JPS61155758A - クレアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキツト - Google Patents
クレアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキツトInfo
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- JPS61155758A JPS61155758A JP28137584A JP28137584A JPS61155758A JP S61155758 A JPS61155758 A JP S61155758A JP 28137584 A JP28137584 A JP 28137584A JP 28137584 A JP28137584 A JP 28137584A JP S61155758 A JPS61155758 A JP S61155758A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は酵素を用いた体液中特に血清するいは尿中のク
レアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキ
ットに関する。
レアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキ
ットに関する。
従来の技術
クレアチンは主として肝で合成されて血中に入り、その
大部分は筋肉に分布し、クレアチ／・キナーゼの作用に
より高エネルギー化合物であるクレアチン・リンｌ［合
成されてエネルギー源として重要な役割をはたしている
、クレアチンは腎糸球体から炉遇されるが、尿細管で再
吸収されるため、成人男子ではほとんど尿中に排泄さｎ
ない。
大部分は筋肉に分布し、クレアチ／・キナーゼの作用に
より高エネルギー化合物であるクレアチン・リンｌ［合
成されてエネルギー源として重要な役割をはたしている
、クレアチンは腎糸球体から炉遇されるが、尿細管で再
吸収されるため、成人男子ではほとんど尿中に排泄さｎ
ない。
血清クレアチン濃度は原発性筋疾患、筋萎縮、甲状腺機
能先進症などで増加しクレアチン尿をきたす、一方クレ
アチンの無水物であるクレアチニンは筋肉ではクレアチ
ンリン酸から不可逆的かつ非酵素的に脱水されて生じ、
代謝終産物として腎糸球体全通過し尿細管で再吸収され
ることなく排泄さｊる。し７ｔがって尿毒症、慢性腎炎
、尿路閉塞などの腎機能疾患の時にば、クレアチニンを
正常に排泄できずに血清中にクレアチ二／が増加してく
る。このように血清及び尿中のクレアチン及びクレアチ
ニン濃度を測定することにより、これらの疾患の診断の
重要な指標となる。その検体数は年々増加の一途をｔど
っている。
能先進症などで増加しクレアチン尿をきたす、一方クレ
アチンの無水物であるクレアチニンは筋肉ではクレアチ
ンリン酸から不可逆的かつ非酵素的に脱水されて生じ、
代謝終産物として腎糸球体全通過し尿細管で再吸収され
ることなく排泄さｊる。し７ｔがって尿毒症、慢性腎炎
、尿路閉塞などの腎機能疾患の時にば、クレアチニンを
正常に排泄できずに血清中にクレアチ二／が増加してく
る。このように血清及び尿中のクレアチン及びクレアチ
ニン濃度を測定することにより、これらの疾患の診断の
重要な指標となる。その検体数は年々増加の一途をｔど
っている。
従来よく用いられているクレアチニン定量法はアルカリ
性下でピクリン酸と反応させて発色するヤンフエ反応を
用ｔ／−１７’ｅものである（ Ｂｏｎａｎθａ ａｎ
ｄＴａｕｓｓｋｙ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅＩＩｎ
、１５８ ５８１ （１９４５））。
性下でピクリン酸と反応させて発色するヤンフエ反応を
用ｔ／−１７’ｅものである（ Ｂｏｎａｎθａ ａｎ
ｄＴａｕｓｓｋｙ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅＩＩｎ
、１５８ ５８１ （１９４５））。
この方法はクレアチニンＶＣ％異的な反応を示さないの
で、体液中の他の物質の影響を受けるため正確ナクレア
チニン量を求め得ないし、ピクリン酸が反応容器や分析
機を汚染させ測定誤差の原因となる。また自動分析機に
適応させた場合には他の測定項目に影響を与えるなど、
取扱い上、問題が多かった。
で、体液中の他の物質の影響を受けるため正確ナクレア
チニン量を求め得ないし、ピクリン酸が反応容器や分析
機を汚染させ測定誤差の原因となる。また自動分析機に
