JPS584918B2 - グルタメ−ト−オキザロアセテ−ト−トランスアミナ−ゼ及びグルタメ−ト−ピルベ−ト−トランスアミナ−ゼの測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素、グルタメートーオキザロアセテートー
トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）及びグルタメートーピル
ベートートランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の活性を測定す
るための方法に関する。

この方法は生物学的液体、例えば血清、尿中の又は他の
物質中の前記酵素の測定に好適である。

血漿、血清、組織及び他の生物学的物質中の前記トラン
スアミラーゼの測定が診断上非常に重要であるというこ
とはすでに公知である。

例えば、肝臓疾患、心臓疾患及び筋肉疾患の診断及び鑑
別診断において、この測定は相応する文献（例えばＨ．
Ｕ． Ｂｅｒｇｍｙｅｒ ， Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄ
ｅｒ ｅｎｚｙｍａ−ｔ ｉ ｓｃｈｅｎ Ａｎａ ｌ
ｙｓｅ ，第３改訂、１９７４年、ｖｅ ｒ ｌ ａｇ
Ｃｈｅｍｉ ｅ社、パインハイム在、第１巻、第６〜
７４頁参照）からわかるように、１９５５年以来導入さ
れ、今日まで異論はない。

従って、ＧＯＴ及びＧＰＴの種々の測定法が記載されて
いるが、しかしこれらはすべて欠点を有する。

前記のトランスアミナーゼは次の反応を接触する： ａ）ＧＰＴ ｂ） ＧＯＴ この酵素の測定のためにはすでに多数の方法が公知であ
る。

例えばヘンリー（Ｋ． Ｓ． Ｈｅｎｌｅｙ ）及びポ
ラード（Ｈ． Ｍ． Ｐｏｌｌ ａｒｄ） （Ｊ． Ｌ
ａｂ．ＣＩ ｉｎ． Ｍｅｄ−、第４６巻（１９５５年
）第７８５〜７８９頁）は、次のＧＰＴ活性の測定に関
して記載している：反応１）をアラニン及びα−ケトグ
ルタレート（α−ＫＧ）を用いて実施し、ピルベートの
形成を次のように測定する： ＬＤＨ−ラクテートデヒドロゲナーゼ ３ ６ ５ｍｍにおける紫外線中で測定した、１分間当
りのＮＡＤＨ吸光度の減少が測定信号である。

ＧＯＴに関する類似の試験はカーメン（ Ａ． Ｋａ
ｒ −ｍｅｎ） （Ｊ． ＣＩ ｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ
．第３４巻（１９５５年）第１３１〜１３３頁）により
記載されている。

この場合は、反応式２）により生成したオキザロアセテ
ート（ＯＡＡ ）を次のように測定している：紫外線中
の３ ６ ５ｍｍで測定した、１分当りのＮＡＤＨ吸光
度の減少が測定信号である。

ＧＰＴの検出にもＧＯＴの検出にも好適なもう１つの方
法は、ライトマン（Ｓ．Ｒｅｉｔｍａｎｎ ）及びフレ
ンケル（Ｓ． Ｆｒａｅｎｋｅｌ）によりアメリカン・
ジャーナル・オブ・クリニカル・パトロギー、第２８巻
（１９５７年）、第５６〜６３頁に記載されている。

ここでは、ＧＰＴにより１）式に従い生じたピルベート
、もしくはＧＯＴにょり２）式に従い生じたＯＡＡを、
残分中に存在するα−ケトグルタレートと同時にジニト
ロフエニルヒドラジンと反応させ、相応する有色ヒドラ
ゾンに変じ、これをアルカリ性とした後、その５００及
び５５０間の間の異なった吸光度に基づき一緒に測定す
ることができる。

一方ではα−ケトグルタレートのヒドラゾン及び他方で
はピルベートもしくはＯＡＡのヒドラゾンは、測定範囲
において異なった吸光度を示すので、計算は複雑である
か、可能である。

