Estos intermediarios son conocidos como cuerpos cetónicos, y la condición es conocida como cetoacidosis . Los cuerpos cetónicos pueden ser reciclados normalmente en otras formas por el cuerpo, siempre que no sean abrumadores. Por lo tanto, un individuo sano acumula una cantidad despreciable de estos analitos. Cuando se metaboliza una gran cantidad de grasas en un período relativamente corto, o cuando la mayor parte de la energía deriva de las grasas, se producen cantidades masivas de cuerpos cetónicos. La producción excesiva de estos metabolitos de la grasa pueden ocasionar ciertos trastornos neurológicos si el problema no se corrige rápidamente . Los cuerpos cetónicos están presentes en la sangre, y si se excede cierto umbral, son excretados a través de la orina. Son detectados fácilmente por un analizador clínico moderno. En promedio, los porcentajes de beta-hidroxibutirato, acetoacetato y acetona son 78%, 20% y 2%, respectivamente. Debido a su concentración relativamente baja y a su alta volatilidad, raramente se mide la acetona. En su lugar, el acetoacetato se determina cuantitativamente por medio de una reacción de nitroprusiato, _y el beta-hidroxibutirato se cuantifica con un método enzimático. Por décadas, se han tenido disponibles tiras de prueba de acetoacetato. Se basan en una reacción de copulación de ion nitroprusiato con aldehidos y cetonas . Una muestra de orina o un espécimen de suero alcalinos se deja reaccionar con el nitroprusiato durante algunos minutos, y se desarrolla un color púrpura. La intensidad del color indica la concentración de acetoacetato. Sin embargo, la acetona interfiere con la prueba, dando como resultado lecturas más altas. Además, conforme el paciente se recupera de un episodio de cetoacidosis, aumenta el nivel de acetoacetato en la orina y en la sangre, haciendo así difícil el diagnóstico. La prueba de beta-hidroxibutirato es más útil para monitorear las concentraciones de cuerpos cetónicos . Se basa en la oxidación de beta-hidroxibutirato con la deshidrogenasa correspondiente en presencia de cofactor de dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) . (Hablando estrictamente, solo el beta-hidroxibutirato está presente naturalmente y es oxidado, pero los autores de la presente omiten la "D" para mayor brevedad en toda esta especificación y en las reivindicaciones anexas) . Después de la oxidación, se produce NADH, y se mide directamente su concentración con un espectrofotóraetro UV. Por lo tanto, el cambio correspondiente de señal en el espectro es proporcional a la concentración del analito. Desafortunadamente, ocurre excitación de NADH en la región UV; así, este modo de detección es adecuado solo para instrumentos de laboratorio. Otro „método para monitorear beta-hidroxibutirato, es la oxidación de NADH con un compuesto de tetrazolio . Los compuestos de tetrazolio han desempeñado un importante papel en los estudios del metabolismo de tejidos. Por ejemplo, se ha usado esta clase de compuestos en el análisis de reacciones de oxidación y reducción en las células. Además, se usan comunmente en diagnóstico clínico. Los compuestos son típicamente compuestos incoloros o de color ligero que sufren una reacción de reducción en. presencia de un agente reductor, para producir un formazán altamente coloreado. Agentes reductores tales como ascorbatos, sulfhidrilos , o variantes de NADH y NADPH, son capaces de formar el colorante . En diagnóstico clínico, se ha encontrado que estos colorantes son inapreciables para monitorear la formación de NAD(P)H a partir de sus compuestos de origen, NAD(P)+, en reacciones anaerobias. La reacción de óxido- educción es rápida y no es sensible al oxígeno. El color del colorante resultante es muy intenso y tiene baja solubilidad en agua. En principio, los precursores de colorante de tetrazolio se pueden usar para medir cuerpos cetónicos y glucosa en sangre completa. Sin embargo, el tetrazolio puede