適応させた場合には他の測定項目に影響を与えるなど、
取扱い上、問題が多かった。
一方クレアチン定量法は酸性で加熱してクレアチニンに
変え、生じたクレアチニンを上記のヤツフエ反応で測定
し酸性加熱前のクレアチニン量との差からクレアチニン
量を推定する方法である、このためクレアチニノ定量法
は誤差を生じやすく操作が繁雑な欠点がおる。このよう
な従来の欠点を克服した、操作が簡単で正確なりレアチ
ニン及びクレアチンの同時定量方法の開発が望まれてい
穴。
変え、生じたクレアチニンを上記のヤツフエ反応で測定
し酸性加熱前のクレアチニン量との差からクレアチニン
量を推定する方法である、このためクレアチニノ定量法
は誤差を生じやすく操作が繁雑な欠点がおる。このよう
な従来の欠点を克服した、操作が簡単で正確なりレアチ
ニン及びクレアチンの同時定量方法の開発が望まれてい
穴。
本発明者らはこのような実情を背景に迅速で高感度かつ
正確なりレアチニン及びクレアチンの同時定量方法を確
立すべく鋭意研究を重ねた結果、クレアチニン・アミド
１ヒト１０ラーゼ、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ
、ザルコシン・オキシダーゼ、カタラーゼの４＃素及び
発色試薬を用いると上述の従来方法の欠点を克服できる
ことを見出し昭和５８年１２月２６日付で特許出願した
（出願番号５８−２４７９０４）。この出願の発明は、
試料の１つのアリコートにクレアチニン・アミドヒト１
０ラーゼ、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコ
シン・オキ７ダーゼの３酵素を組合せて作用させて該試
料中のクレアチ／とクレアテニ／ヲホルムアルデヒド゛
、過酸化水素及びグリシンに変換し、上記試料の他の７
リコートにクレアチン−アミジノヒドロラーゼとザルコ
シン・オキシダーゼの２酵素を組合せて作用させて試料
中のクレアチンをホルムアルデヒド、過酸化水素及びグ
リシンに変換し、各々の場合に生じた過酸化水素をカタ
ラーゼの存在下にメタノールと反応させてホルムアルデ
ヒド１に変換させることによりクレアチニ７ 及０：Ｉ
レアチン各１分子当り２分子のホルムアルデヒド゛ヲ生
成させ、各々生じたホルムアルデヒドに発色試薬全作用
させ、生じた発色体を測定して各々クレアチニンとクレ
アチンの合計量及びクレアチンの量を定量し店該合計量
からクレアチンの量を差引くことによりクレアチニンの
量を算出することからなるクレアチニンとクレアチ／の
同時定量方法である。
正確なりレアチニン及びクレアチンの同時定量方法を確
立すべく鋭意研究を重ねた結果、クレアチニン・アミド
１ヒト１０ラーゼ、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ
、ザルコシン・オキシダーゼ、カタラーゼの４＃素及び
発色試薬を用いると上述の従来方法の欠点を克服できる
ことを見出し昭和５８年１２月２６日付で特許出願した
（出願番号５８−２４７９０４）。この出願の発明は、
試料の１つのアリコートにクレアチニン・アミドヒト１
０ラーゼ、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコ
シン・オキ７ダーゼの３酵素を組合せて作用させて該試
料中のクレアチ／とクレアテニ／ヲホルムアルデヒド゛
、過酸化水素及びグリシンに変換し、上記試料の他の７
リコートにクレアチン−アミジノヒドロラーゼとザルコ
シン・オキシダーゼの２酵素を組合せて作用させて試料
中のクレアチンをホルムアルデヒド、過酸化水素及びグ
リシンに変換し、各々の場合に生じた過酸化水素をカタ
ラーゼの存在下にメタノールと反応させてホルムアルデ
ヒド１に変換させることによりクレアチニ７ 及０：Ｉ
レアチン各１分子当り２分子のホルムアルデヒド゛ヲ生
成させ、各々生じたホルムアルデヒドに発色試薬全作用
させ、生じた発色体を測定して各々クレアチニンとクレ
アチンの合計量及びクレアチンの量を定量し店該合計量
からクレアチンの量を差引くことによりクレアチニンの
量を算出することからなるクレアチニンとクレアチ／の
同時定量方法である。
しかし、上記出願の方法はホルムアルデヒドヲ測定する
方法でらるため、反応槽に合成樹脂が用いられると樹脂
に含１ｎるアルデヒドの几めに正確に測定することがで
きない、、また、発色反応が２段階で使用する発色試薬
が３ａｌ類と多く、操作が繁雑となり、このために限ら
れた臨床自動分析装置にしか用いることができない、ざ
らに劇物である水酸化カリウムを使用している。しかも
変動像ａは１〜２．５％”ｌる。
