JP2003207512A

JP2003207512A - イムノアッセイに用いるための第三級アミン化合物

Info

Publication number: JP2003207512A
Application number: JP2002363686A
Authority: JP
Inventors: Christopher C Lawrence; シー．ローレンスクリストファー; Armen B Shanafelt; ビー．シャナフェルトアーメン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2001-12-18
Filing date: 2002-12-16
Publication date: 2003-07-25
Also published as: CA2414704A1; EP1321770A3; US6777246B2; EP1321770A2; US20030138974A1

Abstract

(57)【要約】【課題】粒子に基づく凝集イムノアッセイにおいて粒
子とサンプル成分との非特異的相互作用を抑制し、該ア
ッセイの精度を向上させる。【解決手段】各粒子の表面がカルボジイミドにより活
性化されており、且つ、結合剤が共有結合により該表面
に連結されている複数の粒子と、式I： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル及
びアルキルエーテルからなる群から選択され、X、Y、及
び Z は、互いに独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)
-OH、-C(=O)-OR⁴又は -C(=O)-NHR⁴からなる群から選択
され、ここで、R⁴はアルキルである]で表される第三級
アミン化合物と、を含んでなる、イムノアッセイに用い
るための試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粒子に基づく凝集
イムノアッセイの技術分野に属する。

【０００２】

【従来技術】薬物分子等のアナライトの検知において、
イムノアッセイは非常に有用であることが分かってい
る。イムノアッセイでは、アナライト（抗原と称するこ
ともある）と特異的受容体（典型的には抗体）との相互
作用の結果、抗原-抗体複合体が形成される。この複合
体は、放射能、蛍光、吸光、光散乱等の種々の測定によ
り検出できる。この結果はアナライトの有無、理想的に
は濃度と相関する。

【０００３】イムノアッセイの１種に、粒子に基づく凝
集イムノアッセイがある。これは、一方が粒子に結合さ
れている抗原と抗体との結合に基づくものである。用い
られる粒子は、多くの場合、ポリスチレン、ポリ(メチ
ルメタクリレート)等のポリマー粒子であり、典型的に
は乳化重合法により製造されたものである。金ナノ粒
子、金コロイド等の金粒子、及び、シリカ、ガラス、金
属酸化物粒子等のセラミック粒子を含めて、他の粒子系
を使用することもできる。抗原又は抗体である結合剤を
粒子上に物理的に吸着させることもできる。しかしなが
ら、結合剤を共有結合により結合させた場合のほうがよ
り高い安定性とより長い貯蔵寿命が得られる。例えば、
J.L. Ortega-Vinuesaら, J. Biomater. Sci. Polymer E
dn., 12(4),379-408 (2001)を参照されたい。

【０００４】共有結合により連結された結合剤を有する
粒子は、典型的には、粒子の活性化とその後の活性化さ
れた粒子への結合剤のカップリングにより製造する。あ
る例では、活性化の後に活性化された粒子への連結基の
カップリングを行い、次いで該連結基を介して結合剤を
粒子につなぎ止める。連結基としては、例えば、アビジ
ン又はストレプトアビジン、及びマレイミド、チオール
等の官能基を提示する化学成分が挙げられる。

【０００５】カルボキシレート基が表面に結合している
粒子に関しては、活性化は、多くの場合、該粒子を、カ
ルボジイミドカップリング試薬及びN-ヒドロキシスクシ
ンイミド（NHS）、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド
（sNHS）等のスクシンイミド試薬の溶液と接触させるこ
とにより行う。こうして表面上のカルボキシレート基を
NHS-エステル基又はsNHS-エステル基に変換する。カル
ボジイミドカップリング試薬としては、例えば、N-エチ
ル-N’-(3-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド
（EDC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）及び
ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）が挙げられる。
その後、結合剤又は連結基を、活性化された粒子と該結
合剤又は該連結基とを水性混合物中で混合することによ
って粒子にカップリングすることができる。活性化され
た粒子と接触させようと、連結基を含む粒子と反応させ
ようと、ひとたび結合剤が表面に連結されると、感作さ
れた粒子（sensitized particle）が形成される。この
工程の単純な例（スクシンイミド試薬としてNHSを用
い、抗体により感作する）の説明図を次の反応スキーム
において示す。典型的には、次に、この工程により製造
した感作された粒子を、残存するNHSエステル基又はsNH
Sエステル基と反応してそれを不活性化させる働きをす
る、ウシ血清アルブミン（BSA）等のブロッキング剤で
処理する。

【０００６】

【化１】

【０００７】かかる感作された粒子を水性環境において
分析サンプルと混合すると、サンプル中のアナライト
は、粒子上に存在するか又は液体混合物中に別個に存在
し得る抗体と特異的に結合することになる。アッセイの
特定のフォーマットに応じて、この相互作用が粒子の凝
集を引き起こしてもよく（直接認識）、又は、凝集過程
を阻害してもよい（競合的阻害）。凝集とは、個々の粒
子の大きさよりも大きな集合体の大きさを有する粒子の
クラスターの形成であり、サンプルによる光の吸収又は
散乱の変化を測定することにより検出できる。理想的に
は、粒子に基づく凝集イムノアッセイにおける凝集の程
度が、サンプル中の抗原の量と相関し得る。しかしなが
ら、粒子とサンプルとの非特異的相互作用が、抗原-抗
体相互作用とは無関係な粒子の凝集又は粒子の凝集の阻
害を引き起こすことがある。これらの望ましくない相互
作用は、偽陽性の結果又は偽陰性の結果をもたらすこと
があり、また、凝集応答と対象とする抗原の濃度との不
正確な相関をもたらすこともある。これらの望ましくな
い作用の全ては、アッセイ結果の質を低下させる。これ
らはまとめて「干渉」として知られている。

