JPS6058095A - 血清遊離脂肪酸の定量法 - Google Patents
血清遊離脂肪酸の定量法Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血清中の遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡと略す）
の酵素による定量法の改良に関するもの更に詳しくは、
アシルコエンザイムＡ合成酵素（以下、ＡＣ８と略す）
およびアシルコエンザイム人酸化酵素（以下、ＡＣＯＤ
と略す）を用いる血清中のＮＥＦＡの定量法において、
ＮＥＦＡ−アルブミン解離剤を共存せしめることＫより
、高・感度のＮＥＦＡの定量を可能にすることを目的と
している。
の酵素による定量法の改良に関するもの更に詳しくは、
アシルコエンザイムＡ合成酵素（以下、ＡＣ８と略す）
およびアシルコエンザイム人酸化酵素（以下、ＡＣＯＤ
と略す）を用いる血清中のＮＥＦＡの定量法において、
ＮＥＦＡ−アルブミン解離剤を共存せしめることＫより
、高・感度のＮＥＦＡの定量を可能にすることを目的と
している。
血清中のＮＥＦＡ＃′ｉ脂肪組織でのトリグリセリドの
分解、あるいは血清中のトリグリセリドが組織に吸収さ
れる際に、リボプ四ティンリパーゼの作用により生じる
。
分解、あるいは血清中のトリグリセリドが組織に吸収さ
れる際に、リボプ四ティンリパーゼの作用により生じる
。
大部分のＮＥＦＡは通常アルブミンと結合して血液中に
存在し、体内を循環している。
存在し、体内を循環している。
その濃度はトリグリセリド、コレステロール、リン脂質
等の他の血清脂質に比べ、著しく低いが代謝的には最も
活発な脂質であり、血中のＮＥＦ Ａの動態を正確に把
握することは臨床的に極めて重要まこととされている０ 従来のＮＥＦＡの定量法としては、滴定法と比色法とに
大別できる。
等の他の血清脂質に比べ、著しく低いが代謝的には最も
活発な脂質であり、血中のＮＥＦ Ａの動態を正確に把
握することは臨床的に極めて重要まこととされている０ 従来のＮＥＦＡの定量法としては、滴定法と比色法とに
大別できる。
滴定法はＤｏｌｅ Ｋよる方法、即ちインプロパツール
、ヘプタン、ＩＮ硫酸を４０：１０：Ｉの割合で混合し
た抽出液でＮＥＦＡを抽出し、ヘプタン層に抽出された
ＮＥＦＡに基づく酸度を中和滴定する方法を始めとして
、これの改良方′法であり、一方の比色法は脂肪酸の銅
塩やコバルト塩がクロロホルムによく溶けることを利用
し、ＮＥＦＡとともにクロロホルム層へ移行した銅ある
いはコバルトを適当な発色試薬で発色させて比色定量す
る方法で、改良法としてＩｔａｙａ −Ｕｉ法、Ｎｏｖ
ａｋ法、Ｌａｕｒｅｌｌ法等がある。その他の方法とし
て螢光法、ＲＩ法、ガスクロマトグラフィーによるもの
、マススペクトロメトリーによるものがあるが、いずれ
も日常の測定法としては複雑すぎて、実用的で力く研究
用に行なわれているのが実情である。
、ヘプタン、ＩＮ硫酸を４０：１０：Ｉの割合で混合し
た抽出液でＮＥＦＡを抽出し、ヘプタン層に抽出された
ＮＥＦＡに基づく酸度を中和滴定する方法を始めとして
、これの改良方′法であり、一方の比色法は脂肪酸の銅
塩やコバルト塩がクロロホルムによく溶けることを利用
し、ＮＥＦＡとともにクロロホルム層へ移行した銅ある
いはコバルトを適当な発色試薬で発色させて比色定量す
る方法で、改良法としてＩｔａｙａ −Ｕｉ法、Ｎｏｖ
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て螢光法、ＲＩ法、ガスクロマトグラフィーによるもの
、マススペクトロメトリーによるものがあるが、いずれ
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用に行なわれているのが実情である。
いずれＫせよ、これらの方法は、すべて有機溶媒による
抽出操作を必要としており、操作の煩雑さや、測定感度
の点で満足のいく方法では々がったＯ 近年、酵素を用いたＮＥＦＡ定量法が、試料の微量化、
反応特異性、簡易性および有機溶媒を使用しないこと等
よｐ、有望な方法として広く利用されるようになってき
た。利用できる酵素反応としては、Ａｃ１による脂肪酸
の活性化反応や、脂肪酸のω−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ
系によるω−酸化反応である。しかし、ω−酸化反応は
脂肪酸に特異的々反応ではないので、主にＡｃ１による
活性化反応を利用した方法が行なわれている。
抽出操作を必要としており、操作の煩雑さや、測定感度
の点で満足のいく方法では々がったＯ 近年、酵素を用いたＮＥＦＡ定量法が、試料の微量化、
反応特異性、簡易性および有機溶媒を使用しないこと等
よｐ、有望な方法として広く利用されるようになってき
た。利用できる酵素反応としては、Ａｃ１による脂肪酸
の活性化反応や、脂肪酸のω−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ
系によるω−酸化反応である。しかし、ω−酸化反応は
脂肪酸に特異的々反応ではないので、主にＡｃ１による
活性化反応を利用した方法が行なわれている。
す々わち、次の反応式〔Ｉ〕に従って、コエンザイムＡ
（以下、Ｃ，ｏＡと略す）およびアデノシン三リン酸（
以下、ＡＴＰと略す）の存在下、脂肪酸を活性化し、生
成するアシルコエンザイムＡ（以下、 Ａｃｙｌ−Ｃｏ
Ａと略す）あるいはアデノシン−リン酸（以下、ＡＭＰ
と略す）量を測定する方法である０ このＡｃ１の作用によりて生成するＡＭＰを測定する方
法は、Ａｃｙｌ−ＣｏＡの生成とＡＭＰの生成、が常に
並行しているという前提に基づいているＯしかし、血清
中に微量ながら存在するＡＭＰ 。
（以下、Ｃ，ｏＡと略す）およびアデノシン三リン酸（
以下、ＡＴＰと略す）の存在下、脂肪酸を活性化し、生
成するアシルコエンザイムＡ（以下、 Ａｃｙｌ−Ｃｏ
Ａと略す）あるいはアデノシン−リン酸（以下、ＡＭＰ
と略す）量を測定する方法である０ このＡｃ１の作用によりて生成するＡＭＰを測定する方
法は、Ａｃｙｌ−ＣｏＡの生成とＡＭＰの生成、が常に
並行しているという前提に基づいているＯしかし、血清
中に微量ながら存在するＡＭＰ 。
ＡＤＰ、ピルビン酸あるいはＡＴＰ ａ ｓ ａ様の作
用による阻害等の影響を受けＮＥＦＡの測定精度を悪く
する欠点を有する０そこで最近では他方の生成物である
Ａａｙｌ−ＣｏＡを測定するととＫよるＮＥＦＡの定量
法が広く行なわれている。すなわち前記反応式〔Ｉ〕に
よって生成したＡｃｙｌ−ＣｏＡを、次の反応式（ＩＩ
）に従って、酸素の存在下、ＡＣＯＤを作用させ、生成
する過酸化水素、又は酸化反応で消費される酸素量を測
定することによりＮＥＦＡを定量する方法である０ ところで、血清中のＮｇＦＡ濃度は通常０．２〜１ｍＭ
程度であり、又、ＮＥＦＡは単一の化合物で々く、炭素
数１６のパルミチン酸を代表とする多数の脂肪酸の混合
物である。すなわち、分子量の異なる脂肪酸の総和が問
題とがる。更にこれらの脂肪酸の一部は、遊離の型、一
部は血清タンパク、特にアルブミンと疎水結合、イオン
結合等、さまざまな様式で結合して存在している。すな
わち、血清中のＮＥＦＡの定量は、存在形態の異なるも
のの総和を問題にする定量といえる。
用による阻害等の影響を受けＮＥＦＡの測定精度を悪く
する欠点を有する０そこで最近では他方の生成物である
Ａａｙｌ−ＣｏＡを測定するととＫよるＮＥＦＡの定量
法が広く行なわれている。すなわち前記反応式〔Ｉ〕に
よって生成したＡｃｙｌ−ＣｏＡを、次の反応式（ＩＩ
）に従って、酸素の存在下、ＡＣＯＤを作用させ、生成
する過酸化水素、又は酸化反応で消費される酸素量を測
定することによりＮＥＦＡを定量する方法である０ ところで、血清中のＮｇＦＡ濃度は通常０．２〜１ｍＭ
程度であり、又、ＮＥＦＡは単一の化合物で々く、炭素
数１６のパルミチン酸を代表とする多数の脂肪酸の混合
物である。すなわち、分子量の異なる脂肪酸の総和が問
題とがる。更にこれらの脂肪酸の一部は、遊離の型、一
部は血清タンパク、特にアルブミンと疎水結合、イオン
結合等、さまざまな様式で結合して存在している。すな
わち、血清中のＮＥＦＡの定量は、存在形態の異なるも
のの総和を問題にする定量といえる。
Ａｃ１．ＡＣＯＤを用いる酵素法を用いて、血清中のＮ
ＥＦＡを測定するに当如、上述の結合を解離させ反応を
すみやかに完結せしめることを目的として、本発明者等
は、鋭意、研究の結果、アルブミンとＮＥＦＡとの解離
剤としてハロゲン化フェノキシ脂肪酸が有効であること
を見い出し本発明を完成した。
ＥＦＡを測定するに当如、上述の結合を解離させ反応を
すみやかに完結せしめることを目的として、本発明者等