方法でらるため、反応槽に合成樹脂が用いられると樹脂
に含１ｎるアルデヒドの几めに正確に測定することがで
きない、、また、発色反応が２段階で使用する発色試薬
が３ａｌ類と多く、操作が繁雑となり、このために限ら
れた臨床自動分析装置にしか用いることができない、ざ
らに劇物である水酸化カリウムを使用している。しかも
変動像ａは１〜２．５％”ｌる。
本発明者らはこれら先行技術の欠点を解決すべく研究し
た結果、本発明を完成【７た。本発明の目的Ｆｉ１反応
が１段階で発色試薬Ｆｉ１種類あるいは２種類であり、
操作も単純であるため、あるゆるである。
た結果、本発明を完成【７た。本発明の目的Ｆｉ１反応
が１段階で発色試薬Ｆｉ１種類あるいは２種類であり、
操作も単純であるため、あるゆるである。
問題を解決するための手段
本発明の方法の測定原理を具体的に示せば下記の通りで
ある。
ある。
クレアチニン ＋ Ｈ２Ｏクレアチン
Ｒ
クレアチン 十 Ｈ２０＋ザルコシン＋尿素試料中の
クレアチニンをクレアチニン・アミド１ヒドロラーゼ（
ＥＣａａｚｌｏ；略号ＣＲＮ）でクレアチンに変え、生
じｔクレアチンをクレアチン・アミジノヒドロラーゼ〔
ｇｃａａａａ；略号ＣＲ〕でザルコシンと尿素に変え、
ザルコシンをザルコシン・オキシダーゼ（ＥＣ１ａ＆１
；略号ＳＯＸ ）で過酸化水素とホルムアルデヒｒとグ
リシンに変える酵素反応と、酵素反応により生じた過酸
化水素を発色試薬とイルオキシダーゼ（ＩＣＩ ＩＬ７
；略号ＰＯＤ）の存在下で反応させる発色反応とから
なり、そして生じた発色体の可視部吸光度を測定して、
目的とするクレアチニンを定量することができる。
クレアチニンをクレアチニン・アミド１ヒドロラーゼ（
ＥＣａａｚｌｏ；略号ＣＲＮ）でクレアチンに変え、生
じｔクレアチンをクレアチン・アミジノヒドロラーゼ〔
ｇｃａａａａ；略号ＣＲ〕でザルコシンと尿素に変え、
ザルコシンをザルコシン・オキシダーゼ（ＥＣ１ａ＆１
；略号ＳＯＸ ）で過酸化水素とホルムアルデヒｒとグ
リシンに変える酵素反応と、酵素反応により生じた過酸
化水素を発色試薬とイルオキシダーゼ（ＩＣＩ ＩＬ７
；略号ＰＯＤ）の存在下で反応させる発色反応とから
なり、そして生じた発色体の可視部吸光度を測定して、
目的とするクレアチニンを定量することができる。
上記酵素反応においてＣＲＭを用いないで酵素反応を進
行名せるとクレアチンの定量を行なうことができる。ま
た試料中に存在するクレアチニンの量を知りたいときに
＃−ｒ１上記＃素反応においてＣＲＮも用いて酵素反応
を進行させて得たクレアチンとクレアチニンの合計量か
らＣＲＮ＠用いないで酵素反応全進行式せて得たクレア
チンの量を差し引くことによって得らｎる。
行名せるとクレアチンの定量を行なうことができる。ま
た試料中に存在するクレアチニンの量を知りたいときに
＃−ｒ１上記＃素反応においてＣＲＮも用いて酵素反応
を進行させて得たクレアチンとクレアチニンの合計量か
らＣＲＮ＠用いないで酵素反応全進行式せて得たクレア
チンの量を差し引くことによって得らｎる。
本発明に使用するＣＲＮはいかなる起源のものででよい
がたとえばアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
礪、シュート１モナス（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
属、フラボバクテリウム（Ｆ１ａｖＣ＋ｈａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ）属等ＶＣ礪する微生物が産生ずるＣＲＮがある
。
がたとえばアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
礪、シュート１モナス（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）
属、フラボバクテリウム（Ｆ１ａｖＣ＋ｈａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ）属等ＶＣ礪する微生物が産生ずるＣＲＮがある
。
本発明に使用するＣＲＦｉいかなる起源のものでもよい
がたとえばアルカリゲネス（ＡｌｃａｌｉｇｅｎθＢ）
鴎、シュート１モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 礪
、フラボバクテリウム（Ｆｘａｖｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ
