JPS603480B2 - クレアチニンおよびクレアチンの定量法 - Google Patents

クレアチニンおよびクレアチンの定量法

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JPS603480B2
JPS603480B2 JP15803380A JP15803380A JPS603480B2 JP S603480 B2 JPS603480 B2 JP S603480B2 JP 15803380 A JP15803380 A JP 15803380A JP 15803380 A JP15803380 A JP 15803380A JP S603480 B2 JPS603480 B2 JP S603480B2
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勇蔵 林
義隆 中桐
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素を用いるクレアチニンおよびクレアチンの
定量法に関するものである。
体液中のクレアチニンおよびクレアチンの定量は賢疾患
、筋肉疾患、甲状腺機館冗進症等の診断の有用な情報を
提供するものである。
従来よく用いられたクレアチニンの定量法はアルカリ性
ピクリン酸を用いるャツフェ法である。この方法はクレ
アチニンに特異的な反応を示さないので、体液中の他の
物質の影響を受けるため正確なクレアチニン基を求め得
ないし、また強アルカリを用いたり、ビクリン酸が反応
容器や分析機を汚染させ測定誤差の原因になる、また自
動分析機に適応させた場合には他の測定項目に影響を与
える等の取扱い上、問題が多かった。一方、クレアチン
は酸性で加熱してクレアチニンに変え、生じたクレアチ
ニンを上記のヤツフェ法で測定し「酸性加熱前のクレア
チニン量との差からクレアチン量を推定する方法である
このためクレアチン定量法は誤差を生じやすくト磯作が
繁雑な欠点がある。このような従来の定量法の欠点を解
決するために、クレアチニンアミドヒドロラーゼ(以下
CRHと略称する)およびクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼ(以下CAHと略称する)およびザルコシンデヒド
ロゲナーゼ(以下SDHと略称する)を絹合せて作用さ
せるクレアチニンおよびクレァチンの定量法が提案され
ている(袴関昭52−117694号、特関昭52−1
56695号へ 特関昭53一11091号)。
ところが、この定量法では反応が4ステップであって繁
雑である。
本発明者等は操作が簡単で、しかも正確度の高いクレア
チニンおよびクレアチンの定量法を見出すために、種々
鋭意検討したところ、CRH,CAH、ザルコシンオキ
シダーゼ(以下SODと略称する)、ベルオキシダーゼ
(以下PEOと略称する)および特定の色原体を用いる
と所期の目的が達成されることを見出し本発明に到達し
た。
すなわち本発明は試料にクレアチニンアミドヒドロラー
ゼ(CRH)、クレアチンアミジノヒドロラーゼ(CA
H)およびザルコシンオキシダーゼ(SOD)の三酵素
を粗合せて作用させ「生成する過酸化水素にベルオキシ
ダーゼ(PEO)および(i)4−アミノアンチピリン
と下記一般式(1)で表わされるフェノール性化合物「
(ii)4ーアミノアンチピリンと下記一般式(ロ)で
表わされるァニリン誘導体、又は(肌ジェチルアニ1」
ンまたはジメチルアニリンと3−メチル−2ーベンゾチ
アゾリノンヒドラゾンを作用させ、生じた発色体を測定
することにより、クレアチニンおよびクレアチンクレア
チンを定量することを特徴とするクレアチニンおよびク
レアチンの定量法である。一般式(1): (但し、Xはハロゲン基、Yは水素原子「ハロゲン基、
低級アルキル基、又は低級アルコキシ基「 Zは水素原
子、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。
)一般式(D): (但し〜R,は水素原子、低級アルキル基「低級ァルコ
キシ基、R2,R3は低級アルキル基、低級ァルコキシ
基しアセチルアミド基を含む低級アルキル基またはスル
ホン酸基を含む低級アルキル基を示す。
)本発明の測定腺理は下記に示す通りである。
■ 酵素反応クレアチニン十日20CRH クレアチン
クレァチン十舷OCAH ザルコシン+尿素 ザルコシン+弦○十02SOD グリシン+HCHO+
は02舷 発色反応 日202十色源体 PEO 発色体 すなわちクレアチニンをCRHでクレアチンに変え、生
じたクレアチンをCAHでザルコシンと尿素に変え、ザ
ルコシンをSODでグリシンとホルムアルデヒドと過酸
化水素に変える酵素反応と、この過酸化水素を色原体と
ベルオキシダーゼの存在下で反応させて発色させる発色
反応とからなり「そして生じた発色体の可視部吸光度を
