JPS6024199A - 疾病関連物質の定量法 - Google Patents
疾病関連物質の定量法Info
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- JPS6024199A JPS6024199A JP13063783A JP13063783A JPS6024199A JP S6024199 A JPS6024199 A JP S6024199A JP 13063783 A JP13063783 A JP 13063783A JP 13063783 A JP13063783 A JP 13063783A JP S6024199 A JPS6024199 A JP S6024199A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、キサンチン、ヒポキサンチン、グルコース、
尿酸、リン脂質等の殊病関連物質の定量法に関する。
尿酸、リン脂質等の殊病関連物質の定量法に関する。
一般に、反応生成物として過酸化水素を生じるオ「り”
−ゼは、色原体とペルオキシダーゼと共ニクルコニス、
コレステロール、コリン等の比色定量に利用せられてい
る。 ７ 然しなから、斯かる所謂従来オキダーゼ法は、血清中の
共存成分であるアスコルビン酸の影響による測定値の低
下を免れないと云う峠点かあつた０ そこで、本発明者は斯かる従来の難点全解消し、信頼性
の高い、臨床上有効な測定法を開発すべく種々研冗全重
ねた結果、フラビン金補酵素とするオキシダーゼが、そ
の基質存在下で電子伝達体（水素伝達体）を介してテト
ラゾリウム塩を還元してホルマザンを生成することを見
い出し、本発明を・完成したものである。
−ゼは、色原体とペルオキシダーゼと共ニクルコニス、
コレステロール、コリン等の比色定量に利用せられてい
る。 ７ 然しなから、斯かる所謂従来オキダーゼ法は、血清中の
共存成分であるアスコルビン酸の影響による測定値の低
下を免れないと云う峠点かあつた０ そこで、本発明者は斯かる従来の難点全解消し、信頼性
の高い、臨床上有効な測定法を開発すべく種々研冗全重
ねた結果、フラビン金補酵素とするオキシダーゼが、そ
の基質存在下で電子伝達体（水素伝達体）を介してテト
ラゾリウム塩を還元してホルマザンを生成することを見
い出し、本発明を・完成したものである。
すなわち、本発明は補酵素としてＦＡＤ又はＦＭＮを結
合するオキシダーゼ系酵素、還元型電子伝達体及びテト
ラゾリウム塩を含有する発色試薬を検体に作用させて発
色せしめることを特徴とする疾病関連物質の定量法であ
る。
合するオキシダーゼ系酵素、還元型電子伝達体及びテト
ラゾリウム塩を含有する発色試薬を検体に作用させて発
色せしめることを特徴とする疾病関連物質の定量法であ
る。
本発明に於て補酵素としてＦＡＤすなわちフラビンアデ
ニンジヌクレオチド又はＦＭＮすなわちフラビンモノヌ
タレオチドを結合するオキシダーゼ系酵素としては、例
えばキサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ
、コリンオキシダーゼ、ウリカーゼ等が挙げられ、定量
物質に対応して適宜選択使用される。
ニンジヌクレオチド又はＦＭＮすなわちフラビンモノヌ
タレオチドを結合するオキシダーゼ系酵素としては、例
えばキサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ
、コリンオキシダーゼ、ウリカーゼ等が挙げられ、定量
物質に対応して適宜選択使用される。
また、還元型電子伝達体としては、例えば１−メトキシ
−５−メチルフエナジウムメチル丈ルアエート（１−Ｍ
−ＰＭＳ）、フェナジンメトサルフェートＣＰＭＳ）、
９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾ゛キソニウム
クロライド（メルトラブル−）等が挙げられ、就中１−
Ｍ−ＦＭＳが光に対する安定性に優れ特に有利である。
−５−メチルフエナジウムメチル丈ルアエート（１−Ｍ
−ＰＭＳ）、フェナジンメトサルフェートＣＰＭＳ）、
９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾ゛キソニウム
クロライド（メルトラブル−）等が挙げられ、就中１−
Ｍ−ＦＭＳが光に対する安定性に優れ特に有利である。
また、テトラゾリウム塩としては、ニトロテトラゾリウ
ムブルー（Ｎ、ＴＢ） 、 ３− （バラインドフェニ
ヘル）−２−（バラ二トロンェニル）−５−フェニル−
２Ｈ−テトラゾリウム、クロライド（ＩＮＴ）が挙げら
れる。
ムブルー（Ｎ、ＴＢ） 、 ３− （バラインドフェニ
ヘル）−２−（バラ二トロンェニル）−５−フェニル−
２Ｈ−テトラゾリウム、クロライド（ＩＮＴ）が挙げら
れる。
本発明に於ては上記三物質が発色試薬の必須成分とされ
るが、更に必要に応じてトリトン−Ｘ１００の如き酵素
賦活剤が配合使用される〇尚、上記三物質すなわちオキ
シダーゼ系酵素、還元型電子伝達体及びテトラゾリウム
