JPS5819279B2 - Ｎａｄ（ｐ）ｈ又はサリチル酸塩を測定する方法及び試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形成性酵
素反応又はサリチル酸塩又はサリチル酸塩形成性酵素反
応を検出する方法に関する。

診断パラメータ、例えばグルコース又はグリセリンの測
定は、臨床化学にとっては非常に重要である。

通例は、このためにデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼ
が使用されている。

オキシダーゼは、生じるＨ２０□を呈色反応で測定でき
るので有利に使用されており、この際は、例えばペルオ
キシダーゼの存在で色原体をＨ２０□の作用下に酸化的
に結合させて色素にしている。

この種の系は、測定に使用される試薬が安定であシ、適
当なカップリング成分の選択によシ、最大吸収及び波長
に支障なしに測定できるように影響を及ぼす可能性をも
たらす利点を有する。

しかしながら、この方法は、重大な欠点をも有する。

即ち、オキシダーゼは比較的非特異性の酵素であるから
、試験物質中の他の酸化可能の物質の存在も検出でき、
障害となる。

更に、中間生成物Ｈ２Ｏ２は屡々化学量論的には形成さ
れず、更に非常に不安定である。

形成されるＨ２Ｏ２のペルオキシダーゼによる変換は化
学量論的に不都合に進行し、生じる色素１モル当りＨ２
Ｏ２少なくとも２モルを必要とする。

これに反して、デヒドロゲナーゼ−反応は、厳密に化学
量論的に、かつ一般にオキシダーゼ反応よりも著るしく
特異的に進行する。

更に中間生成物ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは非常に安定である。

従って、特異的かつ化学量論的デヒドロゲナーゼ反応の
利点と色素形成性反応の利点とを結合させることが望ま
しい。

デヒドロゲナーゼ反応での反応生成物 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをジアホラーゼ及ｄテトラゾリウム塩を
用いて色素に変えることができることは公知である。

しかしながら、この系も、テトラゾリウム塩が不安定で
あり、生じる色素が重合する傾向を有し、従って不溶に
なるので、同様に大いに不満足である。

従って、本発明は、これらの欠点を有さず、す。

リチル酸塩−測定法の要求をも満足する、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈを眼に見えるようにする方法を得ることを課題として
いる。

。この課題は、本発明により、ＮＡＤ（
、、、Ｐ、）、Ｈ又はサリチル酸塩を測定する方法で解
決今れ、この・方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに関連する反応
で、サリチル酸塩をサリチレートヒドロキシラーゼによ
り脱カルボキシル化し、この脱カルボキシル化生成物を
チロシナーゼの存在で、適当な色素成分との酸化性カッ
プリングによって色素を形成させ、これをフォトメータ
ーで測定することより彦る。

本発明方法は次の公知反応に基づいている：（１）サリ
チル酸塩十ＮＡＤ （Ｐ ） Ｈ十〇□サリチレート−
ヒドロキシ ラーゼ（Ｅ、Ｃ，１，１４，１３，１） ブレンツカチキン＋ ＣＯ２＋Ｈ２０＋ＮＡＤ＋ （２）ブレンツカチキン＋ヒドラゾン＋０２チロシナー
ゼ（Ｅ、Ｃ，１，１０，３，１）又は（Ｅ、Ｃ，１，１
４，１８，１） □ アシン−色素子 ２０ 反応（１）はＲ，Ｈ，ホワイトーステーヴンス（Ｗｈｉ
ｔｅ −Ｓ ｔｅｖｅｎｓ ）及びＨ，カミｙ（Ｋａｍ
ｉｎ）のＪ 、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２４−７巻２
３５８頁（１９７２年）から公知である。

サリチル酸塩とはサリチル酸塩以外にすべてのサリチル
酸塩誘導体と解する。

反応（２）から、チロシナーゼはブレンツカチキン以外
にモノフェノールをも酸化し、この際に生じるキノンに
ヒドラゾンを酸化的に結合して色素にすることは公知で
ある（Ｃ，Ｒ，Ｄａｗｓｏｎ及びＲＪ、Ｍａｇｅｅ、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ ２
巻８１７頁（１９５５年）及びＢ、Ｇ、Ｍａ１ｍｓｔｒ
６ｍ及びＬ 、 ＲｙｄｅｎのＢ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ（Ｓｉｎｇｅｒ Ｔ、Ｐ、Ｅ
ｄ、）４１９頁、Ｉ ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌ
、Ｎ、Ｙ、 （１９６８年）参照〕。

従って、チロシナーゼの存在におけるサリチル酸塩とヒ
ドラゾンとの直接反応による妨害が予期できたので、反
応（１）と（２）との結合がＮＡＤ（Ｐ）Ｈの指示薬系
として好適であるとは予期されなかった。

