CN108872606B - 一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白（hp）检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结合珠蛋白（HP）体外免疫诊断检测技术领域，特别涉及一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白（HP）检测试剂盒及其制备、使用方法，试剂R1中含有缓冲液、氯化锂、D‑木糖、羟丙基‑β‑环糊精、麦芽糖醇、PEG‑8000、N,N‑二甲基‑N‑十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯、防腐剂，试剂R2中含有缓冲液、D‑木糖、麦芽糖醇、羟丙基‑β‑环糊精、羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒、N,N‑二甲基‑N‑十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯、防腐剂。本发明显著改善了试剂的稳定性和线性范围，显著增强了试剂的灵敏度和准确度。
Description
技术领域
本发明属于体外免疫诊断检测技术领域，具体涉及一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白（HP）检测试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术
结合珠蛋白 （haptoglobin，HP）又称触珠蛋白，是一种分子量约为85000的酸性糖蛋白，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中。结合珠蛋白主要在肝脏合成，其降解也在肝脏，半衰期约为3.5～4天。
结合珠蛋白又是一种急性期时相反应蛋白。当机体处在应激状态时，血液中的结合珠蛋白明显增多，如心肌梗塞、肿瘤、炎症、创伤、感染等病理状态时，以及应用某些激素，如皮质激素和雄性激素后，其血清含量常有显著升高，并与严重程度和预后有关。研究结论表明，血清结合珠蛋白和铁蛋白含量的变化，对急性肺栓塞和深部静脉血栓形成的病人具有一定的诊断价值。
另外，在进行糖尿病合并血管病变患者的基础研究中，也发现血清结合珠蛋白含量与疾病进展发生相关性变化，HP基因型有可能是糖尿病冠状动脉病变的一个独立的风险因素。因此认为，对结合珠蛋白含量的动态监测，有益于糖尿病血管病变患者的治疗，尤其是在建立糖尿病患者血管病变预防策略时，具有十分重要的意义。由于结合珠蛋白的合成与降解均在肝脏，并且在结合珠蛋白与血红蛋白的复合物形成与降解的过程中，结合珠蛋白不能重复利用，因此当肝脏功能出现问题时，体内的结合珠蛋白数量常发生明显的变化。合成不足则其含量减少，降解不足则其含量增多。此时化验检查血液中的结合珠蛋白含量是否减少或增加，对诊断肝脏疾病、判断疾病的预后很有帮助。
目前，测定结合珠蛋白（HP）常用方法有ELISA法、免疫比浊法等。其中ELISA法，操作繁琐，灵敏度低，检测结果多为定性；免疫比浊法，操作简单、使用方便，但灵敏度和稳定性较差。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种结合珠蛋白（HP）检测试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法，克服了普通免疫比浊法的灵敏度低、稳定性差等缺点，可以有效检测结合珠蛋白（HP）的含量，具有灵敏度高，稳定性好的优点；本发明的另一目的在于提供该检测试剂盒的制备和使用方法。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种结合珠蛋白（HP）检测试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1包括如下含量的组分：
缓冲液 25mmol/L，
氯化锂 5g/L，
D-木糖 5~10g/L，
羟丙基-β-环糊精 5-10g/L，
麦芽糖醇 10-20g/L，
PEG-8000 10~25g/L，
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.1~0.3g/L，
防腐剂 0.3g/L；
所述试剂R2包括如下含量的组分：
缓冲液 45mmol/L，
D-木糖 5~10g/L，
麦芽糖醇 10~20g/L，
羟丙基-β-环糊精 5~10g/L，
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒 0.15%~0.35%（W/V），
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.1~0.3g/L，
防腐剂 0.3g/L。
试剂R1中缓冲液为25℃，pH为6.85的4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.15的4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液。
试剂R1、R2所述防腐剂为1'3-双羟甲基脲。
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：按照2:1比例取粒径70nm和180nm表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入pH为6.2的丁二酸缓冲液25ml，使胶乳颗粒终浓度为1.7%，然后加入适量羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体、EDC，40℃下搅拌反应5小时左右，13500 rpm离心35分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒。
上述的结合珠蛋白（HP）检测试剂盒的使用方法为：使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为570nm，R1试剂和R2试剂的比例为3:1。
本发明检测的基本原理为：样本中的抗原结合珠蛋白（HP）与试剂中超敏化的羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体胶乳颗粒形成不溶性免疫复合物，在波长570nm处检测其浊度变化，其变化程度与样本中结合珠蛋白（HP）浓度成正比。
本发明的有益效果在于：
1）本发明采用胶乳增强免疫比浊法，通过优化反应体系，试剂R1和试剂R2采用4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液，并添加氯化锂、D-木糖、羟丙基-β-环糊精、麦芽糖醇、PEG-8000等多种稳定剂，优化各稳定剂的配比，显著改善了试剂的稳定性。
2）优选的新型表面活性剂N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯，可以促进并维持抗体稳定，防止体系浑浊，并且有防腐抑菌作用，显著增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。
3）采用胶乳增强免疫比浊法，特别是运用70nm和180nm羧基微球制成的双颗粒胶乳增强试剂，大大增强了试剂的反应灵敏度和线性范围，并且试剂的重复性和抗干扰能力更强。
4）该试剂操作简便快速，适用于自动化分析，是一种更加稳定、灵敏的结合珠蛋白（HP）试剂，试剂的准确度和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便，完全可以满足临床需要。
附图说明
图1 实施例1试剂检测方法；
图2 精密度试验中高值质控物精密度试验数据表；
图3 精密度试验中低值质控物精密度试验数据表；
图4 准确度对比试验中高值质控物准确度试验数据表；
图5 准确度对比试验中低值质控物准确度试验数据表；
图6 灵敏度对比试验数据表；