）層、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）属等に属する
微生物が産生ずるＣＲがある。
がたとえばアルカリゲネス（ＡｌｃａｌｉｇｅｎθＢ）
鴎、シュート１モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） 礪
、フラボバクテリウム（Ｆｘａｖｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ
）層、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）属等に属する
微生物が産生ずるＣＲがある。
本発明に使用するＳＯｘはいかなる起源のものでもよい
がたとえばシューｒモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ
）−、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎａｂａａｔｓｒ
ｉｕｍ ） ＠。
がたとえばシューｒモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ
）−、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎａｂａａｔｓｒ
ｉｕｍ ） ＠。
ミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕθ）層、バチル
ス（Ｂａｃｉｌ’ｌｕｓ ） ＠等Ｋｌする微生物が産
生ずるＳＯＸがある。
ス（Ｂａｃｉｌ’ｌｕｓ ） ＠等Ｋｌする微生物が産
生ずるＳＯＸがある。
より正確な結果を得るためには上記各酵素をアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって精製する。上記酵素を
アフィニティークロマトグラフィーにより精製すると、
より純度の高い酵素を得ることができる。すなわち、タ
ンノセク質重量当たりの酵素力価を上げることができ、
試薬の中に、より多くの酵素を入することができるよう
になる。
ィークロマトグラフィーによって精製する。上記酵素を
アフィニティークロマトグラフィーにより精製すると、
より純度の高い酵素を得ることができる。すなわち、タ
ンノセク質重量当たりの酵素力価を上げることができ、
試薬の中に、より多くの酵素を入することができるよう
になる。
そして、純度の高い酵素を用いることにより、今まで酵
素に含まｊ、ていた不純物による試薬の保存中の発色反
応が起こらなくなり、第１図に示さするように試薬ブラ
ンクの経日的変化が起こらなくなる。こｔｌＫより、た
とえば、血清中のクレアチン測定では、試薬ＧＫよるザ
ルコシンの測定け、血清中にはザルコシンがまったく存
在しないため同一試薬を１週間用いる場合、試薬Ｃの試
薬ブランクに１回測定するだけでよい。
素に含まｊ、ていた不純物による試薬の保存中の発色反
応が起こらなくなり、第１図に示さするように試薬ブラ
ンクの経日的変化が起こらなくなる。こｔｌＫより、た
とえば、血清中のクレアチン測定では、試薬ＧＫよるザ
ルコシンの測定け、血清中にはザルコシンがまったく存
在しないため同一試薬を１週間用いる場合、試薬Ｃの試
薬ブランクに１回測定するだけでよい。
本発明に使用するはルオキシダーゼは動植物微生物等の
いかなる起源のものでもよいが、好ましくは西洋ワサビ
由来のＲルオキシダーゼである。
いかなる起源のものでもよいが、好ましくは西洋ワサビ
由来のＲルオキシダーゼである。
本発明の過酸化水素全定量する発色試薬としては次のよ
うなものが挙げられる： （１）４−アミノアンチピリンと一般式ＴＩＩの化合物
。
うなものが挙げられる： （１）４−アミノアンチピリンと一般式ＴＩＩの化合物
。
（但しＸＶｉハロゲン基、Ｙけ水素原子、ハロゲン基、
低級アルキル基または低級アルコキシル基、２け水素原
子、スルホン酸基まｔ＃ｉカルボキシル基を表わす） （Ｉ）で表わされるフェノール性化合物としてＦ！。
低級アルキル基または低級アルコキシル基、２け水素原
子、スルホン酸基まｔ＃ｉカルボキシル基を表わす） （Ｉ）で表わされるフェノール性化合物としてＦ！。
たとえば、ｐ−クロロフェノール、２４−ジクロロフェ
ノール ３−ヒドロキシ−２４６−） ＩＪヨー ）’
安、Ｉ香酸、 ２４− ：）クロロフェノールスルホネ
ート等がある。
ノール ３−ヒドロキシ−２４６−） ＩＪヨー ）’
安、Ｉ香酸、 ２４− ：）クロロフェノールスルホネ
ート等がある。
（２）４−アミノアンチピリンと一般式０のアニリン誘
導体。
導体。