しかしながら、意外にも、チロシナーゼがサリチル酸塩
を変換せず、反応生成物ブレンツカチキンのみが試験の
当初に酸化的に結合することが明らかになった。

この反応は、化学量論的に進行し、この際、ブレンツカ
チキン１モル当り安定な色素−錯体１モ９ルが生じる。

本発明は、すべてのＮＡＤＨ−又はＮＡＤＰＨ−を生じ
る反応に対する広い使用領域を有する。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−形成反応としては、例えば、種種のデ
ヒドロゲナーゼを用いる基質例えばグルコース、グルコ
ース−６−燐酸、グリセリン及びトリグリセリドの測定
がこれに該当する。

種々のデヒドロラ−ゼ例工ばグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼの酵素活性を測定することもでき
る。

この方法の基本になっている反応から同時に、本発明を
、測定すべきサリチル酸塩に比べてＮＡＤ（Ｐ）Ｈが反
応混合物中に存在する際に、サリチル酸塩又はサリチル
酸塩誘導体の測定するために使用する可能性も得られる
。

この方法ですべてのサリチル酸塩形成性誘導体が測定で
きる。

例えば式：の化合物を分解することのできるヒドロラー
ゼ即ちプロテアーゼ、凝固因子、アミラーゼ、リパーゼ
の測定も可能である。

色素形成成分としては、色属性ヒドラゾン及びアミンが
これに該当する。

種々の結合可能なヒドラゾン及びアミンの選択により、
吸光度及び波長を要求に応じて影響させることができる
。

好適な化合物は、例えばＳ、ヒュニヒ（Ｈｉｉｎｉｇ
） Ｋ ヨルアンケハンテ・ヘミ−（Ａｎｇｅｗａｎｄ
ｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ） ７０巻２１５頁（１９５８年
）に記載されているすべてのヒドラゾンである。

有利な実施形では、結合可能なヒドラゾンとして３−メ
チル−２−ベンゾ（２′−スルホ）−チアゾロン−ヒド
ラゾン（ＭＢＴＨ−８）が使用される。

色原性アミンとしては、例えばプロリン、プロタミン、
ヒスタミン及びリジンが好適でアル。

本発明の目的は、更に、ＮＡＤＨ又はＨＡＤＰＨの測定
のだめの試薬であシ、これは、サリチル酸塩、色原性ヒ
ドラゾン又はアミン、サリチレートヒドロキシラーゼ、
チロシナーゼ及び緩衝液を含有し、サリチル酸塩測定用
の試薬は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ１色原性ヒドラゾン又はアミ
ン、サリチレートヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ及び
緩衝液を含有する。