【０００８】種々の物質が非特異的相互作用を抑制する
ことにより凝集イムノアッセイにおける干渉を減少させ
る、と報告されている。例えば米国特許第4,362,531号
には、グアニジニウム塩、チオシアン酸塩、アルカリ金
属ハロゲン化物塩などの塩の使用が記載される。加え
て、米国特許第5,506,151号及び同第5,486,479号には、
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)ウレア（ED
U）、3-ジメチルアミノプロピルアミン、3-ジエチルア
ミノプロピルアミン、ジメチルアミノプロピルクロリ
ド、メソ-p-トルエンスルホン酸1-シクロヘキシル-3-(2
-モルホリノエチル)カルボジイミド（CMC）等の第一
級、第二級及び第三級アミンの使用が記載される。他の
報告されている物質としては、ハロゲン置換カルボン酸
（米国特許第4,536,478号）及び置換アミド（米国特許
第4,292,038号）が挙げられる。一般的にはこれらの添
加剤では、非特異的相互作用による干渉を低減すること
と、対象とする抗体又は抗原に対する該添加剤の反応性
を最小化することの間で最適なバランスがとれない。添
加剤と抗体又は抗原との非特異的相互作用もまたイムノ
アッセイにおける干渉の一因である。

【０００９】従って、粒子に基づく凝集イムノアッセイ
においては、粒子と分析するサンプルの成分との非特異
的相互作用を防止することが望まれる。また、抗原又は
抗体との相互作用を回避しながらイムノアッセイにおい
て非特異的相互作用を抑制することができる添加剤を提
供することも望まれる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、粒子に基づく凝集イムノアッセイにおいて
粒子と分析するサンプルの成分との非特異的相互作用を
防止し、それによってイムノアッセイの精度を向上させ
ることである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の一形態では、複
数の粒子、及び、式I： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル及
びアルキルエーテルからなる群から選択され、X、Y、及
び Z は、互いに独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)
-OH、-C(=O)-OR⁴又は -C(=O)-NHR⁴からなる群から選択
され、ここで、R⁴はアルキルである]で表される第三級
アミン化合物、を含んでなる、イムノアッセイに用いる
ための試薬を提供する。前記の各粒子は、表面がカルボ
ジイミドにより活性化されており、且つ、結合剤が共有
結合により該表面に連結されている。

【００１２】本発明の他の形態では、複数の粒子、及
び、式II： N(R¹-OH)(R²-OH)(R³-OH) (II) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、１〜５個の
炭素原子を含んでなるアルキル基である]で表される第
三級アミン化合物、を含んでなる、イムノアッセイに用
いるための試薬であって、該試薬がサンプルと混合され
てアッセイ混合物を形成し、そしてその結果、第三級ア
ミン化合物がアッセイ混合物中で50mM以下の濃度で存在
する前記試薬を提供する。前記の各粒子は、表面がカル
ボジイミドにより活性化されており、且つ、結合剤が共
有結合により該表面に連結されている。

【００１３】本発明のさらに別の形態では、アナライト
を含んでいる可能性があるサンプルと上記試薬のうちの
何れかとを混合すること、及び、検出可能な複合体の存
在又は量を、該サンプル中の該アナライトの指標として
測定すること、を含んでなる、アナライトを測定するた
めのアッセイ方法を提供する。試薬は、アナライトの抗
体を含んでなり、該試薬は該アナライトと検出可能な複
合体を形成できる。

【００１４】本発明のさらに別の形態では、上記試薬の
うちの何れかを含んでなる試験キットを提供する。

【００１５】本発明のさらに別の形態では、アナライト
を含んでいる可能性があるサンプルを、各粒子の表面が
カルボジイミドにより活性化されており、且つ、結合剤
が共有結合により該表面に連結されている複数の粒子と
混合するイムノアッセイ法であって、式（I）： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル及
びアルキルエーテルからなる群から選択され、X、Y、及
び Z は、互いに独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)
-OH、-C(=O)-OR⁴又は -C(=O)-NHR⁴からなる群から選択
され、ここで、R⁴はアルキルである]で表される第三級
アミン化合物を該サンプルに添加してアッセイ混合物を
形成することを特徴とする上記方法を提供する。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明は、粒子凝集イムノアッセ
イにおける干渉を低減することを意図している。カルボ
ジイミドと、NHS又はsNHSのどちらかで活性化した後
に、結合剤により感作した粒子を、特定の第三級アミン
化合物の存在下でイムノアッセイにおいて使用する。本
発明において使用する第三級アミン化合物は、粒子とサ
ンプル成分との非特異的相互作用を防止するうえで非常
に有効である。非特異的相互作用の減少又は排除はイム
ノアッセイの精度を向上させる。

