CN101305093A - 用于稳定生物分子的方法及组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是为了提供使生物分子稳定化的方法和组合物，特别是使用于临床诊断中的酶或标记的抗体以及组合物稳定化的方法。因此，本发明公开了使生物分子稳定化的方法，其特征为使(a)生物分子和(b)丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物彼此共存。本发明还公开了其中具有稳定化的生物分子的组合物，其特征为在组合物中成分(a)和(b)彼此共存。本发明另外还公开了用于稳定生物分子的组合物，其中含有丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物。

Description

用于稳定生物分子的方法及组合物

技术领域

本发明涉及用于稳定生物分子的方法以及含有生物分子的组合物，具体来说，涉及用于稳定在临床诊断中使用的酶或标记的抗体的方法以及含有酶或标记抗体的组合物。

技术背景

酶、以及通过用酶使用多种化合物修饰抗体而产生的标记的抗体，由于它们的高底物特异性以及操作的便利性而具有广泛的应用。例如，它们可以用于生产分子生物学所用的分析试剂、生物化学用途的分析试剂、体外诊断试剂、液体体外诊断试剂、碎片或碎屑形式的干燥的体外诊断试剂、酶传感器或酶电极、药物、食物、饮料等。用于生产上述组合物的酶可以用标记化合物例如染料、生物素和亲和素进行标记，用多种化合物进行修饰，或者与抗体或抗原结合。

为了在较长的时间内维持这些含有酶或标记的抗体的组合物的效力，重要的是稳定地保持酶或标记的抗体的活性。例如，当试剂组合物中的酶的活性随时间而降低时，可以预先向组合物中加入过量的酶，其量取决于所需的试剂有效期以及酶活性降低的速度。但是，在许多情况下，这样的方法不能从本质上解决问题，并且使用的酶或标记抗体的花费增加了。

因此，尝试了使用多种方法来稳定组合物，包括向组合物中添加底物、辅酶、盐、离子、糖类、糖醇、氨基酸、脂肪酸酯、蛋白例如牛血清白蛋白或明胶水解产物等(参见例如专利文献1到5)。

专利文献1：JP-A 2004-141162

专利文献2：日本专利No.3685815

专利文献3：日本专利No.3696267

专利文献4：JP-A 2005-114368

专利文献5：JP-A 10-279594

发明内容

本发明解决的问题

但是，在使用辅酶作为稳定剂的情况下，辅酶通常非常昂贵，并且预期将只对特定的生物分子起作用。在使用高分子、盐或某些氨基酸溶液作为稳定剂的情况下，由于它们的低溶解度或在某些情况下储存过程中会沉淀，因此不能以足够的量添加。特别是，在向诊断试剂中加入糖类或氨基酸作为稳定剂的情况下，添加物可能会与试剂系统中存在的或酶或标记抗体中含有的污染物质发生意料之外的反应。此外，在使用动物来源的成分例如牛血清白蛋白作为稳定剂的情况下，需要小心地注意污染、牛海绵状脑病(BSE)等的风险。

本发明的目的是提供有效地稳定生物分子例如酶或标记的抗体的方法，以及提供含有生物分子的组合物，其中的生物分子的稳定性通过所述方法维持较长的时间。

解决问题的方法

本发明的发明人研究了多种方法以达到上述的目的。结果，他们发现可以通过使生物分子与丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物彼此共存来有效地稳定生物分子。由此完成了本发明。

