WO2019216406A1 - 生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法 - Google Patents

生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法 Download PDF

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WO2019216406A1
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reagent
biological component
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satisfies
sensitivity
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研吾 西村
木全　伸介
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東洋紡株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing sensitivity reduction of a biological component measurement reagent kit used in clinical diagnosis. More specifically, hydrogen peroxide generated from a biological component using an oxidation-reduction reaction and an oxidation-reduction coloring reagent (such as a Trinder reagent combining an aminoantipyrine compound as a coupler and a hydrogen donor),
  • the present invention relates to a method for suppressing a decrease in sensitivity in a biological component measurement reagent kit that performs colorimetric determination of coloration generated by oxidative condensation in the presence of peroxidase.
  • Examples of the redox coloring reagent system include a method using a hydrogen donor and a coupler.
  • a typical example is a Trinder method in which a hydrogen donor and a coupler are oxidized and condensed with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to form a dye.
  • 4-aminoantipyrine hereinafter also referred to as 4AA
  • 4AA 4-aminoantipyrine
  • the present inventors have prepared an enzyme-peroxidase-coloring agent system biocomponent measurement reagent using an aminoantipyrine compound and a hydrogen donor, and when using it for biocomponent measurement, the measurement sensitivity of unknown cause is reduced. Experienced.
  • an object of the present invention is to provide a means for suppressing a decrease in sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine in order to solve the above-mentioned problems that have not been known so far.
  • the present inventors have unexpectedly found that the pH of a reagent containing an aminoantipyrine compound is 8.0 or more in preparing a biological component measurement reagent kit.
  • the present invention has the following configuration.
  • the biological component measurement method uses a reagent or a reagent set that satisfies the following requirements (a) to (d), and is added to the reagent that satisfies the requirement (d): Item 2.
  • the measurement sensitivity lowering inhibitor of a biological component according to Item 1, which is used.
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B Contains peroxidase.
  • C A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • D An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • CLAIM ITEM 3 The measurement sensitivity fall inhibitor of the biological component of claim
  • a method for suppressing a decrease in measurement sensitivity of a biological component characterized by using a pH adjuster that adjusts to a constant value.
  • a method for suppressing a decrease in measurement sensitivity of biological components, characterized in that it is 8.0 or more A method for suppressing a decrease in measurement sensitivity of biological components, characterized in that it is 8.0 or more
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B Contains peroxidase.
  • C A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B) Contains peroxidase.
  • (D) An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • kit A biological component measurement method using the biological component measurement kit according to any one of Items 9 to 11.
  • a method for producing a reagent kit for measuring a biological component that satisfies the following requirements (a) to (e) and suppresses a decrease in sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine comprising: (d) and (e) A method for producing a reagent kit for measuring a biological component, which comprises producing a reagent that satisfies the above requirements as one reagent that simultaneously satisfies two requirements.
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B Contains peroxidase.
  • C A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • (D) An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • the reagent satisfying the requirements (d) and (e) above, wherein one reagent that simultaneously satisfies the two requirements is an intermediate reagent in the manufacturing process of the biological component measurement reagent kit, 14.
  • the present invention it is possible to suppress a decrease in sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine in biological component measurement by an enzyme method using an oxidase-peroxidase-color former system. Therefore, according to the present invention, it is possible to measure a favorable biological component. In particular, stable measurement is possible in the measurement of biological components that require high sensitivity, for example, the content of the biological components is extremely small.
  • the biological component measurement sensitivity decrease inhibitor of the present invention is a measurement sensitivity decrease inhibitor applied to a biological component measurement method using an aminoantipyrine compound as a redox coloring reagent coupler, and contains the aminoantipyrine compound.
  • the biological component measurement method to which the biological component measurement sensitivity decrease inhibitor of the present invention is applied is preferably a biological component measurement method using a reagent or a reagent set that satisfies the following requirements (a) to (d).
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B Contains peroxidase.
  • C A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • D An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • a pH adjuster to a reagent that satisfies the requirement (d).
  • the aminoantipyrine compound contained in the reagent satisfying the requirement (d) may contain a trace amount of 4-hydroxyantipyrine as a by-product during the production thereof. It has been found that 4-hydroxyantipyrine causes a decrease in measurement sensitivity of biological components. Furthermore, the present inventors have found that it is possible to suppress such a decrease in sensitivity by coexisting a pH adjusting agent in 4-hydroxyantipyrine and setting the pH of the reagent to 8.0 or more, thereby completing the present invention.
  • the biological component measurement sensitivity decrease inhibitor of the present invention by adding a pH adjuster that adjusts the pH of the reagent to 8.0 or more in the reagent that satisfies the requirement (d).
  • the object is to suppress a decrease in measurement sensitivity of biological components caused by 4-hydroxyantipyrine.
  • the reagent or reagent set may be prepared as one reagent that satisfies the requirements of (a) to (d), or is composed of 2 to 3 or more by packaging the reagents. It may be a reagent set.
  • the reagent or reagent set may be in a form such as a kit packaged in a single packaging container, or may be a form in which each reagent is prepared separately and used in a set.
  • the method for suppressing a decrease in measurement sensitivity of a biological component of the present invention is a method for suppressing a decrease in measurement sensitivity applied to a biological component measurement method using an aminoantipyrine compound as a redox coloring reagent coupler, A pH adjuster that adjusts the pH of the reagent containing the aminoantipyrine compound to 8.0 or more is used.
  • the method for suppressing a decrease in measurement sensitivity of a biological component of the present invention is a method for suppressing a decrease in measurement sensitivity in a biological component measurement method using a reagent or reagent set that satisfies the following requirements (a) to (d):
  • a pH adjusting agent for adjusting the pH of the reagent to 8.0 or more is added to the reagent that satisfies the requirement (d).
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B Contains peroxidase.
  • C A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • the present inventors speculate that the decrease in measurement sensitivity occurs as a result of consumption of hydrogen peroxide by the reaction of 4-hydroxyantipyrine with peroxidase.
  • the reaction of 4-hydroxyantipyrine The present invention was completed by finding that the property can be suppressed by coexisting a pH adjusting agent and adjusting the pH to 8.0 or more. That is, in the method for suppressing measurement sensitivity of biological components according to the present invention, the pH of the reagent that satisfies the requirement (d) is 8.0 by adding a pH adjuster to the reagent that satisfies the requirement (d). As described above, by suppressing the reactivity of 4-hydroxyantipyrine, a decrease in measurement sensitivity of biological components caused by 4-hydroxyantipyrine is suppressed.
  • the reaction time under conditions of pH 8.0 or higher is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the pH of the reagent satisfying the requirement (d) is adjusted to 8.0 or more, 1 ° C. to 10 ° C. for at least 2 weeks, 11 ° C. to 25 ° C. for at least 1 week, 26 ° C. to 40 ° C.
  • a sufficient effect can be obtained by reacting at 41 ° C. to 60 ° C. for at least 5 hours and at 61 ° C. to 80 ° C. for at least 1 hour for at least 2 days.
  • the effect of the present invention can be obtained if the reaction is carried out under conditions of pH 8.0 or more for about one month or more.
  • a reagent that satisfies the above-mentioned requirement (d) after reacting 4-hydroxyantipyrine at a pH of 8.0 or more over the above period.
  • said reaction may be performed during a stock storage and a distribution
  • the storage temperature the lower limit temperature is preferably a temperature at which the reagent does not freeze, and the upper limit temperature is preferably a temperature at which various components in the reagent do not cause quality deterioration such as alteration or denaturation.
  • the reagent satisfying the requirement (d) is a product reagent (for example, a reagent containing a protein such as an enzyme)
  • the pH of the product reagent is adjusted. Since the reaction proceeds by refrigeration or storage near room temperature, storage, distribution, and storage before use, the biological component measurement reagent manufactured by adjusting the pH of the reagent that satisfies the requirement (d) before use It may be used after at least 2 weeks have passed since the date of manufacture of the kit.
  • a reagent that satisfies the requirement (d) is an intermediate reagent (for example, an aminoantipyrine compound having a concentration several to several tens of times that of a product reagent as a buffer component).
  • an intermediate reagent for example, an aminoantipyrine compound having a concentration several to several tens of times that of a product reagent as a buffer component.
  • the adjusted reagent after adjusting the pH of the intermediate reagent, for example, store it for several days at a temperature condition of 30 ° C. or higher, and for several hours at a temperature condition of 45 ° C. or higher. What is necessary is just to prepare.
  • the product reagent may be adjusted by adjusting the pH of the reagent that satisfies the requirement (d) to 8.0 or less at the stage of preparing the product reagent.
  • the present inventors have found that such a decrease in measurement sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine can be suppressed by adjusting the pH of a reagent containing 4-hydroxyantipyrine to 8.0 or higher in advance. It was. Although the mechanism by which the decrease in sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine is suppressed by adjusting the pH to 8.0 or higher is not clear, the present inventors have found that 4-hydroxyantipyrine has been reduced by adjusting the pH to 8.0 or higher. It is assumed that some structural change occurs and it does not react with peroxidase and does not consume hydrogen peroxide.
  • the structural change of 4-hydroxyantipyrine is presumed to be an irreversible change, and the measurement sensitivity of the biological component due to 4-hydroxyantipyrine suppressed by adjusting the pH to 8.0 or higher was reduced. Then, the present inventors presume that the reaction between 4-hydroxyantipyrine and peroxidase will not be restored even if the pH of the reagent is 8.0 or less.
  • the concentration of the pH adjusting agent that makes the pH of the reagent satisfying the requirement (d) 8.0 or more is preferably 1 to 5000 mM, preferably 5 to 1000 mM. More preferably, it is more preferably 10 to 500 mM.
  • the concentration of the pH adjusting agent is 1 mM or less, the pH adjusting power is weak, and when the concentration of the pH adjusting agent is 5000 mM or more, the cost of the pH adjusting agent increases.
  • the preferable concentration range of the pH adjuster coexisting in the reagent satisfying the requirement (d) depends on the concentration of 4-hydroxyantipyrine mixed in the reagent satisfying the requirement (d).
  • the concentration of the hydroxyantipyrine is low, a decrease in the measurement sensitivity of the biological component can be suppressed even if the concentration of the pH adjusting agent is low, and if the concentration of 4-hydroxyantipyrine is high, it is effective to use a higher concentration of pH adjusting agent. For this reason, in the biological component measurement sensitivity reduction suppressing method of the present invention, it is preferable to appropriately set the concentration of the pH adjuster according to the concentration of 4-hydroxyantipyrine mixed therein.
  • the concentration of 4-hydroxyantipyrine present in the reagent satisfying the requirement (d) is 0.1 to 50 ⁇ g at a concentration before adding the pH adjuster. / Ml is particularly easy to obtain.
  • concentration of 4-hydroxyantipyrine present in the reagent that satisfies the requirement (d) before adding the pH adjuster is less than 0.1 ⁇ g / ml, the measurement sensitivity of biological components is reduced by 4-hydroxyantipyrine. Is 1% or less, and there is little need to suppress a decrease in measurement sensitivity by coexisting a pH adjuster.
  • the present invention is a reagent containing about 0.01 to 100 g / l of aminoantipyrine compound (4-aminoantipyrine), preferably about 0.01 to 10 g / l of aminoantipyrine compound (4-amino It is effective to be used for a reagent containing an antipyrine), more preferably a reagent containing about 0.01 to 5 g / l of an aminoantipyrine compound (4-aminoantipyrine).
  • the amount of 4-hydroxyantipyrine mixed in it is preferable to remove 4-hydroxyantipyrine from the aminoantipyrine compound in advance by a method for removing 4-hydroxyantipyrine, which will be described later, and then subject it to biological component measurement. .
  • the biological component to be measured by the biological component measurement reagent kit of the present invention is not particularly limited, and can be used for measurement of various biological components.
  • the biological components used in the biological component measurement of the present invention are uric acid (UA), creatinine (CRE), triglyceride (TG), cholesterol (CHO), AST (GOT), ALT (GPT), LDH (lactic acid dehydrogenation).
  • Enzymes and isozymes ALP (alkaline phosphatase) and isozymes, CK (creatine kinase) and isozymes, amylases (Amy) and isozymes, lipases, ⁇ -GTP ( ⁇ -glutamyl transpeptidase), cholinesterase (ChE), sodium (Na) , Potassium (K), chlor (Cl), calcium (Ca), phosphorus (P) [inorganic phosphorus (IP)], iron (Fe), magnesium (Mg), total protein (TP), serum protein fraction (PF) ), Urea nitrogen (BUN), creatinine (CRE), uric acid (U ), Bilirubin (Bil), ammonia, cholesterol, HDL cholesterol (HDL-C, high density lipoprotein cholesterol), LDL cholesterol (LDL-C, low density lipoprotein cholesterol), neutral fat (triglyceride) (TG), cholesterol (CHO), BTR (BTR, total branched chain amino acid / t
  • uric acid U
  • CRE creatinine
  • TG triglyceride
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • uric acid In the case of measuring uric acid (UA), hydrogen peroxide produced by the reaction of uricase (oxidase) using uric acid (UA) as a substrate can be quantified by a peroxidase-chromogenic system.