は、鋭意、研究の結果、アルブミンとＮＥＦＡとの解離
剤としてハロゲン化フェノキシ脂肪酸が有効であること
を見い出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は一般式、
Ｒ１
２
（式中、Ｘはハロゲン原子、あるいは原子団を表わし、
Ｒ□とＲ２は同じか異っていてよく、水素原子あるいは
アルキル基を表わし、Ｙは水素原子あるいはＮａもしく
はＫを表わす）で示されるハロゲン化フェノキシ脂肪酸
を、Ａｃ１およびＡＣＯＤを用いる血清中のＮＥＦＡの
定量法において共存せしめることを特徴としており、血
清中の蛋白、殊にアルブミン結合脂肪酸を解離すること
により１反応速度を速めると同時に測定感度をも上昇せ
しめる効果を有するものである。
Ｒ□とＲ２は同じか異っていてよく、水素原子あるいは
アルキル基を表わし、Ｙは水素原子あるいはＮａもしく
はＫを表わす）で示されるハロゲン化フェノキシ脂肪酸
を、Ａｃ１およびＡＣＯＤを用いる血清中のＮＥＦＡの
定量法において共存せしめることを特徴としており、血
清中の蛋白、殊にアルブミン結合脂肪酸を解離すること
により１反応速度を速めると同時に測定感度をも上昇せ
しめる効果を有するものである。
アルブミンとＮＥＦＡの解離剤としては特開昭５６−４
８８９５においてブラシル酸２カリウム等の２価の脂肪
酸またはアルキル硫酸エステル塩等が開示されているが
、前者のブラシル酸２カリウム等の２価の脂肪酸はＡＣ
８，ＡＣＯＤの反応系に用いる場合、用いる酵素により
ては被測定物であるＮＥＦＡとして反応してしまい、極
端ｉｃ Ｂｌａｎｋ値が高くなる。又、後者のアルキル
硫酸エステル塩も、ＡＣ８を阻害する等、両者共、実用
には適さないものであった◇まして、測定感度の上昇も
期待できるものではなかった。
８８９５においてブラシル酸２カリウム等の２価の脂肪
酸またはアルキル硫酸エステル塩等が開示されているが
、前者のブラシル酸２カリウム等の２価の脂肪酸はＡＣ
８，ＡＣＯＤの反応系に用いる場合、用いる酵素により
ては被測定物であるＮＥＦＡとして反応してしまい、極
端ｉｃ Ｂｌａｎｋ値が高くなる。又、後者のアルキル
硫酸エステル塩も、ＡＣ８を阻害する等、両者共、実用
には適さないものであった◇まして、測定感度の上昇も
期待できるものではなかった。
本発明に用いられるハロゲン化フェノキシ脂肪酸として
は、０−クロロフェノキシ酢酸、ｐ−クロロフェノキシ
酢酸、０−クロロフェノキシプロヒオン酸、ｐ−クロロ
フエノキシグロピオン酸、２−（０−１０ロフエノキシ
）−イソ酪酸、２−（ｐ−クロロフェノキシ）−イソ酪
酸もしくはこれらの塩類が例示され、これらの１種類、
もしくＦｉ２種以上を併用して用いる。
は、０−クロロフェノキシ酢酸、ｐ−クロロフェノキシ
酢酸、０−クロロフェノキシプロヒオン酸、ｐ−クロロ
フエノキシグロピオン酸、２−（０−１０ロフエノキシ
）−イソ酪酸、２−（ｐ−クロロフェノキシ）−イソ酪
酸もしくはこれらの塩類が例示され、これらの１種類、
もしくＦｉ２種以上を併用して用いる。
該ハロゲン化フェノキシ脂肪酸の反応系への添加量は、
酵素に対する影響や、溶解度等によって異なるが、測定
するＮ Ｅ Ｆ、Ａに対して、５〜５００倍城相当が好
ましい。
酵素に対する影響や、溶解度等によって異なるが、測定
するＮ Ｅ Ｆ、Ａに対して、５〜５００倍城相当が好
ましい。
本発明は反応系としてＣｏＡとＡＴＰの存在下で、ＡＣ
８を作用させ、Ａｅｙｌ−ＣｏＡを生成せしめ、生成し
たＡｅｙｌ−ＣｏＡに酸素共存下、ＡＣＯＤを作用させ
て、過酸化水素を生せしめる反応系からなり、コノ系二
ハロゲン化フェノキ７脂肪酸を共存させ、反応をすみや
かに完結略せる方法であるＱこの際、用いられるＡＣ８
及びＡＣＯＤは動物由来、あるいは微生物由来のいずれ
をも用いることができる０以下に１実施例をあけ、本発
明の詳細な説明する。
８を作用させ、Ａｅｙｌ−ＣｏＡを生成せしめ、生成し
たＡｅｙｌ−ＣｏＡに酸素共存下、ＡＣＯＤを作用させ
て、過酸化水素を生せしめる反応系からなり、コノ系二
ハロゲン化フェノキ７脂肪酸を共存させ、反応をすみや
かに完結略せる方法であるＱこの際、用いられるＡＣ８
及びＡＣＯＤは動物由来、あるいは微生物由来のいずれ
をも用いることができる０以下に１実施例をあけ、本発
明の詳細な説明する。
実施例１゜
試薬（１）
ＡＣ８３５０ＩＵ
ＣｏＡ Ｏ，５ｍＭ