【００１７】アナライトの粒子凝集イムノアッセイは、
表面上に結合剤を含んでなる粒子を利用する。アナライ
トの抗体は、分析するサンプル中のアナライトと特異的
に相互作用し、場合によっては、アッセイ混合物に存在
するアナライトのコンジュゲートとも特異的に相互作用
する。これらの相互作用は粒子の凝集の程度に影響を与
える。そして、この凝集をモニターして、サンプル中の
アナライトの量と相関させることができる。凝集イムノ
アッセイは、抗体とアナライトとの結合が凝集に直接に
影響する直接アッセイであってもよい。または、凝集イ
ムノアッセイは、有効抗体との結合をめぐり、アナライ
トが該アナライトのコンジュゲート誘導体と競合する、
競合阻害アッセイであってもよい。

【００１８】アナライトとは、液体媒質中での存在又は
量を測定しようとする物質又は物質の群を指し、任意の
薬物若しくは薬物誘導体、ホルモン、タンパク質抗原、
オリゴヌクレオチド、ハプテン又はハプテン-担体複合
体が含まれるがこれらに限定されない。アナライト類似
体とは、アナライトと同様に挙動するか、又は、抗体の
アナライトに対する結合親和性及び／又は特異性に関し
て所望のアッセイ結果を得るのに役立つように挙動す
る、任意の物質又は物質の群であって、アナライトの誘
導体、代謝物及び異性体が含まれるがこれらに限定され
ない。

【００１９】抗体とは、アナライトの特異的な結合パー
トナーを意味し、他の物質を排除してアナライトに対し
て特異的結合親和性を有する任意の物質、物質の群を意
味する。この用語は、ポリクロナール抗体、モノクロナ
ール抗体及び抗体フラグメントを含む。

【００２０】ペプチドは、アミド（ペプチド）結合によ
り２個以上のアミノ酸が連結して形成される任意の化合
物であり、通常は、一本の鎖の中で、各アミノ酸残基
（NH₂-末端を除く）のα-アミノ基が隣の残基のα-カル
ボキシル基と連結している、α-アミノ酸のポリマーで
ある。ペプチド、ポリペプチド及びポリ（アミノ酸）の
用語は、本明細書においては、大きさに関して限定のす
ることなくこのクラスの化合物を指す同意語として用い
る。このクラスに属する最大のメンバーはタンパク質と
称する。

【００２１】共有結合は二つの化合物間の化学結合であ
り、一重結合又は多重結合を含み得る。用語「共有結
合」には、疎水性／親水性相互作用、水素結合、ファン
デルワールス相互作用及びイオン相互作用は含まれな
い。

【００２２】アナライトを含む可能性のあるサンプルは
何れも、本発明の方法により分析できる。サンプルは典
型的には、例えば尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、
糞、痰、脳髄液、涙、粘液といった被験者の体液等の水
性溶液であり、好ましくは、尿、血漿又は血清である。
サンプルは所望であれば前処理することができ、また、
任意の適当な媒質中で調製することもできる。水性媒質
が好ましい。

【００２３】検定物質とは、測定するアナライトを既知
の量含む、任意の標準物質または対照物質を意味する。
アナライトを含有する可能のあるサンプル及び検定物質
を同じ条件の下でアッセイする。その後、未知の試料に
ついて得られた結果と標準物質について得られた結果と
を比較して、アナライト濃度を算出する。

【００２４】凝集イムノアッセイに使用し得る粒子には
カルボジイミド化学を用いて活性化される任意の種類の
粒子が含まれる。かかる粒子には、例えば、ポリスチレ
ン及びポリ(メチルメタクリレート）を含むポリマー粒
子、金ナノ粒子及び金コロイドを含む金粒子、並びに、
シリカ、ガラス及び金属酸化物粒子を含むセラミック粒
子が含まれる。例えば、C.R.Martinら, Analytical Che
mistry-News & Features, 1998年5月1日、322A-327Aを
参照のこと。

【００２５】これらの粒子は、カルボジイミド化学を用
いて直接に活性化することができ、または、その表面を
一度カルボキシレート基を含むように改変したうえで活
性化してもよい。カルボキシレート基は、例えば加水分
解反応、カルボキシル化剤による処理、又はカルボキシ
レート基を含む自己組織化単分子膜の形成により表面に
導入することができる。例えばR.G. Chapmanら, J. Am.
Chem. Soc., 122, 8303-8304 (2000) を参照のこと。
続いて活性化された粒子を抗体と混合し、続いて任意に
BSAに曝露して、感作された粒子を作製する。これらの
感作された粒子を更に第一級アミン化合物により処理し
て、サンプル成分と粒子表面上の残存するNHSエステル
又はsNHSエステルとの間の共有結合による相互作用を防
止してもよい。好適な第一級アミンとしては例えばグリ
シンエチルエステル、2-(アミノエトキシ)エタノール
（AEO）、2,2’-(エチレンジオキシ)ビスエチルアミン
（EBE）、又は、4,7,10-トリオキサ-1,3-トリデカンジ
アミン（TTD）が挙げられる。

【００２６】カルボジイミドによる活性化反応の化学の
解析により、粒子の表面に連結した第三級アミン官能基
は、O-アシルイソウレア中間体がN-アシルウレア部分に
変換することにより形成され得ることが示される。粒子
に結合したカルボキシレート基がNHS-エステル又はsNHS
-エステルに変換される間に、過剰のEDCが存在すること
により、次の反応スキームに示すように、粒子表面上に
N-アシルウレア部分が形成されるようになると考えられ
る。このN-アシルウレア部分は、その後に行なう処理ス
テップ（感作及び第一級アミンによる処理）の間、及
び、通常のイムノアッセイ条件において安定であると考
えられる。

