DK151974B - Fremgangsmaade og reagens til brug ved denne, til bestemmelse af glutamat-oxalacetat-transaminase og glutamat-pyruvat-transaminase - Google Patents

Description

DK 151974B

i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af glutamat-oxalacetat-transaminase (GOT) eller glutamat-pyruvat-transaminase (GPT) ved omsætning af oxalacetat eller pyruvat med glutamat under dannelse af α-ketoglutarat i pufret opløsning samt et til gennemførelse af denne fremgangsmåde egnet reagens. Fremgangs-5 måden egner sig til bestemmelse af de nævnte enzymer i biologiske væsker, såsom serum og urin, eller i andre materialer.

Den store diagnostiske betydning af bestemmelsen af de nævnte transaminaser i plasma, serum, væv og andet biologisk materiale har længe været kendt. Ved diagnose og differentialdiag-10 nose, f.eks. af lever-, hjerte- og muskelsygdomme, har disse bestemmelser været indført siden 1955 og har indtil i dag været uomstridte, således som det vil fremgå af de pågældende lærebøger (f.eks. H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 3. oplag , 1974, Verlag Chemie Weinheim, bind I, 15 side 6 til 74). Der har derfor været beskrevet forskellige fremgangsmåder til bestemmelse af GOT og GTP, hvilke fremgangsmåder imidlertid alle er behæftede med ulemper.

De nævnte transaminaser katalyserer følgende reaktioner:

a) GPT

GPT

20 1) Alanin + α-ketoglutaratpyruvat + glutamat

b) GOT

GOT

2) Aspartat + a-ketoglutarat^=£ oxalacetat (OAA) + glutamat

Til bestemmelse af disse enzymer kendes allerede flere metoder. Således beskriver K.S. Henley og H.M. Pollard (J.

25 Lab. Clin. Med. 46 (1955) 785 til 789) følgende bestemmelse af GPT-aktiviteten: Reaktionen 1) gennemføres med alanin og α-ketoglutarat (a-KG), og dannelsen af pyruvatet måles som følger:

DK 151974 B

2 3) Pyruvat + NADH + H+ NAD+ + lactat LDH = lactatdehydrogenase

Formindskelsen af absorptionen af NADH pr. minut, målt i UV-lys ved 365 nm, er målesignal. A.Karmen (J.Clin. Invest. 34 5 (1955) 131 til 133) beskriver et analogt forsøg med GOT. Her ved bliver det ifølge reaktionsskemaet 2) !dannede oxalacetat (OAA) målt som følger: 4) OAA + NADH + H+ malat + NAD+ MDH = malatdehydrogenase 10 Formindskelsen af absorptionen af NADH pr. minut, målt ved 365 nm i UV-lys, er målesignal.

En anden fremgangsmåde, der skal være egnet såvel til påvisning af GPT som til påvisning af GOT, er beskrevet af S. Reit-mann og S. Fraenkel i Am. J. Clin. Path. 28 (1957) 56 til 63. 15 Herved bliver det ved hjælp af GPT i følge reaktionsskema 1) dannede pyruvat eller det ved hjælp af GOT ifølge reaktionsskema 2) dannede OAA samtidig med det i resten tilstedeværende a-ketoglutarat omsat med dinitro phenylhydrazin til dannelse af de tilsvarende farvede hydrazoner, som efter alkalisering-20 en sammen kan bestemmes nå grund af deres forskellige absorption mellem 500 og 550 nm. Beregningen er kompliceret, men mulig, fordi hydrazonen af α-ketoglutarat på den ene side og hydrazonen af pyruvat eller OAA på den anden side udviser forskellige ekstinktioner i måleområdet.

25 Man kan imidlertid også koble det ifølge reaktionsskema 2) dannede oxalacetat med diazoniumsalte til dannelse af et farvestof, som derpå kan vurderes fotometrisk. En sådan fremgangsmåde er beskrevet af A.L. Babson (Clin. Chem. 6 (1960), 394). Med denne kan GOT-aktiviteten måles. Til må-30 ling af GPT-aktiviteten benytter T. Matsuzawa og N. Katunuma (Anal. Biochem. 17 (1966) 143 til 153) dannelsen af α-KG i-

DK 151974 B

3 følge reaktionsskema 1). Dette a-KG omdanner de ved tilsætning af aspartat og krystallinsk GOT ifølge reaktionsskema 2) til OAA og måler derpå dettes dannelse med diazoniumsalt-koblingen ifølge A.C. Babson. Mængden af det dannede AZO-5 farvestof kan måles i synligt lys og er et mål for GPT- eller GOT- aktiviteten i prøven.

