JP5443355B2 - 免疫学的測定におけるヘモグロビンの影響回避方法及びそのための試薬 - Google Patents
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Description
また、特許文献4には、抗ヒトCRPウサギ血清を用いたヒト血清中のCRPの免疫学的測定方法において、多価フェノールを添加することにより、補体成分による非特異反応を抑制できることが記載され、具体例として硫酸カリックス(6)アレーンを5mM添加することにより補体等による非特異反応が抑制できたことが記載されている。しかし、この特許文献4には、ヒト血清を試料とし、抗ヒトCRPウサギ血清を用いてCRPを測定する場合における補体の影響に対するカリックスアレーン類の作用が記載されているだけであり、カリックスアレーン類が感度に対してどのような作用をするか、また、ヘモグロビンの影響に対する効果については全く記載されていない。更に、測定対象抗原又は抗体を、当該抗原に対する抗体又は当該抗体に対する抗原を感作した不溶性担体(例えばラテックス粒子)を用いて測定する方法については何ら記載されていない。
また、本発明は、試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法において、大環状化合物を主成分とする感度増強剤又はヘモグロビンの影響回避剤を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬を提供するものである。
該不溶性担体としては、有機高分子粒子、無機物質粒子、赤血球などが挙げられる。有機高分子粒子としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどの粒子が例示でき、好ましくはラテックス粒子が良い。該ラテックス粒子としては、例えばポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどの粒子が挙げられる。さらには、種々の変性ラテックス(例えば、カルボン酸変性ラテックス)等を必要に応じて用いてもよい。用いるラテックス粒子の平均粒径は、測定機器などによって0.05〜0.50μmのものが適宜選択される。無機物質粒子としてはシリカ、アルミナなどが挙げられる。
反応系におけるシクロデキストリンの濃度は、1〜400mM、特に1〜100mMが好ましい。
(1)第一試薬の調製
Calix[8]arene p−sulfonic acid,octasodium salt,hydrate若しくはCalix[6]arene p−sulfonic acid,hexasodium salt,hydrate(同仁化学研究所社製)を0.01〜10mM(反応系での終濃度0.005〜5mM)の濃度で、0.4% 牛血清アルブミン及び0.5M塩化ナトリウムを含む30mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)に添加して第一試薬とした。尚、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。
抗SFモノクローナル抗体を、20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で0.7mg/mLとなるように希釈した抗体液と、平均粒径0.2μmのポリスチレン系ラテックス(積水メディカル社製)1%懸濁液を等量ずつ混和し、4℃で2時間攪拌した。さらに1%牛血清アルブミンを等量加え1時間攪拌した後、遠心分離により沈殿部を集め、0.5%牛血清アルブミンを含む5mM MOPS(pH7)で懸濁し、第二試薬(抗SF抗体固定化粒子懸濁液)を調製した。
精製したフィブリノゲンにトロンビンを作用させて調製した酸可溶性desAABBフィブリンを、ヒトクエン酸血漿にそれぞれ最終濃度10.3μg/mLとなるように添加して可溶性フィブリンを調製した。尚、試薬ブランクの測定には生理食塩水を用いた。
試料3μLに第一試薬100μLを加え、37℃で5分間加温後、第二試薬100μLを加えて撹拌後1〜5分の主波長570nm及び副波長800nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度値を表1及び表2に示した。
実施例1同様、酸可溶性desAABBフィブリンを、ヒトクエン酸血漿にそれぞれ最終濃度10.3、及び20.1μg/mLとなるように添加して可溶性フィブリンを調製し、第一試薬に反応系終濃度で0.005〜2mMの各カリックスアレーンを含む試薬を用いて測定した。尚、第二試薬は実施例1と同じものを用いた。また、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。得られた吸光度とSF濃度の関係を表3及び4に示した。
(1)第一試薬の調製
Calix[8]arene p−sulfonic acid,octasodium salt,hydrate若しくはCalix[6]arene p−sulfonic acid,hexasodium salt,hydrate(同仁化学研究所社製)を0.01〜5mM(反応系での終濃度0.005〜2.5mM)の濃度で、0.2M塩化ナトリウムを含む0.05M グリシン緩衝液(pH9)に混和し、第一試薬を調製した。尚、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。