試薬組成物は前記の必須成分以外に付加的に慣用の溶剤
及び助剤例えば安定剤及び界面活性物質を含有していて
よい。

６〜９．３のｐＨ−範囲で０．００５〜１．０モル／ｌ
の緩衝液濃度のすべての緩衝液が有利である。

燐酸塩−及びグリシルグリシン−緩衝液が有利である。

酵素は次の濃度で使用するのが有利である：サリチレー
トヒドロキシラーゼ０．０５〜５．０ｋＵ／ｌ、チロシ
ナーゼ１０〜２００ｋＵ／ｌ。

本発明による試薬は、担体、例えば紙、プラスチックシ
ート又は他の多孔性物体上に含浸されて存在していても
よく、例えば試験片として使用することができる。

次の実施例につき本発明を更に説明する。

例Ｉ ＮＡＤＨ−測定 試薬： ＭＢＴＨ−８１，７ミリモル／１ ＳＡＨＸ ７０Ｕ／ＩＪ チロシナーゼ ３３゜１０３Ｕ／ｌサリチル酸Ｎ
ａ Ｏ，３３ミリモル／ｌ燐酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，０）０．１モル／１反応開始： ＮＡ
ＤＨ−含有試料の添加測定条件： ４９２ｎｍ、
２５℃ 終 点： 試験量３ｄ中のＮＡＤＨｏ、０２μモ
ルに対して１５分 後 例２ ＮＡＤＨ−測定 例１と同様 反応開始： ＮＡＤＰＨ−含有試料の添加例３ グルコース−６−燐酸の測定 試薬： ＮＢＴＨ−８１，７ミリモル／１ ＳＡＨＸ ７０Ｕ／１ チロシナーゼ ３．３・１０３Ｕ、＃サリチル酸
Ｎａ Ｏ，３３ミリモル／ｌ燐酸に緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） ０．１モル／ｌグルコース−６−フォス
フニー １．６Ｘ１０Ｕ／＃トープビトロゲナーゼ（ロ
イコ ノストック・メセントロイデス １ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
）ＮＡＤ十 ０．２５ミリモル／１ 反応開始： 試料で 測定条件： ４９２ｎｍ、２５℃ 反応の終点： ５ｍｍ 例４ グルコース−６−ホスフニートテヒドロケナーゼの活性
測定 試薬： ＭＢＴＨ−８１，７ミリモル／１ ＳＡＨＸ ７０Ｕ／１ チロシナーゼ ３．３・１０３Ｕ／ｌサリチル
酸Ｎａ Ｏ，３３ミリモル／ｌ燐酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７，０）０．１モル／１ＮＡＤ＋
０．２５ミリモル／ｌグルコースー６−燐酸
３．３ミリセル／ｌ開 始：Ｇ−６−ＰＤＨ含有試料
で 測定条件： ４９２ｎｍ、２５８Ｃ例５ グリセリン−測定 試薬： ＭＢＴＨ−８１，７ミリモル／１ ＳＡＨＸ ちＯＴＪ／１ チロシナーゼ ′６．６・１０３Ｕ／ｌグリセリンデ
ヒドーロゲナーゼ ２４００ Ｕ／Ａサリチル酸Ｎａ
Ｏ，３３ミリモルＺｌＮＡＤ＋ −
１，３５ミリモル／ｌグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ８
，５） ０．１モ＃／１（ＮＨ４）２ＳＯ４０，０１モ
ル／ｌ 開 始： 試料添加による 測定条件： ４９２’ｎｍ、２５℃終 点：
３０分後 例６ トリグリセリドの測定 試薬： ＭＢＴＨ−８・１．７ミリモル ５ＡＨＸ ８０Ｕ／ｌ チロシナーゼ ６．６・１０３Ｕ／Ａ？グリセ
リンデヒドロゲナーゼ ２４００Ｕ／１サリチル酸Ｎａ
０１３３ミリモル／１ＮＡＤ＋ □
１．３５ミリモル／ｌグリシルグリシン−ｏ、ｉ
モル／ｌ 緩衝液（ｐＨ８，５） （ＮＨ４）２ＳＯ４０，０１モル／ｌ プソイドモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からのエ
ステラーゼ １００ＯＵ／ｌ イソトリデシルエーテル ２ｆ／ｌ 試料添加によシ開始 測定条件： ４９２ｎｍ、２５℃ 終 点＝ ３０分間 例７ サリチル酸の測定 試薬： ＭＢＴＨ−８１，７ミリモル／１ ＳＡＨＸ ７０Ｕ／Ｉｔチロシナーゼ
３３・１０３Ｕ／７ＮＡＤＨ０，２３ミリモ
ル／ｌ 燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）０．１モル／ｌ開
始： 試料添加による 測定条件： ４９２ｎｍ、２５°Ｃ終 点：
試験量３ｄ中のサリチル酸塩０．０２μモルに対し
て１０分 後 例１〜例７で、各々１．７ミ・リモル／ｌの濃度のＭＢ
ＴＨ−８をプロリン１０ミリモル／／ｌで換えることが
でき、結果は変わらない。

この場合測定は５４６ ｎｍで行なう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｉ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに関連する反応でサリチル酸。 塩を与ルチレートヒドロキシラーゼにより脱カルボキシ
   ル化し、この脱カルボキシル化生成物から、チロシナー
   ゼの存在で適当な色素成分との酸化的結合により色素を
   形成し、これをフォトメーターで測定することを特徴と
   する、ＮＡＤ（Ｐ’）Ｈ又はサリチル酸塩を測定する方
   法。 ２ サリチル酸塩、色原性ヒドラゾン又はアミン、サリ
   チレートヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ及び緩衝液を
   含有することを特徴とする、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ（Ｐ）
   Ｈを測定する試薬。 ３ サリチル酸塩０．０５〜２０ミリモル／Ｉｔ、ヒド
   ラゾン又はアミン０．３〜３０ミリモル／Ｉｔ、サリチ
   レートヒドロキシラーゼ０．０５〜５ｋＵ／１１チロシ
   ナーゼ１０〜２００ｋＵ／＃及びｐＨ６，０〜９．３の
   緩衝液を特徴する特許請求の範囲第２項記載の試薬。 ４ ヒドラゾンとして、３−メチル−２−ベンゾ（２ｔ
   −スルホ）−チアゾロン−ヒドラゾン（ＭＢＴＨ−８）
   を特徴する特許請求の範囲第２項反は第３項に記載の試
   薬。 ５ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，ヒドラゾン又はアミン、サリチ
   レートヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ及び緩衝液を含
   有することを特徴とする、サリチル酸塩を測定する試薬
   。 ６ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈｏ、０５〜１．５ミリモル／Ｉｔ
   。 ヒドラゾン又はアミン０．３〜３０ミリモル／１１サリ
   チレートヒドロキシラーゼ０．０５〜５に／ｌ。 チロシナーゼ１０〜５ＣＯｋＵ／７及びｐＨ６，０〜９
   ．３の緩衝液を特徴する特許請求の範囲第５項記載の試
   薬。 ７ ヒドラゾンとして、３−メチル−２−ベンゾ（２／
   −スルホ）−チアゾロン−ヒドラゾン（ＭＢＴＨ−８）
   を特徴する特許請求の範囲第５項又は第６項記載の試薬
   。