【００２７】

【化２】

【００２８】O-アシルイソウレア基のN-アシルウレア基
への変換は、O-アシルイソウレア中間体とNHS又はsNHS
との間の所望のエステル化、及び遊離のカルボキシレー
トに戻る中間体の加水分解の両者と競合する。O-アシル
イソウレアのカルボシキレートへの加水分解反応は、エ
ステル化反応とN-アシルウレアを生じる副反応のどちら
に対しても優勢であると考えられる。N-アシルウレア部
分の形成は第２当量のカルボジイミドにより触媒され得
る（N.Nakajima及びY.Ikeda, Bioconjugate Chem., 6,
123-130, (1995)）。典型的な活性化のプロトコールで
は、EDCを添加して反応を開始する前に、粒子懸濁液中
にNHSを添加することが必要である。いったんO-アシル
イソウレア中間体が形成されると、O-アシルイソウレア
のN-アシルウレア部分への変換速度は、これらの条件下
において最小となる。この副反応の速度は高度のカルボ
キシレート活性化が望まれる場合にはより問題になる。
なぜなら、この場合は相当な当量数のEDCの使用が必要
だからである。

【００２９】粒子表面上にN-アシルウレア部分が存在す
ることは望ましくない。この基及び粒子へのその結合は
化学的に安定なので、結合剤及びウシ血清アルブミンに
よる感作、並びに残留するNHS-エステル又はsNHS-エス
テルの第一級アミンによる不活性化の両方を含めて、そ
の後に行なう全ての調製ステップの間中、微粒子上に残
存し得る。そのうえ、N-アシルウレア部分の末端の第三
級アミン基はイムノアッセイのpH条件（5<pH<9）におい
てプロトン化されることとなり、それゆえに、分析サン
プル中に存在する適当に荷電した成分または極性成分と
の非特異的な静電相互作用に関与する可能性がある。

【００３０】N-アシルウレア基がイムノアッセイの精度
に及ぼす影響は、多くのタンパク質と同様に、N-アシル
ウレア基の第三級アミンと相互作用し得る色素を用い
て、イムノアッセイ粒子の相互作用を分析することによ
り観察できる。図1を参照すると、活性化した後で第一
級アミンにより処理した粒子は、該粒子の吸光度により
示される通り、その表面に色素を吸着する。この場合の
色素はアシッドオレンジ７である。これは酸性pH条件下
にてプロトン化されたアミノ基に対して親和性を有する
色素である。該色素はカルボジイミド活性化ステップを
行なった粒子に結合する。そしてこの結合は色素-粒子
混合物中での粒子濃度に依存する。対照的に、活性化の
手順を行なっていない粒子では該色素の有意な結合は起
こらない。該色素の結合は、干渉をもたらす、粒子とサ
ンプル成分との間に起こり得る非特異的相互作用につい
てのモデルとなる。

【００３１】粒子表面上にN-アシルウレア基が存在する
ために生じる干渉は、式（I）： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル又
はアルキルエーテルであり、X、Y、及び Z は、互いに
独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)-OH、-C(=O)-OR⁴
又は -C(=O)-NHR⁴であり、ここで、R⁴はアルキルであ
る]で表される第三級アミン化合物をイムノアッセイ混
合物中に存在させることにより減少又は排除される。こ
こで、「アルキル」は、置換又は無置換の、直鎖状、分
岐状又は環状の炭化水素鎖を指す。「アルキルエーテ
ル」は、少なくとも１つの-C-O-C-結合を含んでなるア
ルキル基を指す。好ましくは、R¹、R²、R³及びR⁴は互い
に独立して１〜５個の炭素原子を含んでなるアルキル基
である。より好ましくは、R¹、R²、R³及びR⁴は互いに独
立して１〜３個の炭素原子を含んでなる。好ましくは、
X, Y, 及び Z は互いに独立して-OH又は-O-R⁴である。
より好ましくは、X, Y, 及び Z は全て-OHである。

【００３２】どのような作用理論によっても拘束される
ものではないが、第三級アミン化合物は、サンプル成分
と静電的且つ非特異的に相互作用することによって干渉
を減少させると考えられる。さもなくば、該サンプル成
分は、粒子表面上に存在するN-アシルウレア部分の第三
級アミン官能基と非特異的且つ静電的に相互作用するこ
とになる。第三級アミン化合物は身代わりとして有効に
働き、その結果、N-アシルウレアとサンプル成分との間
の相互作用を最小化又は除去する。粒子を巻き添えにす
る非特異的相互作用を抑制することにより、イムノアッ
セイの精度が向上する。

【００３３】第三級アミン化合物は、粒子を含む水性混
合物に混ぜ合わせてもよく、又は、サンプルを粒子と混
合する前にサンプルと混ぜ合わせてもよい。かくして、
イムノアッセイを行なうためにサンプルに添加する「試
薬」は、粒子及び第三級アミン化合物を含む単一の成分
であり得る。あるいは、「試薬」は2以上の成分であっ
てもよく、この場合は、各成分を単独で又は組み合わせ
てサンプルに添加することができる。分析する最終的な
混合物（アッセイ混合物と称する）中において、第三級
アミン化合物が50mM以下の濃度で存在することが好まし
い。より好ましくは、第三級アミン化合物は25mM以下の
濃度で存在する。さらに好ましくは、第三級アミン化合
物は12.5mM以下の濃度で存在する。さらに好ましくは、
第三級アミン化合物は5mM以下の濃度で存在する。第三
級アミン化合物の最少量は当業者であれば容易に決定す
ることができる。当該最少量は、非特異的相互作用を抑
制するのに有効な濃度でなければならない。大部分の条
件下では、0.5mMという最少量で足りる。より好ましい
ものは、2.5mMの濃度である。