精製ヒトapo(a)を免疫原として、定法によりマウスから得られた、単独種類の使用により免疫凝集を生じさせるモノクローナル抗体(工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたハイブリドーマ28205(FERM BP−3755)により生産されるもの。以下「抗Lp(a)モノクローナル抗体」と称する。〕を1.4mg/mLの濃度で0.05Mグリシン緩衝液(pH9)に混和した液と平均粒径0.1μmのポリスチレン系ラテックス(積水メディカル社製)5%懸濁液を等量加え、4℃にて2時間撹拌した。遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に2%牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシン緩衝液(pH9)を加え、4℃で一晩撹拌した。遠心分離により沈殿部を集め、これを2%牛血清アルブミンを含む0.05Mグリシン緩衝液(pH9)で懸濁し、抗Lp(a)抗体固定化粒子懸濁液を調製した。
Lp(a)濃度既知血清を用いた。
Lp(a)を含有する試料液2.5μLに第一試薬100μLを加え、37℃で5分間加温後、第二試薬100μLを加えて撹拌後1〜5分の主波長570nm及び副波長800nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とLp(a)濃度の関係を表5及び6に示した。
(1)第一試薬の調製
Calix[6]arene p−sulfonic acid, hexasodium salt,hydrate(同仁化学研究所社製)を0.01〜6mM(反応系終濃度0.005〜3mM)、及び0.4%牛血清アルブミン、0.5M塩化ナトリウムを含む30mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)を第一試薬とした。尚、比較例としてはカリックスアレーン類を含まない第一試薬を用いた。
抗SFモノクローナル抗体を20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で0.7mg/mLとなるように希釈した抗体液と、平均粒径0.2μmのポリスチレン系ラテックス(積水メディカル社製)1%懸濁液を等量ずつ混和し、4℃で2時間攪拌した。さらに1%牛血清アルブミンを等量加え1時間攪拌した後、遠心分離により沈殿部を集め、0.5%牛血清アルブミンを含む5mM MOPS(pH7)で懸濁し、第二試薬(抗SF抗体固定化粒子懸濁液)を調製した。
ヘモグロビン試料として、干渉チェックAプラス(Sysmex社製)の溶血ヘモグロビンを用いて、ヘモグロビン濃度0〜500mg/dLの試料を調製した。
試料3μLに第一試薬100μLを加え、37℃で5分間加温後、第二試薬100μLを加えて撹拌後1〜5分の主波長570nm及び副波長800nmにおける吸光度変化量を測定した。得られた吸光度の測定結果を表7に示した。
実施例4のCalix[6]arene p−sulfonic acid,hexasodium salt,hydrateに変えて、Calix[8]arene p−sulfonic acid,octasodium salt,hydrate(同仁化学研究所社製)を第一試薬中で0.01〜4mM(反応系終濃度0.005〜2mM)を用いた以外は、実施例4と同様に測定した。得られた吸光度の測定結果を表8に示した。
実施例4のCalix[6]arene p−sulfonic acid,hexasodium salt,hydrateに変えて、β−シクロデキストリンを第一試薬中で10mM若しくは40mM(反応系終濃度5若しくは20mM)を用いた以外は、実施例4と同様に測定した。得られた吸光度の測定結果を表9に示した。
Claims (9)
- 生体試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法において、カリックス(8)アレーン、カリックス(6)アレーン、及びβ−シクロデキストリンから選ばれる大環状化合物の存在下に反応を行うことを特徴とする免疫学的測定におけるヘモグロビンの影響回避方法。
- 免疫学的測定方法が、抗体を感作した不溶性担体を用いるものである請求項1記載の方法。
- 免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法又は金属コロイド凝集法である請求項1又は2記載の方法。
- 測定対象物質が蛋白抗原である請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- カリックス(8)アレーン、又はカリックス(6)アレーンの反応系における終濃度が0.005mM〜4mMである請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 生体試料中の測定対象物質を抗原抗体反応を用いて測定する免疫学的測定方法に使用される試薬であって、カリックス(8)アレーン、カリックス(6)アレーン、及びβ−シクロデキストリンから選ばれる大環状化合物を主成分とするヘモグロビンの影響回避剤を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬。
- 大環状化合物がカリックス(8)アレーン、又はカリックス(6)アレーンである請求項6記載の免疫学的測定用試薬。
- 免疫学的測定方法が、抗体を感作した不溶性担体を用いるものである請求項6又は7記載の免疫学的測定用試薬。
- カリックス(8)アレーン、又はカリックス(6)アレーンの反応系における終濃度が0.005mM〜4mMである請求項6〜8のいずれか1項記載の免疫学的測定用試薬。
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