U. Lippi og G. Guidi (Clin. Chim. Acta 28 (1970) 431 til 437) målte GPT og GOT ved hjælp af det i reaktionsskema 1) og 2) frigjorte glutamat, idet de efterindskød følgende to indika-10 torreaktioner: + ΓΊΠΗ +

5) Glutamat + NAD y α-KG + NH3 + NADH + H

+ ΡΜς +

6) NADH + INT y formazan + NAD

G1DH = glutamatdehydrogenasel PMS = phenazinmethosulfat; INT = 2-(p-jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchlorid.

Formazan-farvestoffet måles herefter.

15 R.B. Domecq, M. Carta og E.F. de Armony (Biochim. Clinica 2, (1971) 25 til 36) kombinerede reaktionsrækkefølgen fra reaktionsskema 2) og 4) med reaktions skema 6): til bestemmelse af GOT. Derved bliver formindskelsen af NAD'H-mængden, målt som formazan-farvestof, til målestørrelsen ved'det pågældende 20 forsøg. Formindskelsen kan følges i synligt lys og er ligeledes et mål for aktiviteten af GOT i prøven. Til GPT beskriver forfatterne en analog fremgangsmåde (Biochim. Clinica 2 (1971) 102 til 111),

Alle her beskrevne prøvemetoder til bestemmelse af aktivite-25 ten af GPT og GOT er behæftet med forskellige graverende mangler, som fordyrer eller vanskeliggør deres anvendelse. Således muliggør fremgangsmåden ifølge Henley og Pollard eller ifølge A. Karmen ganske vist måling af ekstinktionsændringen pr. minut af NADH, hvilket er fordelagtigt, men der skal anven-30 des en UV-prøve. Som det er kendt., af fagmanden er optiske måleindretninger til måling i UV-lys imidlertid særlig dyre

DK 151974 B

4 og derfor dyrere end måleapparater, som kan måle absorptionsændringer i synligt lys. En yderligere tungtvejende mangel er den kendsgerning, at der skal måles en formindskelse af NADH-ekstinktionen. Ved en sådan prøve kan der af måletek-5 niske grunde kun foreligge en begrænset begyndelseskoncentration af NADH. Dette har til følge, at de her benyttede indikatorenzymer LDH og MDH ikke er mættede med deres substrat NADH og følgelig ikke opnår maximal reaktionshastighed. Dette skal udlignes ved hiælp af forøget enzymanvendelse. Det-10 te er ikke alene uøkonomisk, men indebærer også den risiko, at andre generende enzymaktiviteter indføres i større omfang i prøvesystemet. En yderligere ulempe ved den lave NADH-kon-centration fremkommer ved, at der såvel i analyseautomater som ved den manuelle prøve går en vis tid mellem tilsætning 15 af prøven og målingens begyndelse. Foreligger der nu en stor aktivitet af GPT eller GOT i prøven, så forbruges allerede en stor del af NADH-mængden før målingens begyndelse. Derfor måler man for lav eller ingen aktivitet netop ved stærkt forøgede GPT- eller GOT-værdier, som refererer til en patologisk 20 begivenhed i legemet. Dette er en alvorlig ulempe ved disse bestemmelser.

Ved metoden ifølge Reitman og Fraenkel bestemmes de dannede hydrazoner i synligt lys. Dette muliggør anvendelsen af simp-lere og dermed mere prisgunstige fotometriske indretninger.