ＡＴＰ １ ｍＭ
ＭｇＣ１２−６Ｈ２０２ｍＭ
ハロゲン化スフエノキシ脂肪酸 ５ｍＭ以上をトリトン
ｘ−ｉｏｏ（ロームアンドハース社製）ｏ、１（ｉを含
有する５ ０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０） １
ｔで溶解し、試薬（１）とする。
ｘ−ｉｏｏ（ロームアンドハース社製）ｏ、１（ｉを含
有する５ ０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０） １
ｔで溶解し、試薬（１）とする。
試薬（２）
ＡＣＯＤ ４５Ｑ ＩＵ
パーオキシダーゼ ３０００ ＩＵ
Ｎ−エチルマレイミド １ｍＭ
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メチルスルホンアミドエチル）
−ｍ−トルイジン １ｍＭ ４−アミノアンチピリン Ｏ，ｊ５ｍＭ以上を１０ｍＭ
リン酸緩衝＊（ｐＨ７，０） １ ｔで溶解し、試薬（
２）とする◇ 測定操作 ４本の試験管に被検血清５０μｔをとシ、試薬（１）を
１−加え混和後、各々３７Ｃで１．５分、３分、５分及
び１０分間反応させる。次に試薬（２）を２Ｗｄづつ加
え混和し、更に３７Ｃで１ｏ分間反応後、試薬盲検を対
照として、５５０ｎｍで各々の吸光度を測定する。
−ｍ−トルイジン １ｍＭ ４−アミノアンチピリン Ｏ，ｊ５ｍＭ以上を１０ｍＭ
リン酸緩衝＊（ｐＨ７，０） １ ｔで溶解し、試薬（
２）とする◇ 測定操作 ４本の試験管に被検血清５０μｔをとシ、試薬（１）を
１−加え混和後、各々３７Ｃで１．５分、３分、５分及
び１０分間反応させる。次に試薬（２）を２Ｗｄづつ加
え混和し、更に３７Ｃで１ｏ分間反応後、試薬盲検を対
照として、５５０ｎｍで各々の吸光度を測定する。
被検体として凍乾血清であるリピ、ド・セーラム■（栄
研化学製： １７６５μＥｑ／Ｌ相当）を用いて、上記
操作により測定した。
研化学製： １７６５μＥｑ／Ｌ相当）を用いて、上記
操作により測定した。
なお、試薬（１）に用いるハロゲン化フェノキシ脂肪酸
としてｐｏ−クロロフェノキシ酢酸％２−（’−クロロ
フェノキシ）−イソ−酪酸及び２−（ｐ−クロロフェノ
キシ）−イソ−酪酸を用いた場合、ならびに無添加の場
合の測定結果を第１表に示した。
としてｐｏ−クロロフェノキシ酢酸％２−（’−クロロ
フェノキシ）−イソ−酪酸及び２−（ｐ−クロロフェノ
キシ）−イソ−酪酸を用いた場合、ならびに無添加の場
合の測定結果を第１表に示した。
第 １ 表
（表中の数字は吸光度Ｘ１００Ｏを表わす）第１表より
、ハロゲン化フェノキシ脂肪酸を添加した系は、無添加
に比べ反応速度が有意に速く、高感度であることが認め
られた。
、ハロゲン化フェノキシ脂肪酸を添加した系は、無添加
に比べ反応速度が有意に速く、高感度であることが認め
られた。
尖施例２゜
被検体としてヒト血清（１１５０μＥｑ／Ｌ相当）を用
いて、実施工、と同様に行なった結果を第２表に示した
。
いて、実施工、と同様に行なった結果を第２表に示した
。
第 ２ 表
（表中の数字は吸光度Ｘ１００Ｏを表わす）第２表よシ
、ハロゲン化フェノキシ脂肪酸を添加した系は無添加に
比べ反応速度が有意に速く、高感度であることが認めら
れた・ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第１６４２３３号 ２、発明の名称 血清遊離脂肪酸の定量法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 昭和５９年１月１１日（発送日昭和５９年１月３１日）
５、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 別紙の通り黒色により鮮明に記載した全文訂正明細書（
内容に変更なし）に補正する。
、ハロゲン化フェノキシ脂肪酸を添加した系は無添加に
比べ反応速度が有意に速く、高感度であることが認めら
れた・ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第１６４２３３号 ２、発明の名称 血清遊離脂肪酸の定量法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 昭和５９年１月１１日（発送日昭和５９年１月３１日）