ser reducido no enzimáticamente por la hemoglobina (Fe (II)) para formar un formazán de color, si la hemoglobina no está contenida dentro de los glóbulos rojos de la sangre. De esta manera, la hemoglobina libre causa una seria interferencia con las mediciones. De hecho, debido a la hemolisis y a la abundancia resultante de hemoglobina libre en relación con el analito de interés, en una muestra clínica típica, la señal de interferencia de la hemoglobina podría exceder a la señal buscada. Esto es particularmente cierto en muestras de alto hematocrito, o cuando la reacción se lleva a cabo a una temperatura más alta en -donde la reacción de oxidación de hemoglobina es más rápida. Puesto que la hemolisis de glóbulos rojos, que ocasiona la presencia de hemoglobina libre, no puede ser evitada fácilmente, los glóbulos rojos deben ser removidos de las muestras antes de la prueba si se utiliza tetrazolio para el análisis. Los glóbulos rojos se pueden remover de las muestras filtrando con membranas y filtros, por medio de sujeción con reactivos químicos, o por medio de una combinación de ambos métodos. Los métodos de filtración para separar glóbulos rojos de sangre completa son costosos y requieren más bien de grandes volúmenes de. muestra. Un ejemplo de una prueba de cetona (beta-hidroxibutirato) en sangre que utiliza filtración para eliminar glóbulos rojos de una muestra de sangre completa es la prueba KetoSiteR, disponible de GDS Diagnostics, Elkhart, Indiana (véase "Tietz Textbook of Clinical Chemistry" , 2a edición, editado por C. Burtis y otros, W. B. Saunders Co . , Philadelphia, Pennsylvania, 1994, página 974) . La tarjeta "Test Card" usada en esa prueba tiene dos capas de filtro, que hace a la tarjeta más bien costosa y "requiere una muestra grande (25 µl) de sangre. Además, la sangre no debe estar hemolizada. Una combinación de filtración y sujeción químico es utilizada en la tira Ames Glucometer Encoré para glucosa en sangre, disponible de Miles. Esa tira usa una capa de material de filtro y un auxiliar de aglutinación (lectina de papa) para eliminar la interferencia de los glóbulos rojos (véase Chu y otros, Solicitud de Patente Europea 0 638 805 A2 , publicada el 15 de febrero de 1995) . Otra forma para reducir la interferencia de la hemoglobina es la introducción de un agente oxidante en un sistema, para oxidar la hemoglobina a metahemoglobina . Aunque se sabe que los ferricianuros transforman la hemoglobina en metahemoglobina, también destruyen el producto deseado, NADH.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un reactivo para medir la concentración de un analito en un fluido biológico que contiene -hemoglobina. El reactivo comprende: a) una enzima deshidrogenasa que tiene -especificidad por el analito; b) dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) o un derivado de NAD; c) un precursor de colorante de tetrazolio; d) una enzima diaforasa o un análogo de la misma, y e) una sal de nitri o-- El reactivo es particularmente adecuado para ser aplicado como recubrimiento sobre uno o más substratos para formar una tira reactiva seca para medir un analito. Una tira particularmente preferida comprende: a) una capa de soporte; b) sobre la capa de soporte, una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento que comprende: i) una enzima deshidrogenasa que tiene especificidad por el analito; ii) dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) o un derivado de NAD; iii) un precursor de colorante de tetrazolio, y iv) una enzima diaforasa o un análogo de la misma, y c) sobre la almohadilla de prueba, una capa superior absorbente que está recubierta con una sal de nitrito.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una vista es perspectiva de una tira de prueba de esta invención. La figura 2 es una vista esquemática de otra_tira de prueba de esta invención. La figura 3 es una vista esquemática de otra tira de prueba de esta invención.

