ES2230240T3 - Compuestos de diagnostico basados en tetrazolio. - Google Patents

Compuestos de diagnostico basados en tetrazolio.

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ES2230240T3 ES01301670T ES01301670T ES2230240T3 ES 2230240 T3 ES2230240 T3 ES 2230240T3 ES 01301670 T ES01301670 T ES 01301670T ES 01301670 T ES01301670 T ES 01301670T ES 2230240 T3 ES2230240 T3 ES 2230240T3
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Abstract

Un reactivo para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende: a) una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina enlazada en ella y que tiene especificidad por el analito, b) un precursor de tinción de tetrazolio c) un agente de transferencia de electrones, y d) una sal nitrito.

Description

Compuestos de diagnóstico basados en tetrazolio.
Referencia cruzada a la solicitud previa
Esta solicitud es una continuación de la solicitud de serie de los Estados Unidos Nº. 09/282.083 en trámite junto con el presente documento, archivada en el 30 de marzo, 1999, la cual es una continuación en parte de la solicitud de serie de los Estados Unidos Nº. 09/161.876, archivada en el 28 de septiembre, 1998, ahora patente de los Estados Unidos Nº. 5.902.731.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
Esta invención se refiere a las composiciones de diagnóstico que permiten la medida de concentraciones de analito en fluidos biológicos que contienen hemoglobina. Las composiciones se basan en precursores de tinción de tetrazolio e implican suprimir la reducción inducida por hemoglobina de ellas.
2. Descripción de la técnica relacionada
El tejido adiposo es una de las formas más abundantes de almacenamiento de energía en el cuerpo. Libera ácidos grasos almacenados dentro del sistema circulatorio para metabolizarse principalmente en el hígado. En el procedimiento, la grasa se consume y la energía se libera y se hace disponible para el cuerpo. Normalmente, se consume un poco de grasa, los ácidos grasos se metabolizan completamente a dióxido de carbono y agua, y la conversión no afecta el delicado balance de pH del cuerpo. Sin embargo, si están presentes en el cuerpo cantidades insuficientes de carbohidratos, debido, por ejemplo, a la dieta, entonces el consumo de grasas y el consumo de ácidos grasos se puede incrementar hasta niveles potencialmente dañinos. Además de los que hacen dieta, lo pacientes insulinodependientes son vulnerables, debido a su metabolismo de carbohidratos dañado. Cuando se usan ácidos grasos excesivos para suministrar una demanda de energía del cuerpo, entonces se producen grandes cantidades de acetoacetato, acetona, y beta-hidroxibutirato. Estos intermediarios se citan como cuerpos cetónicos, y la afección se conoce como cetoacidosis.
Los cuerpos cetónicos se pueden reciclar normalmente en otras formas por el cuerpo, dado que no está sobrepasado.
Por lo tanto, un individuo sano acumula una cantidad despreciable de estos analitos. Cuando una gran cantidad de grasas se metaboliza en un periodo relativamente corto o cuando la mayoría de la energía se deriva de grasas, se producen las cantidades masivas de cuerpos cetónicos. La producción excesiva de estos metabolitos grasos puede causar ciertos trastornos neurológicos, si el problema no es corregido puntualmente.
Los cuerpos cetónicos están presentes en sangre y, si se excede un umbral, se excretan por medio de la orina. Se detectan fácilmente por medio de un analizador clínico moderno. En promedio, los porcentajes de betahidroxibutirato, acetoacetato, y acetona son 78%, 20% y 2% respectivamente. Debido a su concentración relativamente baja y alta volatilidad, la acetona se mide rara vez. En cambio, el acetoacetato se determina cuantitativamente mediante una reacción de nitroprúsido y el beta-hidroxibutirato se cuantifica mediante un procedimiento enzimático. Las tiras de análisis de acetoacetato han estado disponibles durante décadas. Se basan en una reacción de acoplamiento de ión nitroprúsido con aldehídos y cetonas. Una muestra alcalina de orina o un espécimen de suero se deja reaccionar con el nitroprúsido durante algunos minutos, y se desarrolla un color púrpura. La intensidad del color indica la concentración de acetoacetato. Sin embargo, la cetona interfiere con el análisis, dando como resultado lecturas más altas. Adicionalmente, según el paciente se recupera de un episodio de cetoacidosis, el nivel de acetoacetato en la orina y en la sangre se incrementa, haciendo así difícil el diagnóstico.