更に、２）式により生じたオキザロアセテートをジテゾ
ニウム塩とカップリングさせ、色素とし、次いでこれを
光度測定法で評価することもできる。

このような方法はバブソン（Ａ． Ｌ． Ｂａｂｓｏｎ
）（ＣＩｉｎ． Ｃｈｅｍ．第６巻（１９６０年）、
第３９４頁）により記載されている。

ここでＧＯＴ活性を測定する。

ＧＯＴ＝活性の測定のためにＴ．マッザワ及びＮ．カツ
ヌマ（Ａｎａｌ． ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７巻（１９
６６年）、第１４３〜１５３頁）は１）式によるα−Ｋ
Ｇの形成を利用している。

このα一ＫＧを、アスパルテート及び結晶ＧＯＴの添加
により２）式に従って、ＯＡＡに変換し、次いで、この
形成をバブソン（Ａ． Ｃ． Ｂａｂｓｏｎ ）による
ＯＡＡのジアゾニウム塩カップリングで測定する。

生じたアゾ色素の量は可視光線で測定することかでき、
これは試料中のＧＰＴ活性もしくはＧＯＴ活性の尺度で
ある。

リツピイ（Ｕ． Ｌｉｐｐｉ）及びガイジ（ Ｇ． （
｝ｕ ｉｄ ｉ ）（ＣＩ ｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃ
ｔａ，第２８巻（１９７０年）、第４３１〜４３７頁）
は、ＧＰＴ及びＧＯＴを、１）及び２）式で遊離したグ
ルタメートを用いて次の２つの指示反応を後続すること
により、測定した： ＧＬＤＨ−グルタメートデヒドロゲナーゼ；ＰＭＳ＝フ
エナジンメトスルフエート； ＩＮＴ＝２− （ｐ−ヨードフエニル）−３−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニ ルーテトラゾリウムクロリド ドメーク（Ｒ．Ｂ．Ｄｏｍｅｃｑ）、カルタ（Ｍ ．
Ｃａｒ ｔａ ）及びドウ・アルモニイ（Ｅ． Ｆ，
ｄｅ Ａｒｍｏｎｙ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｃ ｌｉｎ
ｉｃａ，第２巻（１９７１年）、第２５〜３６頁）は、
ＧＯＴの測定のために２）及び４）式の反応を６）式と
組合わせた。

これによりＮＡＤＨ量の減少（ホルマザン色素として測
定）がそれぞれの試験の測定量となる。

可視光線で追跡することもでき、同様に試料中のＧＯＴ
の活性の基準である。

この著者等は、ＧＰＴに関して同様な方法を記載してい
る（ Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｃｌｉｎｉｃａ第２巻（１９
７１年）、第１０２〜１１１頁参照），ここに記載した
ＧＰＴ及びＧＯＴの活性を測定するための方法は、すべ
て、その使用を高価にしたり、困難とする種々の重大な
欠陥を有する。

従って、ヘンリー（Ｈｅｎ１ｅｙ））Ｒびボラード（Ｐ
ｏｌｌ−ａｒｄ）による方法もしくはカーメン（ Ａ．
Ｋａ ｒｍ−ｅｎ）による方法は、ＮＡＤＨの１分間
あたりの吸光度変化の測定を可能とするが（このことは
有利である）、紫外線試験を用いなければならない。

専門家にとって公知であるように、紫外光での測定用の
光学測定装置は、特に費用がかかり、従って可視光線中
で吸光度変化を測定することのできる測定装置より高価
である。

そのもう１つの重要な欠点は、ＮＡＤＨ一吸光の減光を
測定しなければならないことである。

そのような試験においては、測定技術に基づき、ＮＡＤ
Ｈに関する限られた初期濃度のみが存在してよい。

その結果として、ここで使用した指示酵素ＬＤＨもしく
はＭＤＨはその基質ＮＡＤＨで飽和されておらす、従っ
て最大反応速度に達しないということになる。

このことは高めた酵素使用により調整すべきである。

このことは不経済であるばかりでナく、他の妨害となる
酵素活性体が多量に試験系にもちこまれるという危険を
も包含する。

低いＮＡＤＨ濃度のもう１つの欠点は、自動分析機にお
いても又手による試験においても試料の添加と測定の開
始の間にある程度の時間がかかることである。

試料中にＧＰＴ又はＧＯＴの大きな活性が存在する場合
、ＮＡＤＨの大部分が測定の開始前にすでに使用される
。

従って、まさに、著しく高められたＧＰＴ値又はＧＯＴ
値（体内の病的な事態に関する指標を提供する）の際に
、低くすぎる活性が測定されるか又は全く活性か測定さ
れない。