25 Dertil knytter sig andre tungtvejende ulemper. De er meget ufølsomme og kræver derfor den meget lange inkubationstid på 1 time. Først da er der dannet tilstrækkeligt pyruvat eller oxalacetat, så at hydrazondannelsen kan indledes. Denne kræver en yderligere inkubationstid. Desuden bliver det i prø-30 vematerialet nødvendige α-KG ligeledes omsat til en farvet hydrazon. Derved opstår yderst kompliceret forhold for bedømmelsen af denne prøve, da der samtidig skal tages hensyn til formindskelsen af α-KG-hydrazon og forøgelsen af pyruvat-eller OAA-hydrazon. Det har derfor længe været fagmanden 35 bekendt, at der ved denne metode må regnes med fejl på 20 til 30%.

DK 151974 B

5

Principielt lignende problemer foreligger ved metoderne ifølge Babson og ifølge Matsuzawa og Katunuma. Ganske vist kan der også her måles i synligt lys, og på grund af at a- KG ikke interfererer med diazoniumsalt er bedømmelsen væsenlig enk-5 lere. Imidlertid skal der også her først tilvejebringes OAA

eller pyruvat ved hjælp af længere tids inkubation. Derefter skal farvedannelsen gennemføres i et yderligere inkubationstrin. Ifølge Matsuzawa og Katunuma bliver det dannede farvestof yderligere, stabiliseret ved hjælp af saltsyre, som er 10 ubehagelig at håndtere. Yderligere er fagmanden bekendt med, at mange ketoforbindelser med lignende struktur kobler med diazoniumsaltet til dannelse af farvestoffer, som forstyrrer bestemmelsen, fordi de foregøgler for høje værdier. Denne fejl skal elimineres ved hjælp af en blindværdi. Således 15 indeholder f.eks. serum altid skiftende mængder aceteddike-syre, som foregøgler oxalacetat, der først skal dannes ved GPT- eller GOT-reaktionen.

Ved metoden ifølge Lippi og Guidi måles ligeledes i det synlige område. Metoden kræver kun ét inkubationstrin, som 20 imidlertid med en varighed på 45 minutter ligeledes er meget langvarigt. Reaktionen skal derefter også standses med den giftige og farlige saltsyre. En yderligere ulempe er, at relativt store mængder glutaminsyre er indeholdt i serummet. Dennne foregøgler GOT eller GPT ifølge reaktionsskema 5) ved 25 de to prøver. Derfor skal der også her medregnes en blindværdi .

Fremgangsmåden ifølge Domecq et al. kræver ligeledes to inkubationstrin. Da der tilsidst måles formindskelsen af NADH, svarende til hvad der er tilfælde ved metoden ifølge Henley og 30 Pollard eller ifølge Karmen, gælder her de samme ulemper, som er påvist i forbindelse med den metode. De optræder endnu kraftigere,fordi der af måletekniske grunde skal benyttes .endnu mindre NADH. Fordelagtig er målingen i synligt .lys. Også her kan det fulde forbrug af NADH ikke overskues som følge 35 af for høje aktiviteter i prøveopløsningen. Som det uden

DK 151974 B

6 videre vil fremgå for fagmanden,er fremgangsmåden imidlertid som helhed forbundet med store omkostninger og lidet modstandsdygtig mod forstyrrelser, da den stiller de højeste krav til nøjagtig dosering af NADH ved enhver måleværdi.

5 Opfindelsen tager sigte på at angive en fremgangsmåde til be stemmelse af aktiviteten af de to nævnte transaminaser, som ikke er behæftet med ulemperne ved de kendte fremgangsmåder.

Især er det et formål med opfindelsen at angive en sådan fremgangsmåde, som kræver kort måletid og kun én inkubation, som 10 måler absorptionsændringen pr. minut, fører til en absorptionsforøgelse og ikke til en absorptionsformindskelse og også mu- , liggør en måling i det synlige lys, således at der kan anvendes enklere fotometriske apparater.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde 15 til bestemmelse af glutamat-oxalacetat-transaminase eller glutamat-pyruvat-transaminase gennem omsætning af oxalacetat eller pyruvat med glutamat under dannelse af a-ketoglutarat i pufret opløsning, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man omsætter dannet α-ketoglutarat med γ-aminobutvrat 20 i nærværelse af α-aminobutyrat-transaminase under dannelse af succinat-semialdehyd, reducerer NADP med sidstnævnte i nærværelse af succinat-semialdehyd-dehydrogenase til dannelse af NADPH og enten måler dette direkte eller med et tetra-ssoliumsalt og en elektronoverfører omdanner det til et formazan-25 farvestof og måler dette.