El análisis beta-hidroxibutirato es más útil para realizar un seguimiento a las concentraciones de cuerpos cetónicos. Se basa en la oxidación de beta-hidroxibutirato con la correspondiente deshidrogenasa en la presencia de un cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NAD). (Hablando estrictamente, sólo D-betahidroxibutirato está presente de forma natural y oxidado, pero omitimos la "D" por brevedad por todo el documento y las reivindicaciones adjuntas). En la oxidación, se produce NADH, y su concentración se mide directamente con un espectrofotómetro UV. De este modo, la señal de cambio correspondiente en el espectro es proporcional a la concentración de analito, Desafortunadamente, la excitación de NADH tiene lugar en la región UV; así, este modo de detección es adecuado sólo para instrumentos de laboratorio. Otro procedimiento para realizar un seguimiento de beta-hidroxibutirato es oxidando el NADH con un compuesto de tetrazolio.
Los compuestos de tetrazolio son generalmente muy sensibles a las bases fuertes y a la luz. Así, se debe ejercer cuidado especial para asegurar la integridad de estos compuestos. No obstante, los tetrazolios han jugado un papel importante en estudios de metabolismo de tejidos. Por ejemplo, esta clase de compuestos se ha usado en probar oxidación anaeróbica y reacciones de reducción en células. Adicionalmente, se usan comúnmente en diagnósticos clínicos. Los compuestos son típicamente compuestos de colores claros o incoloros que sufren una reacción de reducción, en la presencia de un agente reductor, para producir un formazán altamente coloreado. Los agentes reductores tales como ascorbatos, sulfhidrilos, o variantes de NADH, NADPH, PQQH_{2} (PQQ reducida - pirroloquinolinaquinona), FMNH_{2} (FMN reducido - flavinmononucleótido), y FADH_{2} (FAD reducido - adenoflavín dinucleótido) son capaces de formar la tinción.
En diagnósticos clínicos, se ha encontrado que estas tinciones son inapreciables para realizar un seguimiento de la formación de NAD(P)H a partir de sus compuestos padre, NAD(P)+, en reacciones anaeróbicas. (Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 5.380.595, cedida en el 1 de noviembre, 1994 a D. Bell y col.). La reacción redox es rápida y no es sensible a oxígeno. El color de la tinción resultante es muy intenso y tiene baja solubilidad en agua.
En principio, los precursores de tinción con tetrazolio se pueden usar para medir los cuerpos cetónicos y la glucosa en sangre completa. Sin embargo, el tetrazolio se pudo reducir no enzimáticamente mediante hemoglobina (Fe(II)) para formar un formazán coloreado, si la hemoglobina no está contenida dentro de los glóbulos rojos de la sangre. Así, la hemoglobina libre causa interferencia seria con las medidas. De hecho, debido a la hemolisis y la abundancia resultante de hemoglobina libre relativa al analito de interés, en una típica medida de cuerpos cetónicos, la señal que interfiere de la hemoglobina puede exceder la señal deseada. Las medidas de glucosa, particularmente en la concentración normal o sobre ella, no se afectan de forma adversa. Cuando la reacción se lleva a cabo en muestras elevadas de hematocrito o a una temperatura más alta, donde la reacción de oxidación de hemoglobina es más rápida, la interferencia con las medidas de glucosa es significativa, también. Dado que la hemolisis de los glóbulos rojos, la cual causa que la hemoglobina libre esté presente, no se puede evitar fácilmente, los glóbulos rojos se deben eliminar de las muestras antes de analizar, si el tetrazolio se usa para el análisis.