（但し、Ｒ１，Ｒ４け水素原子、低級アルキル基、低級
アルコキシル基、Ｒ２，Ｒ，＃ｉ低級アルキル基、ヒド
ロキシ低級アルキル基、アセチルアミド１基ｔ−含む低
級アルキル基、スルホン酸基を含む低級アルキル基ま几
はスルホン酸基を含むヒドロキシ低級アルキル基を示す
、） （２）で表わされるアニリン誘導体としては、たとえば
、ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジ
ン、ｍ−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−メチルフェニル−Ｎ′−アセチルエチ
レンジアミン、ソジウム Ｎ−１＋ルーＮ−（２−ヒト
１０キシ−３−スルホソロピル）−７ニリン、ソジウム
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒト１０キシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジン等がある。
アルコキシル基、Ｒ２，Ｒ，＃ｉ低級アルキル基、ヒド
ロキシ低級アルキル基、アセチルアミド１基ｔ−含む低
級アルキル基、スルホン酸基を含む低級アルキル基ま几
はスルホン酸基を含むヒドロキシ低級アルキル基を示す
、） （２）で表わされるアニリン誘導体としては、たとえば
、ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジ
ン、ｍ−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−メチルフェニル−Ｎ′−アセチルエチ
レンジアミン、ソジウム Ｎ−１＋ルーＮ−（２−ヒト
１０キシ−３−スルホソロピル）−７ニリン、ソジウム
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒト１０キシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジン等がある。
（３）ジエチルアニリンまタハジメチルアニリンと３−
メチル−２−インゾチアゾリノヒｒラゾン。
メチル−２−インゾチアゾリノヒｒラゾン。
更に本発明は体液中のクレアチニン及びクレアチンを同
時定量するキットをも提供するものであり以下これにつ
いて具体的に説明する。
時定量するキットをも提供するものであり以下これにつ
いて具体的に説明する。
本発明によるクレアチニン及びクレアチンの同時定量キ
ットは、３酵累、すなわちクレアチニン拳アミド１ヒト
１０ラーゼ、クレアゲン・アミジノヒドロラーゼ及びザ
ルコシ／・オキシダーゼならびにイルオキシダーゼの計
４＃素を含む試薬Ａ；２＃素すなわちクレアチニン・ア
ミジノヒドロラーゼ、４ルコシン・オキシダーゼならび
Ｖｃ−＜ルオキシターゼの計３酵素を含む試薬Ｂ；ザル
コシン・オキシダーゼとはルオキシダーゼの２酵素を含
む試薬Ｃ；及び過酸化水素定量用発色試薬からなり該発
色試薬のうちの１成分は上記試薬Ａ％Ｂおよび／ま７ｔ
はＣＫ含まれていてもよい、。
ットは、３酵累、すなわちクレアチニン拳アミド１ヒト
１０ラーゼ、クレアゲン・アミジノヒドロラーゼ及びザ
ルコシ／・オキシダーゼならびにイルオキシダーゼの計
４＃素を含む試薬Ａ；２＃素すなわちクレアチニン・ア
ミジノヒドロラーゼ、４ルコシン・オキシダーゼならび
Ｖｃ−＜ルオキシターゼの計３酵素を含む試薬Ｂ；ザル
コシン・オキシダーゼとはルオキシダーゼの２酵素を含
む試薬Ｃ；及び過酸化水素定量用発色試薬からなり該発
色試薬のうちの１成分は上記試薬Ａ％Ｂおよび／ま７ｔ
はＣＫ含まれていてもよい、。
好゛ましい形態としては本発明のキットは、アフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製した３酵素ＣＲＮ、
ＯＲ％ＳＯＸと４ルオキシダーゼとの計４酵素に発色
試薬の１成分を含む試薬Ａ；アフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製し７？：２酵素ＯＲ，ＳＯＸとイル
オキシダーゼとのｔ＋３酵Ｘｌｃ発色試薬の１成分を含
む試薬Ｂ；アフィニティークロマトグラフィーにより悄
製した酵素ＳＯＸとはルオキシダーゼとの計２＃素に発
色試薬の１成分を含む試薬Ｃ；および過酸化水素発色試
薬の他の成分からなる。
ィークロマトグラフィーにより精製した３酵素ＣＲＮ、
ＯＲ％ＳＯＸと４ルオキシダーゼとの計４酵素に発色
試薬の１成分を含む試薬Ａ；アフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製し７？：２酵素ＯＲ，ＳＯＸとイル