Princippet i fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i kombinationen af reaktionen ifølge reaktionsskema 1) eller 2) med de efterfølgende reaktionsskemaer 7) og 8):

GAB-GT

7) α-KG + γ-aminobutyrat ····} succinat-semialdehyd + a-glu- 3 0 tamat GAB-GT = γ-aminobutyrat-transaminase 7

DK 151974B

+ CC —ΔΊ —HW +

8) Succinat-semialdehyd+NADP · —*succinat + NADPH + H

SS-A1-DH = succinat -semialdehyd-dehydrogenase

Disse reaktionsskemaer kendes fra J. Biol. Chem. 234 (1958) 932 til 940, Det har nu overraskende vist sig, og herpå be-5 ror opfindelsen, at det er muligt at sammenkoble disse reaktioner 7) og 8) med reaktionsskemaerne 1) og 2) via a-KG-dan-nelsen. Herved bliver absorptionsforøgelsen pr. tidsenhed ved hjælp af det dannede NADPH til et mål for aktiviteten af GPT eller GOT, En sådan sammenkobling blev hidtil ikke an-10 set for mulig, hvilket allerede fremgår af, at der i mere end 20 år har været søgt efter en tilfredsstillende fremgangsmåde til bestemmelse af GOT og GPT, og reaktionerne også har været kendt så længe i forvejen.

Ifølge en særlig fordelagtig udførelsesform for denne frem-15 gangsmåde efterindskydes yderliaere en reaktion, som med et tetrazoliumsalt i nærværelse af en elektronoverfører fører til returoxidation af NADPH under samtidig dannelse af farvet formazan, der let kan måles i synligt lys. I en foretrukken udførelsesform svarer dette til det efterfølgende reaktions-20 skema 9).

9) NADPH + MTT + H+formazan + NADP+ MTT = 3-(4,5-dimethyl-thiazolyl-2-)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromid.

Den i reaktionsskema 9) som elektronoverfører anførte diapho-25 rase foretrækkes. Der kan imidlertid også anvendes andre elektronoverførere, der kendes af fagmanden. Især phenazin— methosulfat (PMS) og phenantroltnmethosulfat har vist sig velegnede dertil. Denne udførelsesform egner sig også udmærket til anvendelse på prøvestrimler.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres generelt ved

DK 151974 B

8 pH-værdier mellem 7 og 9,5. Ved højere og lavere pH-værdi-er opnås en betydelig forsinkelse af reaktionen med en tilsvarende forlængelse af tidsforbruget pr. prøve. De bedste resultater opnås ved pH-værdier mellem ca. 8 og ca. 8,6.

5 Passende pufferkoncentrationer ligger mellem 5 millimol/liter og 0,5 mol/liter svarende til ca. 0,05 til 6% puffersalt i prøven. Fortrinsvis anvendes puffer i en koncentration mellem ca. 10 og ca. 100 millimol/liter.

Arten af den benyttede puffer er ikke kritisk. Vigtigt er det 10 blot, at den pufrer i det ovenfor nævnte område. Således blev der eksempelvis opnået sammenlignelige gode resultater med phosphatpuffer, triethanolaminpuffer, glycinpuffer, pyro-phosphatpuffer, tris (hydroxymethyl)-aminomethanpuffer eller imidazol-puffer. De to sidstnævnte puffere foretrækkes af måletekniske 15 og håndteringsmæssige grunde. De øvrige ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen benyttede reagenser og enzymer kan anvendes inden for et bredt koncentrationsområde, uden at resultatet af målingen forandres. I intet tilfælde er det nødvendigt at overholde kritiske, snævre qrænser for et af reagenserne. Som tetra-20 zoliumsalt foretrækkes det allerede nævnte MTT. Der kan i-midlertid også anvendes andre tetrazoliumsalte. Gode resultater blev især også opnået med nitroblåt-tetrazoliumchlorid (NBT) og 2- (p-jodphenyl) -3- (p-nitro phenyO -5- phenyl-tetrazolium-chlorid(INT). Udvælgelsen af tetrazoliumsaltet sker under 25 hensyntagen til opløseligheden af det dannede formazanfarve-stof. Har sidstnævnte nemlig en ringe opløselighed, så kan der ved høje GOT- eller GPT-aktiviteter ske udfældninger af farvestoffet, hvilket fører til målevanskeligheder. Af denne grund bliver der ved gennemførelsen af fremgangsmåden i-30 følge opfindelsen under måling af et formazanfarvestof hensigtmæssigt tilsat et overfladeaktivt middel, som forbedrer farvestoffets opløselighedsforhold. Eksempler på egnede overfladeaktive midler er desoxycholsyre, saponin, alkylaryl-polyethylenglycol-estere og-ethere, sorbitanestere, såsom 35 sorbimacrogololeat, polyethylenglycollaurylethere og lignende. Koncentrationen af overfladeaktivt middel ligger gene-