塩の配合量は、試薬全量に対してそれぞれ０．０５〜０
．２重ｉ％、０．００２〜０．００５重ｘｑｂ、０．０
１−０．０４重量％か好ましい。
るが、更に必要に応じてトリトン−Ｘ１００の如き酵素
賦活剤が配合使用される〇尚、上記三物質すなわちオキ
シダーゼ系酵素、還元型電子伝達体及びテトラゾリウム
塩の配合量は、試薬全量に対してそれぞれ０．０５〜０
．２重ｉ％、０．００２〜０．００５重ｘｑｂ、０．０
１−０．０４重量％か好ましい。
而して、本発明は斯かる試薬を検体に作用させて発色せ
しめるものであるが、該作用法としては、例えば０．５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）等を用いて２５〜４５Ｃ
で１０〜４０分間程度インキュベイジョンする方法が挙
げられる。
しめるものであるが、該作用法としては、例えば０．５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）等を用いて２５〜４５Ｃ
で１０〜４０分間程度インキュベイジョンする方法が挙
げられる。
因に、西咳インキュベイジョンに工ｐ発色が生じるか、
これは次式の如き発色原理によるものと思料される。
これは次式の如き発色原理によるものと思料される。
テトラゾリウム塩 ホルマザン発色
すなわち、本発明の発色原理は必ずしも判然としないが
、電子伝達体が存在しないときは、オキシダーゼが基質
から脱水素した水素を酸素（０２）へ渡すので過酸化水
素を生じるが、電子伝達体が存在するとオキシダーゼの
補酵素（フラビｙ）に結合している水素が酸素（０２）
とエフも酸化還元電位の低い電子伝達体との反応が容易
なため、ホルマザン會生成するものと考えられる。
、電子伝達体が存在しないときは、オキシダーゼが基質
から脱水素した水素を酸素（０２）へ渡すので過酸化水
素を生じるが、電子伝達体が存在するとオキシダーゼの
補酵素（フラビｙ）に結合している水素が酸素（０２）
とエフも酸化還元電位の低い電子伝達体との反応が容易
なため、ホルマザン會生成するものと考えられる。
本発明は以上の如き方法により発色せしめるものである
ため、予め定量せんとする物質につき各段階量の標準液
を作製して置くことにより、検体中の目的物質を極めて
容易かつ確実に比色定量することかできるものである。
ため、予め定量せんとする物質につき各段階量の標準液
を作製して置くことにより、検体中の目的物質を極めて
容易かつ確実に比色定量することかできるものである。
しかも本発明にぶれば、アスコルビン酸による負の影響
を受けないので、従来のオキシダーゼ法に比し極めて高
い精度の定量を行うことができるものであり、臨床上極
めて有利な測定法である。
を受けないので、従来のオキシダーゼ法に比し極めて高
い精度の定量を行うことができるものであり、臨床上極
めて有利な測定法である。
以下実施例を挙げて本発明を更に説明する。
実ｍ例１（ヒポキサンチンの測定）
（１） 試薬組成
キサンチンオキシダーゼ（０，５■／＋り ０．１ 尻
１１−Ｍ−ＦＭＳ （８０ｆＩｋｇ／ｅｕ） ０．０５
Ｔｌ／ＮＴＢ（２，５！／ｄ） ０．２ ｄ １％トリトンＸ−１０００，１ｍｌ （２）、緩衝液 ０、５ Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，５＞ ０．５５ｄ（
３） 標準品の測定 各濃度のヒポキサンチン０．０２ｄを上記試薬−緩衝液
１−に加え、３７Ｃにて１０分間インキュベイジョンし
て発色せしめ、５７０ｎｍにて吸光度を測定し、各標準
吸光度を得る。
１１−Ｍ−ＦＭＳ （８０ｆＩｋｇ／ｅｕ） ０．０５
Ｔｌ／ＮＴＢ（２，５！／ｄ） ０．２ ｄ １％トリトンＸ−１０００，１ｍｌ （２）、緩衝液 ０、５ Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，５＞ ０．５５ｄ（
３） 標準品の測定 各濃度のヒポキサンチン０．０２ｄを上記試薬−緩衝液
１−に加え、３７Ｃにて１０分間インキュベイジョンし
て発色せしめ、５７０ｎｍにて吸光度を測定し、各標準
吸光度を得る。
因に、１０ ｔｎｇ／ｃｕの吸光度は０．３１０であっ
た。
た。
（４）試料の測定
血清０．０２ｄを試料とし、（３）と同様にして発色せ
しめ、５７０ｎｍにて吸光度を測定したところ、０゜１
０５であった。標準吸光度エフ試料中のヒポキサンチン
含有量をめたところ、３．３８ｑ／ｇ ′ｆＬる結果が
得られた。
しめ、５７０ｎｍにて吸光度を測定したところ、０゜１
０５であった。標準吸光度エフ試料中のヒポキサンチン
含有量をめたところ、３．３８ｑ／ｇ ′ｆＬる結果が
得られた。
０．１０５
（０，３１０ＸＩＯ”″）
実施例２（グルコースの測定）
（υ 試薬組成
グルコースオキシダーゼ（１０キ／ｄ） ０．０５＋ｔ
／１−Ｍ−ＰＭＳ（８０”Ｐ／ｄｌ） ０．０５ｗＬＩ
ＮＴＢ（２，５ｗ９／ｍｊ） ０．２ ｄ（２）緩衝液 ０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） １．７ ｄ（３