  • creatinine (CRE) When measuring creatinine (CRE), hydrogen peroxide is not directly generated in the reaction of creatinine amidinohydrolase using creatinine (CRE) as a substrate. Therefore, creatine obtained by adding creatine generated in the reaction of creatinine amidinohydrolase to the reagent in advance is used.
  • Peroxidase-coloring agent system by designing a so-called conjugation reaction in which sarcosine is generated by reacting with amide hydrolase, and hydrogen peroxide is generated using sarcosine oxidase (oxidase) with sarcosine added to the reagent in advance. Quantification of creatinine (CRE) concentration by means of
  • triglyceride (TG) When triglyceride (TG) is measured, hydrogen peroxide is generated by using lipoprotein lipase using triglyceride (TG) as a substrate and glycerol kinase and glycerol triphosphate oxidase (oxidase) as conjugate enzymes.
  • TG triglyceride
  • the triglyceride (TG) concentration can be quantified using a peroxidase-color former system.
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • glycated hemoglobin oxidase for example, fructosyl amino acid oxidase
  • creatinine (CRE) and glycated hemoglobin (HbA1c) have extremely low biological component content, and therefore, particularly sensitive measurement is required.
  • the influence of 4-hydroxyantipyrine which inhibits the reaction of the oxidase-peroxidase-color former system, can be suppressed and the decrease in sensitivity of biological component measurement can be suppressed, and thus high sensitivity measurement is required.
  • the present invention is suitable for measurement of creatinine and glycated hemoglobin, and in particular, it is suitably used for measurement of creatinine.
  • the biological component measurement kit of the present invention includes a measurement sensitivity lowering inhibitor containing a pH adjuster that adjusts the pH of a reagent containing an aminoantipyrine compound as described above to 8.0 or more. .
  • the biological component measurement kit of the present invention satisfies the following requirements (a) to (e) and simultaneously satisfies the two requirements for a reagent that satisfies the following requirements (d) and (e): It is characterized by being a single reagent.
  • A An oxidase capable of generating hydrogen peroxide is included.
  • B Contains peroxidase.
  • (C) A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • (D) An aminoantipyrine compound is included as a coupler for the redox coloring reagent.
  • E) A pH adjuster that adjusts the pH of the reagent that satisfies the requirements of (d) to 8.0 or more is included.
  • the biological component measurement kit of the present invention it is preferable that one reagent that satisfies the two requirements (d) and (e) has passed at least one month after production.
  • the present inventors presume that 4-hydroxyantipyrine reacts with peroxidase, and as a result, hydrogen peroxide is consumed.
  • the reactivity of 4-hydroxyantipyrine is determined by adding a pH adjusting agent to 4-hydroxyantipyrine. It discovered in this invention that it can suppress by adding.
  • the reaction rate of the suppression reaction may affect the reaction temperature and reaction time.
  • the suppression effect is produced when the storage period is several weeks to one month or more. It is preferable that at least one month has passed since the biological component measurement kit of the present invention. In general, such a measurement kit is considered to take one month to several months after being manufactured and used through an inventory / distribution process, during which the suppression reaction proceeds and the effect of the present invention is exhibited. It will be.
  • the biological component measuring method of the present invention is characterized by measuring biological components using the aforementioned biological component measuring kit.
  • the method for producing a biological component measurement kit of the present invention is a method for producing a biological component measurement reagent kit that satisfies the following requirements (a) to (e) and suppresses a decrease in sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine. , (D) and (e) are manufactured as one reagent that satisfies the two requirements at the same time.
  • B) Contains peroxidase.
  • C A redox coloring reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to develop color.
  • (D) An aminoantipyrine compound is included as a coupler of the redox coloring reagent.
  • E) A pH adjuster that adjusts the pH of the reagent that satisfies the requirements of (d) to 8.0 or more is contained.
  • the reagent that satisfies the requirements (d) and (e) is preferably manufactured as one reagent that simultaneously satisfies the two requirements, and that the biological component derived from 4-hydroxyantipyrine is measured.
  • a sufficient period for example, about one month or more
  • one reagent that simultaneously satisfies the two requirements is an intermediate reagent in the production process of the biological component measurement reagent kit.
  • the product reagent may be prepared using the intermediate reagent.
  • the biological component measurement kit of the present invention needs to suppress the reactivity of 4-hydroxyantipyrine by adjusting the pH of the reagent that satisfies the requirement (d) to 8.0 or more. May be carried out by adjusting the pH of the reagent that satisfies the requirement (d) as a product reagent to 8.0 or more, but this suppression reaction is not necessarily carried out in the product reagent.
  • an aminoantipyrine compound In the process of preparing the reagent containing the reagent, after adjusting the pH to 8.0 or higher in the state of the intermediate reagent, etc., and then performing the inhibition reaction, the product reagent is manufactured using the intermediate reagent and provided as a biological component measurement kit. May be.
  • the reagent intermediate containing an aminoantipyrine compound as described above is, for example, diluting the aminoantipyrine compound base with a buffer solution or the like in the step of producing a reagent containing the aminoantipyrine compound. It means an intermediate reagent adjusted to a concentration several times to several tens of times that of the product reagent.
  • the biological component measurement kit of the present invention when adding a pH adjuster to an intermediate reagent containing an aminoantipyrine compound and performing an inhibitory reaction, adds the pH adjuster to the intermediate reagent and then ends the product production date.
  • the sum of the period and the period from product manufacture date to product use date is preferably at least one month.
  • the present invention is characterized in that the pH of a reagent containing an aminoantipyrine compound used as a color former is 8.0 or higher in the measurement of biological components by an enzyme method using an oxidase-peroxidase-color former system.
  • any compound showing basicity can be used as a pH adjusting component, as will be described later, but is limited to this means.
  • the pH of the reagent is preferably adjusted to pH 8.0 to pH 12, and pH 8.0 to pH 11 It is more preferable to adjust to.
  • the pH adjuster used in the present invention is not particularly limited, and any component that can adjust the pH of a reagent containing an aminoantipyrine compound to 8.0 or more can be used.
  • a pH adjuster for example, N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine [abbreviation: Tricine]), N, N-bis (2-hydroxyethyl) is used.
  • pH adjuster When a Good buffer is used as the pH adjuster, an appropriate amount of a 0.1 M NaOH aqueous solution may be added to a 0.1 M Good buffer aqueous solution to adjust the pH to 8.0 or more.
  • pH adjusters can be appropriately selected according to, for example, a biological component or a biological sample to be measured.
  • the pH adjuster used in the present invention is N- [tris (hydroxymethyl) from the viewpoint that it is easy to obtain a high effect by stably adjusting the pH of the reagent satisfying the requirement (d) to 8.0 or more.
  • Methyl] glycine N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine [abbreviation: Tricine]
  • N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine N, N-Bis (2-hydroxyethyl) glycine [abbreviation: Bicine]
  • N-Tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid N-Tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfuric acid [abbreviation: TAPS]
  • N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid N - Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (abbreviation: CHES)
  • the pH adjuster used in the present invention has an effect of suppressing a decrease in the sensitivity of biological component measurement caused by 4-hydroxyantipyrine contained as an impurity of the aminoantipyrine compound after blending with the aminoantipyrine compound. Is preferably allowed to elapse for a certain time after blending.
  • the storage temperature is 1 ° C. to 10 ° C. for 2 weeks or more, 11 ° C.
  • the longer the time is required depending on the storage temperature, the higher the temperature, the shorter and the lower the temperature.
  • the upper limit of time to make it react is not specifically limited, For example, it can be made into 10 years or less.
  • the pH adjuster used in the present invention suppresses a decrease in the sensitivity of the biological component measurement caused by 4-hydroxyantipyrine as long as the quality of the reagent used in the biological component measurement kit does not deteriorate The effect is maintained.
  • the product life cycle of a general biological component measurement kit it takes about several weeks or more than one month until it is blended with reagents in the production process and used for quality testing, shipping, distribution, storage and use.
  • the measurement kit containing a reagent in which the pH adjuster of the present invention is coexistent with an aminoantipyrine compound is in a state where the sensitivity decrease suppressing effect by the pH adjuster used in the present invention is expressed and maintained at the stage of use.
  • the product life cycle when the product life cycle is shortened, it can be prepared by manufacturing process management, product management at the time of shipment, or the like.
  • oxidase used in the present invention can generate hydrogen peroxide from a substrate, it can be used without limitation depending on the target measurement target. Specific examples include, but are not limited to, uricase, sarcosine oxidase, glycerol triphosphate oxidase, fructosyl amino acid oxidase and the like. As commercially available products, UAO-211 (manufactured by Toyobo), SAO-351 (manufactured by Toyobo), G3O-311 (manufactured by Toyobo) and the like are preferably used. There are no particular restrictions on the amount used or the form of addition.
  • peroxidase As the peroxidase used in the present invention, any kind of enzyme may be used as long as it catalyzes the reaction between hydrogen peroxide and a redox coloring reagent.
  • peroxidases derived from plants, bacteria, and basidiomycetes Is mentioned.
  • horseradish, rice, soybean-derived peroxidase is preferable, and horseradish-derived peroxidase is more preferable because of purity, availability, and price.
  • PEO-131 (Toyobo), PEO-301 (Toyobo), PEO-302 (Toyobo) and the like are preferably used as commercially available products. There are no particular restrictions on the amount used or the form of addition.
  • Peroxidase activity is defined by the following method. 14 mL of distilled water, 2 mL of 5% (W / V) pyrogallol aqueous solution, 1 mL of 0.147M hydrogen peroxide solution and 2 mL of 100 mM phosphate buffer solution (pH 6.0) were sequentially mixed, and then pre-conditioned at 20 ° C. for 5 minutes. Then, 1 mL of the sample solution is added to start the enzyme reaction. After reacting for 20 seconds, the reaction is stopped by adding 1 mL of 2N aqueous sulfuric acid, and the resulting purpurogallin is extracted 5 times with 15 mL of ether.
  • the total volume is 100 mL, and the absorbance at a wavelength of 420 nm is measured ( ⁇ OD test ).
  • the absorbance at a wavelength of 420 nm is measured ( ⁇ OD test ).
  • 14 mL of distilled water, 2 mL of 5% pyrogallol solution, 1 mL of 0.147M hydrogen peroxide solution and 2 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) were mixed in order, and then 1 mL of 2N sulfuric acid aqueous solution was added and mixed. Then, add 1 mL of the sample solution. About this liquid, ether extraction is performed in the same manner as described above, and the absorbance is measured ( ⁇ OD blank ).
  • the amount of purpurogallin produced is calculated from the difference in absorbance between ⁇ OD test and ⁇ OD blank , and the peroxidase activity is calculated.
  • the amount of enzyme that produces 1.0 mg of purpurogallin in 20 seconds under the above conditions is defined as 1 purpurogallin unit (U).
  • the calculation formula is as follows.
  • Peroxidase activity (U / mg) peroxidase activity (U / mL) ⁇ 1 / C
  • C Enzyme concentration at the time of dissolution (c mg / mL) (One propargalin unit corresponds to 13.5 international units (with o-dianisidine as a substrate and reaction conditions at 25 ° C.).
  • the sample solution was dissolved in 0.1 M phosphate buffer pH 6.0 that had been ice-cooled in advance, and diluted to 3.0 to 6.0 purpurogallin units (U) / mL with the same buffer solution. Then, it is preferable to use for the measurement.
  • Redox coloring reagent As the redox coloring reagent used in the measurement of the biological component of the present invention, any kind of dye may be used as long as it reacts with hydrogen peroxide and develops color. For example, a combination of a hydrogen donor and a coupler is used. Can be mentioned. There are no particular restrictions on the amount used or the form of addition. All of these can be obtained as commercial products.
  • a typical example using a hydrogen donor and a coupler is a Trinder method in which a hydrogen donor and a coupler are oxidized and condensed with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to form a dye.
  • phenol, a phenol derivative, an aniline derivative, naphthol, a naphthol derivative, a naphthylamine, a naphthylamine derivative, or the like is used as a hydrogen donor used in the Trinder method or the like.
  • Coupler These hydrogen donors can be used in combination with a coupler.
  • couplers examples include 4-aminoantipyrine (4AA), aminoantipyrine compounds such as aminoantipyrine derivatives; vanillin diamine sulfonic acid compounds such as vanillin diamine sulfonic acid; methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), sulfonated methylbenzthia.
  • MBTH methylbenzthiazolinone hydrazone
  • SMBTH zolinone hydrazone
  • the present invention can suppress a decrease in sensitivity of a biological component measurement reagent kit caused by a trace amount of 4-hydroxyantipyrine contained in an aminoantipyrine compound, and is effective when an aminoantipyrine compound is used as a coupler. is there.
  • the present invention is useful when 4-aminoantipyrine is used as a coupler.
  • the coupler used in the present invention may be two or more aminoantipyrine compounds, or may be used in combination with another coupler in addition to the aminoantipyrine compound, but preferably one aminoantipyrine compound. It is preferable to use 4-aminoantipyrine.
  • the amount of aminoantipyrine compound used in the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the aminoantipyrine compound may contain a trace amount of 4-hydroxyantipyrine that causes a decrease in sensitivity, and it is desired to reduce the amount of 4-hydroxyantipyrine.
  • the pH is 8.0.
  • the concentration of 4-hydroxyantipyrine mixed in the reagent containing the aminoantipyrine compound prior to coexistence with the pH adjuster is preferably 0.1 to 50 ⁇ g / ml, more preferably It is effective to prepare and use the aminoantipyrine compound used for the biological component measurement so that the amount is 0.3 to 20 ⁇ g / ml, particularly preferably 1 to 10 ⁇ g / ml.