Los glóbulos rojos se pueden eliminar de muestras filtrando con membranas y filtros, atrapándolos con reactivos químicos, o mediante una combinación de ambos procedimientos. Los procedimientos de filtración para separar los glóbulos rojos de la sangre completa son caros y requieren volúmenes de muestra bastante grandes. Un ejemplo de un análisis de cetona en sangre (beta-hidroxibutirato) que usa filtración para eliminar glóbulos rojos de una muestra de sangre completa es el análisis KetoSite® disponible a partir de GDS Diagnostics, Elkhart, IN. (Véase Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2ª Ed., editado por C. Burtis y col., W. B. Saunders Co., Filadelfia, PA, 1994, p. 974). La "Tarjeta de Análisis" usada en este análisis tiene dos capas de filtros, las cuales hacen la tarjeta costosa y necesita una gran (25 \mul) muestra de sangre. Adicionalmente, la sangre no debe estar hemolizada.
Una combinación de filtración y atrapamiento químico se usa en la tira de glucosa en sangre Ames® Glucometer Encore™, disponible a partir de Miles. Esa tira usa una capa de material de filtro y ayuda de aglutinación (lectina de patata) para eliminar interferencia de los glóbulos rojos. (Véase Chu y col., solicitud de patente Europea 0 638 805 A2, publicada el 15 de febrero, 1995).
Introducir un agente oxidante dentro de un sistema, para oxidar la hemoglobina a metahemoglobina, es otra vía para reducir la interferencia de la hemoglobina. Aunque los ferricianuros se conocen por transformar la hemoglobina en metahemoglobina, también destruyen el producto deseado, NADH.
Palmer y col., EPO 0 330 517 B2, publicado en el 30 de agosto, 1989, describe un procedimiento para medir analitos bioquímicos que implican hacer reaccionar el analito con una enzima oxidasa capaz de actividad electrón transferasa con el analito para producir enzima reducida. La enzima se somete a ensayo colorimétricamente para determinar la concentración de analito. La reacción enzimática no es dependiente de oxígeno.
Freitag y col., WO 94/01544, publicado en el 20 de enero, 1994, describe un reactivo estable para el análisis de analito. El reactivo incluye una enzima, un derivado fenazina, una sal de tetrazolio, y una sal metálica divalente para estabilizar el reactivo.
El documento JP 60-0241 (XP-002198080) describe el tratamiento de una muestra de suero sanguíneo con un reactivo coloreado que contiene un sistema oxidasa unido a adenoflavín dinucleótido (FAD) o flavinmononucleótido (FMN) como coenzima. Este documento también describe el uso de una materia de transferencia de electrones y una sal tetrazolio.
Bruchhaus y col., Biochem. J. (1998), 330, 1217-1221 describen el gen que codifica una supuesta NADPH:flavino-
xidoreductasa del protozoo parásito Entamoeba histolytica (Eh 34) expresado recombinantemente en Escherichia coli.
Storhoff y col., WO 94/01578, publicado en el 20 de enero, 1994, describe también un reactivo estable para el análisis de analitos. El reactivo incluye una enzima, un mediador, una sal tetrazolio, y un agente oxidante que estabiliza el reactivo.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un reactivo para medir la concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina. El reactivo comprende:
a)
una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina unida a él y que tiene especificidad para el analito,
b)
un precursor de la tinción de tetrazolio,
c)
un agente de transferencia de electrones, y
d)
una sal nitrito.
En una realización alternativa de la invención, el reactivo comprende:
a)
una enzima dependiente de flavina que tiene especificidad para el analito y no tiene unida a él una flavina,
b)
flavinmononucleótido (FMN) o flavinadenindinucleótido (FAD),
c)
un precursor de tinción de tetrazolio,
d)
un agente de transferencia de electrones, y
e)
una sal nitrito.