La figura 4 es una representación gráfica de la química de una prueba de cetona de esta invención. La figura 5 es una gráfica que muestra el efecto del nitrito como un supresor de hemoglobina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un reactivo para medir la concentración de analito en fluidos biológicos que contienen hemoglobina (tal como sangre completa) , produciendo una concentración de NADH que es una medida de la concentración de analito. La inclusión de nitrito en el reactivo supera la interferencia de hemoglobina con la medición de la concentración de NADH. Es particularmente útil para la medición de cuerpos cetónicos, pero no está limitado a ésta. La figura 1 representa una tira de prueba 10, típica de la invención, que consiste de una almohadilla de prueba 12 fija sobre un soporte 14. El soporte puede ser una hoja de plástico -v.gr., poliestireno, nylon, o poliéster- o metálica, o de cualquier otro material conocido en la técnica. La almohadilla de prueba está recubierta con un reactivo que reacciona con el analito para ocasionar un cambio de color. La almohadilla de prueba comprende preferiblemente un material absorbente, tal como papel filtro o membrana de polímero. Sin embargo, puesto que la reacción no requiere de oxígeno, la almohadilla de prueba puede ser de un material no absorbente, tal como película de plástico. El reactivo incluye una enzima que es específica para el analito, un agente- de transferencia de hidruro, un precursor " de—colorante de tetrazolio, un cofactor de enzima adecuado y un supresor de hemoglobina. Opcionalmente, se incluyen un amortiguador y un estabilizador para mayor estabilidad. Como se muestra en la figura 2, la tira de prueba puede ser también una construcción de capas múltiples, con la capa superior 16 cubriendo la almohadilla de prueba 12. En esa construcción, el reactivo puede estar dividido entre las dos capas. Por ejemplo, el supresor de hemoglobina puede ser aplicado como recubrimiento sobre la capa superior opcional 16 y el resto del reactivo puede ser aplicado como recubrimiento sobre la almohadilla de prueba 12. Preferiblemente, la capa superior 16 es absorbente y sirve como una capa de extensión y como una capa absorbente para absorber el exceso de muestra. La muestra se aplica a la capa superior 16 y pasa completamente hacia la almohadilla de prueba 12. La concentración de analito se determina midiendo el cambio de color a través de la capa de soporte 14 o, si la capa 14 no es transparente en donde colinda con el área de reacción, a través de la ventana o agujero pasado opcional 18. En la modalidad alternativa mostrada en la figura 3, el separador 20 separa la capa de superior 16 y la almohadilla de prueba 12. El separador 20 es preferiblemente una película de plástico no absorbente que tiene un recubrimiento adhesivo (no mostrado) sobre ambas caras. El canal 22 en el separador 20 provee una ruta de capilaridad para que la muestra fluya desde la abertura 24 hasta el área de medición 26. El flujo depende de la ventilación de aire entre una superficie de la almohadilla de prueba 12 y una capa contigua o alternativamente, a través de la ventilación opcional 18. Se monitorea el cambio de color en el área de medición 26 a través de la ventilación/ventana opcional 18. Puede estar todo el reactivo sobre la almohadilla de prueba 12 o, alternativamente, puede estar -dividido entre la almohadilla de prueba y una o las dos capas no absorbentes 14 y 16. Cuando se hace aquí referencia a que el reactivo como un "recubrimiento" o "sobre" una capa, se pretende incluir la posibilidad de que el reactivo será absorbido en la capa, particularmente si esta es absorbente. Las enzimas que son adecuadas para las pruebas con esta invención y los analitos correspondientes son: alcohol deshidrogenasa para alcohol, formaldehído deshidrogenasa para formaldehído, glucosa deshidrogenasa para glucosa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para glucosa-6-fosfato, glutamato deshidrogenasa para ácido glutámico, glicerol deshidrogenasa para glicerol, beta-hidroxibutirato deshidrogenasa para beta-hidroxibutirato, hidroxiesteroide deshidrogenasa para esteroides, L-lactato deshidrogenasa para L-lactato, leucina deshidrogenasa para leucina, malato deshidrogenasa para ácido málico, y piruvato deshidrogenasa para ácido pirúvico.