  • concentration of 4-hydroxyantipyrine is below the above range, there is little influence on the measurement sensitivity of biological components due to 4-hydroxyantipyrine, and there is little need to suppress the decrease in measurement sensitivity due to the coexistence of a pH adjuster.
  • the concentration of 4-hydroxyantipyrine exceeds the above range, a high-concentration pH adjusting agent is required to suppress a decrease in measurement sensitivity of biological components due to 4-hydroxyantipyrine. It may occur, and the measurement accuracy of biological components tends to decrease.
  • the amount of 4-hydroxyantipyrine mixed in is large, remove 4-hydroxyantipyrine mixed in the aminoantipyrine compound in advance by a method for removing 4-hydroxyantipyrine, which will be described later. Is preferred.
  • the present invention has an aminoantipyrine compound (4-aminoantipyrine) of about 0.01 to 100 g / l.
  • the content of 4-hydroxyantipyrine in the aminoantipyrine compound is, for example, high performance liquid chromatography (hereinafter also referred to as HPLC method), gas chromatography (hereinafter also referred to as GC method), mass spectrometry (hereinafter referred to as MS). It can also be measured by performing quantitative methods such as a nuclear magnetic resonance method (hereinafter also referred to as NMR method) alone or in any combination.
  • HPLC method is preferably used from the viewpoint of the convenience of operation and the economical efficiency of the system / equipment.
  • the HPLC method column is preferably a reverse phase column, and more preferably a silica-based porous column.
  • (4-hydroxyantipyrine) 4-hydroxyantipyrine has a structure in which the amino group at the 4-position of 4-aminoantipyrine is converted to a hydroxyl group, and is considered to be a byproduct produced and mixed in the production process of 4-aminoantipyrine.
  • 4-hydroxyantipyrine has a great influence on the color reaction in the color development reaction in the biological component measurement method even when the amount of contamination is very small. This phenomenon is caused by the fact that 4-hydroxyantipyrine has a faster reaction rate and consumes hydrogen peroxide than aminoantipyrine compounds originally intended to be reacted as a coupler (for example, 4-aminoantipyrine). It is guessed.
  • an aminoantipyrine compound drug substance that can contain 4-hydroxyantipyrine may be used as it is, or an aminoantipyrine compound drug substance that has a low 4-hydroxyantipyrine content. May be used by selecting the amount of 4-hydroxyantipyrine content reduced by removing 4-hydroxyantipyrine from the aminoantipyrine compound drug substance. .
  • the method for reducing the 4-hydroxyantipyrine content from an aminoantipyrine compound there is no particular limitation on the method for reducing the 4-hydroxyantipyrine content from an aminoantipyrine compound.
  • any method known in the art such as a method of using chromatography such as HPLC from a biological component measurement reagent, a method of dissolving 4-hydroxyantipyrine on an adsorbent such as a resin after being dissolved in water or a solvent, etc.
  • Separation / removal may be performed using means.
  • chromatography is used as a means for removing 4-hydroxyantipyrine from an aminoantipyrine compound
  • the physicochemical principle of the separation is not particularly limited. Examples include various principles such as distribution (normal phase / reverse phase), adsorption, molecular exclusion, and ion exchange. Separation may be performed by a method in which a ligand is bound to a resin or an adsorbent.
  • the 4-hydroxyantipyrine removal means general reverse phase chromatography can be used.
  • the carrier for reverse phase chromatography is not particularly limited.
  • silica gel is suitable, but a polymer carrier may be used. When silica gel is used as a carrier, those with and without end cap treatment can be selected.
  • the chromatography apparatus can be used by appropriately preparing the conditions according to the purpose regardless of whether the chromatography system is low pressure, medium pressure, or high pressure.
  • the type of ligand that binds to the chromatography carrier is not particularly limited. In addition to the octadecyl group (ODS), which is widely used, a ligand and an octyl group can be selected by optimizing the conditions.
  • ODS octadecyl group
  • Ligand binding may be monomeric or polymeric. Any filler can be used by optimizing the separation conditions.
  • the chromatographic mobile phase may be water and a water-soluble solvent such as methanol or acetonitrile.
  • the pH of the chromatographic mobile phase should be acidic.
  • a small amount of preparation or ion pair reagent may be added to the side.
  • the mobile phase flow rate may be optimized according to the capacity of the system used. Further, elution may be performed stepwise instead of using a linear gradient.
  • the biological component measurement reagent kit of the present invention preferably contains a reagent containing a buffer component.
  • ascorbate oxidase, preservatives, salts, enzyme stabilizers, chromogen stabilizers, etc. are added to the reagents contained in the biological component measurement reagent kit of the present invention as long as they do not affect the reaction. Also good.
  • buffer solution component examples include Tris buffer solution, phosphate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution, and GOOD buffer solution. There are no particular limitations on the amount used, the set pH, the form of addition, and the like. All of these can be obtained as commercial products.
  • GOOD buffers include N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), N-cyclohexyl- 2-aminoethanesulfonic acid (CHES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminomethanesulfonic acid (TES), N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), N-cyclohexyl-2- Hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid (CAPSO), 3- [N, N-bis (2-hydro Cyethy
  • biological component measurement reagent of the present invention there are no particular limitations on the amount used or the form of addition of ascorbic acid oxidase, preservatives, salts, enzyme stabilizers, chromogen stabilizers, and the like. All of these can be obtained as commercial products.
  • preservatives include Procrine 150, Procrine 200, Procrine 300, Procrine 950, azide, chelating agent, antibiotic, antibacterial agent and the like.
  • Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salt.
  • Antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol and the like.
  • antibacterial agents examples include methyl isothiazolinone and imidazolidinyl urea.
  • salts examples include sodium chloride, potassium chloride, aluminum chloride and the like.
  • Enzyme stabilizers include sucrose, trehalose, cyclodextrin, gluconate, amino acids and the like.
  • chromogen stabilizers examples include chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid and its salts, and cyclodextrins.
  • the reagent contained in the biological component measurement reagent kit of the present invention may be a liquid reagent dissolved in an arbitrary solvent (for example, purified water, organic solvent, etc.), or dissolved in the same solvent as described above before use. It may be a dry powder reagent (for example, freeze-dried powder) used.
  • a general-purpose automatic analyzer for example, Hitachi 7180 automatic analyzer
  • the biological component measurement kit of the present invention may be configured to be applicable to such an automatic analyzer.
  • the mode is not particularly limited.
  • Various forms such as a kit called a so-called dry system and a kit using a sensor can be exemplified.
  • kits composed of one reagent or a kit composed of 2 to 3 or more by packaging the reagent is used.
  • a reagent is packaged to form a kit composed of two or more reagents, for example, (a) an oxidase capable of generating hydrogen peroxide and (c) a hydrogen donor of the redox coloring reagent.
  • the kit may be configured by being packaged into a reagent containing 4-aminoantipyrine as a coupler among (b) peroxidase and (d) redox coloring dye.
  • kits composed of a liquid reagent in which two reagents are packaged (hereinafter also referred to as a two-reagent liquid reagent) will be described.
  • the first type of reagent (hereinafter also referred to as the first reagent or R1) is added to the sample and allowed to react for a certain period of time, and then the second type.
  • the target component can be quantified by further adding and reacting the reagent (hereinafter also referred to as the second reagent or R2) and measuring the change in absorbance during this period.
  • the concentration of pH adjuster in each packaging reagent and other It is determined whether or not the concentration of the component is within the preferable concentration range of each component.
  • the biological component measurement method targeted by the present invention includes the following steps (1) to (3).
  • (1) a step of generating hydrogen peroxide by causing an oxidase to act on a biological component; (2)
  • the hydrogen peroxide generated in step (1) reacts with peroxidase in the presence of peroxidase, whereby the reaction solution is colored by oxidative condensation of 4-aminoantipyrine and redox coloring reagent.
  • Process (3) A step of colorimetrically determining the reaction product colored in step (2).
  • the biological component measurement method of the present invention is a biological component measurement method by an enzyme method, particularly a method using an oxidase-peroxidase-color former system, that is, the amount of biological component by enzymatic reaction of the biological component in the specimen.
  • the measurement principle is to perform colorimetric determination of the color produced by generating hydrogen peroxide according to the above and reacting it with a color former in the presence of peroxidase.
  • Biological component measurement methods using this principle have already been established in the art. Therefore, the knowledge can be applied to the present invention to measure the amount or concentration of a biological component in various samples, and the mode is not particularly limited.
  • the present inventors have found that 4-hydroxyantipyrine contained in a trace amount in an active ingredient of an aminoantipyrine compound (especially 4-aminoantipyrine) inhibits the reaction of this oxidase-peroxidase-color-developer system. We found for the first time that it caused a decline.
  • the mechanism by which 4-hydroxyantipyrine inhibits the above reaction is not necessarily clear, but its structure causes a redox coloring reagent and 4-hydroxyantipyrine to undergo a condensation reaction in the presence of hydrogen peroxide by the action of peroxidase. It is guessed that it consumes.
  • specimen containing a biological component used for the biological component measurement of the present invention examples include biological fluids such as blood (particularly serum and plasma), urine, ascites, and cerebrospinal fluid, and people such as beverages and foods. Ingestion and so on.
  • biological fluids such as blood (particularly serum and plasma), urine, ascites, and cerebrospinal fluid, and people such as beverages and foods. Ingestion and so on.
  • human body fluid a sample derived from blood such as serum or plasma, a sample derived from urine, or the like
  • the present invention uses a pH adjuster to detect sensitivity due to 4-hydroxyantipyrine in the measurement of biological components by an enzymatic method using an oxidase-peroxidase-color former system, compared to the case where no pH adjuster is used. Can be suppressed.
  • the detection sensitivity of the biological component measurement reagent kit will be described using creatinine as an example of the biological component.
  • eGFR also referred to as estimated glomerular filtration rate
  • eGFR has been required to have a measurement accuracy of creatinine up to two digits after the decimal point, and a minimum detection sensitivity of about 0.03 mg / dL is required as a creatinine concentration.
  • the present invention by using a pH adjuster, it is possible to suppress a decrease in sensitivity of the biological component measurement reagent kit caused by 4-hydroxyantipyrine and increase the detection sensitivity to the above level.
  • Example 1 Separation of 4HA by HPLC Since it was found that the degree of reagent sensitivity decrease was caused by lot differences of 4AA, it was assumed that the content of impurities contained in trace amounts in 4AA differed from lot to lot, and impurities were determined by the 4HA quantitative method (HPLC method) described above. Was detected. The purity of 4AA used for examination of lot difference was 98.0% or more according to JIS-K8048.
  • the HPLC fraction when 4AA is analyzed is shown in FIG.
  • the large peak that is observed around the elution time of 7 to 8 minutes on the horizontal axis of the graph is the peak of 4-aminoantipyrine.
  • this HPLC fraction as shown in FIG. 1, three kinds of impurities other than 4-aminoantipyrine were confirmed.
  • Example 2 Identification of 4HA Examining the contents of each lot for the three types of impurities (a, b, c) seen in FIG. 1 of Example 1, it was found that the contents of only the impurities b differ greatly from lot to lot. Therefore, the molecular weight and structure of these three kinds of substances were analyzed by mass spectrometry (MS spectrum method).
  • FIG. 2 shows the structural formula of 4HA.
  • Example 3 Dependence of 4HA concentration on creatinine measurement sensitivity Using creatinine as a biological component, the dependency of 4HA on the amount of contamination was evaluated with respect to a decrease in measurement sensitivity caused by 4HA mixed in the reagent.
  • Each measurement reagent was prepared by adding 4HA to the second reagent of the following creatinine measurement reagent such that the final concentration in the reagent was 0.13 to 8.75 ⁇ g / ml. A 5 mg / dL creatinine aqueous solution was used as the biological component sample.
  • a creatinine measuring reagent having the following composition was prepared.
  • 4-aminoantipyrine commercially available 4-aminoantipyrine raw material was purified to produce 4-aminoantipyrine free of 4-hydroxyantipyrine and used.
  • Example 4 Sensitivity reduction inhibitory effect by pH adjuster About Tricine and Bicine, the inhibitory effect of the sensitivity fall resulting from 4HA was confirmed.
  • the experimental conditions were as follows. For the reagents other than the control (a), 4HA was added to the second reagent of the creatinine measurement reagent so that the final concentration in the reagent was 10 ⁇ g / ml, and a 5 mg / dL creatinine aqueous solution was used as the biological component sample. The process was performed under the same conditions as in Example 3 except that.
  • Example 5 Inhibition of sensitivity reduction by another pH adjuster Concentration and pH were adjusted for TAPS, CHES, CAPS, and disodium hydrogen phosphate, and the effect of suppressing the decrease in sensitivity due to 4HA was confirmed.
  • the experimental conditions were as follows. For the reagents other than the control (a), 4HA was added to the second reagent of the creatinine measurement reagent so that the final concentration in the reagent was 10 ⁇ g / ml, and a 5 mg / dL creatinine aqueous solution was used as the biological component sample. The process was performed under the same conditions as in Example 3 except that.
  • Example 6 Concentration dependence of pH adjusting agent on sensitivity reduction inhibiting effect
  • the concentration of the regulator was changed from 10 mM to 100 mM, and the effect of suppressing the decrease in sensitivity due to 4HA was confirmed.
  • the experimental conditions were as follows.
  • 4HA was added to the second reagent of the creatinine measurement reagent so that the final concentration in the reagent was 10 ⁇ g / ml, and a 5 mg / dL creatinine aqueous solution was used as the biological component sample.
  • the process was performed under the same conditions as in Example 3 except that.
  • the present invention can be applied to a measurement method for measuring a biological component using an oxidation-reduction reaction, and a reagent or composition used in the method.