このことはこの測定の重大な欠陥である。

ライトマン（Ｒｅ ｉ ｔｍａｎ）及びフレンケル（
Ｆｒａｅｎｋｅ ｌ ）によ方法では、生じたヒドラゾ
ンを可視光線で測定する。

これは使用法を簡単とし、これにより割安な光学測定装
置を可能とする。

このために他の重要な欠点が生じる。

これは非常に感度が低く、従って１時間という長い恒温
保持時間を必要とする。

こうして始めて、十分なピルベートもしくはオキザロア
セテートが生じ、ヒドラゾン形成を開始することができ
る。

これは更に恒温保持時間を必要とする。

更に、試験配合物中に必要なα一ＫＧも同様に反応し、
有色ヒドラゾンとなる。

これにより、この試験の評価は非常に複雑になる。

というのはα−ＫＧ−ヒドラゾンの減少とピルベートー
ヒドラゾンもしくはＯＡＡ−ヒドラゾンの増加を同時に
考えなければならないからである。

この方法において２０〜３０％の誤差は甘受しなければ
ならないということは、従来専門家にとっては公知であ
る。

原則的に、類似の問題がバブソンによる方法もしくはマ
ツザワ及びカツヌマによる方法においても生ずる。

ここでは可視光線中で測定でき、α−ＫＧはジアゾニウ
ム塩と干渉しないので、評価は非常に簡単である；しか
しここでも先すＯＡＡもしくはピルベートを長い恒温保
持により生じさせねばならない。

引き続き、色素形成をもう１回の恒温保持工程で実施し
なければならない。

マツザワ及びカツヌマによれば生じたアゾ色素を更に取
り扱いにくい塩酸により安定化する。

更に、類似の構造の多くのケト化合物はジアゾニウム塩
とカップリングし、高すぎる値に見せかけることにより
測定を妨害する式素となる、この誤差は空値により除か
なければならない。

例えば血清は常にアセト酢酸の変動量を有し、これは、
ＧＰＴ反応もしくはＧＯＴ反応によりはじめて形成され
るオキザロアセテートとまちがえられる。

リツピイ（ Ｌｉ ｐｐ ｉ ）及びガイジ（Ｇｕｉｄ
ｉ）による方法は、同様に可視域で測定される。

これも１回の恒温保持の工程のみ必要とするか、これは
同様に４５分という長時間である。

次いで、この反応は有毒で危険な塩酸で停止させなけれ
ばならなＧ１ｏ血清中に比較的多量のグルタミン酸か含
有されているということも、もう１つの欠点である。

このグルタミン酸は両方の試験において５）式によるＧ
ＯＴもしくはＧＰＴと思い違いされる。

従って、ここでも空値測定を実施しなければならない。

ドメーク（ Ｄｏｍｅ ｃ ｑ ）等の方法は、同様に
二段階の恒温保持工程を必要とする。

この方法はヘンリー（Ｈｅｎｌｅｙ）及びボラード（
Ｐｏｌ ｌａｒｄ）のもしくはカーメン（Ｋａｒｍｅｎ
、）の方法と同様に、結局ＮＡＤＨの減少を測定するの
で、ここでも前記と同様な欠点がある。

ここでは測定技術に基づき、より少量のＮＡＤＨを使用
すべきであるのでより強く欠点は現われる。

可視光線中での測定は有利である。

更に、ここでは試料溶液中の高すぎる活性によるＮＡＤ
Ｈの完全な使用を見過ごすことはできない。

しかし、専門家に容易にわかるように全体的にこの方法
は、それぞれの測定値におけるＮＡＤＨの精確な投与量
が強く要求されるので、非常に費用かかかりかつ妨害を
受けやすい。