測定して、目的とするクレアチニンを定量することがで
きる9上記反応において「CRHを用いないで酵素反応
を進行させるクレアチンの定量を行なうことができる。
また試料中に存在するクレアチニンの量を知りたいとき
には、上記反応においてCRHを用いて酵素反応を進行
させて得たクレアチニンの量からCRHを用いないで酵
素反応を進行させて得たクレアチンの量を差し引くこと
によって得られる。本発明では酵素反応は発色反応と同
時に行なってもよく、また別々に、つまり酵素反応を行
なってから発色反応を行なってもよい。
本発明ではSODにより生成した過酸化水素にベルオキ
シダーゼと発色体を作用させるが、カタラーゼを用いる
場合に比べ、1ステップ反応(一試薬系)が可能であり
、反応が早いので反応時間が短かくてすむ。
本発明に使用するCRHはいかなる起源のものでもよい
が、たとえばシユウドモナス属、フラボバクテリウム属
、アルカリゲネス属、アルスロバクター属等に属する微
生物が産生するCRHがある。
本発明に使用するCAHはいかなる起源のものでもよい
が、たとえばシュウドモナス属「フラボバクテリウム属
等に属する微生物が産生するCAHがある。
また本発明に使用するSODもいかなる起源のものでも
よいが、たとえばコリネバクテリウム属、ミクロコッカ
ス属、アルスロバクター属等に属する微生物が産生する
SODがある。
さらに本発明に使用するPEOは動植物、微生物等いか
なる起源のものでもよいが、好ましくは西洋ワサビ由来
のPEOである。
本発明の色原体としては、(i)4−アミノアンチピリ
ンと一般式(1):(但し、×はハロゲン基、Yは水素
原子、ハロゲン基、低級アルキル基、又は低級アルコキ
シル基、Zは水素原子、スルホン酸基又はカルポキシル
基を示す。
)で表わされるフェノール性化合物、(ii)4ーアミ
ノアンチピリンと一般式く〇):(但し、R,,R4は
水素原子、低級ァルキル基、低級アルコキシル基、R2
,R3は低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキル基、
アセチルアミド基を含む低級アルキル基またはスルホン
酸基を含む低級アルキル基を示す。
)で表わされる化合物、(iiDジェチルアニリンまた
はジメチルアニリンと3−メチル−2−ペンゾチアゾリ
ノンヒドラゾンを用いる。−匁史式(1)で表わされる
フェノール性化合物としては、例えばp−クロルフェノ
ール、pーブロムフエノール、2,4−ジクロルフエノ
ール、2,4ージブロムフエノール、2,4ージクロル
フェノールスルホネート等がある。
一般式(0)で表わされるアニリン誘導体としては、例
えばジェチルアニリン、N,Nージェチルーm−トルイ
ジン、mーメトキシーN,Nージメチルアニリン、Nー
エチルーN−(3ーメチルフエニル)−Nーアセチルエ
チレンジアミン、ソジウムーNーエチル−N一(3ース
ルホプロピル)メタトルイジン、ソジウム−Nーエチル
−N−(2ーヒドロキシ−3ースルホプロピルナ3,5
ージメトキシアニリン等がある。
本発明に使用する定量試薬は上記酵素および/または色
原体を溶解させた緩衝液である。
本発明では過酸化水素の発色を妨害する検体中のアスコ
ルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼ(以下ASOと
略記する)を作用させることによって除去することがで
きる。
この場合、ASOは他の酵素反応に先だって作用させて
も、また他の酵素反応と共役させて同時に作用させて除
去してもよい。ASOは植物由釆のもの、好ましくはカ
ボチャ、キュウリ由来のものがある。本発明に従えば測
定系にCRH,CAH,SODおよびPEOの酵素を用
い、簡単操作で、感度よく、共存物質の影響を受けずに
、特異性高く正確に体液中のクレァチニンおよびクレア
チンの定量が可能となり、臨床検査の診断分野において
極めて有意義である。
さらに本発明ではSODを用いることにより、SDHを
用いる方法に比べて、1ステップ反応が可能で非常に簡
便である。
またPEOを用いることにより、カタラーゼを用いる方
法に比べて、1ステップ反応(一試薬系)が可能であり
、反応が早いので反応時間が短かくてすむ。
次に本発明を実施例により説明する。
実施例 1 血清中のクレアチン量を下記試薬を用い、下記方法によ
り定量した。
1試薬 CRH 20山単位SOD
50〃PE0
20〃4ーアミノア
ンチピリン 2のopーク。
ルフエノール 10のタASO
IO■単位0.1Mリン酸緩衝液
(pH8.0) 全量10のと2 測定法血清または
クレアチン標準液loo一夕をとり、これに上記試薬1
机を添加し、370で1ぴ分間反応させた後、0.1M
リン酸緩衝液(pH8,0)を2の上添加し、波長51
Mmで吸光度を測定した。
血清中のクレアチン量は既知濃度のクレアチン標準液と