【００３４】-R¹-X、-R²-Y及び-R³-Zは、互いに独立し
て、電子吸引性基であることが好ましい。電子吸引性基
は、その末端又は末端付近に、該電子吸引性基が結合し
ている原子よりも電気的に陰性の原子又は原子団を含
む。これらの例においては、電気的に陰性の部分をX、Y
及びZと表す。電子吸引性基の効果は、電子密度を、X、
Y及びZへと引き寄せ且つ中央の窒素から遠ざけることに
よって、中央の第三級窒素上の部分正電荷を高めること
である。部分正電荷が高められた第三級窒素は、荷電し
た又は極性の物質と静電的に相互作用する能力が増加す
る。本発明の第三級アミン化合物の-R¹-X、-R²-Y及び-R
³-Z基は、知られている最も強力な電子吸引性部分であ
るというわけではない。しかしながら、これらの基は電
気的陰性と化学的安定性とのバランスがとれている。他
の電子吸引性基は、対象とする抗体又は抗原をはじめと
するサンプル成分に対して反応性がありそうである。

【００３５】本発明の第三級アミン化合物は、サンプル
成分との非特異的相互作用をめぐって、粒子に結合した
N-アクリルウレアと競合するが、粒子に結合した抗体と
対象とする抗原との特異的相互作用は妨害しない。実
際、第三級アミン化合物を用いたイムノアッセイの性能
は干渉が無くなることにより向上する。図３及び４は、
イムノアッセイにおける、本発明の粒子の高められた性
能を示す。図３は、蛍光偏光法（FP）により行なったゲ
ンタマイシンについてのイムノアッセイの測定と、第三
級アミン化合物を添加せずに粒子凝集により行なったゲ
ンタマイシンについてのイムノアッセイの測定とを相関
させたグラフである。図４は、同じFPゲンタマイシン測
定と、第三級アミン化合物添加剤、この場合は12.5mMの
トリエタノールアミン（N(CH₂CH₂OH)₃; TEO）を用いた
粒子凝集イムノアッセイによるゲンタマイシン測定とを
相関させたグラフである。データ点を相関させた最適合
致直線は、理想的には勾配が１、y軸切片がゼロ、そし
て相関係数（R）が１の直線である。これら3つの指標の
各々に基づいて、TEOを含有するアッセイの性能はTEO無
しで行なうアッセイの性能よりも優れている。第三級ア
ミン化合物が存在すると最適合致直線の勾配が1.01とな
る。一方で、それが不存在であれば最適合致直線の勾配
は1.11となる。第三級アミン化合物が存在すると切片は
0.05となる。一方で、それが不存在であれば切片は-0.1
1となる。第三級アミン化合物はR値を0.985とする。一
方で、第三級アミン化合物が不存在であればR値は0.976
となる。またこれらの比較結果は、理想的な直線と、デ
ータから算出された最適合致直線との比較によって視覚
的にも明らかである。

【００３６】粒子凝集イムノアッセイへの添加剤として
第三級アミン類を比較したところ、本発明の第三級アミ
ン化合物は、他の第三級アミン類よりも、より正確な結
果を与えた。ゲンタマイシンイムノアッセイにおける種
々の第三級アミンについての最適合致直線のパラメータ
ーを比較する本明細書中の実施例３及び表１を参照する
と、TEOについての最適合致直線が、勾配だけでなく、
切片及びR値に関しても最適な値の組み合わせを有して
いる。他の第三級アミンは最適合致パラメーターについ
て１つ又は２つの好適な値を有してはいるが、TEOは３
つ全てについて好適な値を有している。例えば、トリエ
チルアミンはTEOと同様の切片及びR値を有しているもの
の、トリエチルアミンはTEOよりも1.0からより離れた勾
配値を有している。

【００３７】これらの結果は、粒子に基づくイムノアッ
セイの性能の向上が、本発明の第三級アミン化合物をア
ッセイ混合物に組み込むことによって実現できることを
示している。第三級アミン化合物を加えることは、それ
単独で利用してもよく、又は、イムノアッセイにおける
干渉を減少させるための他の技術と組み合わせて利用し
てもよい。粒子凝集イムノアッセイの性能を最大限にす
るには、本発明の第三級アミン化合物をアッセイ混合物
中に組み込み、且つまた第一級アミン化合物で処理した
感作された粒子を使用することが好ましい。ある場合に
は、グリシンエチルエステル、AEO、EBE、TTD等の第一
級アミンで処理した感作された粒子の使用が、イムノア
ッセイの干渉を所望の水準に低下させるのに十分であり
得る。第一級アミンによる粒子の処理又は第三級アミン
化合物の添加を、単独で又は組み合わせて使用すること
は、一方の技術が他方の技術よりも優れているかどう
か、又は、組み合わせることで最良の結果が得られるか
どうかを判断することによって経験的に決めることがで
きる。