图7 稳定性对比试验检测曲线图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
本实施例所提供的结合珠蛋白（HP）的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2：
1）试剂R1的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=6.85，25℃) 25mmol/L，
氯化锂 5g/L，
D-木糖 5g/L，
羟丙基-β-环糊精 5g/L，
麦芽糖醇 10g/L，
PEG-8000 10g/L，
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.1g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L；
2）试剂R2的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=7.15，25℃) 45mmol/L，
D-木糖 5g/L，
麦芽糖醇 10g/L，
羟丙基-β-环糊精 5g/L，
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒 0.15%（W/V），
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.1g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L。
3）本实施例试剂的使用方法：
本实施例描述的结合珠蛋白（HP）检测试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如图1。
实施例2
本实施例所描述的结合珠蛋白（HP）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
1）试剂R1的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=6.85，25℃) 25mmol/L，
氯化锂 5g/L，
D-木糖 8g/L，
羟丙基-β-环糊精 8g/L，
麦芽糖醇 15g/L，
PEG-8000 20g/L，
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.2g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L；
2）试剂R2的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=7.15，25℃) 45mmol/L，
D-木糖 8g/L，
麦芽糖醇 15g/L，
羟丙基-β-环糊精 8g/L，
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒 0.25%（W/V），
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.2g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L。
实施例3
本实施例所描述的结合珠蛋白（HP）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
1）试剂R1的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=6.85，25℃) 25mmol/L，
氯化锂 5g/L，
D-木糖 10g/L，
羟丙基-β-环糊精 10g/L，
麦芽糖醇 20g/L，
PEG-8000 25g/L，
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.3g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L；
2）试剂R2的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=7.15，25℃) 45mmol/L，
D-木糖 10g/L，
麦芽糖醇 20g/L，
羟丙基-β-环糊精 10g/L，
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒 0.35%（W/V），
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.3g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L。
对比例1
本对比例所描述的结合珠蛋白（HP）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
1）试剂R1的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=6.85，25℃) 25mmol/L，
氯化锂 5g/L，
D-木糖 1g/L，
羟丙基-β-环糊精 2g/L，
麦芽糖醇 3g/L，
PEG-8000 2g/L，
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.05g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L；
2）试剂R2的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=7.15，25℃) 45mmol/L，
D-木糖 1g/L，
麦芽糖醇 3g/L，
羟丙基-β-环糊精 2g/L，
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒 0.08%（W/V），
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.05g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L。
对比例2
本对比例所描述的结合珠蛋白（HP）的检测试剂，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：
1）试剂R1的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=6.85，25℃) 25mmol/L，
氯化锂 5g/L，
D-木糖 18g/L，
羟丙基-β-环糊精 20g/L，
麦芽糖醇 30g/L，
PEG-8000 35g/L，
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.5g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L；
2）试剂R2的组分包括：
4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸（CABS）缓冲液(pH=7.15，25℃) 45mmol/L，
D-木糖 18g/L，
麦芽糖醇 30g/L，
羟丙基-β-环糊精 20g/L，
羊抗人结合珠蛋白（HP）抗体包被胶乳颗粒 0.55%（W/V），
N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯 0.5g/L，
防腐剂1'3-双羟甲基脲 0.3g/L。
对比例3
本对比例采用市场常见的国家食品药品监督管理局认可的结合珠蛋白（HP）检测试剂盒。该试剂盒未采用双胶乳颗粒，也未添加新型表面活性剂N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯。
试验一