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Abstract

本発明は、酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制剤であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含有することを特徴とする、生体成分の測定感度低下抑制剤を提供する。好ましくは、前記生体成分測定法が以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法であって、前記ｐＨ調整剤を（ｄ）の要件を満たす試薬中に添加して用いることを特徴とする：（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

Description

生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法

　本発明は、臨床診断で用いられる生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法に関する。より詳細には、酸化還元反応を利用して生体成分から発生させた過酸化水素と、酸化還元発色試薬（カップラーとしてのアミノアンチピリン系化合物と水素供与体とを組み合わせたトリンダー試薬等）とを、ペルオキシダーゼ存在下で酸化縮合させて生じる呈色を比色定量して測定する生体成分測定試薬キットにおける、感度の低下を抑制する方法等に関する。

　従来、臨床診断においては、酵素法による生体成分の測定が行われており、特に酸化酵素－ペルオキシダーゼ－酸化還元発色試薬（以下、発色剤とも表記する。）系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下、発色剤と反応させて比色定量する方法が広く行われている（非特許文献１）。

　該酸化還元発色試薬系としては、例えば水素供与体とカップラーを用いた方法があげられる。代表例としては、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法があげられる。本方法で用いるカップラーとしては例えば４－アミノアンチピリン（以下、４ＡＡとも表記する）が知られている。

ＢＵＮＳＥＫＩ　ＫＡＧＡＫＵ　Ｖｏｌ．４５，　Ｎｏ．２，　ｐｐ．１１１－１２４　（１９９６）

　本発明者らは、アミノアンチピリン系化合物および水素供与体を用いた酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系の生体成分測定試薬を調製し、それを生体成分測定に用いるにあたり、原因不明の測定感度の低下を経験した。　

　測定感度の低下の程度は、測定のために調製した試薬組成物のロットによりばらつきがあったため、本発明者らは、測定キットの試薬組成について種々検討した。その結果、意外なことに、４－アミノアンチピリン中に極微量の４－ヒドロキシアンチピリン（以下、４ＨＡとも表記する。）という物質が存在することを見出した。理論に束縛されることは望まないが、４－ヒドロキシアンチピリンが試薬中に存在した場合、構造上４－ヒドロキシアンチピリンは水素供与体とカップリング反応しないが、過酸化水素存在下、４－ヒドロキシアンチピリンとペルオキシダーゼが反応し、過酸化水素が消費されると考えられるため、その結果、検体中の測定対象物質に酵素を反応させて発生した過酸化水素が４－ヒドロキシアンチピリンに消費されることとなり、本来の４－アミノアンチピリン－水素供与体の反応で発色する発色量が減り、感度が低下すると考えられた。　

　そこで、本発明は、これまでに知られていなかった上記課題を解決するために、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下を抑制する手段を提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、予想外のことに、生体成分測定試薬キットの調製にあたり、アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調製することで、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の構成からなる。　

［項１］　酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制剤であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含有することを特徴とする、生体成分の測定感度低下抑制剤。

［項２］　前記生体成分測定法が以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法であって、（ｄ）の要件を満たす試薬中に添加して用いることを特徴とする、項１に記載の生体成分の測定感度低下抑制剤。

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

［項３］　４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制することを特徴とする、項１又は２に記載の生体成分の測定感度低下抑制剤。

［項４］　酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制方法であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を用いることを特徴とする、生体成分の測定感度低下の抑制方法。

［項５］　以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法における測定感度低下の抑制方法であって、（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にすることを特徴とする、生体成分の測定感度低下の抑制方法

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

［項６］　４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制することを特徴とする、項４又は５に記載の生体成分の測定感度低下の抑制方法。

［項７］　前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤の濃度が１～５０００ｍＭであることを特徴とする、項５又は６に記載の生体成分の測定感度低下の抑制方法。

［項８］　前記生体成分が、クレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかであることを特徴とする、項４乃至は７のいずれかに記載の生体成分の測定感度低下の抑制方法。

［項９］　酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定試薬キットであって、項１に記載の測定感度低下抑制剤を含むことを特徴とする、生体成分測定試薬キット。

［項１０］　以下の（ａ）～（ｅ）の要件を満たす生体成分測定試薬キットであって、（ｄ）及び（ｅ）要件を満たす試薬については２つの要件を同時に満たす一つの試薬としてなることを特徴とする、生体成分測定試薬キット。

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

　（ｅ）（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤を含む。

［項１１］　前記（ｄ）及び（ｅ）の２つの要件を同時に満たす一つの試薬が、製造後少なくとも１か月間を経過していることを特徴とする、項１０に記載の生体成分測定試薬キット。

［項１２］　項９乃至は１１のいずれかに記載の生体成分測定キットを用いることを特徴とする生体成分測定方法。

［項１３］　以下の（ａ）～（ｅ）の要件を満たす、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下が抑制された生体成分測定試薬キットの製造方法であって、（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬として製造することを特徴とする、生体成分測定試薬キットの製造方法。

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

　（ｅ）（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤を含む。

［項１４］　前記（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬が、生体成分測定試薬キットの製造プロセスでの中間試薬であることを特徴とする、項１３に記載の生体成分測定試薬キットの製造方法。

　本発明により、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法での生体成分測定において、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下を抑制することが可能となる。従って、本発明により、良好な生体成分の測定が可能となる。とりわけ、生体成分の含有量が極微量であるなど高感度を要する生体成分の測定において安定した測定が可能となる。

４－アミノアンチピリン原薬を分析した結果のＨＰＬＣフラクションを示す図である。 ４－ヒドロキシアンチピリンの構造式を示す図である。 ４－ヒドロキシアンチピリンの第二試薬中濃度と試料測定感度との関係を示す図である。

　本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

　また、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。また本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。　

　（生体成分の測定感度低下抑制剤）

　本発明の生体成分の測定感度低下抑制剤は、酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制剤であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含有することを特徴とする。　

　本発明の生体成分の測定感度低下抑制剤が適用される生体成分測定法は以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法であることが好ましい。

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。　

　本発明の生体成分の測定感度低下抑制剤において、ｐＨ調整剤を前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に添加して用いることが好ましい。

　前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に含まれるアミノアンチピリン系の化合物は、その製造中の副産物として極微量の４－ヒドロキシアンチピリンが混入することがあり、本発明において、本発明者らはかかる４－ヒドロキシアンチピリンが生体成分の測定感度低下を生じることを見出した。さらに、本発明者らは４－ヒドロキシアンチピリンにｐＨ調整剤を共存させ当該試薬のｐＨを８．０以上にすることによりかかる感度低下を抑制することが可能であること見出し本発明を完成した。

　つまり、本発明の生体成分の測定感度低下抑制剤は、前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に当該試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を添加して用いることが好ましく、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制することを目的とするものである。　

　ここで、試薬又は試薬セットとは、（ａ）～（ｄ）の要件を満たす１つの試薬として調製されたものであってもよいし、試薬が分包されて２乃至３以上で構成された試薬セットであってもよい。また試薬又は試薬セットは、１つの包装容器にパッケージングされたキット等のような態様であってもよいし、各試薬を別々に用意して使用時にセットで用いる態様であってもよい。

　（生体成分の測定感度低下の抑制方法）

　一つの実施態様において、本発明の生体成分の測定感度低下の抑制方法は、酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制方法であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を用いることを特徴とする。

　更なる実施態様において、本発明の生体成分の測定感度低下抑制方法は、以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法における測定感度低下の抑制方法であって、（ｄ）の要件を満たす試薬中に当該試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤を添加することを特徴とする。

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。　

　本発明者らは、測定感度低下は、４－ヒドロキシアンチピリンがペルオキシダーゼと反応することにより過酸化水素が消費された結果生じるものと推察しているが、本発明において、この４－ヒドロキシアンチピリンの反応性をｐＨ調整剤を共存させｐＨを８．０以上にすることにより抑制できることを見出し本発明を完成した。　つまり、本発明の生体成分の測定感度低抑制方法は、前記（ｄ）の要件を満たす試薬中にｐＨ調整剤を添加することにより、前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上とし、４－ヒドロキシアンチピリンの前記反応性を抑制することで、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制することを特徴とする。　