DK 151974 B

9,

Opfindelsen angår endvidere et reagens til bestemmelse af GOT og GPT ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og som er ejendommeligt ved, at det indeholder γ-aminobutyrat-transaminase (GAB-GT), succinat-semialdehyd-dehydrogenase (SS-A1-DH), γ-aminobutyrat, glutamat, NADP, puffer samt enten oxalacetat eller pyruvat og 5 eventuelt tetrazoliumsalt, elektronoverfører og overfladeaktivt middel.

Med hensyn til γ-aminobutyrat, glutamat, oxalacetat og pyruvat er der tale om saltene af de til grund liggende syrer med kationer, som ikke påvirker den enzymatiske reaktion.

Generelt foretrækkes alkali-ammonium- eller aminosalte, men også magnesiumsalte og lignende kan anvendes.

Et foretrukket reagens af denne art indeholder 0,5 til 20 U/ml 15 SS-A1-DH, 0,5 til 20 U/ml GAB-GT, 0,1 til 50 millimol/liter pyruvat eller oxalacetat, 0,02 til 0,5 mol/liter glutamat, 10 til 300 millimol/liter γ-aminobutyrat, 0,2 til 10 millimol NADP og 10 til 100 millimol/liter puffer, referende til koncentration i prøven. Reagenset kan foreligge i tør form el- 20 ler i form af en opløsning. Samtlige bestanddele kan foreligge blandet eller separat.

Fortrinsvis indeholder et sådant reagens yderligere 0,02 til 1 U/ml diaphorase, 0,02 til 0,5 millimol/liter MTT, INT eller NBT 25 og 0,5 til 5% overfladeaktivt middel. U er den internationale enhed og svarer til den enzymmængde, der omsætter 1 μπιοί substrat per minut.

Diaphorasen kan herved også være erstattet af ikke-enzymatisk 30 virkende elektronoverførere. Dette reagens egner også særligt til imprægnering af eller inkorporering i bærematerialer til fremstilling af prøvestrimler.

Bestemmelsen ifølge opfindelsen forløber hurtigt. En inku-35 bationstid mellem 1 og 5 minutter, fortrinsvis på ca. 2 minut ter, er fuldstændig tilstrækkelig. Efter starten af reaktionen ved tilsætning af prøveopløsningen, som skal undersøges, er målingen afsluttet efter få minutter. I reglen måles eks-

DK 151974 B

10 dier tilstrækkelige, som optages i løbet af 1 eller 2 minutter. For nemheds skyld optages 2 til 4 måleværdier med minutafstande.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udmærker sig ved høj nøj-5 agtighed, ringe tidsforbrug, ringe tilbøjelighed til forstyrrelse og ved at kunne gennemføres med enkle fotometriske indretninger. Da målingen af absorptionsændringen sker pr. minut, bliver måletiden kort. Der kræves også kun en enkelt inkubation. En væsentlig fordel består i, at absorptionsæn-10 dringen er en absorptionsforøgelse, så at måleparameteren ikke skal benyttes i begrænsede mængder og ingen falske værdier af for høje aktiviter af GPT eller GOT kan foregøgles, således som dette er tilfældet ved fremgangsmåder, ved hvilke der sker en absorptionsformindskelse.