）標準品の測定 各濃度のグルコース０．０５ｄを上記試薬−緩衝液２ｍ
ｌに加え、３７Ｃにて１５分間インキュベイジョンして
発色せしめ、５７０ｎｍに吸光度を測定し、各標準吸光
度を得る。因に、２５０■／ｄｌ の吸光度は０．８０
であった。
／１−Ｍ−ＰＭＳ（８０”Ｐ／ｄｌ） ０．０５ｗＬＩ
ＮＴＢ（２，５ｗ９／ｍｊ） ０．２ ｄ（２）緩衝液 ０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） １．７ ｄ（３
）標準品の測定 各濃度のグルコース０．０５ｄを上記試薬−緩衝液２ｍ
ｌに加え、３７Ｃにて１５分間インキュベイジョンして
発色せしめ、５７０ｎｍに吸光度を測定し、各標準吸光
度を得る。因に、２５０■／ｄｌ の吸光度は０．８０
であった。
（４）試料の測定
血清０．０５ｄを試料とし、（３）と同様にして発色せ
しめ、５７０ｎｍに吸光度を測定したところ、０．４２
５であった。標準吸光度エフ試料中のグルコース含有量
をめたところ、１３２．８実施例３（リン脂質の測定） （１）試薬組成 コリンオキシダーゼ（５０ｕ／ＩＩＩ／ ） ０．２
ｍ１７オスフオリパーゼＤ（２５ｕ／ｄ） ｏ、２ ｄ
ｌ −Ｍ −ＰＭＳ （０，２’９／ｖｔｌ ） ０．
２ ｍｌＮ Ｔ Ｂ （２，５’９／ｙＪ ） ０．２
・ｍ１ＣａＣノ２ （１ｏ”ｖ／ｖ） ０．２ ａｔ
（２）緩衝液− ０，２ＭトリシンＮａ緩衝液（ｐＨ７，５） １．Ｏｍ
ｔ（３）標準品の測定 各濃度のリン脂質（フオスファチジルコリン）乳化液０
．０２ｄ’ｚ上記試薬−緩衝液２ＰＬｌに加え、３７Ｃ
にて２０分間インキュベイジョンして発色せしめ、５７
０ｎｍにて吸光度を測定し、各標準吸光・度を得る。因
に２００η／、ｕの吸光度はＯ，’８５０であった。
しめ、５７０ｎｍに吸光度を測定したところ、０．４２
５であった。標準吸光度エフ試料中のグルコース含有量
をめたところ、１３２．８実施例３（リン脂質の測定） （１）試薬組成 コリンオキシダーゼ（５０ｕ／ＩＩＩ／ ） ０．２
ｍ１７オスフオリパーゼＤ（２５ｕ／ｄ） ｏ、２ ｄ
ｌ −Ｍ −ＰＭＳ （０，２’９／ｖｔｌ ） ０．
２ ｍｌＮ Ｔ Ｂ （２，５’９／ｙＪ ） ０．２
・ｍ１ＣａＣノ２ （１ｏ”ｖ／ｖ） ０．２ ａｔ
（２）緩衝液− ０，２ＭトリシンＮａ緩衝液（ｐＨ７，５） １．Ｏｍ
ｔ（３）標準品の測定 各濃度のリン脂質（フオスファチジルコリン）乳化液０
．０２ｄ’ｚ上記試薬−緩衝液２ＰＬｌに加え、３７Ｃ
にて２０分間インキュベイジョンして発色せしめ、５７
０ｎｍにて吸光度を測定し、各標準吸光・度を得る。因
に２００η／、ｕの吸光度はＯ，’８５０であった。
（４）試料の測定
血清０．０２ｄを試料とし、（３）と同様にして発色せ
しめ、５７０ｎｍにて吸光度を測定したところ、０．７
３０であった。標準吸光度エフ試料を 中のリン脂質の含ＶＯめたところ、１７２”Ｐ／ａ実施
例４（尿酸の測定） （１） 試薬組成 ウリカーゼ（１，ＯＷ／ａ＃ ） ０．２ ゴ１−Ｍ−
ＰＭＳ（８０キ／ｌ Ｏ，０５＋ｍＩＮＴ（２，５〜〜
） ０．２ ｄ １％トリトンＸ−１０００，１ｍＮ （２）緩衝液 ０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ０．５ ｍＪ（
３） 標準品の測定 各濃度の尿酸０．１−を上記試薬−緩衝液１−に加え、
３７Ｃにて１５分間インキュベイジョンして発色せしめ
、５００ｎｍにて吸光度を測定し、各標準吸光度を得る
。因に、６ｍｙ／ｃｔｔΩｍ９／ｃｔｔΩ吸光０であっ
た。
しめ、５７０ｎｍにて吸光度を測定したところ、０．７
３０であった。標準吸光度エフ試料を 中のリン脂質の含ＶＯめたところ、１７２”Ｐ／ａ実施
例４（尿酸の測定） （１） 試薬組成 ウリカーゼ（１，ＯＷ／ａ＃ ） ０．２ ゴ１−Ｍ−
ＰＭＳ（８０キ／ｌ Ｏ，０５＋ｍＩＮＴ（２，５〜〜
） ０．２ ｄ １％トリトンＸ−１０００，１ｍＮ （２）緩衝液 ０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ０．５ ｍＪ（
３） 標準品の測定 各濃度の尿酸０．１−を上記試薬−緩衝液１−に加え、
３７Ｃにて１５分間インキュベイジョンして発色せしめ
、５００ｎｍにて吸光度を測定し、各標準吸光度を得る
。因に、６ｍｙ／ｃｔｔΩｍ９／ｃｔｔΩ吸光０であっ
た。
（４）試料の測定
血清０．１ ｍＪ ＆試料とし、（３）と同様にして発
色せしめ、５００ｎｒｎにて吸光度を測定したところ、
０．２８０であった。標準吸光度、Ｃり試料中の尿酸含
有量をめたところ、７．６ ｍ９／ｃｔｔな以上 ；、：’、；”１１４’蜀
色せしめ、５００ｎｒｎにて吸光度を測定したところ、
０．２８０であった。標準吸光度、Ｃり試料中の尿酸含
有量をめたところ、７．６ ｍ９／ｃｔｔな以上 ；、：’、；”１１４’蜀
Claims (1)
- 補酵素としてＦＡＤ又はＦＭＮを結合するオキ７ダーゼ
系酵素、還元配電子伝達体及びテトラゾリウム塩を含有