５、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 別紙の通り黒色により鮮明に記載した全文訂正明細書（
内容に変更なし）に補正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 アシルコエンザイムＡ合成酵素およびアシルコエンザイ
ムＡ酸化酵素を用いる血清中の遊離脂肪酸の定量法にお
いて、一般式 （式中、又はハロゲン原子あるいは原子団を表わし、Ｒ
□とＲ２は同じかまたは異っていてよく、水素原子ある
いはアルキル基を表わし、Ｙは水素原子あるいはＮａも
しくはＫを表わす）で示されるハロゲン化フェノキシ脂
肪酸を共存せしめることを特徴とする血清遊離脂肪酸の
定量法０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16423383A JPS6058095A (ja) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | 血清遊離脂肪酸の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16423383A JPS6058095A (ja) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | 血清遊離脂肪酸の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6058095A true JPS6058095A (ja) | 1985-04-04 |
| JPH0427838B2 JPH0427838B2 (ja) | 1992-05-12 |
Family
ID=15789198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16423383A Granted JPS6058095A (ja) | 1983-09-08 | 1983-09-08 | 血清遊離脂肪酸の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6058095A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500581A (ja) * | 2000-03-31 | 2004-01-08 | アーボガスト ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド | 子かん前症及び他の疾患の予測方法 |
| CN104480077A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 重组乙酰辅酶a合成酶 |
-
1983
- 1983-09-08 JP JP16423383A patent/JPS6058095A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500581A (ja) * | 2000-03-31 | 2004-01-08 | アーボガスト ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド | 子かん前症及び他の疾患の予測方法 |
| JP4813736B2 (ja) * | 2000-03-31 | 2011-11-09 | アーボガスト ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド | 子かん前症及び他の疾患の予測方法 |
| CN104480077A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 重组乙酰辅酶a合成酶 |
| CN104480077B (zh) * | 2014-12-22 | 2017-03-01 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 重组乙酰辅酶a合成酶 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0427838B2 (ja) | 1992-05-12 |
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