15 i de efterfølgende eksempler anvendes følgende forkortelser: GPT glutamat-pyruvat-transaminase GAB-GT γ-aminobutyrat-a-ketoglutarat- transaminase SS-Al-DH succinatsemialdehyd-dehydroge- 20 nase GOT glutamat-oxalacetat-transami- nase NADP nicotinamid-adenin-dinucleo- tidphosphat 25 NADPH nicotinamid-adenin-dinucleo- tidphosphat, reduceret MTT 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)- 2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid

Tris tris(hydroxymethyl)-aminome- 30 than

Triton"'x 100 alkylaryl-polyethylenglycol- ether

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

DK 151974B

Påvisning af GPT; NADPH-dannelse som målesignal. Temperatur: 25°C, bølgelængde 365 nm, prøvevolumen 3 ml, 1 cm kuvetter.

Eksempel 1 η.

5 Begyndelsesopløsning_Mængde Koncentration i prøve_

Tris HC1, pH 8,3 50 millimol/1 (=0,6055%) 1,5 ml 25 millimol/1 (=0,30275%) NADP, 27 millimol/1 (=2%) 0,1 ml 0,9 millimol/1 (0,067%) 10 γ-aminobutyrat, 0,9 millimol/1 pH 8,3 (=9%) 0,2 ml 60 millimol/1 (=0,06%)

Glutamat, 0,6 mol/1, pH

8,3 (=8,8%) 0,5 ml 0,1 mol/1 (=1,47%)

Natriumpyruvat, 0,55 mol/1 (=6%) 0,03 ml 5,4 millimol/1 (=0,06%) 15 GAB-GT, 86 U/ml (=11% protein) 0,05 ml 1,43 U/ml (= 0,183%) SS-Al-DH, 133 U/ml 0,05 ml 2,2 U/ml (=0,183%) (=11% protein) 20 H20 0,02 ml

Blanding, begyndelse med_

Serum (GPT-holdig) _ 0,5 ml____

Blanding, inkubering i 2 minutter, aflæsning af , aflæsning 25 af E2, E^, E^ og E^ efter nøjagtig 1,2,3 og 4 minutter. Heraf beregnes ΔΕ/minut. GPT-aktiviteten i prøven beregnes ifølge U/ml = — = ΔΕ x 1,714, hvor V betyder prøvevolumen, v betyder prøvevolumen ved forsøget i ml, E betyder ekstinktion, og ε betyder ekstinktionskoefficient.

30 :

Eksempel 2 GPT-bestemmelse; formazan-dannelse som målesignal.

35 o

Temperatur 25 C, bølgelængde 578 nm, prøvevolumen 3 ml, 1 cm kuvette.

I kuvette DiDetteres: 12

DK 151974B

Udgangsopløsning Mængde Koncentration 1 prøve TRIS HC1, pH 8,3 50 „ „ mm ni /1 ' 1,5 ml triton ^ x 100 5 (= 1%) (= 0,6055%) indeholdende 2% triton x 100 tris 25 mmol/1 (= 0,30275%) NADP, 27 mmol/1 (= 2%) 0,1 ml ] 0,9 mmol/1 10 j (= 0,067%) i γ-aminobutyrat, 0,9 mol/1 0,2 ml ! 60 mmol/1 (= 9%) (= 0,06%) glutamat, 0,6 mol/1 :0,5 ml : 0,1 mol/1 (= 8,8%) . } (= 1,47%) ] 15 natriumpyruvat, 0,55 mol/1 0,03 ml ; 5,4 mmol/1 (= 6%) j (= 0,06%) i MTT, 1,5 mmol/1 0,2 ml ! 0,1 mmol/1 (= 0,0621%) 5 (= 0,00414%) GAB-GT, 86 U/ml (= 11% 10,05 ml j 1,43 U/ml 20 protein) I j (= 0,183%) j SS-A1-DH, 133 U/ml ;0,05 ml | 2,2 U/ml (= 11% protein) : j (= 0,183%) I i diaphorase, 23 U/ml s i (= 0,5% protein) >0,01 ml j 0,077 U/ml 25 j i (=0,0017%) ! ; H„0 ‘0,26 ml ! _f_i_i_ blanding, begyndelse med serum (GPT-holdigt) 0,1 ml blanding, inkubering i 2 minutter, aflæsning af E^, aflæs-30 ning af E2, E3, E4 og E5 efter nøjagtig 1,2,3 og 4 minutter, derefter beregning af ΔΕ/minut. GPT-aktiviteten i prøven beregnes som følger

U/ml x - X- V = ΔΕ x 1,796 C X V

GOT-bestemmelse^ NADPH-dannelse som målesignal.