従って、本発明の課題は前記両トランスアミナーゼの活
性を測定するための、公知方法の欠点を有さない方法を
確立することである。

特に、本発明の目的は、短かい測定時間及び唯一回の恒
温保持を必要とし、１分間当りの吸光度変化を測定し吸
光度増加させ吸光度減少させず、かつ可視光線中で測定
を行なう方法を得ることであり、このことにより簡単な
光学測定装置を使用することができる。

この課題は本発明により、緩衝液中でα−ケトグルタレ
ードの形成下にオキザロアセテートもしくはピルベート
とグルクメートとを反応させることにより、グルタメー
トーオキザロアセテートートランスアミナーゼ又はグル
タメートーピルベートートランスアミナーゼを測定する
方法により解決し、この方法は生じたα−ケトグルタレ
ートとγ−アミノブチレートとを、γ−アミノブチレー
トートランスアミナーゼの存在でスクシネートーセミア
ルデヒドの形成下に反応させ、スクシネートーセミアル
デヒドでＮＡＤＰをスクシネートーセミアルデヒドーデ
ヒドロゲナーゼの存在下に還元してＮＡＤＰＨとし、こ
れを直接測定するか又はテトラゾリウム塩及び電子逓伝
体を用いてホルマザン色素に変じ、これを測定する。

本発明による方法の原理は１）もしくは２）式の反応と
次の７）及び８）式の反応との組み合せより成る： スクシネートーセミアノげヒド＋α−グルタメートＧＡ
Ｂ−ＧＴ−γ−アミノブチレートー これらの反応式はジャーナル・オブ・ビオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２３
４巻（１９５８年）、第９３２〜９４０頁から公知であ
る。

意外にも、これらの７）及び８）式の反応を、α−ＫＧ
形成を介して１）及び２）と連結することが可能である
ということが見い出され、本発明はこの事実に基づく。

これにより、生じたＮＡＤＰＨによる１分間当りの吸光
増加はＧＰＴもしくはＧＯＴの活性の尺度となる。

この種の連結は、２０年以上ＧＯＴ及びＧＰＴの満足で
きる測定方法か探究されており、かつこの反応がすでに
同様に長く公知であるという事実からもわかるように、
従来可能なものとは思われなかった。

この方法の特に有利な実施態様によれば更に、電子逓電
体の存在下にテトラゾリウム塩で、有色ホルマザンの同
時形成下にＮＡＤＰＨの逆酸化に導びく反応を後続させ
ることであり、この有色ホルマザンは可視光線で測定す
ることができる。

有利な実癩態様において、これは次の９）に相応する。

ＭＴＴ＝３−（４ ．５−ジメチルーチアゾリル−２）
−２，５−ジフエニルーテトラゾリウムブロミド ９）式中に電子逓伝体として記載したジアホラーゼは有
利である。

しかしながら、専門家に公知の他の電子逓伝体を使用す
ることもできる。

この際、特にフエナジンメトスルフエート（ＰＭＳ）及
びフエナントロリンメトスルフエートか非常に好適であ
ることが判明した。

この実施態様は試験片上で使用するためにも好適である
。

一般に、本発明方法を７〜９．５のｐＨ値で実怖する。

これより高い又は低いｐＨ値においては、反応が非常に
遅くなり、１試験当りの必要時間か相応してひき延ばさ
れる。

最高の結果は約８〜８．６のｐＨ値で得られる。

好適な緩衝剤濃度は５ ｍ Ｍｏｌ／ｌ〜０． ５ Ｍ
ｏｌ／ｌであり、試験中の約０．０５〜６％緩衝塩に相
応する。

緩衝剤を約１０〜約１ ０ ０ ｍ Ｍｏｌ．／ ｌの
間の濃度で使用するのが有利である。

使用する緩衝剤の種類は厳密ではない。

重要なのは、それが前記範囲内で緩衝作用を有するとい
うことである。

従って、例えば燐酸塩緩衝剤、トリエタノールアミン緩
衝剤、グリシン緩衝剤、ピロ燐酸塩緩衝剤、トリス緩衝
剤又はイミダゾール緩衝剤でほぼ同様に良好な結果が得
られる。