　４－ヒドロキシアンチピリンが混入するアミノアンチピリン系化合物を含有する試薬において、ｐＨ８．０以上の条件で反応させる時間は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。例えば、前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に調整した状態で、１℃～１０℃で少なくとも２週間、１１℃～２５℃で少なくとも１週間、２６℃～４０℃で少なくとも２日間、４１℃～６０℃で少なくとも５時間、６１℃～８０℃で少なくとも１時間にわたり反応させれば十分な効果を得ることができる。従って、厳密な温度制御をしない場合であっても、約１か月以上にわたりｐＨ８．０以上の条件で保管して反応させれば、本発明の効果を得ることが可能である。本発明では、上記のような期間にわたりｐＨ８．０以上で４－ヒドロキシアンチピリンを反応させた後に、前記（ｄ）の要件を満たす試薬を使用することが好ましい。なお、上記の反応は製造後、在庫保管や流通段階の間に行われてもよい。

　保管温度は、下限温度は試薬が凍結しない温度が好ましく、上限温度は試薬中の各種成分が変質や変性など品質劣化を生じない温度が好ましい。　

　本発明の具体的な実施態様としては、例えば、前記（ｄ）の要件を満たす試薬が製品試薬（例えば、酵素などのタンパク質を含む試薬）の場合には、当該製品試薬のｐＨを調整した後、冷蔵乃至は室温付近で在庫保管、流通、使用前保管することにより前記反応は進行するので、使用までに、前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを調整して製造した生体成分測定試薬キットの製造日から少なくとも２週間経過した後に、使用に供すればよい。

　本発明の別の具体的な実施態様として、（ｄ）の要件を満たす試薬が中間試薬（例えば、製品試薬に比し数倍乃至は数１０倍濃度のアミノアンチピリン系化合物を緩衝液成分などで調整した試薬）の場合には、当該中間試薬のｐＨを調整した後、例えば３０℃以上の温度条件では数日間、４５℃以上の温度条件では数時間保管し、保管後希釈して製品試薬を調製すればよい。

　なお、中間試薬のｐＨを調整する場合、製品試薬を調製する段階で、（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以下に調整して製品試薬としてもよい。　

　本発明者らは、このような４－ヒドロキシアンチピリンに起因する測定感度低下が、予め４－ヒドロキシアンチピリンを含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整して反応させることにより抑えられることを見出した。ｐＨを８．０以上に調整することにより４－ヒドロキシアンチピリンによる感度低下を抑制されるメカニズムは明らかではないが、本発明者らはｐＨを８．０以上に調整することより４－ヒドロキシアンチピリンが何らかの構造変化を生じペルオキシダーゼと反応せず過酸化水素を消費しなくなると推察する。

　なお、この点に関して、４-ヒドロキシアンチピリンの構造変化は、不可逆的な変化と推測され、ｐＨを８．０以上に調整することにより抑制された４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度低下は、その後、当該試薬のｐＨを８．０以下にしても、４－ヒドロキシアンチピリンとペルオキシダーゼとの反応が復活することはないと、本発明者らは推測する。　

　本発明の生体成分の測定感度低下抑制方法において、前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤の濃度は１～５０００ｍＭであることが好ましく、５～１０００ｍＭであればより好ましく、１０～５００ｍＭであればさらに好ましい。

　ｐＨ調整剤の濃度が１ｍＭ以下ではｐＨ調整力が弱く、ｐＨ調整剤の濃度が５０００ｍＭ以上ではｐＨ調整剤のコストが大きくなる。

　なお、前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に共存させたｐＨ調整剤の好ましい濃度範囲は、前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に混入している４－ヒドロキシアンチピリン濃度に依存し、４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が低ければｐＨ調整剤の濃度が低くても生体成分の測定感度低下を抑制でき、４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が高ければより高濃度のｐＨ調整剤を用いることが効果的であることから、本発明の生体成分測定感度低下抑制方法において、ｐＨ調整剤の濃度は混入している４－ヒドロキシアンチピリンの濃度に応じて適宜設定するのが好ましい。　

　本発明の生体成分の測定感度低下抑制方法は、前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に存在する４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が、ｐＨ調整剤を添加する前の濃度で、０．１～５０μｇ／ｍｌである場合に、特に効果を得られやすい。

　前記ｐＨ調整剤を添加する前の前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に存在する４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満の場合は、４－ヒドロキシアンチピリンによる生体成分の測定感度低下が１％以下であり、ｐＨ調整剤を共存させることにより測定感度低下を抑制する必要性が少ない。

　前記イオンを添加する前の前記（ｄ）の要件を満たす試薬中に存在する４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が５０μｇ／ｍｌより多い場合は、４－ヒドロキシアンチピリンによる生体成分の測定感度低下を抑制するためには高濃度のｐＨ調整剤を必要とし、そのためｐＨ調整剤による副反応により発色がやや大きくなる場合があり測定誤差を生じやすい傾向がある。

　本発明者らの検討により、一般的なアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）原薬には、０．００５～０．３０ｗ／ｗ％程度の４－ヒドロキシアンチピリンが混入していることが判明している。従って、本発明は、一例として０．０１～１００ｇ／ｌ程度のアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）を含む試薬、好ましくは０．０１～１０ｇ／ｌ程度のアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）を含む試薬、より好ましくは０．０１～５ｇ／ｌ程度のアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）を含む試薬に用いられるのが効果的である。

　なお、４－ヒドロキシアンチピリンの混入量が多い場合には、後述する４－ヒドロキシアンチピリンの除去方法などによって、予めアミノアンチピリン系化合物から４－ヒドロキシアンチピリンを除去してから生体成分測定に供することが好ましい。　

　（生体成分）

　本発明の生体成分測定試薬キットが測定対象とする生体成分は特に限定されず、各種の生体成分の測定に用いることができる。例えば、本発明の生体成分測定に用いられる生体成分は、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）とアイソザイム、ＡＬＰ（アルカリ性フォスファターゼ）とアイソザイム、ＣＫ（クレアチンキナーゼ）とアイソザイム、アミラーゼ（Ａｍｙ）とアイソザイム、リパーゼ、γ－ＧＴＰ（γ-グルタミルトランスペプチダーゼ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、クロール（Ｃｌ）、カルシウム（Ｃａ）、リン（Ｐ）〔無機リン（ＩＰ）〕、鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、総蛋白（ＴＰ）、血清蛋白分画（ＰＦ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、尿酸（ＵＡ）、ビリルビン（Ｂｉｌ）、アンモニア、コレステロール、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ、高密度リポタンパクコレステロール）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、低密度リポタンパクコレステロール）、中性脂肪（トリグリセリド）（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）、ＢＴＲ（ＢＴＲ、総分岐鎖アミノ酸/チロシン比）、チロシン測定試薬（ＴＹＲ）、血糖（ＢＳ、ＧＬＵ）、１,５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール（１，５－ＡＧ）、糖化アルブミン（ＧＡ）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。　

　これらの生体成分に任意の酸化酵素及び必要に応じて他の酵素（例えば、加水分解酵素）類を作用させて過酸化水素を発生させることができる。例えば、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、トリグリセライド（ＴＧ）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ） について、以下、生体成分測定の具体的な態様を説明する。　

　尿酸（ＵＡ）を測定する場合は、尿酸（ＵＡ）を基質とするウリカーゼ（酸化酵素）の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ－発色剤系により定量することができる。　

　クレアチニン（ＣＲＥ）を測定する場合は、クレアチニン（ＣＲＥ）を基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応においては過酸化水素を直接生じないので、クレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを予め試薬に添加したクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせ、さらに、サルコシンを予め試薬に添加したサルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ－発色剤系によるクレアチニン（ＣＲＥ）濃度の定量が可能になる。　

　トリグリセライド（ＴＧ）を測定する場合は、トリグリセライド（ＴＧ）を基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼ（酸化酵素）を用いて過酸化水素を生じさせることにより、ペルオキシダーゼ－発色剤系によるトリグリセライド（ＴＧ）濃度の定量が可能になる。　

　糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を測定する場合は、糖化ヘモグロビンを基質とする糖化ヘモグロビンオキシダーゼ（例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）の反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ－発色剤系において定量することができる。　

　このように、測定対象を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がなくても、酸化水素を発生することができる酸化酵素の基質に測定対象を変化させうる反応を触媒する酵素（何段階かの酵素反応を繋げてもよい。）と、前記酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。その他の生体成分を測定する場合であっても、上記と同様にして、当該分野で周知の方法により過酸化水素を発生させることができる。　

　上記で挙げた生体成分の中でも、クレアチニン（ＣＲＥ）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、生体成分の含有量が極めて少ないため、とりわけ高感度の測定が求められている。本発明によれば、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系の反応を阻害する４－ヒドロキシアンチピリンの影響を抑えて、生体成分測定の感度低下を抑制できるので、このように高感度の測定が求められる生体成分の測定に有益である。従って、本発明はクレアチニン、糖化ヘモグロビンの測定に好適であり、なかでも、クレアチニンの測定に好適に用いられる。　

　（生体成分測定キット）

　一つの実施態様において、本発明の生体成分測定キットは、前述のようなアミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含有する測定感度低下抑制剤を含む。

　更なる実施態様において、本発明の生体成分測定キットは、以下の（ａ）～（ｅ）の要件を満たし、以下の（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬としてなることを特徴とする。

（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

（ｄ）酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

（ｅ）（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含む。

　前記（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬は、先述のように、（ｄ）の要件を満たす試薬中に前記ｐＨ調整剤を添加することによって製造することができる。　

　本発明の生体成分測定キットは、（ｄ）及び（ｅ）の２つの要件を満たす一つの試薬が、製造後少なくとも１か月間を経過していることが好ましい。

　本発明者らは、４－ヒドロキシアンチピリンがペルオキシダーゼと反応し、その結果過酸化水素が消費されると推測しているが、この４－ヒドロキシアンチピリンの反応性を４－ヒドロキシアンチピリンにｐＨ調整剤を添加することにより抑制できることを本発明において見出した。

　この抑制反応の反応速度は、反応温度と反応時間が影響し得るが、当該生体成分測定キットの通常の保管条件では保管期間が数週間から１か月以上で抑制効果を生じることから、本発明の生体成分測定キットは製造後少なくとも１か月を経過していることが好ましい。

　なお、通常、かかる測定キットは製造後、在庫・流通のプロセスを経て使用されるまでには１カ月乃至は数カ月を要すると考えられ、その間に抑制反応は進行し本発明の効果は奏されることとなる。　

　（生体成分測定方法）

　本発明の生体成分測定方法は、先述の生体成分測定キットを用いて生体成分を測定することを特徴とする。　

　（生体成分測定キットの製造方法）

　本発明の生体成分測定キットの製造方法は、以下の（ａ）～（ｅ）の要件を満たす、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下が抑制された生体成分測定試薬キットの製造方法であって、（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬として製造することを特徴とする。

　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

　（ｅ）（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含有する。

　ここで、前記（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬として製造されることが好ましいこと、及び当該試薬が４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制するに十分な期間（例えば、約１か月以上）を経過したものとすることが好ましい理由については、先述の通りである。　

　本発明の生体成分測定キットの製造方法において、前記（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬については２つの要件を同時に満たす一つの試薬が、生体成分測定試薬キットの製造プロセスでの中間試薬であって、当該中間試薬を用いて製品試薬を調製してもよい。　

　上記の通り、本発明の生体成分測定キットは、（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に調整して４－ヒドロキシアンチピリンの反応性を抑制する必要があるが、この抑制反応は製品試薬として前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に調整することによって行なってもよいが、この抑制反応は必ずしも製品試薬中で行う必要はなく、例えばアミノアンチピリン系化合物を含有する試薬の調製過程において中間試薬などの状態でｐＨを８．０以上に調整し、その後抑制反応を行った後に、中間試薬を用いて製品試薬を製造して生体成分測定キットとして提供してもよい。