El reactivo es particularmente adecuado para recubrir sobre uno o más sustratos para formar una tira de reactivo seco para medir una concentración de analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina. Una tira particularmente preferida comprende
a)
una capa de soporte,
b)
sobre la capa de soporte, una compresa de análisis que tiene un recubrimiento que comprende
i)
una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina unida a ella y que tiene especificidad por el analito,
ii)
un precursor de la tinción de tetrazolio, y
iii)
un agente de transferencia de electrones, y
c)
sobre la compresa de análisis, una capa superior absorbente que se recubre con una sal nitrito.
Otra tira de la invención comprende
a)
una capa de soporte,
b)
sobre la capa de soporte, una compresa de análisis que tiene un recubrimiento que comprende
i)
una enzima dependiente de flavina que tiene especificidad por el analito y que no tiene una flavina unida ella,
ii)
FMN o FAD,
iii)
un precursor de tinción de tetrazolio,
iv)
un agente de transferencia de electrones, y
c)
sobre la compresa de análisis, una capa superior absorbente que se recubre con una sal nitrito.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 es una panorámica en perspectiva de una tira de análisis de esta invención.
Fig. 2 es una panorámica con sus partes separadas de otra tira de análisis de esta invención.
Fig. 3 es una panorámica con sus partes separadas de otra tira de análisis de esta invención.
Fig. 4 es una representación ilustrada de la química de un ensayo de glucosa de esta invención.
Fig. 5 es una gráfica que muestra el efecto de nitrito como un supresor de hemoglobina en un ensayo de dos capas.
Fig. 6 es una gráfica que muestra el efecto de nitrito como un supresor de hemoglobina en un ensayo de glucosa de capa simple.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un reactivo para medir la concentración de analito en fluidos biológicos que contienen hemoglobina (tales como sangre completa), produciendo una concentración de la forma reducida de un cofactor, tal como NADH, NAD(P)H, PQH_{2}, FMNH_{2}, o FADH_{2} que es una medida de la concentración de analito. La inclusión de nitrito en el reactivo supera la interferencia de hemoglobina con la medida de la concentración reducida del cofactor. Es particularmente útil para, pero no limitado a, la medida de los cuerpos cetónicos y glucosa.
La figura 1 representa una típica tira de análisis 10 de la invención, que consiste en una compresa de análisis 12 pegada sobre un soporte 14. El soporte puede ser un plástico -por ejemplo, poliestireno, nylon, o poliéster -o lámina metálica o cualquier otro material adecuado conocido en la técnica. La compresa de análisis está recubierta con un reactivo que reacciona con el analito para causar un cambio de color. La compresa de análisis comprende preferiblemente un material absorbente, tal como papel de filtro o membrana polimérica. Sin embargo, dado que la reacción no requiere oxígeno, la compresa de análisis puede ser un material no absorbente, tal como una película de plástico. El reactivo incluye una enzima que es específica para el analito, un agente de transferencia hidruro, un precursor de tinción de tetrazolio, un cofactor enzimático adecuado, y un supresor de hemoglobina. Opcionalmente, un tampón y estabilizador se incluye para una mayor estabilidad.
Como se muestra en la figura 2, la tira de análisis puede ser también una construcción multicapa, con una capa superior 16 revistiendo la compresa de análisis 12. En esta construcción, el reactivo puede dividirse entre las dos capas. Por ejemplo, el supresor de hemoglobina se puede recubrir sobre la capa superior opcional 16 y el equilibrio del reactivo recubierto sobre la compresa de análisis 12. Preferiblemente, la capa superior 16 es absorbente y sirve como una capa extendida y como una capa absorbente para absorber la muestra excedente. La muestra se aplicó a la capa superior 16, y se pasó a lo largo de la compresa de análisis 12. La concentración de analito se determinó midiendo el cambio de color a lo largo de la capa de soporte 14 o, si la capa 14 no es transparente donde es contigua al área de reacción, a través de la ventana o agujero con salida opcional 18.