本发明提供了：

(1)稳定生物分子的方法，包括使下列(a)和(b)彼此共存：

(a)生物分子；以及

(b)丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物；

(2)上述(1)的方法，其中的生物分子存在于溶液中；

(3)上述(1)的方法，其中的生物分子存在于冷冻干燥的组合物中；

(4)上述(1)中的方法，其中的丝胶蛋白和/或其水解产物来自于从茧丝或生丝提取的天然存在的丝胶蛋白；

(5)上述(1)的方法，其中的丝胶蛋白的等价物是通过遗传工程技术获得的；

(6)上述(1)的方法，其中的生物分子是蛋白；

(7)上述(1)的方法，其中的生物分子是酶；

(8)上述(1)的方法，其中的生物分子是标记的抗体；

(9)含有稳定化的生物分子的组合物，其中下列(a)和(b)在组合物中彼此共存：

(a)生物分子；以及

(b)丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物；

(10)上述(9)的液体组合物，其中的生物分子存在于溶液中；

(11)上述(9)的组合物，其中的生物分子存在于冷冻干燥的组合物中；

(12)上述(9)的组合物，其中的丝胶蛋白和/或其水解产物来自于从茧丝或生丝提取的天然存在的丝胶蛋白；

(13)上述(9)的组合物，其中的丝胶蛋白的等价物是通过遗传工程技术获得的；

(14)上述(9)的组合物，其中的生物分子是蛋白；

(15)上述(9)的组合物，其中的生物分子是酶；

(16)上述(9)的组合物，其中的生物分子是标记的抗体；

(17)生产含有稳定化的生物分子的组合物的方法，包括使丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物与生物分子共存的步骤；

(18)用于稳定生物分子的组合物，含有丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物；

(19)用于诊断的试剂盒，含有上述(9)的包含稳定化的生物分子的组合物；以及

(20)生物传感器，含有上述(9)的包含稳定化的生物分子的组合物。

发明效果

根据本发明，无论生物分子是处于液体状态还是干燥状态，通过使用丝胶蛋白和/或丝胶蛋白的水解产物或等价物来增强生物分子的稳定性都是可能的，因此，含有生物分子的组合物的效力能够维持较长的时间。

根据本发明的稳定生物分子的方法，无论酶或标记的抗体是处于液体状态还是干燥状态，增加其稳定性都是可能的，因此，含有生物分子的组合物的效力能够维持较长的时间。

本发明的最佳实施方案

在后文中将对本发明进行详细的解释。

本文中使用的术语“稳定效果”是指生物分子在条件(a)下储存后保留的剩余功能大于生物分子在条件(b)下储存后保留的剩余功能的状态，其中条件(a)是将生物分子在存在某种物质的情况下保存特定时间段，而条件(b)是将生物分子在不存在某种物质的情况下保存特定时间段。

例如，术语“稳定效果”是指生物分子例如水溶液中包含的酶或标记的抗体在条件(a)下储存后比在条件(b)下储存后剩余的活性高的状态，其中条件(a)是将含有生物分子和某种物质的水溶液在适当的温度下保存特定的时间段，而条件(b)是将含有生物分子但不含某种物质的水溶液在适当温度下保存特定的时间段。

此外，术语“稳定效果”是指例如生物分子例如干燥组合物中包含的酶或标记的抗体在条件(a)下储存后比在条件(b)下储存后剩余的活性高的状态，其中条件(a)是将含有生物分子和某种物质的干燥组合物在适当的温度下保存特定的时间段，而条件(b)是将含有生物分子但不含某种物质的干燥组合物在适当温度下保存特定的时间段。

稳定效果的评估可以通过例如测量在存在某种物质的情况下[条件(a)]和不存在某种物质的情况下[条件(b)]剩余的功能随时间的减少、然后对相应条件下的半衰期进行比较来进行。

对“在适当温度下储存特定的时间段”的条件没有具体的限制，只要它在条件(a)和条件(b)之间能够产生剩余活性的差别就行。优选情况下，选择加速(苛刻)测试条件，其目的是确定生物分子在诊断试剂等中的长期储存稳定性。这样的条件的具体例子包括“在40℃储存7天”和“在52℃储存1小时”。如果有足够的时间，可以选择在2℃到10℃的冷藏温度下储存6个月或更长时间的条件，2℃到10℃的冷藏温度是通常用于含有生物分子等的诊断试剂的长期储存的温度范围。

本发明的一个实施方案是将酶在含有添加的丝胶蛋白的50mMPIPES-NaOH缓冲液(pH 7.0)中于25℃储存2个月后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有1g/L Triton X-100和添加的丝胶蛋白的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.0)中于40℃储存14天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有添加的丝胶蛋白的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中于52℃储存1小时后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有1g/L Triton X-100和添加的丝胶蛋白的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中于9℃储存24小时后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有1g/L Triton X-100和添加的丝胶蛋白的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.0)中于25℃储存14天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有1g/L Triton X-100和添加的丝胶蛋白的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中于25℃储存14天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有0.5g/L叠氮钠和添加的丝胶蛋白的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.0)中于25℃储存14天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将酶在含有添加的丝胶蛋白的情况下以冷冻干燥粉末的形式于37℃储存14天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，酶的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将标记的抗体在含有添加的丝胶蛋白的20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)中于4℃储存3天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，标记的抗体的剩余活性增加的方法。