　上記でアミノアンチピリン系化合物を含有する試薬中間体とは、例えば、アミノアンチピリン系化合物を配合した試薬を製造する工程でアミノアンチピリン系化合物の原体を緩衝液などにより希釈し、アミノアンチピリン系化合物濃度として製品試薬の数倍乃至は数十倍程度の濃度に調整した中間試薬などを意味する。　

　本発明の生体成分の測定キットは、アミノアンチピリン系化合物を含有する中間試薬にｐＨ調整剤を添加して抑制反応を行う場合には、中間試薬にｐＨ調整剤を添加した後製品製造日までの期間と製品製造日から製品使用日までの期間の合計が、少なくとも１か月間であることが好ましい。　

　本発明において、前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に調整することにより、アミノアンチピリン系化合物の不純物として混入する４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度低下を抑制するものと推測する。

　上記で、生体成分測定の感度低下が抑制される理由に関しては定かではないが、ｐＨを８．０以上に調整することにより４－ヒドロキシアンチピリンに何らかの変化を生じ、その結果、４－ヒドロキシアンチピリンがペルオキシダーゼと反応することによる過酸化水素の消費が減少し、感度低下が抑制されるものと考えられる。ここにおいて、前記４－ヒドロキシアンチピリンの変化は不可逆的であると予想され、一旦変性して無害化された４－ヒドロキシアンチピリンは通常の生体成分測定キットの保管条件では感度低下を生じないと推測される。

　このため、前記中間試薬のｐＨを８．０以上に調製した場合などには、その後製品試薬を製造する段階においてｐＨを８．０以下に調整して製造することが可能と考えられるが、このような製品試薬を用いて製造した生体成分の測定試薬キットやその製造方法も本発明の範囲内である。　

　本発明では、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法での生体成分測定において、発色剤として用いるアミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上にすることを特徴としている。このように当該試薬のｐＨを８．０以上に調整する手段としては、後述で説明するように、塩基性を示す任意の化合物をｐＨ調整成分として利用すること可能であるが、この手段に限定されない。４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下をより効果的に抑制し試薬成分の品質劣化を防ぐという観点から、当該試薬のｐＨは、ｐＨ８．０～ｐＨ１２に調整することが好ましく、ｐＨ８．０～ｐＨ１１に調整することがより好ましい。　

　本発明に用いるｐＨ調整剤としては、特に限定されず、アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整できる任意の成分が用いられうる。

　このようなｐＨ調整剤としては、例えば、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ〔略称：Ｔｒｉｃｉｎｅ〕）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ〔略称：Ｂｉｃｉｎｅ〕）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＴＡＰＳ〕）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＣＨＥＳ〕）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＣＡＰＳ〕）、Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＣＡＰＳＯ〕）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＢＥＳ〕）、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（３－［Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＤＩＰＳＯ〕）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＥＰＰＳ〕）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（２－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＨＥＰＥＳ〕）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸ナトリウム塩（Ｓｏｄｉｕｍ２－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ〔略称：ＨＥＰＥＳ－Ｎａ〕）、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸・一水和物ｐ（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ〔略称：ＨＥＰＰＳＯ〕）、２－モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ〔略称：ＭＥＳ〕）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（３－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＭＯＰＳ〕）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＭＯＰＳＯ〕）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）・二水和物（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ），ｄｉｈｙｄｒａｔｅ〔略称：ＰＯＰＳＯ〕）、２－ヒドロキシ－Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＴＡＰＳＯ〕）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＴＥＳ〕）等の双性イオン構造を有する化合物（好ましくは、グッド緩衝剤）：アルカノールアミン：リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩等を挙げることができるがこれらに限定されない。ｐＨ調整剤として、グッド緩衝剤を用いる場合には、０．１Ｍのグッド緩衝剤水溶液に０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を適量添加しｐＨを８．０以上に調整して用いられてもよい。これらのｐＨ調整剤は、例えば、測定対象となる生体成分や生体試料等に応じて適宜選択することができる。

　本発明に用いるｐＨ調整剤としては、前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上に安定して調整して高い効果が得られ易いという観点から、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ〔略称：Ｔｒｉｃｉｎｅ〕）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ〔略称：Ｂｉｃｉｎｅ〕）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＴＡＰＳ〕）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＣＨＥＳ〕）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＣＡＰＳ〕）、Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ〔略称：ＣＡＰＳＯ〕）等の双性イオン構造を有する化合物（グッド緩衝剤）やリン酸水素二ナトリウムが好適に用いられる。　

　本発明に用いるｐＨ調整剤は、アミノアンチピリン系化合物と共に配合した後に、アミノアンチピリン系化合物の不純物として含有される４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分測定の感度低下を抑制する効果を発現するためには、配合した後に一定時間の経過させることが好ましい。

　本発明に用いるｐＨ調整剤が４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分測定の感度低下を抑制する効果を発現するためには、保管温度が１℃～１０℃では２週間乃至はそれ以上、１１℃～２５℃では１週間乃至はそれ以上、２６℃～４０℃では２日間乃至はそれ以上、４１℃～６０℃では５時間乃至はそれ以上、６１℃～８０℃では１時間乃至はそれ以上が好ましく、保管温度に依存して温度が高いほど短く、温度が低いほど長い時間が必要となる。反応させる時間の上限は特に限定されないが、例えば、１０年間以下とすることができる。

　なお、経過時間の上限を超えても、生体成分測定キットに用いる試薬品質の劣化を生じない限り、本発明に用いるｐＨ調整剤が４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分測定の感度低下を抑制する効果は維持される。　

　上記において、一般的な生体成分測定キットの製品ライフサイクルにおいては、生産工程において試薬配合され、品質試験、出荷、流通、保管、使用されるまでに約数週間乃至は１カ月以上を要するため、本発明のｐＨ調整剤をアミノアンチピリン系化合物と共存させた試薬を含む測定キットは、使用される段階においては、本発明に用いるｐＨ調整剤による感度低下抑制効果が発現され維持された状態になるが、製品ライフサイクルが短くなった場合などは、製造のプロセス管理や出荷時の製品管理等により調製することが可能である。　

　（酸化酵素）

　本発明に用いる酸化酵素は、基質から過酸化水素を発生させることができるものであれば、目的となる測定対象に応じて制限なく用いることができる。具体例としては、ウリカーゼ、サルコシンオキシダーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等を用いることができるが、これらに限定されない。市販品としては、ＵＡＯ－２１１（東洋紡製）、ＳＡＯ－３５１（東洋紡製）、Ｇ３Ｏ－３１１（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。　

　（ペルオキシダーゼ）

　本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ－１３１（東洋紡製）、ＰＥＯ－３０１（東洋紡製）、ＰＥＯ－３０２（東洋紡製）等が好適に用いられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。　

　ペルオキシダーゼ活性は、以下の方法で定義する。

　蒸留水１４ｍＬ、５％（Ｗ／Ｖ）ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始する。

　２０秒間反応を行った後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出する。

　抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。

　一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍＬを順次混合した後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。

　この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。

　ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出する。

　上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。

　ペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ－ＯＤｂｌａｎｋ）×希釈倍率}／｛０．１１７×１（ｍＬ））＝ΔＯＤ×８．５４７×希釈倍率

　ペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）＝ペルオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）×１／Ｃ

０．１１７　：１ｍｇ％　プルプロガリンエーテル溶液の４２０ｎｍにおける吸光度

Ｃ　：溶解時の酵素濃度（ｃ　ｍｇ／ｍＬ）

　（１プロプルガリン単位は１３．５国際単位（ｏ－ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅを基質とし、２５℃の反応条件下）に相当する。）　

　なお、上記測定において、サンプル溶液は、予め氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、同緩衝液で３．０～６．０プルプロガリン単位（Ｕ）／ｍＬになるよう希釈して測定に供することが好ましい。　

　（酸化還元発色試薬）

　本発明の生体成分測定に用いられる酸化還元発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラーの組合せが挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。　

　水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。　

　（水素供与体）

　本発明の生体成分測定法においては、トリンダー法などに用いる水素供与体として、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体などが用いられる。　

　たとえば、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－スルホプロピルアニリン、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－２，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。　

　（カップラー）

　これら水素供与体はカップラーと組合せて用いることができる。　

　カップラーとしては、４－アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体等のアミノアンチピリン系化合物；バニリンジアミンスルホン酸等のバニリンジアミンスルホン酸系化合物；メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等のメチルベンズチアゾリノンヒドラゾン系化合物などを挙げることができる。　

　本発明は、アミノアンチピリン系化合物に含まれる極微量の４－ヒドロキシアンチピリンにより引き起こされる生体成分測定試薬キットの感度低下を抑制することができるので、アミノアンチピリン系化合物をカップラーとして用いる場合に効果的である。とりわけ、本発明は、４－アミノアンチピリンをカップラーとして用いる場合に有益である。

　本発明に用いるカップラーは、２種以上のアミノアンチピリン系化合物であってもよいし、アミノアンチピリン系化合物に加えて他のカップラーを組み合わせて用いてもよいが、好ましくは１種のアミノアンチピリン系化合物を用いるのがよく、より好ましくは４－アミノアンチピリンを用いるのがよい。　

　本発明に用いるアミノアンチピリン系化合物の使用量は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。アミノアンチピリン系化合物には、感度低下を生じさせる４－ヒドロキシアンチピリンが極微量に含まれる場合があり、４－ヒドロキシアンチピリンの量を低減させることが望まれるが、本発明によれば、ｐＨ８．０以上に調整するｐＨ調整剤を共存させることで、４－ヒドロキシアンチピリンを多少含んでいても感度低下を抑制できる。このような観点から、一例として、ｐＨ調整剤と共存させる前のアミノアンチピリン系化合物を含有する試薬中に混入する４－ヒドロキシアンチピリンの濃度を、好ましくは０．１～５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３～２０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは１～１０μｇ／ｍｌとなるように生体成分測定に用いるアミノアンチピリン系化合物の使用量を調製して用いるのが効果的である。

　４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が上記範囲を下回る場合は、４－ヒドロキシアンチピリンによる生体成分の測定感度低下の影響が少なく、ｐＨ調整剤を共存させることによる測定感度低下の抑制する必要性が少ない。

　４－ヒドロキシアンチピリンの濃度が上記範囲を上回る場合は、４－ヒドロキシアンチピリンによる生体成分の測定感度低下を抑制するためには高濃度のｐＨ調整剤を必要とし、そのためｐＨ調整剤による発色副反応を生じる場合があり、生体成分の測定精度が低下しやすい傾向がある。

　なお、４－ヒドロキシアンチピリンの混入量が多い場合には、後述する４－ヒドロキシアンチピリンの除去方法などによって、予めアミノアンチピリン系化合物に混入する４－ヒドロキシアンチピリンを除去してから生体成分測定に供することが好ましい。

　一般的なアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）における４－ヒドロキシアンチピリン混入量を考慮すると、本発明は、一例として０．０１～１００ｇ／ｌ程度のアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）を含む試薬、好ましくは０．０１～１０ｇ／ｌ程度のアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）を含む試薬、より好ましくは０．０１～５ｇ／ｌ程度のアミノアンチピリン系化合物（４－アミノアンチピリン）を含む試薬に用いることが効果的である。

　このような範囲でアミノアンチピリン系化合物を用いることにより、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。　

　（４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法）

　アミノアンチピリン系化合物中の４－ヒドロキシアンチピリンの含有量は、例えば、高速液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣ法ともいう）、ガスクロマトグラフ法（以下、ＧＣ法ともいう）、質量分析法（以下、ＭＳ法ともいう）、核磁気共鳴法（以下、ＮＭＲ法ともいう）などの定量方法を単独で、又は任意に組み合わせて行うことにより測定することができる。特に制限されるものではないが、操作の簡便性やシステム・設備などの経済性の観点から、ＨＰＬＣ法が好ましく用いられる。ＨＰＬＣ法のカラムとしては、逆相カラムが好ましく、逆相カラムがシリカベースの多孔質カラムであればより好ましい。　