En la realización alternativa que se muestra en la figura 3, el espaciador 20 se separa de la capa superior 16 y la compresa de análisis 12. El espaciador 20 es preferiblemente una película de plástico no absorbente que tiene un recubrimiento adhesivo (no mostrado) sobre ambas caras. El canal 22 en el espaciador 20 proporciona una vía capilar para la muestra para fluir de la apertura 24 al área de medida 26. El flujo depende del aire de ventilación entre una superficie de la compresa de análisis 12 y una capa contigua o, alternativamente, a través de la abertura opcional 18. El cambio de color en el área de medida 26 se sigue a través de la abertura/ventana opcional 18. El reactivo puede estar todo en la compresa de análisis 12 o, alternativamente, puede estar dividido entre la compresa de análisis y una o ambas de las capas no absorbentes 14 y 16. Así, una primera parte del reactivo puede estar en la compresa de análisis y una segunda parte del reactivo puede estar en una o ambas de las capas no absorbentes. Cuando nos referimos al reactivo como que es un "recubrimiento" o "sobre" una capa, deseamos incluir la posibilidad de que el reactivo sea absorbido dentro de la capa, particularmente si esta es absorbente.
Todas las enzimas dependientes de flavina son adecuadas para ensayos con esta invención. Las enzimas oxidasa adecuadas y sus correspondientes analitos incluyen: alcohol oxidasa para alcohol, glucosa oxidasa para glucosa, galactosa oxidasa para galactosa, colesterol oxidasa para colesterol, L-lactato oxidasa para L-lactato, urato oxidasa para ácido úrico, bilirrubina oxidasa para bilirrubina, y colina oxidasa para colina. Las enzimas deshidrogenasa adecuadas y los correspondientes analitos incluyen: piruvato deshidrogenasa para piruvato, D-lactato deshidrogenasa para D-lactato, y succinato deshidrogenasa para succinato.
Cuando no está unido al enzima, un cofactor debe añadirse para activar la enzima. Los cofactores que se pueden añadir a una enzima flavina-dependiente incluyen: flavinmononucleótido (FMN) y adenoflavín dinucleótido (FAD). En presencia de la enzima, el analito reduce el cofactor.
La siguiente etapa en el procedimiento de formación de tinción es la retirada de hidruro del cofactor reducido mediante un agente de transferencia de electrones. Los agentes adecuados de transferencia de electrones incluyen diaforasa, del mismo modo que deshidrogenasa lipoica, ferredoxín-NADP-reductasa, y lipoamida deshidrogenasa. Más preferidos, cuando se usa un cofactor de flavina, son los agentes no enzimáticos de transferencia de electrones tales como metosulfato de fenazina (PMS), etosulfato de fenazina (PES), metosulfato de 1-metoxifenacina, o Azul de Meldola. Las cinéticas de reacción y la estabilidad son los factores primarios para seleccionar un agente de transferencia de electrones o "esquematizador hidruro". Por ejemplo, PMS es el esquematizador hidruro universal, debido a que tiene unas cinéticas de reacción relativamente rápidas con la mayoría de los compuestos tetrazolio enumerados más abajo. Por esa razón, se prefiere cuando el cofactor es PQQ. PMS es, sin embargo, más sensible a la luz que los esquematizadores hidruro con base enzimática. La diaforasa es más estable y, por esa razón, se prefiere cuando el cofactor es NAD.