する発色試薬を検体に作用させて発色せしめることを特
徴とする疾病関連物質の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13063783A JPS6024199A (ja) | 1983-07-18 | 1983-07-18 | 疾病関連物質の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13063783A JPS6024199A (ja) | 1983-07-18 | 1983-07-18 | 疾病関連物質の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6024199A true JPS6024199A (ja) | 1985-02-06 |
Family
ID=15039011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13063783A Pending JPS6024199A (ja) | 1983-07-18 | 1983-07-18 | 疾病関連物質の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6024199A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4801538A (en) * | 1985-03-01 | 1989-01-31 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for determining superoxide dismutase activity |
| EP1130111A3 (en) * | 2000-02-25 | 2002-07-03 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| WO2002022855A3 (en) * | 2000-09-12 | 2002-07-18 | Lifescan Inc | Test-strips with positively charged membranes for tetrazolium based assays |
| US6635434B1 (en) | 1999-09-17 | 2003-10-21 | Exiqon A/S | Immunoassay for pesticides and their degradation products |
-
1983
- 1983-07-18 JP JP13063783A patent/JPS6024199A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4801538A (en) * | 1985-03-01 | 1989-01-31 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for determining superoxide dismutase activity |
| US6656697B1 (en) | 1998-09-28 | 2003-12-02 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US7011954B2 (en) | 1998-09-28 | 2006-03-14 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US7144709B2 (en) | 1998-09-28 | 2006-12-05 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US6635434B1 (en) | 1999-09-17 | 2003-10-21 | Exiqon A/S | Immunoassay for pesticides and their degradation products |
| EP1130111A3 (en) * | 2000-02-25 | 2002-07-03 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| SG100621A1 (en) * | 2000-02-25 | 2003-12-26 | Lifescan Inc | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| WO2002022855A3 (en) * | 2000-09-12 | 2002-07-18 | Lifescan Inc | Test-strips with positively charged membranes for tetrazolium based assays |
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