Måletemperatur 25°C, målebølgelængde 365 nm, prøvevolumen 3 ml, 1 cm kuvette.

DK 151974 B

Eksempel 3 13 5 I kuvette pipetteres:

Udgangsopløsning Mængde Koncentration i prøve imidazol x HC1, pH 7,6, 1,5 ml 50 mmol/1 ί= 3,404%) 100 ramol/1 (= 6,808%) NADP, 27 mmol/1 (= 2%) 0,1 ml 0,9 mmol/1 {- 0,067%) 10 γ-aminobutyrat, 0,9 mol/1 0,3 ml 90 mmol/1 (= 0,9%) pH 8,3 (= 9%) glutamat, 0,6 mmol/1 pH 0,3 ml 60 mmol/1 (= 0,88%) 8,3 (= 8,8%) oxalacetat, 20,8 mmol/1 0,1 ml 0,65 mmol/1 (= 0,00917%; 15 (= 0,275%) GAB-GT, 86 U/ml (= 11% 0,05 ml 1,43 U/ml {= 0,183%) protein j SS-Al-DH, 133 U/ml (= 11% I 0,05 ml 2,22 U/ml {= 0,183%) protein i i 20 h20 0,1 ml blanding, begyndelse med serum (GOT-holdigt) 0,5 ml blanding, inkubering i 2 minutter, aflæsning af aflæsning af E2, E^, E^ og Ε^ efter nøjagtig 1,2,3 og 4 minutter, der-25 af beregning af ΔΕ/minut. GOT-aktiviteten i prøven beregnes som følger: U/ml = M x-v= AE x 1,717 ε x v Påvisning af GOTj formazandannelse som målesignal.

Temperatur 25°C, målebølgelængde 578 nm, prøvevolumen 3 ml, 1 cm kuvetter.

Eksempel 4 14

DK 151974B

5 Udgangsopløsning Mængde Koncentration i prøve imidazol x HCl, pH 7,6, 1,5 ml imidazol 50 mmol/1 100 mmol/1 (= 6,808%) . (= 0,30275%) (3 3% triton x 100 i triton x 100 (= 1,5%) i NADP, 27 mmol/1 (= 2%) i 0,1 ml 0,9 mmol/1 (= 0,067%) t 10 γ-aminobutyrat, 0,9 mmol/1 ; 0,3 ml 90 mmol/1 (= 0,9%) pH 8,3 (= %) ; > glutamat, 0,5 mol/1, pH 8,3 . 0,3 ml 60 mmol/1 (= 0,88%) (= 8,8%) i ! oxalacetat, 20,8 mmol/1 0,1 ml ! 0,65 mmol/1 (= 0,00917%) 15 (=0,275%) : MTT, 1,5 mmol/1 (= 0,0621%) ' 0,2 ml : 0,1 mmol/1 (= 0,00414%) GAB-GT, 86 U/ml (= 11% ! 0,05 ml 1,43 U/ml (= 0,183%)

protein I

SS-A1-DH 133 U/ml (= 11% 0,05 ml ‘ 2,22 U/ml (= 0,183%) 20 protein

Diaphorase, 23 U/ml (=0,5% 0,01 ml 0,077 U/ml (= 0,0017) protein) H20 ' 0,24 ml blanding, begyndelse med serum (GOT-holdigt) ! 0,05 ml _i-——__— blanding, inkubering i 2 minutter, aflæsning af E-^, aflæsning 25 af E2, E3, E4 og E,- efter nøjagtig 1,2,3 og 4 minutter. Prøvens GOT-aktivitet beregnes som følger:

ΔΕ x V

U/ml = * * = ΔΕ x 3,593

Eksempel 5 15

DK 151974B

Påvisning af GPT på prøvestrimler.