【００３８】どのような理論によっても拘束されるもの
ではないが、この場合にN-アシルウレア基との競合を行
わなければ、その代わりとして、イムノアッセイの間に
N-アシルウレアが生物学的液体中のタンパク質成分と相
互作用するようになると考えられる。ひいては、これ
が、標的アナライトを含む生物学的液体サンプル及びそ
うでないサンプルの両方の場合において、粒子凝集過程
の動力学及び／又は熱力学を妨害し、どちらの場合にも
誤ったアッセイ結果につながる。

【００３９】本発明によるアッセイにおいては種々の補
助的な成分を用いることが多い。例えば、通常は、アッ
セイ媒体及びアッセイ成分のための安定剤のみならず、
緩衝剤もまたアッセイ媒体中に存在するであろう。多く
の場合、これらの添加剤のほかに、アルブミンのような
更なるタンパク質を加えてもよい。又は、界面活性剤、
特に非イオン性界面活性剤等を加えてもよい。

【００４０】第三級アミン化合物は、イムノアッセイ系
の他の成分と共に、アナライトを測定するためのアッセ
イ法を簡便に行なうために有用なキットに組み込むこと
ができる。本発明の汎用性を高めるために、各成分を、
同一又は別個の容器に、液体形態又は凍結乾燥形態で、
パッケージされた組合せで提供して、その方法及びアッ
セイを実質的に最適化するように各成分の比を定めるこ
とができる。各成分はそれぞれ別個の容器に入れること
ができ、また、様々な成分を、該成分の交差反応性及び
安定性に応じて１以上の容器内で組み合わせることがで
きる。好ましくは、結合剤を含んでなる感作された粒子
と第三級アミンとを同じ容器に入れて、単一の液体混合
物としてサンプルに添加するようにする。

【００４１】例えば、試験キットは、第三級アミン化合
物、特定のアナライトに特異的な抗体、該抗体又は該ア
ナライトの誘導体を含んでなる感作された粒子、該抗体
の類似体若しくは誘導体、又は該アナライトのコンジュ
ゲート誘導体をパッケージされた組合せで含んでなる。
特定の組合せキットとしては、第三級アミンと抗体とを
含む第１のパッケージと、アナライト誘導体を含んでな
る粒子を含む第２のパッケージとの組合せ；第三級アミ
ンと抗体を含んでなる粒子とを含む第1のパッケージ
と、アナライトのコンジュゲート誘導体を含む第２のパ
ッケージとの組合せ；並びに、第三級アミンと、抗体を
含んでなる粒子と、アナライトのコンジュゲート誘導体
とを含む単一のパッケージ、が挙げられる。該キットは
また、既知量のアナライトを含んでなる１以上の検定物
質を含んでいてもよい。かかる試験キットは、アナライ
ト及び構造的に関係のある化合物についての、臨床的感
度が高いアッセイのための試薬を提供することができ
る。

【００４２】本発明の別の形態は、粒子に基づくイムノ
アッセイ、特に凝集イムノアッセイにおける、粒子と分
析サンプルの成分との間の非特異的な相互作用を完全に
又は少なくとも部分的に防止又は抑制するための、上記
の式（I）又は式（II）で表される第三級アミン化合物
の使用である。特に、これらの添加剤は、抗原又は抗体
との相互作用を回避しつつも非特異的相互作用を抑制す
ることができる。

【００４３】

【実施例】以下の実施例は説明することを目的として示
すものであり、本発明の範囲を限定するものとして考え
るべきではない。

【００４４】201ナノメートル(nm)の平均粒子径、1グラ
ムあたり28.4平方メートル（m²/g）の表面積を有し、ラ
テックス1グラムあたり0.21ミリ当量（meq）の表面カル
ボキシレート基を含んでなるラテックス粒子をSERADYN
社（Indianapolis）から入手し、それ以上特徴づけるこ
とはせずに使用した。微粒子凝集イムノアッセイをHITA
CHI 717アナライザー（ROCHE DIAGNOSTICS CORPORATIO
N, Indianapolis）によって行い、その性能を、INTEGRA
700アナライザー（ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEMS）によ
って並行して行なったROCHE蛍光偏光（FP）イムノアッ
セイの結果を対照として評価した。ROCHE FP検定物質を
用いて微粒子に基づくアッセイのための検量線を作成し
た。ラテックスペレットの再懸濁化は、ULTRASONIC HOM
EGENIZER-4710 SERIES超音波処理器を用い、25〜50％の
出力にてサンプルを氷上に維持しながら行なった。そし
てラテックスの単分散性を、COBAS MIRAアナライザー
（ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEMS）によって多波長での光
吸収により評価した。

【００４５】溶媒及び緩衝剤はFISHER SCIENTIFIC社(Su
wanee, GA)から入手した。他の試薬は全てALDRICH社(Mi
lwaukee, WI)又はFLUKA社から入手し、そのまま使用し
た。

【００４６】実施例１-カルボジイミド活性化の間のN-
アシルウレア基の形成 5.0のpHを有する10mM 2-モルホリノエタンスルホン酸
（MES）中の1％ (w/v)ラテックス懸濁液50mlに、新たに
調製した0.22M NHS水溶液4.78mlを添加し、続いて、新
たに調製した0.26M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミド（EDC）水溶液4.03mlを添加した。
室温にて2時間インキュベーションした後、懸濁液を遠
心分離し（15,000 x g, 30分間）、ラテックスを、8.0
のpHを有する50mM 3-モルホリノプロパンスルホン酸（M
OPS）25mlの中に再懸濁化した。この懸濁液に、50mM MO
PS（pH 8.0）中の0.84M 2-(アミノエトキシ)エタノール
（AEO）25mlを添加した。室温にて2時間インキュベーシ
ョンした後、ラテックスを遠心分離し（15,000 x g, 30
分間）、50mM MOPS（pH 7.0）50mlに再懸濁化し、そし
て再度遠心分離した。この工程を更に3回繰り返した。
最終的なラテックスペレットを50mM MES (pH 5.0)中に
再懸濁化し、2％ (w/v)懸濁液として4℃にて貯蔵した。