本发明的另一个实施方案是将标记的抗体在含有1mM氯化镁、0.1mM氯化锌、1g/L叠氮钠和添加的丝胶蛋白的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中于4℃储存3天后，与在不添加丝胶蛋白的情况下储存后相比，标记的抗体的剩余活性增加的方法。

在上述的实施方案中，可以用丝胶蛋白水解产物或丝胶蛋白等价物来代替丝胶蛋白。

丝胶蛋白是非晶体的在茧丝或生丝中天然存在的蛋白。具体来说，本文中的“丝胶蛋白”是指以未水解的形式从茧丝或生丝中提取出的丝胶蛋白。

丝胶蛋白的基因一般具有2.6kbp到10.6kbp的大小。已经测定了一些丝胶蛋白的基因，它们显示在例如The Journal of BiologicalChemistry，257：15192-15199(1982)中。本发明中使用的丝胶蛋白是从具有这样序列的基因生产的蛋白。在本发明中使用的丝胶蛋白的例子是主要由SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列作为其全长序列构成的蛋白。典型情况下，SEQ ID NO：2的氨基酸序列由SEQ ID NO：1中显示的38个氨基酸序列构成的基本区和基本区之外的非基本区构成，并且含有基本区的重复序列。例如，由SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列构成的丝胶蛋白含有12个重复的基本区。

本文中使用的词组“主要由SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列构成的”在形容丝胶蛋白时，是指该氨基酸序列(SEQ ID NO：2)可以具有1个或多个、优选1到2000、更优选1到500、更优选1到300个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加，只要丝胶蛋白仍具有稳定生物分子的能力就行。在这种情况下，氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加优选发生在基本区之外的区域。在基本区中的氨基酸残基的情况下，优选进行保守取代。在基本区中，氨基酸序列中的1个或多个、优选1到50、更优选1到20个氨基酸残基可以被保守取代，只要丝胶蛋白仍具有稳定生物分子的能力就行。术语“保守取代”是指一个或多个氨基酸残基被其它具有相似化学性质的氨基酸残基所取代，而基本上不改变蛋白的活性。保守取代的例子包括用另一个疏水残基取代一个疏水残基、用另一个具有同样电荷的极性残基取代一个极性残基、用另一个芳香族氨基酸取代一个芳香族氨基酸等。与每个氨基酸功能上相似的氨基酸在本技术领域中是已知的。

在本发明中，丝胶蛋白的水解产物可以代替未水解状态的丝胶蛋白使用或与其组合使用，只要它具有稳定生物分子的能力就行。

丝胶蛋白和丝胶蛋白水解产物可以按照在WO2002/086133中公开的已知的方法从茧丝或生丝中提取而获得。具体而言，未水解状态的丝胶蛋白可以通过例如下面描述的方法以具有90％或以上纯度的高纯蛋白的形式获得。

首先，用水提取茧丝或生丝中存在的丝胶蛋白，这是通过用水、优选为大约80到100℃的热水处理茧丝或生丝，从而获得丝胶蛋白的水溶液。然后可以对丝胶蛋白水溶液进行分离/纯化处理，例如下列方法(1)到(3)中的任何一种处理方法处理来回收所需的丝胶蛋白。

(1)加入有机或无机酸将丝胶蛋白水溶液调整到pH 3到5。然后在溶液中加入有机或无机絮凝剂，使丝胶蛋白沉淀。沉淀可以通过过滤分离，然后干燥，以获得固体状态的丝胶蛋白。

(2)将丝胶蛋白水溶液与可与水混溶的溶剂例如甲醇、乙醇或二噁烷混合，使丝胶蛋白沉淀。沉淀可以通过过滤分离，然后干燥，以获得固体状态的丝胶蛋白。

(3)用超滤膜或反渗透膜对丝胶蛋白的水溶液进行给定的过滤处理，然后干燥获得粉末状态的丝胶蛋白，如在JP-A 4-202435中描述的那样。

丝胶蛋白的水解产物可以通过例如下面描述的方法以具有90％或以上纯度的高纯蛋白的形式获得。

首先，用水提取茧丝或生丝中存在的丝胶蛋白，这是通过用水、优选为大约80到100℃的热水处理茧丝或生丝，从而获得丝胶蛋白的水溶液。此时，使用电解水、酸、碱或酶的组合使丝胶蛋白部分水解。然后可以对获得的丝胶蛋白水解产物的水溶液进行分离/纯化处理，例如上述方法(1)到(3)中的任何一种处理方法处理来回收所需的丝胶蛋白水解产物。