トリス緩衝剤及びイミダゾール緩衝剤は測定技術及び取
り扱い上の理由で有利である。

その他の、本発明方法に使用する試薬及び酵素は、その
測定の結果を変化させることなしに、広い濃度範囲で使
用することができる。

試薬の１つにとって厳密な狭い限界を守ることは必要で
ない。

テトラゾリウム塩としてはすでに記載のＭＴＴが有利で
ある。

しかし、他のテトラゾリウム塩を使用することもできる
。

良好な結果は特にニトロプル一一テトラゾリウムクロリ
ド（ＮＢＴ）及び２−（ｐ−ヨードフエニル）−３−（
ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニルーテトラソリウム
クロリド（ＩＮＴ）で達成された。

テトラゾリウム塩の選択は、生じたホルマザン色素の溶
解性を考慮し行なわれる。

つまり、もし生じた色素が僅かな溶解性を有するならば
、ＧＯＴ活性又はＧＰＴ活性が高い場合、色素の沈殿が
起こり、これは測定を困難にする。

このような理由から、本発明方法をホルマザン色素の測
定下に実施する際、色素の溶解性を改良する界面活性剤
を添加するのは有利である。

好適な界面活性剤の例はデスオキシコール酸、サポニン
、アルキルアリールーポリエチレングリコールーエステ
ル及びアルキルアリールーポリエチレングリコールーエ
ーテル、ソルビタンエステル、例えばソルビマクロゴー
ルオレアート、ポリエチレングリコールラウリルエーテ
ル等である。

界面活性剤の濃度は一般に試験中０．３〜３％である。

本発明のもう１つの課題はＧＯＴ及びＧＰＴの測定用試
薬であり、この試薬はγ−アミノブチレートートランス
アミナーゼ（ＧＡＢ−ＧＴ）、スクシネートーセミアル
デヒドーデヒドロゲナーゼ（８８−Ａｌ−ＤＨ）、γ−
アミノブチレート、グルタメート、ＮＡＤＰ緩衝剤並び
にオキザロアセテート又はピルベート及び場合によりテ
トラゾリウム塩、電子逓伝体及び界面活性剤を含有する
。

γ−アミノブチレート、グルタメート、オキザロアセテ
ート及びピルベートとは、基礎となっている酸の、酵素
に影響を与えない陽イオンとの塩である。

一般にアルカリ金属塩、アンモニウム塩又はアミノ塩が
有利であるが、マグネジウム塩等も使用することができ
る。

この種の有利な試薬は、それぞれ試験中の濃度に関して
、 ８８−Ａｌ−ＤＨ ０．５〜２０Ｕ／ｍｌＧＡ
Ｂ−ＧＴ Ｏ．５〜２０Ｕ／ｍｌピルベー
ト又はオ キザ。

アヤテート ０．１〜５０ ｍＭｏｌ／ｌグルタメ
ート ０． ０ ２ 〜０． ５ Ｍａｉ
ｌ／ｌγ−アミノブチレート １ ０ 〜３
０ ０ ｍｌＶｉｏｌ／ＡＮＡＤＰ ０
．２〜１０ ｍＭｏｌ／ｌ緩衝剤 １０〜１００ｍ
Ｍｏｌ／ｌ を含有する。

この試薬は乾燥させた形でも又は溶液の形でも存在して
よい。

全成分は混合して又は分離して存在してよい。

有利にこの種の試薬は付加的に、 ジアホラーゼ ０． ０ ２ 〜Ｉ Ｕ／ｍ
ｌＭＴＴ，ＩＮＴ又はＮＢＴ Ｏ．０２〜０．５
ｍＭｏｌ／ｌ界面活性剤 ０．３〜３％ を含有する。