オキシダーゼとのｔ＋３酵Ｘｌｃ発色試薬の１成分を含
む試薬Ｂ；アフィニティークロマトグラフィーにより悄
製した酵素ＳＯＸとはルオキシダーゼとの計２＃素に発
色試薬の１成分を含む試薬Ｃ；および過酸化水素発色試
薬の他の成分からなる。
試薬Ａ、試薬Ｂ及び試薬Ｃに含まｉる発色試薬は酵素と
は別の試薬たとえば、試薬りとなってもよい。ここで、
過酸化水素発色試薬の成分すべてを酵素といっしょにす
ると試料に対して使用する前に発色してしまうので不都
合である。したがって上記発色試薬は酵素試薬と別にす
るかその１成分のみを酵素試薬といっしょにするにとど
める。
は別の試薬たとえば、試薬りとなってもよい。ここで、
過酸化水素発色試薬の成分すべてを酵素といっしょにす
ると試料に対して使用する前に発色してしまうので不都
合である。したがって上記発色試薬は酵素試薬と別にす
るかその１成分のみを酵素試薬といっしょにするにとど
める。
試薬Ａ１試薬Ｂ、試薬Ｃは粉末状及び液状のいず１でも
よく、粉末状の場合に＃：ｔ＃素作用に最適なｐＨ５，
Ｑ〜９． Ｏｔ−与える緩衝液たとえば、５０ｍＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，８１溶解液として用いる。また液
状の場合は試薬Ａ、試薬Ｂ及び試薬Ｃｔ−緩衝液たとえ
ば５０ｍＭＩＪン酸緩衝液で溶解ＬテｐＨ６，０〜９．
０ （好ｔＬ＜ＨｐＨ７，８）ｌｃ１４整しておけばよ
い。
よく、粉末状の場合に＃：ｔ＃素作用に最適なｐＨ５，
Ｑ〜９． Ｏｔ−与える緩衝液たとえば、５０ｍＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，８１溶解液として用いる。また液
状の場合は試薬Ａ、試薬Ｂ及び試薬Ｃｔ−緩衝液たとえ
ば５０ｍＭＩＪン酸緩衝液で溶解ＬテｐＨ６，０〜９．
０ （好ｔＬ＜ＨｐＨ７，８）ｌｃ１４整しておけばよ
い。
作用
本発明の方法およびキットｉ使用して％ＣＲＮ。
ＣＲ％ＳｏＸ及びはルオキシダーゼの４酵Ｘｆｔ用いて
クレアチニン及びクレアチンを定量すｎば従来方法に比
べ感度よく共存物質の影響を受けずに、特異性扁く正確
に体液中のクレアチニン及びクレアチンの定量が可能で
あり、臨床検査の診断分野において極めて有意義である
。
クレアチニン及びクレアチンを定量すｎば従来方法に比
べ感度よく共存物質の影響を受けずに、特異性扁く正確
に体液中のクレアチニン及びクレアチンの定量が可能で
あり、臨床検査の診断分野において極めて有意義である
。
実施例
次に本発明は実施例により説明されるが、何らこｎＫ限
定さｎない。
定さｎない。
実施例１
試料中のクレアチニン及びクレアチンを下記試薬を用い
て下記方法により定量した。
て下記方法により定量した。
試薬
試薬Ａ、Ｃ１ｌ １４０ＵＯＲ
］ ５ｏｔＪ ＳＯＸ １２０Ｕペルオキシダ
ーゼ １００Ｕ４−アミノアンチピ
リン ）ＶｓｏｍＭり糧緩衝液（ｐＨ
７，８） １ｏ＊試薬Ｂ、 ＣＲｔｓｏＬＴ ＳＯＸ ］２０Ｕはル
オキシダーゼ １ ｏｏＴＪ４−ア
ミノアンチピリン ２■５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，８） ］Ｏｄ試薬Ｃ，ＳＯＸ
１２０Ｕペルオキシダーゼ
１ｏｏＵ４−アミノアンチピリン
２■５０ｍＭす々緩衝液（ｐＨ７，８）
１０ｄ５０ｍＭり漕緩衝液（ｐＨ７，８）
１ｍ測定法 試料及びクレアチニン標準液５０μｆｔとり第１表に示
すように操作を行なって波長５５５ ｎｍで吸光度を測
定し、下記計算式によって試料中のクレアチニン及びク
レアチン量を求める。
］ ５ｏｔＪ ＳＯＸ １２０Ｕペルオキシダ
ーゼ １００Ｕ４−アミノアンチピ
リン ）ＶｓｏｍＭり糧緩衝液（ｐＨ
７，８） １ｏ＊試薬Ｂ、 ＣＲｔｓｏＬＴ ＳＯＸ ］２０Ｕはル
オキシダーゼ １ ｏｏＴＪ４−ア
ミノアンチピリン ２■５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，８） ］Ｏｄ試薬Ｃ，ＳＯＸ
１２０Ｕペルオキシダーゼ
１ｏｏＵ４−アミノアンチピリン
２■５０ｍＭす々緩衝液（ｐＨ７，８）
１０ｄ５０ｍＭり漕緩衝液（ｐＨ７，８）
１ｍ測定法 試料及びクレアチニン標準液５０μｆｔとり第１表に示
すように操作を行なって波長５５５ ｎｍで吸光度を測
定し、下記計算式によって試料中のクレアチニン及びク
レアチン量を求める。
第 １ 表
計算式
クレアチン濃度（■／ｄｉ ）
クレアチニンの検量線は第２図に示したとおりであり、
クレアチンの標量線は第３図に示したとおりである。捷