这样获得的丝胶蛋白或丝胶蛋白水解产物通常具有500到500,000的分子量。尽管任何具有该范围内的分子量的丝胶蛋白或丝胶蛋白水解产物，只要具有稳定生物分子的能力就都可以使用，但出于操作的目的，优选具有5,000到100,000、特别是10,000到50,000的平均分子量的丝胶蛋白水解产物。

用于本发明的稳定化方法中的术语“丝胶蛋白和/或其水解产物或其等价物”中的“其等价物”(在后文中也被称为“丝胶蛋白等价物”)是指至少含有上述的天然存在的丝胶蛋白的基本区(即SEQ ID NO：1中显示的38个氨基酸的序列)、并且是人工生产(即通过化学合成或遗传工程技术)的多肽。因此，人工生产的丝胶蛋白等价物可以是由与天然产物来源的丝胶蛋白或丝胶蛋白水解产物具有相同的氨基酸序列构成的多肽。此外，丝胶蛋白等价物的例子包括使用天然存在的丝胶蛋白或丝胶蛋白水解产物的一部分作为基础合成的产物。

在本发明中，“其等价物”可以被用来代替天然产物来源的“丝胶蛋白和/或其水解产物”，只要它具有稳定生物分子的能力就行。

丝胶蛋白等价物优选含有由SEQ ID NO：1中的38个氨基酸的序列构成的基本区，该序列作为重复了1次以上的重复序列。通过使用具有该重复序列的多肽可以增加稳定生物分子的能力。丝胶蛋白等价物优选在其氨基酸序列中每100个氨基酸残基中含有至少1个基本区、更优选至少两个基本区。优选情况下，在丝胶蛋白等价物中存在的基本区的比率较高。含有这样的高比率的重复序列的丝胶蛋白等价物能够稳定地显示出稳定生物分子的能力，即使丝胶蛋白等价物的全长氨基酸残基数量被增加。典型情况下，丝胶蛋白等价物的能力与来自天然产物的丝胶蛋白或丝胶蛋白水解产物的能力相当或更高。

对丝胶蛋白等价物的全长没有特别的限制，只要丝胶蛋白等价物具有稳定生物分子的能力就行。从生产的角度来看，在丝胶蛋白等价物的全长中，基本区优选重复2到8次、更优选2到6次、更优选2到4次。

丝胶蛋白等价物中存在的基本区的氨基酸序列可以具有例如1个或多个、优选1到5个、更优选1到3个氨基酸残基的保守取代。

丝胶蛋白等价物可以按照WO2002/086133中公开的已知的方法来获得。例如，在化学合成丝胶蛋白等价物的情况下，可以适当地使用常规的多肽合成方法，例如参照t-Boc方法或Fmoc方法的固相或液相合成。在通过遗传工程技术生产丝胶蛋白等价物的情况下，如果可以购买到或生产出编码丝胶蛋白等价物的DNA，可以用DNA转化宿主细胞，以使转化的细胞生产丝胶蛋白等价物。

丝胶蛋白等价物可以是融合蛋白。这样的融合蛋白可以通过将编码上述的“丝胶蛋白”或“丝胶蛋白水解产物”的DNA与编码异源多肽的DNA融合以产生编码融合蛋白的DNA、然后表达该DNA来生产。

丝胶蛋白和/或水解产物或其等价物可以例如0.1到200g/L、优选0.1到100g/L、更优选0.2到20g/L的浓度添加。

对用于本发明的稳定方法的生物分子没有特别的限制。生物分子的例子包括蛋白(例如用于临床诊断的酶、标记的抗体等)、核酸和含有蛋白和/或核酸的组合物。

对用作生物分子的酶的类型没有特别的限制。酶的例子包括过氧化物酶、脂酶、蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、抗坏血酸氧化酶、β-半乳糖苷酶、尿酸酶、丙酮酸脱氢酶、甘油激酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、过氧化氢酶、胆固醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、肌酐氨酰水解酶(肌酐酰胺水解酶)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等。