この際、ジアホラーゼを非酵素的に作用する電子逓伝体
で代用することもできる。

この試薬は特に試験テープの製造のための担体に含浸さ
せもしくは封入させるのに好適である。

本発明による測定は迅速に進行する。

１〜５分、有利に約２分の恒温保持時間で完全に十分で
ある。

検査用試料の添加による反応の開始後、測定は数分後に
終了する。

一般に１分当りの吸光度差を測定する。

このためには、１又は２分以内に行なう、数回の測定で
十分である、便宜上、１分間隔で２〜４回の測定値をと
る。

本発明方法は高い精度、僅かな必要時間、僅かな妨害さ
れやすさ及び簡単な光学測定装置での実捲可能性におい
て優れている。

１分間当りの吸光度変化の測定が行なわれるので、測定
時間は短かいままである。

更に、唯一回の恒温保持が必要である。

吸光度変化は吸光度増加を表わし、従って測定パラメー
ターを限られた量で使用する必要はなく、吸光度減少を
測定する方法において起る、高すぎるＧＰＴ又はＧＯＴ
の活性により誤った値を思い違いさせることもないとい
うことが非常に有利である。

次の実施例につき、次の省略を使用する。

グルタメートーピルベートート ＧＰＴ ランスアミナーゼ γ−アミノブチレートーα−ケ ＧＡＢ−ＧＴ トグルタレートートランスアミナーゼ ８８−Ａｌ− スクシネートセミアルデヒドーＤＨ
デヒドロゲナーゼ グルタメートーオキザロアセテ ＧＯＴ 一トートランスアミナーゼニコチン
アミドーアデニンージ ＮＡＤＰ ヌクレオチドーホスフエートニコチ
ンアミドーアデニンージ ＮＡＤＰＨ ヌクレオチドーホスフエート、還元
型 ３−（４，５−ジメチルチアゾ ＭＴＴ リルー２−）−２，５−ジフエニル
ーテトラゾリウムブロミド トリス トリス（ヒドロキシメチル）一アミン
メタン トリトン■× アルキルアリールーポリエチレ１００
ングリコールーエーテル次に実施例につき本
発明を詳細に説明する。

例Ｉ ＧＰＴの検出；測定信号としてのＮＡＤＰＨ−形成。

温度；２５℃、波長３６５ｍｍ、試験容量３ｍｌ、１ｃ
ｍキュベット で開始、混合、恒温保持２分、Ｅ，を読み取る、その後
正確に１，２，３及び４分後にそれぞれＥ２，Ｅ３、Ｅ
４及びＥ５を読み取る。

この値から△Ｅ／分を計算する。

試料中のＧＰＴ活性を式により計算する。

酵素活性単位は、エツクハルト・ブヂツケ（Ｂｃｋｈａ
ｒｔ Ｂｕｄｄｅｃｋｅ ）によるグルンドリス・デル
・ビオヘミ−（Ｇｒｕｎｄｒｉｓｓ ｄｅｒ Ｂｉｏｃ
ｈｅ−ｍｉｅ ： Ｗａｉｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅ
ｒ， Ｂｅｒｌ ｉｎ， ＮｅｗＹｏｒｋ１９７７年）
２９〜３０頁にも記載されているように、Ｕは１分当り
の基質１μモルの変換を接触する酵素量を意味する。

従ってＵ／ｍｌはｌｍｌ量に対するこの酵素単位を意味
する。

前記方法で異なる患者の５血清を検査し、次の結果が得
られた： 例２ ＧＰＴ測定：測定信号としてのホルマザン形成。

温度２５℃、波長５７８ｍｍ、試験容量３ｍｌ，１ｃｍ
キュベット。

キュベット中にピペットで測り入れる： で開始、混合、恒温保持２分、Ｅ１読み取る、その後正
確に１．２，３及び４分後にそれぞれＥ２，Ｅ３，Ｅ，
及びＥ５を読み取る。

この値から△Ｅ／分を計算する。

試料中のＧＰＴ活性を次のように計算する。

例１と同じ血清で例２の方法で試験し、次の結果が得ら
れた： 例３ ＧＯＴ測定；測定信号としてのＮＡＤＰＨ一形成。

測定温度２５゜Ｃ測定波長３６５關、試験容量３ｍｌ，
ｌｃｍキュベット。

キュベット中にピペットで測り入れる： で開始、混合、恒温保持２分、Ｅ１を読み取る、その後
正確に１．２，３及び４分後にそれぞれＥ２，Ｅ３、Ｅ
４及びＥ，を読み取り、この値から△Ｅ／分を計算する
。