た血清を試料とした場合のクレアチニン測定値は第２表
のとおりであった。参考のためヤツフエ（Ｊａｆｆθ′
）法による測定値と比較した。
クレアチンの標量線は第３図に示したとおりである。捷
た血清を試料とした場合のクレアチニン測定値は第２表
のとおりであった。参考のためヤツフエ（Ｊａｆｆθ′
）法による測定値と比較した。
第２表
発明の効果
以上詳細に説明した如く１本発明は液中のクレアチニン
及びクレアチンを正確かつ迅速に同時定量する方法及び
そのキラトラ提供するものであって特に臨床医学におけ
る腎臓及び筋挟患の診断に有効に用いることができるも
のである。
及びクレアチンを正確かつ迅速に同時定量する方法及び
そのキラトラ提供するものであって特に臨床医学におけ
る腎臓及び筋挟患の診断に有効に用いることができるも
のである。
第１図は試薬ブランクの経日変化を示すグラフであって
、図中Ｏ印は試薬Ａの吸光度を表わし、・印は試薬Ｂの
吸光度′１ｉ：表わす。 第２図はクレアチニンの検量線を示すグラフであり、第
３図はクレアチンの検量線を示すグラフである。
、図中Ｏ印は試薬Ａの吸光度を表わし、・印は試薬Ｂの
吸光度′１ｉ：表わす。 第２図はクレアチニンの検量線を示すグラフであり、第
３図はクレアチンの検量線を示すグラフである。
Claims (8)
- （１）試料の１つのアリコートに３つの酵素、すなわち
クレアチニン・アミドヒドロラーゼ、クレアチン・アミ
ジノヒドロラーゼおよびザルコシン・オキシダーゼを混
合して作用させ、該試料中のクレアチニンとクレアチン
を過酸化水素、ホルムアルデヒド及びグリシンに変換し
、上記試料の他のアリコートに２つの酵素、すなわちク
レアチン・アミジノヒドロラーゼとザルコシン・オキシ
ダーゼを混合して作用させ、試料中のクレアチンを過酸
化水素、ホルムアルデヒド及びグリシンに変換し、各々
の場合に生じた過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下
に過酸化水素定量用発色試薬と反応させ、生じた発色体
を測定することにより、各々のクレアチニンとクレアチ
ンの合計量及びクレアチン量を定量し、該合計量からク
レアチンの量を差引くことによりクレアチニンの量を算
出することからなるクレアチニンとクレアチンの同時定
量方法。 - （２）酵素がアフィニティークロマトグラフィーにより
精製されている特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （３）上記発色試薬が４−アミノアンチピリンと下記の
一般式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （但しＸはハロゲン基、Ｙは水素原子、ハロゲン基、低
級アルキル基または低級アルコキシル基、Ｚは水素原子
、スルホン酸基またはカルボキシル基を示す）で表わさ
れるフェノール性化合物からなることを特徴とする特許
請求の範囲第（１）項に記載のクレアチニンとクレアチ
ンの同時定量方法。 - （４）上記発色試薬が４−アミノアンチピリンと下記の
一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （但しＲ＿１、Ｒ＿４は水素原子、低級アルキル基、低
級アルコキシル基、Ｒ＿２、Ｒ＿３は低級アルキル基、
ヒドロキシ低級アルキル基、アセチルアミド基を含む低
級アルキル基、スルホン酸基を含む低級アルキル基また
はスルホン酸基を含むヒドロキシ低級アルキル基を示す
。）で表わされるアニリン誘導体からなることを特徴と
する特許請求の範囲第（１）項に記載のクレアチニンと
クレアチンの同時定量方法。 - （５）上記発色試薬がジエチルアニリンまたはジメチル
アニリンと３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾンからなることを特徴とする特許請求の範囲第（１）
項に記載されるクレアチニンとクレアチンの同時定量方
法。 - （６）クレアチニン・アミドヒドロラーゼ、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼ及びザルコシン・オキシダーゼ
ならびにペルオキシダーゼの計４酵素を含む試薬Ａ；ク
レアチニン・アミジノヒドロラーゼ、ザルコシン・オキ
シダーゼならびにペルオキシダーゼの計３酵素を含む試
薬Ｂ；ザルコシン、オキシダーゼとペルオキシダーゼの
２酵素を含む試薬Ｃ；及び過酸化水素定量用発色試薬か
らなり、該発色試薬のうちの１成分は上記試薬Ａ、Ｂお
よび／またはＣに含まれていてもよいクレアチニンとク