用作生物分子的酶可以从天然存在的来源例如微生物、动物或植物制备、通过遗传工程技术或化学合成来制备。酶也可以通过使用蛋白工程技术等修饰野生型酶来获得。

用于本发明的酶可以用染料或标记化合物(例如生物素或亲和素)来标记、用化合物进行修饰、或与抗体或抗原结合。

作为生物分子使用的标记的抗体或标记的抗原的例子包括但不限于下列的用过氧化物酶、淀粉酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等标记的蛋白、酶、激素、抗体、抗原等：蛋白例如小鼠IgG、β2-微球蛋白、癌胚抗原(CEA)、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)、C-反应蛋白(CRP)、α1-抗胰蛋白酶、α1-微球蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、铁蛋白、白蛋白、血红蛋白A1、血红蛋白A1C、肌红蛋白、肌球蛋白、dupan-2、α-胎儿球蛋白(AFP)、组织多肽抗原(TPA)、载脂蛋白A1、载脂蛋白E、类风湿因子、抗链球菌溶血素O(ASO)、纤维蛋白降解产物(FDP)、纤维蛋白降解产物D组分(FDP-D)、纤维蛋白降解产物D-D组分(FDP-DDimer)、纤维蛋白降解产物E组分(FDP-E)、抗凝血酶-III(AT-III)等；酶例如淀粉酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、纤维蛋白原、弹性蛋白酶、血纤维溶酶原、肌酸激酶-心肌带(CK-MB)等；激素例如胰岛素、促甲状腺激素(TSH)、3，5，3′-三碘甲状腺氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)、促黄体生成激素(LH)等；造成各种感染的病毒的抗体和抗原例如乙肝病毒相关抗体、乙肝病毒相关抗原、丙肝病毒抗体、HTLV(成人T细胞白血病病毒)抗体、HIV(AIDS病毒)抗体、衣原体抗体、梅毒抗体、弓形虫抗体等。抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、单克隆抗体混合物、抗体片段例如通过酶法处理或遗传工程技术片段化的F(ab′)2、Fab′或Fab。

用于本发明的生物分子包括这样的复合物。

对生物分子的状态没有特别的限制。生物分子可以液体状态、冷冻干燥状态、颗粒状态、被固定在支持物上的状态、或包被在芯片上的状态等存在。

生物分子也可以被提供成与其它物质形成混合物的液体组合物、冷冻干燥组合物等。

这样的组合物可以被放置在适当的容器中或固定在适当的装置中，因此它可以采取多种形式，包括用于分子生物学应用的分析试剂、用于生物化学应用的分析试剂、体外诊断试剂、液体体外诊断试剂、碎片或碎屑形式的干燥的体外诊断试剂、酶传感器、酶电极、药物、食物、饮料等。

在本发明中，含有生物分子的组合物还可以与其它用于稳定、改善形状等目的的物质进一步混合。

当含有生物分子的组合物处于粉末状态时，作为常规的稳定剂或形状改善剂，它可以含有糖类例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、环糊精、普鲁兰、菊粉、可溶性淀粉等；糖醇例如葡萄糖醇、甘露糖醇、肌醇、木糖醇等；氨基酸或氨基酸盐例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸等；肽例如甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等；无机酸盐例如磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐、Tris盐等；有机酸或有机酸盐例如黄素、乙酸、柠檬酸、苹果酸、顺丁烯二酸、葡萄糖酸等；蛋白例如明胶、酪蛋白、白蛋白等；或表面活性剂例如胆酸，脂肪酸的糖脂、聚氧乙烯烷基醚、聚乙二醇烷基醚等。

液体状态的含有生物分子的组合物不仅包括其中的生物分子例如酶蛋白完全溶解的溶液，而且包括液体中的分散液例如悬浮液。液体状态的酶可以溶解或悬浮在水或磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液Tris缓冲液或Good′s缓冲液中(例如PIPES、MES、TES、MOPS、HEPES等)。这样的酶的液体组合物可以含有盐例如硫酸铵、磷酸铵、氯化钠或氯化钾。这样的酶的液体组合物还可以含有醇类例如乙醇、甲醇或丙醇，多元醇例如甘油或乙二醇，或表面活性剂例如烷基葡萄糖苷、聚乙二醇烷基醚或脂肪酸醇酯。任选地，在酶的液体组合物中还可以加入青霉素类、头孢烯类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、新喹诺酮类等的抗生素，或防腐剂例如叠氮化合物、1，1′-亚甲基-双[3-(1-羟甲基-2，4-二氧代咪唑-5-基)-尿素]，2-甲基-3(2H)-异噻唑酮盐酸盐、5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷、2-羟基吡啶-N-氧化物、2-氯乙酰胺等。