試料中のＧＯＴ活性を式により計算する。

この方法で異なる患者の５血清を試験し、次の結果が得
られた； 血清／ｌ６Ｅ／ｍｉｎ ＴＪ／ｍｌ Ｕ／
１１１ ０．０１１ ０．０１８９
１８．９２ ０．０２５ ０．０４２９
４２．９例４ ＧＯＴの検出；測定信号としてのホルマザン形成。

温度２５℃、測定波長５７８ｍｍ，試験容量３ｍｌＩｃ
ｍキュベット。

で開始、混合、恒温保持２分、Ｅ１を読み取る、その後
生確に１，２，３及び４分後にそれぞれＥ２，Ｅ，，Ｅ
４及びＥ５を読み取る。

試料のＧＯＴ活性を次のように計算する： 例３と同じ血清を用いて試験し、次の結果が得られた： 血清Ａ６ Ｅ／ｍｉｎ Ｕ／ｍｌ ＴＪ／
１１ ０．００５３ ０．０１９ １９２
０．０１３ ０．０４６７ ４６．７３
０．０１３ ０．０４６７ ４６．７４
０．０３８９ ０．１４ １４０５
０．０７６７６ ０．２７５８ ２７５。

８例５ 試験テープ上でのＧＰＴの検出。

好適な紙を、例２の試薬全体を含有する溶液で含浸させ
、注意深く乾燥させ、好適な担体上に固定し、封入し、
テープ状に切断する。

血清中に浸すと、その濃さが試料中のＧＰＴ活性に比例
する赤青色が生じる。

評価は適する標準色表（例えば約３０Ｕ／ｌで淡赤色、
約８０Ｕ／ｌで紫色、約２００Ｕ／ｌで濃紫色）との比
較により行なうことができる。

同様に、反射光度計での評価も可能である。

例６ 試験テープ上でのＧＰＴの検出。

好適な紙を例４により調製した試験溶液で含浸させ、注
意深く乾燥させ、好適な担体上に固定し、場合により封
入し、テープ状に切断する。

血清中に浸すと、試料中のＧＯＴ活性に強度が比例する
赤青色が生じる。

評価は適する標準色表（例えば約３０Ｕ／ｌで淡赤色、
約８０Ｕ／ｌで紫色、約２ ０ ０Ｕ／ｌで濃紫色）と
の比較により行なわれる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 緩衝溶液中でα〜ケトグルタレートの形成下にオキ
   ザロアセテートもしくはピルベートとグルタメートとを
   反応させることにより、グルタメートーオキザロアセテ
   ートートランスアミナーゼ又はグルタメートーピルベー
   トートランスアミナーゼを測定する方法において、生じ
   たα−ケトグルタレートとγ−アミノブチレートとを、
   γ−アミノブチレートートランスアミナーゼの存在でス
   クシネートーセミアルデヒドの形成下に反応させ、スク
   シネートーセミアルデヒドを用いて、スクシネートーセ
   ミアルデヒドーデヒドロゲナーゼの存在下にＮＡＤＰを
   還元してＮＡＤＰＨとし、これを直接測定するか又はテ
   トラゾリウム塩及び電子逓伝体でホルマザン色素に変じ
   、これを測定することを特徴とする、グルタメートーオ
   キザロアセテートートランスアミナーゼ又はグルタメー
   ト−ピルベートートランスアミナーゼの測定法。 ２ 電子逓伝体としてジアホラーゼ、フエナントロリン
   メトスルフエート又はフエナジンメトスルフエートを使
   用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ テトラゾリウム塩として３−（４，５−ジメチルチ
   アゾリル−２）−２，５−ジフエニルーテトラゾリウム
   ブロミド、ニトロブル一一テトラゾリウムクロリド又は
   ２−（ｐ−ヨードフエニル）−３−（ｐ−ニトロフエニ
   ル）−５−フエニルーテトラゾリウムクロリドを使用す
   る、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ ｐＨ一値を７〜９．５の間に調整する、特許請求
   の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方法。 ５０．０５〜６％の緩衝液濃度を使用する、特許請求の
   範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。