【００４７】0.05〜1.0％（w/v）の上記で調製したラテ
ックス及び2mM アシッドオレンジ７色素（これは50mMス
トック水溶液として添加した）を含んでなる1mlのサン
プルについて、インキュベーションを行なった。該サン
プルのpHを1M HClを用いて3.0に調整し、該サンプルを
室温にて終夜インキュベートした。対照インキュベーシ
ョンは、EDC及びNHSを用いた活性化手順を行なっていな
いラテックスを用いて行なった。ラテックスを遠心分離
（15,000 x g, 30分間）により収集し、H₂O (pH 3.0) 1
ml中に再懸濁化し、そして再度遠心分離して未結合の色
素を除いた。この手順を更に5回繰り返した。得られた
ペレットを、30％（v/v）エタノールアミン水溶液1mlに
再懸濁化し、もう一度遠心分離した。その後、上清液の
吸光度を468nmにおいて測定した。

【００４８】粒子濃度の関数としての468nmにおける吸
光度の依存性を図１のグラフに示す。活性化していない
ラテックス粒子へのアシッドオレンジ７の結合をバック
グラウンド結合とし、これらの値を、活性化-失活させ
たラテックスにより各ラテックス濃度において観察され
た結合から差し引いて、得られたデータを図2に示す。
最適合致直線（R²=0.998）の勾配及び該色素の吸光係数
（ε₄₆₈=13,200 M^-1cm ^-1と測定された）から、ラテック
ス表面上のカルボキシレート基38個ごとに平均して1個
が、活性化-エステル化手順の間にN-アシルウレア部分
に変換された。この計算は、N-アシルウレア部分とアシ
ッドオレンジ７分子との間の相互作用が1:1の化学量論
に従っていることを前提にしている。このように、かか
るアッセイを用いて、カルボジイミドによるカルボン酸
基の活性化状態をモニターし最適化することができる。

【００４９】実施例２-イムノアッセイの性能を向上さ
せる添加剤としてのトリエタノールアミンの使用ゲンタマイシンモノクロナール抗体により感作しAEOに
より処理したラテックス粒子を用いて、ラテックス凝集
イムノアッセイを行なった。イムノアッセイを、トリエ
タノールアミン（TEO）の不存在下にて、又は2.5〜15 m
Mの範囲の最終濃度のTEOの存在下にて行なった。試験す
る各血清サンプルのゲンタマイシン含量を、当該ラテッ
クスに基づくアッセイと同じゲンタマイシンモノクロナ
ール抗体を使用する市販のRoche FP ゲンタマイシンイ
ムノアッセイにより測定した。FP対照イムノアッセイ及
びラテックス凝集イムノアッセイを並行して行ない、サ
ンプルの分解劣化を回避した。ラテックスイムノアッセ
イ緩衝液にTEOを加えても、得られた検量線の質に有意
な影響は無かった。

【００５０】図３及び４は、TEOの不存在下又は12.5 mM
のTEOの存在下での微粒子に基づくイムノアッセイをRoc
he FPイムノアッセイと相関させたグラフである。添加
剤としてTEOを加えると、ラテックス凝集イムノアッセ
イの性能に劇的な影響がある。対照実験（TEO不存在）
と対比して、最適合致直線の勾配は1.11から1.01に減少
し、y-軸切片は-0.11から0.05に変化し、そして、R相関
係数は0.976から0.985に上昇する。このように、目標と
する直線（点線（勾配=1、切片=0））への最適合致直線
（実線）の重ね合わせから視覚的に明らかなように、当
該３つのパラメーターが最適な値である1.00、0.00及び
1.000にそれぞれ近づく。微粒子に基づくアッセイの調
製物にTEOを加えることの同様の有利な効果は、Roche F
Pイムノアッセイによりゲンタマイシンについて陰性で
あると判定された一連の血清サンプルを用いて、ラテッ
クスを試験した場合にも認められた。最終的なアッセイ
混合物が12.5 mM TEOを含んでいた場合、このサンプル
セット中での平均した見かけのゲンタマイシン濃度は、
TEO不存在下において0.42μg/mlであったのに対して、-
0.32μg/mlであった。このアッセイの望ましい検出下限
は0.17μg/mlである。最適化の研究から、この添加剤が
もたらす効果が十分に認識されるためには、5mMの最終T
EO濃度で十分であることが示唆された。

【００５１】実施例３-第三級アミン類を用いたイムノ
アッセイの比較結果ゲンタマイシンについてのラテックス凝集イムノアッセ
イを、種々の第三級アミン類を用いた以外は実施例２の
ようにして行なった。各イムノアッセイについて、12.5
mMの第三級アミンが存在していた。試験した第三級ア
ミン類はTEO、並びに、米国特許第5,506,151号及び第5,
486,479号に既に記載された次の化合物：1-エチル-3-(3
-ジメチルアミノプロピル)ウレア（EDU）、3-ジメチル
アミノプロピルアミン、3-ジエチルアミノプロピルアミ
ン、ジメチルアミノプロピルクロリド、及び、トリエチ
ルアミン、であった。