精密度试验：取具有溯源性的高值质控物（靶值2.25g/L）、低值质控物（靶值0.85g/L）各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，进行对照检测，对每份质控物进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见图2、图3。
由图2、图3变异系数可知，与对比例1-3相比，实施例1-3试剂检测数值更接近靶值，标准偏差和变异系数均较小，具有更高的批内精密度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法（双纳米胶乳颗粒联用），并且采用新型表面活性剂N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯，科学配比D-木糖、羟丙基-β-环糊精、麦芽糖醇、PEG-8000等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的批内精密度。
试验二
准确度对比试验：取具有溯源性的血清高值质控物（靶值2.25g/L）、低值质控物（靶值0.85g/L）各一份，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得结合珠蛋白（HP）检测试剂盒进行对照检测，各检测 5 次，计算平均值，与质控物靶值进行对照。结果见图4、图5。
由图4、图5检测结果可知，与对比例1-3相比，实施例1-3试剂检测数值更接近靶值，平均值与靶值的差值在0.02以内，具有更高的准确度，这说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法（双纳米胶乳颗粒联用），并且采用新型表面活性剂N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯，科学配比D-木糖、羟丙基-β-环糊精、麦芽糖醇、PEG-8000等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的准确度。
试验三
试剂灵敏度的对比试验：取具有溯源性的校准品由低到高稀释出7个浓度样本，分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂，制得结合珠蛋白（HP）检测试剂进行对照检测，将检测结果与理论浓度相比较。结果见图6。
由图6检测结果可知，在样本浓度低至0.05g/L时，对比例1-3检测值为0或0.01，而实施例1-3试剂仍可以检测出样本的准确值；并且与对比例1-3相比，实施例1-3试剂检测接近线性下限的低值样本（0.05-0.50g/L）时的准确度更高。另外，在样本浓度在线性上限3.00g/L时，对比例检测值在2.81~2.90之间，测试值明显偏低，而实施例1-3试剂仍可以检测出样本的准确值，这表明实施例1-3试剂拥有更高的分析灵敏度、准确度及更宽的线性范围。因此可以说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法（双纳米胶乳颗粒联用），并且采用新型表面活性剂N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯，科学配比D-木糖、羟丙基-β-环糊精、麦芽糖醇、PEG-8000等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的分析灵敏度、准确度和线性范围。
试验四
试剂的稳定性对比试验：对实施例1-3和对比例1-3中的试剂，分别均匀分装13组，每组的试剂量为R1为18mL，R2为6mL。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测结合珠蛋白（HP）质控品（靶值为2.25g/L），检测结果如图7所示，实施例1-3试剂在2-8℃储存条件下比对比例更加稳定。
由检测结果可知，在保存13个月时，对比例1-3检测数值为1.75-1.84，与靶值相差0.41-0.50，并且检测值呈现明显的随储存时间延长而降低趋势；而实施例1-3试剂检测数值为2.23-2.30，与靶值相差0.02-0.05；这表明实施例1-3试剂拥有更高的稳定性。说明本发明通过采用胶乳增强免疫比浊法（双纳米胶乳颗粒联用），并且采用新型表面活性剂N,N-二甲基-N-十六酰氨基丙基季铵基乙硫酸酯，科学配比D-木糖、羟丙基-β-环糊精、麦芽糖醇、PEG-8000等稳定剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂的稳定性。
综上所述，通过验证，本发明提供的试剂比对比例灵敏度高、重复性好、线性范围宽，能够达到市场对产品的应用要求，并且准确度高，是一种更加稳定、良好的结合珠蛋白（HP）检测试剂盒。
Claims (5)
1.一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白(HP)检测试剂盒，其特征在于，其包括试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1包括如下含量的组分：
所述试剂R2包括如下含量的组分：
2.根据权利要求1所述的一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白(HP)检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中缓冲液为25℃，pH为6.85的4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.15的4-(环己基氨基)-1-丁烷磺酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白(HP)检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为1'3-双羟甲基脲。
4.根据权利要求1所述的一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白(HP)检测试剂盒，其特征在于，羊抗人结合珠蛋白抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：按照2:1比例取粒径70nm和180nm表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入pH为6.2的丁二酸缓冲液25ml，使胶乳颗粒终浓度为1.7％，然后加入适量羊抗人结合珠蛋白抗体、EDC，40℃下搅拌反应5小时左右，13500rpm离心35分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人结合珠蛋白抗体包被胶乳颗粒。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种高度稳定、灵敏的结合珠蛋白(HP)检测试剂盒，其特征在于，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为570nm，试剂R1、R2使用比例为3:1。
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Denomination of invention: A highly stable and sensitive binding Globin (HP) detection kit Effective date of registration: 20230628 Granted publication date: 20201222 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shandong branch Pledgor: BIOBASE BIODUSTRY (SHANDONG) Co.,Ltd. Registration number: Y2023980045843 |
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