　以下、ＨＰＬＣ法の具体的な態様例を説明する。本明細書では、４－ヒドロキシアンチピリンは以下のＨＰＬＣ法の条件により定量した。

（１）カラム Ｉｍｔａｋｔ Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ－Ｃ１８　２．０×１５０ｍｍ

（２）移動相　Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：メタノール

（３）グラジエント条件

　０ｍｉｎ（Ａ９５％、Ｂ５％）－（この間リニアグラジエント）－１５ｍｉｎ（Ａ２％、Ｂ９８％）－２５ｍｉｎ（Ａ２％、Ｂ９８％）

（４）流速　０．２ｍＬ／ｍｉｎ

（５）カラム温度　４０℃

（６）試料注入量　５μＬ

（７）検出波長　ＵＶ２５０ｎｍ

　濃度既知の４ＨＡ（シグマ社）のものを標準品として使用し、測定試料とのＨＰＬＣのフラクションピークの検出位置の一致を確認した。また、測定試料とのフラクションピークの面積を比較して定量を行った。シグマ社の４ＨＡ（４－Ｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）としてはＣａｓ．ＮＯ．１６７２－６３－５、製品番号１０９４２８－５Ｇ、純度９９％の製品を用いた。

　本発明では、４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法として上記の方法を用いることが好ましい。　

　（４－ヒドロキシアンチピリン）

　４－ヒドロキシアンチピリンは、４－アミノアンチピリンの４位のアミノ基が水酸基に変換された構造であり、４－アミノアンチピリンの製造工程で生成混入した副産物と考えられる。　

　４－ヒドロキシアンチピリンは、混入量が極僅かであっても、生体成分測定法での発色反応において呈色反応に多大な影響を及ぼすことが、本発明者らの検討により明らかとなっている。この現象は、本来カップラーとして反応させることを意図していたアミノアンチピリン系化合物（例えば、４－アミノアンチピリン）よりも、４－ヒドロキシアンチピリンの反応速度が早く過酸化水素を消費させることが原因であると推察される。　

　本発明の生体成分測定試薬キットでは、４－ヒドロキシアンチピリンを含み得るアミノアンチピリン系化合物の原薬をそのまま用いてもよいし、アミノアンチピリン系化合物の原薬の中から４－ヒドロキシアンチピリン含量が低いものを定量して選別したものを用いてもよいし、アミノアンチピリン系化合物の原薬において４－ヒドロキシアンチピリンを除去するなどして４－ヒドロキシアンチピリン含量を低減させたものを選別して用いてもよい。　

　アミノアンチピリン系化合物から４－ヒドロキシアンチピリン含量を低減させる方法には特に制限がない。例えば、生体成分測定試薬からＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーを用いる方法、水や溶媒に溶解した後、樹脂などの吸着材に４－ヒドロキシアンチピリンを吸着させて除去する方法などの当該分野で周知の任意の手段を用いて分離・除去を行えばよい。

　アミノアンチピリン系化合物から４－ヒドロキシアンチピリンを除去する手段として、クロマトグラフィーを用いる場合、その分離の物理化学的原理は特に限定されない。例えば、分配（順相・逆相）、吸着、分子排斥、イオン交換などの諸原理が挙げられる。リガンドを結合させた樹脂や吸着材に吸着させる方法などにより分離を行えばよい。　

　前記の４－ヒドロキシアンチピリン除去手段として、一般的な逆相クロマトグラフィーを用いることが出来る。逆相クロマトグラフィーの担体は特に限定されない。例えばシリカゲルが好適であるがポリマー系の担体でも良い。シリカゲルを担体として使用する場合はエンドキャップ処理をしたもの、及びしないものも選択できる。また、クロマトグラフィー装置は、低圧、中圧、高圧のいずれのクロマトグラフィーシステムであっても条件を目的に合わせて適正に調製することにより使用可能である。

　クロマトグラフィー担体に結合するリガンドの種類も特に限定されない。リガンドは汎用されているオクタデシル基（ＯＤＳ）の他、フェニル基、オクチル基も条件を適正化することで選択することが出来る。リガンドの結合は、モノメリックでもポリメリックでも良い。いずれの充填剤であっても分離条件を適正化することで使用可能である。

　クロマトグラフィーの移動相は水と、メタノールまたはアセトニトリルのような水溶性の溶剤を使用すれば良く、シリカゲルのシラノール基とのイオン的相互作用を回避するため常法に従いクロマトグラフィー移動相のｐＨを酸性側に調製、またはイオンペア試薬を微量添加しても良い。

　移動相の流速は、使用するシステムの能力によって最適化すればよい。また、リニアグラジエントではなく、ステップワイズで溶出させ分離してもよい。　

　（その他の成分等）

　本発明の生体成分測定試薬キットには、緩衝液成分を含有する試薬を含むことが好ましい。また、本発明の生体成分測定試薬キットに含まれる試薬には、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。　

　本発明の生体成分測定試薬に含有させることができる緩衝液成分としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。その使用量や設定ｐＨ、添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。

　ＧＯＯＤ緩衝液としては、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。　

　本発明の生体成分測定試薬において、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などの使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。　

　防腐剤としては、プロクリン１５０、プロクリン２００、プロクリン３００、プロクリン９５０、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。　

　キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。　

　抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。　

　抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。　　　　

　塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。　

　酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。　

　色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。　

　本発明の生体成分測定試薬キットに含まれる試薬は任意の溶媒（例えば、精製水、有機溶媒等）に溶解された液状試薬であってもよいし、使用前に上記と同様の溶媒で溶解して用いられる乾燥粉末状試薬（例えば、凍結乾燥粉末）等であってもよい。　

　（生体成分測定試薬キットを用いた測定方法）

　本発明の生体成分測定キットを用いて生体成分を測定する場合、汎用の自動分析機（例えば、日立７１８０形自動分析機）を用いることができる。本発明の生体成分測定キットは、このような自動分析機に適用できるよう構成されたものであってもよい。その態様は特に限定されず、例えば、液状試薬で構成されたキット、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥試薬と溶解液の組み合わせで構成されたキット、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステムなどと呼ばれるキットやセンサを用いる形態のキットなど種々の形態が例示できる。　

　本発明の生体成分測定キットの構成として、試薬が１つで構成されたキット、また試薬が分包されて２乃至３以上で構成されたキットが用いられる。試薬を分包して２以上の試薬で構成されたキットとする場合、例えば、（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素及び（ｃ）酸化還元発色試薬のうちの水素供与体を含む試薬と、（ｂ）ペルオキシダーゼ及び（ｄ）酸化還元発色色素のうちのカップラーとしての４－アミノアンチピリンを含む試薬に分包してキットを構成させてもよい。　

　以下、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する）で構成されたキットの形態を例について説明する。　

　この形態の試薬を用いて自動分析機で分析する方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第二試薬またはＲ２とも記載する）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することができる。　

　なお、本発明の生体成分測定試薬を、例えば前記のように自動分析機への適用を考慮して２つ以上に分包して供給する場合、各分包試薬中のｐＨ調整剤濃度やその他の成分の濃度が、前記の各成分の好ましい濃度の範囲内であるか否かが判定される。　

　（生体成分測定方法）

　本発明が対象とする生体成分測定方法は、以下の（１）～（３）の工程を含む。

（１）生体成分に酸化酵素を作用させ、過酸化水素を発生させる工程、

（２）工程（１）で発生させた過酸化水素が、ペルオキシダーゼを共存させることによりペルオキシダーゼが作用することにより、４－アミノアンチピリンと酸化還元発色試薬を酸化縮合することにより反応液を呈色させる工程、

（３）工程（２）で呈色した反応産物を比色定量する工程。

　本発明の生体成分測定方法は、酵素法による生体成分測定方法であって、特に酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による方法であり、すなわち検体中の生体成分を酵素反応させることにより生体成分の量に応じた過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて生じた発色を比色定量することを測定原理とするものである。

　この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されるものではない。　

　本発明者らは、アミノアンチピリン系化合物（特に、４－アミノアンチピリン）の原薬中に極微量に含まれる４－ヒドロキシアンチピリンが、この酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系の反応を阻害し、感度低下を招くことを初めて見出した。４－ヒドロキシアンチピリンが上記反応を阻害するメカニズムは必ずしも明らかではないが、その構造から、ペルオキシダーゼの作用により過酸化水素存在下、酸化還元発色試薬と４－ヒドロキシアンチピリンが縮合反応を起こし、過酸化水素を消費してしまうことが推察される。そして、本発明者らは、このような４－ヒドロキシアンチピリンに起因する反応阻害が、予め４－ヒドロキシアンチピリンにｐＨ調整剤を共存させて反応させることにより抑えられ、感度低下を抑制できることを見出した。ｐＨ調整剤が４－ヒドロキシアンチピリンによる感度低下を抑制するメカニズムも明らかではないが、ｐＨ調整剤により４－ヒドロキシアンチピリンが何らかの構造変化を生じペルオキシダーゼと反応しにくくなり過酸化水素を消費しなくなることが推察される。　

　（検体）

　本発明の生体成分測定に用いられる生体成分を含有する検体としては、例えば、血液（特に、血清や血漿など）、尿、腹水、髄液などの生体の体液や、飲料、食品などの人が摂取するものなどが挙げられる。なかでもヒトの体液（血清、血漿等の血液に由来する試料や、尿に由来する試料等）を測定対象の検体とすることが好ましい。　

　（生体成分測定試薬キットの検出感度）

　本発明は、ｐＨ調整剤を用いることにより、ｐＨ調整剤を用いない場合に比べて、酸化酵素－ペルオキシダーゼ－発色剤系による酵素法での生体成分測定において、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する検出感度の低下を抑制することができる。

　以下、生体成分としてクレアチニンを一例として、生体成分測定試薬キットの検出感度について説明する。　

　近年、ｅＧＦＲ（推算糸球体濾過量ともいう）の算出には小数点下二桁までのクレアチニンの測定精度が求められており、最少検出感度としてはクレアチニン濃度で０．０３ｍｇ／ｄＬ程度が要求されている。　

　一方、自動分析機の測定精度として、クレアチニン試薬のブランクの変動はσ＝０．０４５～０．１１４ｍＡＢＳ程度であり、一般的に体外診断薬の最小検出感度とされる２．６σ（９９．５％正規分布）は０．１１７～０．２９６ｍＡＢＳ程度となる。

　従って、２．６σの最大値の０．２９６ｍＡＢＳ、つまり約０．３ｍＡＢＳ以上の吸光度があればシグナルとして検出可能であり、クレアチニンの存否判断やクレアチニンの定量が可能になると考えられる。　

　本発明によれば、ｐＨ調整剤を用いることにより、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分測定試薬キットの感度低下を抑制し、上記のようなレベルまで検出感度を高めることが可能となる。　

　なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて又は変更若しくは置き換えて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

　以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。　

（実施例１）４ＨＡのＨＰＬＣによる分離

　試薬感度低下度合いは４ＡＡのロット差に起因することを見出したため、４ＡＡ中に極微量に含まれる不純物の含有量がロットごとに異なると推測し、前記の４ＨＡの定量法（ＨＰＬＣ法）で不純物の検出を行った。なお、ロット差の検討に使用した４ＡＡの純度はＪＩＳ－Ｋ８０４８にて９８．０％以上のものを使用した。　

　４ＡＡを分析した場合のＨＰＬＣフラクションを図１に示す。図１において、グラフ横軸の溶出時間が７～８分付近に認められる大きなピークが、４－アミノアンチピリンのピークである。今回のＨＰＬＣフラクションでは、図１に示されるように、４－アミノアンチピリン以外に、３種類の不純物を確認した。　

（実施例２）４ＨＡの同定

　実施例１の図１で見られた３種類の不純物（ａ、ｂ、ｃ）について各ロットの含有量を検討したところ、不純物ｂのみロットごとに含有量が大きく異なることがわかった。そこで、これら３種類の物質について質量分析（ＭＳスペクトル法）にて分子量および構造を解析した。　