Se requiere un cofactor de enzima adecuado para activar la enzima. Dependiendo—de la enzima, se pueden usar estos co±actores : dinucleótido de beta-nicotinamida-adenina (beta-NAD) , fosfato del dinucleótido de beta-nicotinamida-adenina (beta-NADP) , dinucleótido de tionicotinamida-adenina, fosfato del dinucleótido de tionicotinamida-adenina, dinucleótido de nicotinamida-1, N-6-etenoadenina, y fosfato del dinucleótido de nicotinamida-1 , N-6-etenoadenina . En presencia de la enzima, el analito reduce el cofactor. ~ ~ El siguiente paso en el proceso de formación del colorante es la separación del hidruro del cofactor reducido. Se puede realizar por medio de una diaforasa, tal como lipoico deshidrogenasa, ferredoxin-NADP reductasa, lipoamida deshidrogenasa, o por medio de un análogo sintético tal como metosulfato de fenazina (PMS) o Azul de Meldola. La cinética de la reacción y la estabilidad son los factores principales para seleccionar un agente de transferencia de hidruro o "atrayente" . Por ejemplo, el PMS es el atrayente universal de hidruro, porque tiene una cinética de reacción relativamente rápida con la mayor parte de los compuestos de tetrazolio mencionados antes. Sin embargo, es más sensible a la luz que los atrayentes de hidruro a base de enzima. Por esa razón es más adecuada la diaforasa y se le prefiere. El hidruro capturado se transfiere a un compuesto de tetrazolio (precursor de colorante) para formar un formazán coloreado. Los compuestos de tetrazolio que son más adecuados para este dispositivo son: 2- (2 ' -benzotiazolil) -5-estiril-3- (4 ' -fatalilhidrazidil) tetrazolio (BSPT) , 2 -benzotiazolil- (2) -3, 5-difeniltetrazolio (BTDP) , 2 , 3 -di (4 -nitrofenil) tetrazolio (DNP) , 2, 5-difenil-3- (4 -estirilfenil) tetrazolio (DPSP) , diestirilnitroazul de tetrazolio (DS-NBT) , 3 , 3 ' - [3 , 3 ' -dimetoxi- (1,1' -bifenil) -4,4 ' -diil.bis [2- (4 -nitrofenil) -5-fenil(2H-tetrazolio (NBT) , 3 - (4 , 5-dimetil-2 -tiazolil) -2 , 5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) , 2-fenil-3- (4-carboxifenil) -5-metiltetrazolio (PCPM) , azul de tetrazolio (TB) , tiocarbamilnitroazul de tetrazolio (TCNBT) , tetranitroazul de tetrazolio (TNBT) , violeta de tetrazolio (TV), 2-benzotiazotiazolil-3- (4-carboxi-2-metoxifenil) -5- [4- (2-sulfoetilcarbamoil) fenil] -2H-metoxifenil) -5- [4- (2 -sulfoetilcarbamoil) fenil] -2H-tetrazalio (WST-4) , y 2, 2 ' -dibenzotiazolil-5-5 • -bis [4-di (2-sulfoetil) carbamoilfenil] -3 , 3 ' - (3 , 3 ' -dimetoxi-4 , 4 ' -bifenilen) ditetrazolio, sal de disodio (WST-5) . Se prefiere WST-5 porque se disuelve rápidamente en un medio acuoso, que es más compatible con las muestras biológicas. Además, el compuesto formazán resultante exhibe fuerte absorción espectral en la región púrpura-azul, reduciendo así la necesidad de corregir la señal base de la hemoglobina. Finalmente, un supresor de hemoglobina está presente en el reactivo para restringir la reacción inconveniente de formación de colorante, entre la hemoglobina y el compuesto de tetrazolio. La función del supresor de hemoglobina es la de oxidar la hemoglobina a metahemoglobina, que no reacciona con el tetrazolio. Sorprendentemente, las sales de nitrito tales como nitrito de sodio, nitrito de potasio, y sus derivados, son muy efectivos para suprimir la hemoglobina, sin destruir el NADH. Los nitritos son efectivos también a temperatura elevada y con muestras de alto hematocrito. Se prefiere el nitrito de sodio porque tiene alta solubilidad en agua, no es tóxico y es relativamente barato. Aunque el reactivo de esta invención se puede usar en un modo químico en húmedo tal como en una cubeta, en una modalidad preferida, la invención es una tira seca para analizar beta-hidroxibutirato en sangre completa. Consiste de una almohadilla de membrana de prueba, preferiblemente de nylon, que se coloca entre un soporte y una capa superior. El soporte es preferiblemente de hoja de poliéster. La capa superior puede ser cualquier material absorbente conocido en la técnica. Un material preferido es un polietileno poroso tratado con metil -oleoiltaurato de sodio, disponible de Porex Corp. de Fairburn, Georgia E.U.A, En la presente descripción este material es referido como "Porex". La almohadilla de prueba contiene un reactivo que comprende beta-hidroxibutirato deshidrogenasa, NAD, diaforasa, y WST-5 (cuadro 1 siguiente) . La capa superior de Porex contiene un reactivo de nitrito (cuadro 2) . Durante la operación, un usuario aplica una gota de sangre completa a la superficie superior de la capa superior de Porex. Conforme la sangre completa o la sangre lisada entra en contacto con el Porex, es reconstituido el nitrito de sodio y reacciona con la hemoglobina libre disponible, haciendo así a la hemoglobina inocua para la prueba. La muestra resultante, substancialmente libre de hemoglobina, es transferida a la almohadilla de prueba hacia abajo, mediante capilaridad o fuerza gravitacional . Sobre la almohadilla de prueba, la muestra inicia la reacción en cascada representada en la figura 4 para producir un colorante, cuya concentración es proporcional al beta-hidroxibutirato en la muestra y se le puede determinar directamente con un fotómetro. La figura 5 representa el efecto del nitrito sobre la reacción de formación de color en este sistema, usando muestras de sangre que contienen 0 y 15 mg/dl . En ausencia de nitrito, la hemoglobina reduce el tetrazolio para formar una concentración de colorante continuamente creciente, con un incremento correspondiente de densidad óptica. El nitrito, al remover la hemoglobina (por oxidación) , limita la formación de color a la que se origina solamente de los cuerpos cetónicos (esto es, beta-hidroxibutirato) en la muestra. El siguiente -ejemplo demuestra una modalidad preferida de la presente invención, en la cual el analito es beta-hidroxibutirato y la enzima es beta-hidroxibutirato deshidrogenasa. La composición puede ser modificada fácilmente para su aplicación a otras combinaciones de enzima-analito mencionadas anteriormente (véase, por ejemplo, "Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2a edición, editado por C. Burtis y otros, W. B. Saunders Co . , Philadelphia, Pennsylvania, 1994, página 976-978 y 1174-1175) . El ejemplo no está construido para ser limitante de ninguna manera.