El hidruro capturado se transfirió a un compuesto tetrazolio (precursor de tinción) para formar un formazán coloreado. Los compuestos de tetrazolio que son más adecuados para este dispositivo son: 2-(2'benzotiazolil)-5-estiril-3-(4'-ftalhidrazidil) de tetrazolio (BSPT), 2-benzotiazolil-(2)-3,5-difenilo de tetrazolio (BTDP), 2,3-di(4'-nitrofenilo) de tetrazolio (DNP), 2,5-difenil-3-(4-estirilfenilo) de tetrazolio (DPSP), distirilo nitroazul de tetrazolio (DS-NBT), 3,3'-[3,3'-dimetoxi-(1,1'-bifenil)-4,4'-diil]-bis[2-(4-nitrofenil)-5-fenil(-2H) tetrazolio (NBT), 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H tetrazolio (MTT), 2-fenil-3-(4-carboxifenil)-5-metilo de tetrazolio (PCPM), azul de tetrazolio (TB), tiocarbamilo nitroazul de tetrazolio (TCNBT), tetranitroazul de tetrazolio (TNBT), violeta de tetrazolio (TV), 2-benzotiazolil-3-(4-carboxi-2-metoxifenil)-5-[4-(2-sulfoetilcarbamoil)fenil]- 2H-tetrazolio (WST-4), y 2,2'-dibenzotiazolil-5,5'-bis[4-di(2-sulfoetil)carbamoilfenil]-3,3'-(3,3'- dimetoxi-4,4'-bifenileno)ditetrazolio, sal disódica (WST-5). Preferiblemente, los precursores de tinción solubles en agua, más preferiblemente WST-5, se usan de tal forma que son compatibles con muestras biológicas. Adicionalmente, cuando se usa WST-5, el compuesto formazán resultante presenta fuerte absorción espectral en la región púrpura-azul, reduciendo así la necesidad de corregir la señal antecedente de la hemoglobina.
Finalmente, un supresor de hemoglobina se presenta en el reactivo para reducir la reacción formadora de tinción indeseable entre la hemoglobina y el compuesto tetrazolio. El papel del supresor de hemoglobina es oxidar la hemoglobina a metahemoglobina, la cual no reacciona con el tetrazolio o el formazán. Sorprendentemente, las sales de nitrito, tales como nitrito de sodio, nitrito de potasio, y sus derivados, son muy efectivas en suprimir la hemoglobina, mientras no se destruya el cofactor reducido (tal como NADH, PQQH_{2}, FMNH_{2}, o FADH_{2}). Los nitritos son efectivos, también, a temperatura elevada y con muestras de hematocrito elevado. Se prefiere el nitrito de sodio, porque tiene elevada solubilidad en agua, no es tóxico, y es relativamente barato.
Opcionalmente, el reactivo puede incluir también un estabilizador, tal como una sal de metal divalente.
Aunque el reactivo de esta invención se puede usar en un modo químico húmedo, tal como en una cubeta, en realizaciones preferidas, la invención proporciona tiras secas para ensayar beta-hidroxibutirato o glucosa en sangre completa. Las tiras pueden estar bien en capa única o bien en dos capas. Una tira de dos capas consta de una compresa de análisis de membrana, preferiblemente de nylon, que se sitúa entre una capa de soporte y una capa superior. El soporte es preferiblemente de lámina de poliéster. La capa superior puede ser una malla o cualquier material absorbente conocido en la técnica. Un material preferido es un polietileno poroso tratado con metiloleoiltaureato de sodio, disponible a partir del Porex Corp. de Fairburn, GA. Nos referimos a este material como "Porex". Preferiblemente, la compresa de análisis es poliamida. La compresa de análisis contiene un reactivo que comprende glucosa oxidasa (incluyendo un cofactor de flavina), PMS (o uno de sus análogos), y WST-5 (tabla 1, dada más adelante). La capa superior de Porex contiene un reactivo nitrito (tabla 2).
En una tira de capa única, la capa de Porex se omite, y el reactivo completo, incluyendo el nitrito (tabla 3), se aplica a la compresa de análisis. Nótese que tanto en la tira de dos capas como en la tira de capa única, se puede usar bien una enzima flavina dependiente que tiene una flavina unida a ella o bien una enzima flavina dependiente que no tiene una flavina unida a ella. En el último caso, se añadió un cofactor de flavina (por ejemplo, FMN o FAD).