　その結果、不純物ｂは４－ヒドロキシアンチピリン（４ＨＡ）であると同定された。図２に４ＨＡの構造式を示す。　

　濃度既知の４ＨＡ（シグマ社）を標準品として用い、実施例１と同条件でＨＰＬＣを実施したところ、４ＨＡと不純物ｂのフラクションピークは一致した。　

（実施例３）クレアチニン測定感度に及ぼす４ＨＡの混入濃度依存性

　生体成分としてクレアチニンを用いて、試薬中に混入した４ＨＡに起因する測定感度低下に関して、４ＨＡの混入量依存性を評価した。

　下記のクレアチニン測定試薬の第二試薬に、４ＨＡを試薬中終濃度で０．１３～８．７５μｇ／ｍｌとなるように添加し各々の測定試薬を調製した。生体成分試料として、５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液を用いた。　

［試薬の調製］

　下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。ここで、４－アミノアンチピリンは、市販の４－アミノアンチピリン原体を精製し、４－ヒドロキシアンチピリンを含まない４－アミノアンチピリンを製造し、用いた。

第一試薬

ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４

アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１） ３Ｕ／ｍＬ

ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製ＳＡＯ－３５１） １０Ｕ／ｍＬ

クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製ＣＲＨ－２２９） ４０Ｕ／ｍＬ

カタラーゼ（東洋紡製ＣＡＯ－５０９） １３０Ｕ／ｍＬ

Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン ０．１４ｇ／Ｌ

第二試薬

ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．４

クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡製ＣＮＨ－３１１） ４００Ｕ／ｍＬ

ペルオキシダーゼ（東洋紡製ＰＥＯ－３０２） １０Ｕ／ｍＬ

４－アミノアンチピリン　０．６ｇ／Ｌ

［測定法］

　日立７１８０形自動分析機を用いた。試料２．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度（主波長）および８００ｎｍにおける吸光度（副波長）を測定した。主波長から副波長を引いた吸光度を算出して求めた。

　なお、本測定条件での４ＨＡの反応中の濃度は０．０３～２．１４μｇ／ｍｌとなる。　

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

　結果を表１および図３に示す。第２試薬中の４ＨＡ濃度が高くなるにしたがって、試料測定感度が低下することを確認した。　

（実施例４）ｐＨ調整剤による感度低下抑制効果

　Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅについて、４ＨＡに起因する感度低下の抑制効果を確認した。

　実験条件は、対照（ａ）以外の試薬について、クレアチニン測定試薬の第二試薬に４ＨＡを試薬中終濃度として１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、生体成分試料として５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン水溶液を用いた以外は、実施例３と同一条件にて行った。

　各種ｐＨ調整剤を所定濃度となるようにクレアチニン測定試薬の第二試薬にＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨの代わりに添加した後、それぞれ加速試験（３５℃）の温度条件で３日間保存した第二試薬を用いて、測定感度（ｍＡＢＳ）を調べた。各試薬のブランク値も同時に測定し、測定感度からブランク値を差し引いた値をＳＴＤ感度として算出した。そして、４ＨＡを添加していない対照（ａ）の測定感度（ｍＡＢＳ）に対する各試薬の測定感度（ｍＡＢＳ）の比率〔vs対照（％）〕を算出した。また、試験に用いた各第二試薬のｐＨを実測した。

　結果を表２に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

　この結果から、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅを共存させてｐＨ８．０以上に調整することにより、４ＨＡに起因する感度低下を効果的に抑制できることを確認した。ここで、３５℃での評価は、冷蔵保存条件の加速試験に相当する。従って、冷蔵条件であっても、長期間にわたってｐＨ８．０以上の条件下で反応させることで、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下を抑制できることが推察される。　

（実施例５）別のｐＨ調整剤による感度低下抑制効果

　ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、リン酸水素二ナトリウムについて、濃度やｐＨを調製し、４ＨＡに起因する感度低下の抑制効果を確認した。

　実験条件は、対照（ａ）以外の試薬について、クレアチニン測定試薬の第二試薬に４ＨＡを試薬中終濃度として１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、生体成分試料として５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン水溶液を用いた以外は、実施例３と同一条件にて行った。

　各種ｐＨ調整剤を所定濃度となるようにクレアチニン測定試薬の第二試薬に添加した後、それぞれ加速試験（３５℃）の温度条件で３日間保存した第二試薬を用いて、測定感度（ｍＡＢＳ）を調べた。各試薬のブランク値も同時に測定し、測定感度からブランク値を差し引いた値をＳＴＤ感度として算出した。そして、４ＨＡを添加していない対照（ａ）の測定感度（ｍＡＢＳ）に対する各試薬の測定感度（ｍＡＢＳ）の比率〔vs対照（％）〕を算出した。また、試験に用いた各第二試薬のｐＨを実測した。

　結果を表３に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

　この結果から、これらの成分を用いた場合であっても、てｐＨ８．０以上に調整する限り４ＨＡに起因する感度低下を抑制できることが確認された。

　なお、リン酸水素二ナトリウム０．７ｍＭでは十分な抑制効果が認められなかったが、この場合、ｐＨ調整剤の濃度が１ｍＭ未満で、ｐＨも７．９４と低いことが一因と考えられた。　

（実施例６）感度低下抑制効果に及ぼすｐＨ調整剤の濃度依存性

　ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳについて、調整剤の濃度を１０ｍＭ～１００ｍＭに変化させて、４ＨＡに起因する感度低下の抑制効果を確認した。

　実験条件は、対照（ａ）以外の試薬について、クレアチニン測定試薬の第二試薬に４ＨＡを試薬中終濃度として１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、生体成分試料として５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン水溶液を用いた以外は、実施例３と同一条件にて行った。

　各種ｐＨ調整剤を所定濃度となるようにクレアチニン測定試薬の第二試薬にＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨの代わりに添加した後、それぞれ加速試験（３５℃）の温度条件で３日間保存した第二試薬を用いて、測定感度（ｍＡＢＳ）を調べた。各試薬のブランク値も同時に測定し、測定感度からブランク値を差し引いた値をＳＴＤ感度として算出した。そして、４ＨＡを添加していない対照（ａ）の測定感度（ｍＡＢＳ）に対する各試薬の測定感度（ｍＡＢＳ）の比率〔vs対照（％）〕を算出した。また、試験に用いた各第二試薬のｐＨを実測した。

　結果を表４に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

　この結果から、これらのｐＨ調整剤を用いた場合、実験条件の濃度範囲ではいずれの濃度であっても、ｐＨ８．０以上である限り、４ＨＡに起因する感度低下を抑制できることが確認された。　

（比較例）ｐＨ８．０未満の場合の感度低下抑制効果

　ｐＨを８．０未満に調整した場合の４ＨＡに起因する感度低下の抑制効果を確認した。

　実験条件は、対照（ａ）以外の試薬について、クレアチニン測定試薬の第二試薬に４ＨＡを試薬中終濃度として１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、生体成分試料として５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン水溶液を用いた以外は、実施例３と同一条件にて行った。

　各種ｐＨ調整剤を所定濃度となるようにクレアチニン測定試薬の第二試薬にＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨの代わりに添加した後、それぞれ加速試験（３５℃）の温度条件で３日間保存した第二試薬を用いて、測定感度（ｍＡＢＳ）を調べた。各試薬のブランク値も同時に測定し、測定感度からブランク値を差し引いた値をＳＴＤ感度として算出した。そして、４ＨＡを添加していない対照（ａ）の測定感度（ｍＡＢＳ）に対する各試薬の測定感度（ｍＡＢＳ）の比率〔vs対照（％）〕を算出した。また、試験に用いた各第二試薬のｐＨを実測した。

　結果を表５に示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

　この結果から、ｐＨ８．０未満である場合には、４ＨＡに起因する感度低下の抑制効果が殆ど認められないことが確認された。

　生体成分を酸化還元反応を利用して測定する測定方法、および、該方法に用いる試薬や組成物に適用できる。

Claims (14)


  1. 　酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制剤であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を含有することを特徴とする、生体成分の測定感度低下抑制剤。

  2. 　前記生体成分測定法が以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法であって、（ｄ）の要件を満たす試薬中に添加して用いることを特徴とする、請求項１に記載の生体成分の測定感度低下抑制剤。

    　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

    　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

    　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

    　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

  3. 　４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制することを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体成分の測定感度低下抑制剤。

  4. 　酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定法に適用される測定感度低下抑制方法であって、前記アミノアンチピリン系化合物を含有する試薬のｐＨを８．０以上に調整するｐＨ調整剤を用いることを特徴とする、生体成分の測定感度低下の抑制方法。

  5. 　以下の（ａ）～（ｄ）の要件を満たす試薬又は試薬セットを使用する生体成分測定法における測定感度低下の抑制方法であって、（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にすることを特徴とする、生体成分の測定感度低下の抑制方法

    　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

    　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

    　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

    　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

  6. 　４－ヒドロキシアンチピリンに起因する生体成分の測定感度の低下を抑制することを特徴とする、請求項４又は５に記載の生体成分の測定感度低下の抑制方法。

  7. 　前記（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤の濃度が１～５０００ｍＭであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の生体成分の測定感度低下の抑制方法。

  8. 　前記生体成分が、クレアチニン又は糖化ヘモグロビンのいずれかであることを特徴とする、請求項４乃至は７のいずれかに記載の生体成分の測定感度低下の抑制方法。

  9. 　酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を用いる生体成分測定試薬キットであって、請求項１に記載の測定感度低下抑制剤を含むことを特徴とする、生体成分測定試薬キット。

  10. 　以下の（ａ）～（ｅ）の要件を満たす生体成分測定試薬キットであって、（ｄ）及び（ｅ）要件を満たす試薬については２つの要件を同時に満たす一つの試薬としてなることを特徴とする、生体成分測定試薬キット。

    　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

    　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

    　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

    　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

    　（ｅ）（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤を含む。

  11. 　前記（ｄ）及び（ｅ）の２つの要件を同時に満たす一つの試薬が、製造後少なくとも１か月間を経過していることを特徴とする、請求項１０に記載の生体成分測定試薬キット。

  12. 　請求項９乃至は１１のいずれかに記載の生体成分測定キットを用いることを特徴とする生体成分測定方法。

  13. 　以下の（ａ）～（ｅ）の要件を満たす、４－ヒドロキシアンチピリンに起因する感度低下が抑制された生体成分測定試薬キットの製造方法であって、（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬として製造することを特徴とする、生体成分測定試薬キットの製造方法。

    　（ａ）過酸化水素を発生させることができる酸化酵素を含む。

    　（ｂ）ペルオキシダーゼを含む。

    　（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬を含む。

    　（ｄ）該酸化還元発色試薬のカップラーとしてアミノアンチピリン系化合物を含む。

    　（ｅ）（ｄ）の要件を満たす試薬のｐＨを８．０以上にするｐＨ調整剤を含む。

  14. 　前記（ｄ）及び（ｅ）の要件を満たす試薬について２つの要件を同時に満たす一つの試薬が、生体成分測定試薬キットの製造プロセスでの中間試薬であることを特徴とする、請求項１３に記載の生体成分測定試薬キットの製造方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55131400A (en) * 1979-01-31 1980-10-13 Millipore Corp Quantitative analysing reagent and method of hydrogen peroxide
JPS5783297A (en) * 1980-11-10 1982-05-25 Toyobo Co Ltd Determination of creatinine and creatine
JPS6188153A (ja) * 1984-09-13 1986-05-06 Wako Pure Chem Ind Ltd 生体微量成分の定量法
JPS6246260A (ja) * 1985-08-26 1987-02-28 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 多層分析素子
JPH11504808A (ja) * 1995-05-05 1999-05-11 ジェンザイム・リミテッド 糖化タンパク質の測定

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55131400A (en) * 1979-01-31 1980-10-13 Millipore Corp Quantitative analysing reagent and method of hydrogen peroxide
JPS5783297A (en) * 1980-11-10 1982-05-25 Toyobo Co Ltd Determination of creatinine and creatine
JPS6188153A (ja) * 1984-09-13 1986-05-06 Wako Pure Chem Ind Ltd 生体微量成分の定量法
JPS6246260A (ja) * 1985-08-26 1987-02-28 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 多層分析素子
JPH11504808A (ja) * 1995-05-05 1999-05-11 ジェンザイム・リミテッド 糖化タンパク質の測定

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