レアチンの同時定量用キット。 - （７）酵素がアフィニテ ィークロマトグラフィーにより精製されている特許請求
の範囲第（６）項記載のキット。 - （８）過酸化水素定量用発色試薬の１成分が試薬Ａ、Ｂ
およびＣの各々に含まれている特許請求の範囲第６項ま
たは第７項記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28137584A JPS61155758A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | クレアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28137584A JPS61155758A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | クレアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61155758A true JPS61155758A (ja) | 1986-07-15 |
Family
ID=17638250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28137584A Pending JPS61155758A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | クレアチニン及びクレアチンの同時定量方法並びにそのキツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61155758A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103278468A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-09-04 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 一种肌酐检测试剂 |
| CN113075142A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-06 | 长沙中生众捷生物技术有限公司 | 一种肌酐测试试条及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5783297A (en) * | 1980-11-10 | 1982-05-25 | Toyobo Co Ltd | Determination of creatinine and creatine |
| JPS589699A (ja) * | 1981-07-10 | 1983-01-20 | Hitachi Ltd | クレアチンとクレアチニンの同時分析方法およびその装置 |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP28137584A patent/JPS61155758A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5783297A (en) * | 1980-11-10 | 1982-05-25 | Toyobo Co Ltd | Determination of creatinine and creatine |
| JPS589699A (ja) * | 1981-07-10 | 1983-01-20 | Hitachi Ltd | クレアチンとクレアチニンの同時分析方法およびその装置 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103278468A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-09-04 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 一种肌酐检测试剂 |
| CN113075142A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-06 | 长沙中生众捷生物技术有限公司 | 一种肌酐测试试条及其应用 |
| CN113075142B (zh) * | 2021-03-31 | 2023-10-03 | 复星诊断科技(长沙)有限公司 | 一种肌酐测试试条及其应用 |
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