比較することにより求めた。
第1図に検量線を示す。
実施例 2 血清中のクレアチニン量を下記試薬を用い、下記方法に
より定量した。
1試薬 URH 403単位CAH
200がS○
D 50がPE
○ 20が4ーアミ
ノアンチピリン 2雌ジエチルアニリン
2の9ASO
ION単位0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0) 全
量10の上2 測定法血清またはクレアチニン標準液5
8科そをとり「 これに上記試薬1の上を添加し「37
Gでi8分間反応させた後、0.2Mリン酸緩衝液(p
H548)を2のと添加し、波長55仇mで吸光度を測
定した。
上記試薬からCRHを除いた試薬で同様の操作を行ない
、その吸光度を求め、先に求めた吸光度から差し引いた
血清中のクレアチニン量を既知濃度のクレアチニン標準
液と比較して求めた。
第2図に検量線を示す。
上記試薬を用いて血清中のクレアチニン濃度を求め、従
来のャツフェ反応法と比較した。
その結果を第1表に示す。なお、ャッフェ反応法とは試
薬にピクリン酸および水酸化ナトリウムの溶液を加え、
活性メチレンの反応により生じた紅色の化合物の吸光度
を測定する。
標準液を同様にして操作して51則mの波長で比色し、
試料中の濃度を求める方法である。第1表(雌〆aZ) 本発明方法は従来のャッフェ法と比較して、特異的な反
応を用いるものであり、正確な測定を行なうことができ
る。
比較例 1 実施例2におけるpークロルフヱノールをフェノールに
代えて「実施例2と同様にクレァチニンの定量を行なっ
た。
第3図に検量線を示す。
第2図および第3図から明らかなように「本発明ではフ
ェノールを用いる場合に比して、感度が高い。
実施例 3 血清中のクレアチニン量を下記試薬を用いも下記方法に
より定量した。
1試薬 A CRH 40山単位C
肌 20蝉位〃SOD
50〃ASO
IOO〃0.1Mリン酸緩
衝液(pH8.0) 全量1ow‘B PE0
30単位0.1Mリン酸緩衝液
(pH6.0) 全量10の‘C ジメチルアニリン
2.5ムク3ーメチルー2ーベンヅチ
アゾリノンヒドラゾン
0.25帆IM酢酸 全量l
ow‘2 測定法血清またはクレアチニン標準液50ム
〆をとり、これに上記試薬AIの【を添加して、37℃
で15分間反応後、試薬CIの‘、次いで試薬$1のZ
を順次加えて、370で5分間反応させた後、波長59
仇mで吸光度を測定した。
上記試薬AからCRHを除いた試薬A′を用い、同機の
操作を行なし、吸光度を求めた。
先に求めた吸光度から、この吸光度を差し引くことによ
り、血清中のクレアチニン量を既知濃度のクレアチニ.
ン標準液と比較して求めた。第4図に検量線を示す。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明方法により測定したクレアチンの検量線
を示す。 第2図は本発明方法により測定したクレァチニンの検量
線を示す。第3図は比較方法により測定したクレアチニ
ンの検量線を示す。第4図は本発明方法により測定した
クレアチニンの検量線を示す。第1図 第2図 第3図 第4図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 試料にクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチ
    ンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼ
    の三酵素を組合せて作用させ、生成する過酸化水素にペ
    ルオキシダーゼおよび(i)4−アミノアンチピリンと
    下記一般式(I)で表わされるフエノール性化合物、(
    ii)4−アミノアンチピリンと下記一般式(II)で表わ
    される化合物、又は(iii)ジエチルアニリンまたはジ
    メチルアニリンと3−メチル−2−ベンゾチアゾリノン
    ヒドラゾンを作用させ、生じた発色体を測定することを
    特徴とするクレアチニンおよびクレアチンの定量法。 一般式(I):▲数式、化学式、表等があります▼ (但し、Xはハロゲン基、Yは水素原子、ハロゲン基、
    低級アルキル基、又は低級アルコキシ基、Zは水素原子
    、スルホン酸基又はカルボキシル基を示す。 )一般式(II): ▲数式、化学式、表等があります▼ (但し、R_1は水素原子、低級アルキル基、低級アル
    コキシ基、R_2,R_3は低級アルキル基、低級アル
    コキシ基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基また
    はスルホン酸基を含む低級アルキル基を示す。 )
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