EJEMPLO 1 Se sumergió una membrana de nylon de 0.8 µm, obtenida de Cuno (Meriden, Connecticut, E.U.A.) en el reactivo del cuadro 1, hasta su saturación. El exceso de- reactivo de quitó raspando suavemente con una varilla de vidrio. La membrana resultante se suspendió para secarse en un horno a 56 °C durante 10 minutos. Se remojó Porex (0.6 mm de espesor) en la solución de nitrito del cuadro 2 y después se suspendió para secar en un horno a 100 °C durante diez horas. Finalmente, la membrana se laminó entre un mango de poliéster (poliéster Melene de 0.4 mm de ICI America, Wilmington, Delaware E.U.A.) y el Porex impregnado de nitrito.

CUADRO 1 Reactivo para la almohadilla de prueba CUADRO 2 Reactivo de nitrito

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un reactivo para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende: a) una enzima deshidrogenasa que tiene especificidad por el analito; b) dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) o un derivado de NAD; c) un precursor de colorante de tetrazolio; d) una enzima diaforasa o un análogo de la misma; y e) una sal de nitrito.

2. - El reactivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el analito es beta-hidroxibutirato y la enzima es beta-hidroxibutirato deshidrogenasa.

3. - Una tira reactiva seca para determinar la presencia y la cantidad de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende una capa de soporte sobre la cual está una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento del reactivo de la reivindicación 1.

4. - La tira de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque comprende una capa superior absorbente cubriendo la almohadilla de prueba.

5.- Una tira reactiva seca para determinar la presencia y la cantidad de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende una. capa de soporte sobre la cual está una almohadilla de prueba, y una capa superior cubriendo la almohadilla de prueba, en la cual una primera parte del reactivo de la reivindicación 1 está sobre la almohadilla de prueba, y una segunda parte del reactivo está sobre la capa superior y/o de soporte.

6. - La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la capa superior es absorbente.

7.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende un separador y un canal entre la capa superior y la almohadilla de prueba, para proveer una ruta de capilaridad entre la capa y la almohadilla.

8.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el analito es beta-hidroxibutirato y la enzima es beta-hidroxibutirato deshidrogenasa.

9.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el analito es glucosa y la enzima es glucosa deshidrogenasa.

10.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el analito es glucosa-6-fosfato y la enzima es glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

11.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el analito es alcohol y la enzima es alcohol deshidrogenasa.

12.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el analito es L-lactato y la enzima es L-lactato deshidrogenasa.

13.- La tira de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el precursor de colorante de tetrazolio es la sal de disodio de 2 , 2 ' -dibenzotiazolil-5 , 5 ' -bis [4-di (2-sulfoetil) carbamoilfenil] -3 , 3 ' - (3 , 3 ' -dimetoxi-4 , 4 ' -bifenilen) ditetrazolio (WST-5) .

14. - Una tira de prueba reactiva seca para determinar la presencia y la cantidad de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende: a) una capa de soporte; b) sobre la capa de soporte, una almohadilla de prueba que tiene un recubrimiento que comprende: i) una enzima deshidrogenasa que tiene especificidad por el analito, ii) dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) o un derivado de NAD, iii) un precursor de colorante de tetrazolio, y iv) una enzima diaforasa o un análogo de la misma; y c) sobre la almohadilla de prueba, una capa superior absorbente que está recubierta, con una sal de nitrito.