Et egnet papir vædes med en opløsning, som indeholder samtlige reagenser ifølge eksempel 2, tørres forsigtigt, fastgø-5 res på egnet bæremateriale, forsegles og skæres i strimler.

Efter neddypning i serum fremkommer en rødblå farvning, hvis intensitet er proportional med GPT-aktiviteten i prøven. Vurderingen kan foregå ved sammenligning med en egnet standardfarveskala. Ligeledes er vurderingen mulig med refleksions-10 fotometeret.

Eksempel 6 Påvisning af GOT på prøvestrimler.

Et egnet papir vædes med en ifølge eksempel 4 fremstillet reagensopløsning, tørres forsigtigt, fastgøres til et egnet bæ-15 remateriale, forsegles eventuelt og skæres i strimler. Efter neddypning i serum fremkommer en rødblå farvning, hvis intensitet er proportional med GOT-aktiviteten i prøven. Denne vurdering kan foregå ved sammenligning med en egnet standardfarveskala. Ligeledes er vurderingen mulig med reflek-20 sionsfotometeret.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af glutamat-oxalacetat-transaminase eller glutamat-pyruvat-transaminase ved omsætning af oxalacetat eller pyruvat med glutamat under dannelse af a-ketoglutarat i pufret opløsning, kendetegnet 5 ved, at man omsætter dannet α-ketoglutarat med γ-aminobuty-rat i nærværelse af γ-aminobutyrat-transaminase under dannelse af succinat-semialdehyd, reducerer NADP med sidstnævnte i nærværelse af succinat-semialdehyd-dehydrogenase til dannelse af NADPH og enten måler dette direkte eller med et te-10 trazoliumsalt og en elektronoverfører overfører det til et formazanfarvestof og måler dette.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som elektronoverfører anvendes diaphorase, phenantro-linmethosulfat eller phenazinmethosulfat.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der som tetrazoliumsalt anvendes 3-(4,5-dimethyl-thia-zolyl-2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid, nitroblåt-tetrazoli-umchlorid eller 2-(p-jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchlorid.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der indstilles en pH-værdi mellem 7 og 9,5.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes en pufferkoncen- 25 tration mellem 0,Q5 og 6%.

6. Reagens til bestemmelse af glutamat-oxalacetat-trans-aminase eller glutamat -pyruvat-transaminase ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder γ-aminobutyrat-transaminase, succinat-semialddhyd-dehydrogenase, 30 γ-aminobutyrat, glutamat, NADP, puffer, enten oxalaceta't eller DK 151974B pyruvat og eventuelt tetrazoliumsalt, elektronoverfører og overfladeaktivt middel.

7. Reagens ifølge krav 6, kendetegnet ved, det som elektronoverfører indeholder diaphorase, phenantrolinme- 5 thosulfat eller phenazinmethosulfat.

8. Reagens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det som tetrazoliumsalt indeholder 3-(4,5-dimethyl-thiazolyl-2)- 2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid, nitroblåt-tetrazoliumchlorid eller 2-(p-jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazolium- 10 chlorid.

9. Reagens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det indeholder 0,5 til 20 U/ml succinat-semialdehyd-dehydrogenase, 0,5 til 20 U/ml γ-aminobutyrat-transaminase, 0,1 til 50 mmol/1 pyruvat eller oxalacetat, 0,02 til 0,5 mol/1 glutamat, 10 til 15 300 mmol/1 γ-aminobutyrat, 0,2 til 10 mmol/1 NADP og 10 til 100 mmol/1 puffer, refererende til koncentrationen i prøven.

10. Reagens ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder 0,02 til 1 U/ml diaphorase, 0,02 til 0,5 mmol/1 3-(4,5-dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl-tetrazo- 20 liumbromid, og 0,5 til 5% overfladeaktivt middel, refererende til koncentrationen i prøven.

11. Reagens ifølge ethvert af kravene 6 til 10, k ende-tegnet ved, at det indeholder tris (hydroxymethyl)-amino- 25 .methanpuffer eller imidazolpuffer. r