En la operación, un usuario aplicó una gota de sangre entera a la superficie superior de la capa superior de Porex. Como la sangre entera o la sangre lisada entra en contacto con el Porex, el nitrito de sodio se reconstituyó y se hizo reaccionar con la hemoglobina libre disponible, volviendo así a la hemoglobina inofensiva para el ensayo. La muestra resultante, sustancialmente libre de hemoglobina, se transfirió a la compresa de análisis debajo, por medio de capilaridad o fuerza gravitacional. En la compresa de análisis, la muestra inicia la reacción de cascada para producir una tinción coloreada, cuya concentración es proporcional al analito en la muestra y se puede determinar directamente con un fotómetro. La figura 4 representa la reacción para glucosa, usando glucosa oxidasa y
PMS.
La figura 5 representa el cambio en densidad óptica a lo largo del tiempo de muestras de sangre, que tienen todas 60% de hematocrito y contienen 0 y 100 mg/dl de glucosa, tanto con como sin nitrito. La gráfica superior mmuestra los resultados a 35ºC La gráfica del fondo muestra los resultados a temperatura ambiente (RT). En cada caso, la concentración de nitrito fue de 5 g/dl. En la ausencia de nitrito, la hemoglobina reduce el tetrazolio para formar una concentración de tinción que se incrementa continuamente, con un correspondiente incremento en densidad óptica. El nitrito, eliminando la hemoglobina (mediante oxidación), limita la formación de color el cual resulta únicamente de la glucosa en la muestra. La preparación de la tira de dos capas que se usó para generar los datos descritos en las gráficas se describe en el ejemplo 1, dado más adelante.
La figura 6 muestra el efecto de nitrito en la reacción de formación de color en el sistema glucosa/glucosa oxidasa para una tira de capa simple. Las muestras de sangre, que tienen todas un 60% de hematocrito, contienen de 0 a 200 mg/dl de glucosa y 0 ó 20 mg/ml de nitrito. Las muestras se corrieron a temperatura ambiente. La gráfica muestra que el presente sistema es efectivo a temperatura ambiente y hematocrito de hasta el 60%. La preparación de la tira de capa simple que se usó se describe en el ejemplo 2, dado más adelante.
Los siguientes ejemplos manifiestan realizaciones preferidas de la presente invención. En el ejemplo 1, se usó una tira de dos capas, el analito es glucosa, y la enzima es glucosa oxidasa. En el ejemplo 2, se usó una tira de capa única. Como anteriormente, el analito es glucosa y la enzima es glucosa oxidasa. Las composiciones pueden modificarse fácilmente para la aplicación a otras combinaciones analito-enzimas enumeradas anteriormente. (Véase, por ejemplo, Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2ª Ed., editado por C. Burtis y col., W. B. Saunders Co., Filadelfia, PA, 1994, páginas 976-978 y 1174-1175). No se desea que los ejemplos sean limitantes de ninguna manera.
Ejemplo 1
Una membrana de nylon de 0,8 \mum obtenida a partir de la Pall Corporation (East Hills, Nueva York) se bañó en el reactivo de la tabla 1, hasta que se saturó. El exceso de reactivo se raspa cuidadosamente con una barra de cristal. La membrana resultante se cuelga para secarse en un horno a 56ºC durante 10 minutos. El Porex (0,6 mm de grosor) se empapó en la disolución de nitrito de la tabla 2 y después se colgó para secarse en un horno a 100ºC durante 10 horas. Finalmente, la membrana se laminó entre una reserva de poliéster (0,4 mm Melenex® poliéster a partir de ICI America, Wilmington, DE) y el Porex impregnado de nitrito.
Ejemplo 2
El procedimiento del ejemplo 1 se repitió, excepto que el primer baño fue en el reactivo de la tabla 3, y no hubo segundo baño, dado que el Porex no se necesitó.