【００５２】データの各セットについての最適合致直線
のパラメーターを表１に示す。1に最も近い勾配を有す
る第三級アミンはTEOであった。ゼロに最も近い切片を
有する第三級アミンはEDU、トリエチルアミン及びTEOで
あった。1に最も近いR値を有する第三級アミンはジメチ
ルアミノプロピルクロリド及びTEOであった。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【発明の効果】本発明により、粒子凝集イムノアッセイ
における干渉すなわち非特異的相互作用が減少又は除去
され、イムノアッセイの精度が向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】粒子濃度の関数としての、結合したアシッドオ
レンジ７による468nmにおける吸光度の依存性を示した
グラフである。

【図２】粒子濃度の関数としての、結合したアシッドオ
レンジ７による468nmにおける吸光度の依存性を、バッ
クグラウンドシグナルを差し引いて示したグラフであ
る。

【図３】蛍光偏光法により行なったゲンタマイシンイム
ノアッセイの測定と、トリエタノールアミン（TEO）不
存在下にて粒子凝集により行なったゲンタマイシンイム
ノアッセイの測定とを相関させたグラフである。

【図４】蛍光偏光法により行なったゲンタマイシンイム
ノアッセイの測定と、TEO存在下にて粒子凝集により行
なったゲンタマイシンイムノアッセイの測定とを相関さ
せたグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クリストファーシー．ローレンスイギリス国 46038 インディアナ，フィッシャーズナンバー 104，チャドウエルコート 9072 (72)発明者アーメンビー．シャナフェルトアメリカ合衆国 46032 インディアナ, カーメル，トリーティーラインストリート 12613

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】各粒子の表面がカルボジイミドにより活
性化されており、且つ、結合剤が共有結合により該表面
に連結されている複数の粒子、及び、式I： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル及
びアルキルエーテルからなる群から選択され、X、Y、及
び Z は、互いに独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)
-OH、-C(=O)-OR⁴又は -C(=O)-NHR⁴からなる群から選択
され、ここで、R⁴はアルキルである]で表される第三級
アミン化合物、を含んでなる、イムノアッセイに用いる
ための試薬。
【請求項２】前記のR¹、R²、R³及びR⁴が、互いに独立
して、１〜５個の炭素原子を含んでなるアルキル基であ
る、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】前記第三級アミン化合物がトリエタノー
ルアミンである、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】前記試薬がサンプルと混合されてアッセ
イ混合物を形成し、且つ、前記第三級アミン化合物が該
アッセイ混合物中で50mM以下の濃度で存在する、請求項
１〜３のいすせれか１項に記載の試薬。
【請求項５】前記粒子が、その表面上にスクシンイミ
ドエステルと第一級アミン化合物との反応生成物を更に
含んでなる、請求項１〜４のいずれか1項に記載の試
薬。
【請求項６】前記第一級アミン化合物が、グリシンエ
チルエステル、2-(アミノエトキシ)エタノール、2,2’-
(エチレンジオキシ)ビスエチルアミン、及び、4,7,10-
トリオキサ-1,3-トリデカンジアミンからなる群から選
択される、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】前記の複数の粒子及び第三級アミン化合
物が単一の液体混合物中に存在する、請求項１〜６のい
ずれか１項に記載の試薬。
【請求項８】アナライトを含んでいる可能性があるサ
ンプルと、該アナライトの抗体を含んでなり且つ該アナ
ライトと検出可能な複合体を形成することができる請求
項１〜６のいずれか１項に記載の試薬とを混合するこ
と、及び、該検出可能な複合体の存在又は量を、該サン
プル中の該アナライトの指標として測定すること、を含
んでなる、アナライトを測定するためのアッセイ方法。
【請求項９】請求項１〜６のいずれか１項に記載の試
薬を含んでなる、試験キット。
【請求項１０】アナライトを含んでいる可能性がある
サンプルを、各粒子の表面がカルボジイミドにより活性
化されており、且つ、結合剤が共有結合により該表面に
連結されている複数の粒子と混合するイムノアッセイ法
であって、式（I）： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル及
びアルキルエーテルからなる群から選択され、X、Y、及
び Z は、互いに独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)
-OH、-C(=O)-OR⁴又は -C(=O)-NHR⁴からなる群から選択
され、ここで、R⁴はアルキルである]で表される第三級
アミン化合物を該サンプルに添加してアッセイ混合物を
形成することを特徴とする上記方法。
【請求項１１】サンプルへの前記添加が、前記第三級
アミンと前記粒子とを混合して粒子混合物とすること、
及び、該粒子混合物と前記サンプルとを混合すること、
を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】非特異的相互作用を防止するための、
式（I）： N(R¹-X)(R²-Y)(R³-Z) (I) [式中、R¹、R²及びR³は、互いに独立して、アルキル及
びアルキルエーテルからなる群から選択され、X、Y、及
び Z は、互いに独立して、-OH、-O-R⁴、-S-R⁴、-C(=O)
-OH、-C(=O)-OR⁴又は -C(=O)-NHR⁴からなる群から選択
され、ここで、R⁴はアルキルである]で表される第三級
アミン化合物の、粒子に基づく凝集イムノアッセイにお
ける使用。