TABLA 1 Reactivo para una compresa de análisis de glucosa
1
TABLA 2 Reactivo nitrito
2
TABLA 3 Reactivo para una compresa de análisis de glucosa
3 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm} *Gantrez AN-139
(anhídrido éter
polimetilvinílico-alt-maleico, peso
molecular 1.080.000, cat# 41632-0, Aldrich
Chemicals, Milwaukee, WI, USA). Hacer Gantrez al 6% en agua,
calentar a 95ºC durante menos de 45 minutos para conseguir  Gantrez
al 6% el cual está listo para
usar.\end{minipage} \cr}

Claims (16)

1. Un reactivo para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende:
a)
una enzima dependiente de flavina que tiene una flavina enlazada en ella y que tiene especificidad por el analito,
b)
un precursor de tinción de tetrazolio
c)
un agente de transferencia de electrones, y
d)
una sal nitrito.
2. Un reactivo para medir una concentración de una analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina, que comprende:
a)
una enzima dependiente de flavina que tiene especificidad por el analito y no tiene una flavina unida a ella,
b)
mononucleótido de flavina (FMN) o adenoflavín dinucleótido (FAD)
c)
un precursor de tinción de tetrazolio,
d)
un agente de transferencia de electrones, y
e)
una sal nitrito.
3. El reactivo de la reivindicación 1 en el cual el analito es glucosa y la enzima es glucosa oxidasa.
4. El reactivo de cualquier reivindicación precedente en el cual el precursor de tinción es soluble en agua.
5. El reactivo de cualquier reivindicación precedente en el cual el agente de transferencia de electrones comprende metosulfonato de fenazina (PMS) o un análogo del mismo.
6. El reactivo de cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente un estabilizador divalente metálico.
7. Una tira de reactivo seco para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina que comprende una capa de soporte sobre la cual está una compresa de análisis que tiene un recubrimiento del reactivo de cualquier reivindicación precedente.
8. La tira de la reivindicación 7 en la cual la compresa de análisis tiene una superficie cargada positivamente.
9. La tira de la reivindicación 7 o la reivindicación 8 en la cual la compresa de análisis comprende una poliamida.
10. La tira de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 comprende adicionalmente una capa superior absorbente que reviste la compresa de análisis.
11. Una tira de reactivo seco para medir una concentración de un analito en un fluido biológico que contiene hemoglobina que comprende una capa de soporte sobre la cual está una compresa de análisis y una capa superior que reviste la compresa de análisis en la cual una primera parte de los componentes del reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 está sobre la compresa de análisis y en la cual los restantes componentes del reactivo están sobre la capa de soporte y/o sobre la capa superior.
12. La tira de la reivindicación 11 en la cual la capa superior es absorbente.
13. La tira de la reivindicación 11 que comprende adicionalmente un espaciador y un canal entre la capa superior y la compresa de análisis para proporcionar una vía capilar entre la capa superior y la compresa de análisis.
14. La tira de la reivindicación 11 en la cual el precursor de tinción de tetrazolio es la sal disódica de 2,2'-dibenzotiazolil-5,5'-bis[4-di(sulfoetil)carbamoilfenil]-3,3'-(3,3'- dimetoxi-4,4'-bifenileno)ditetrazolio (WST-5).
15. Una tira de análisis de reactivo seco de acuerdo con la reivindicación 12, en la cual el analito es glucosa; la compresa de análisis que tiene un recubrimiento que comprende:
i)
glucosa oxidasa que tiene una flavina unida a ella,
ii)
un precursor de tinción de tetrazolio, y
iii)
PMS o un análogo del mismo; y
la capa superior absorbente está recubierta con una sal nitrito.
16. Una tira de análisis de reactivo seco de acuerdo con la reivindicación 12, en la cual el analito es glucosa; la compresa de análisis tiene un recubrimiento que comprende:
i)
una enzima dependiente de flavina que no tiene una flavina unida a ella,
ii)
FMN o FAD,
iii)
un precursor de tinción de tetrazolio; y
iv)
PMS o un análogo del mismo; y
la capa superior absorbente está recubierta con una sal nitrito.
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