含有酶和/或标记的抗体的组合物，根据所需的应用，可以包含辅酶例如NAD+、NADH、NADP+、NADPH、ATP、ADP、AMP、GTP、GMP、FAD、FMN、生物素、烟酸、钴胺素、PQQ等；金属盐例如钠、钾、锌、镁、钙、锂、铜、铁、锰盐等；巯基化合物；硒化合物；盐例如硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硼酸盐、Tris盐等；氨基酸或氨基酸盐；糖或糖苷；或任选的酚类或苯胺类Trinder′s试剂和4-氨基安替比林(aminoantipyrine)作为偶合剂，四唑鎓盐和电子载体例如吩嗪硫酸甲酯，或染料例如无色试剂和底物。

含有标记的抗体的组合物，根据所需的应用，可以含有非特异性的反应阻断试剂。非特异性的反应阻断试剂的例子包括但不限于与标记抗体同种的抗体和与标记抗体同种的酶。同种的抗体的例子包括小鼠IgG、小鼠IgM、通过聚合化制备的小鼠IgG聚合物、山羊IgG、绵羊IgG、马IgG、大鼠IgG和兔IgG。尽管含有这样的抗体的体液例如动物血清或腹水可以原样添加到含有标记的抗体的组合物中，但优选情况下体液在进行病毒失活处理、补体失活处理、脱脂化处理等后再加入。

实施例

在下面，将通过实施例对本发明进行具体的解释，这些实施例不对本发明构成限制。

在下面的实施例1到21中，根据在WO2002/086133的生产实施例1中公开的方法生产丝胶蛋白水解产物。

详细的描述如下。

生产实施例1

将1公斤茧丝(由家蚕(Bombyx mori)产生)进行热水处理，处理在50L 0.2％的碳酸钠水溶液(pH 11-12)中于95℃进行2小时，以提取丝胶蛋白水解产物。获得的丝胶蛋白水解产物提取物通过平均孔径直径0.2μm的滤器进行过滤以除去聚集物。然后将滤液通过反渗透膜脱盐，以获得0.2％的透明无色的丝胶蛋白水解产物的水溶液。

将溶液用蒸发装置浓缩到浓度为大约2％，然后冷冻干燥以获得100g粉末形式的丝胶蛋白水解产物，纯度为90％或以上，平均分子量为20,000。

实施例1

将以下描述的含有过氧化物酶(Toyobo，PEO-302)和丝胶蛋白水解产物的试剂溶液在25℃储存2个月或在50℃储存7天，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

试剂的制备

制备了具有下列成分的每种试剂。

PIPES-NaOH 50mM pH 7.0

过氧化物酶(Toyobo，PEO-302)5,000U/L

丝胶蛋白水解产物0.2到2g/L

对比实施例1

按照实施例1制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用0.2到2g/L牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。试剂溶液在与实施例1中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表1所示，发现过氧化物酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表1]

表1：丝胶蛋白水解产物对过氧化物酶溶液的稳定效果

实施例2

在实施例1中制备的含有过氧化物酶和2g/L丝胶蛋白水解产物的试剂溶液中加入0.5g/L叠氮化钠作为防腐剂以制备试剂溶液。然后将试剂溶液在25℃储存14天，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

对比实施例2

按照实施例2制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用2g/L牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。试剂溶液在与实施例2中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表2所示，发现在存在防腐剂的情况下过氧化物酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表2]

表2：丝胶蛋白水解产物对过氧化物酶溶液的稳定效果

实施例3

将以下描述的含有脂蛋白脂酶(Toyobo，LPL-311)和丝胶蛋白水解产物的试剂溶液在25℃或40℃储存14天，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

试剂的制备

制备了具有下列组成的每种试剂。

PIPES-NaOH 50mM pH 7.0

Triton X-100  1g/L

脂蛋白脂酶(Toyobo，LPL-311)5,000U/L

丝胶蛋白水解产物0.2到2g/L

对比实施例3

按照实施例3制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用0.2到2g/L牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。试剂溶液在与实施例3中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表3所示，发现脂蛋白脂酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表3]

表3：丝胶蛋白水解产物对脂蛋白脂酶溶液的稳定效果

实施例4

将以下描述的含有甘油激酶(Toyobo，GYK-301)和丝胶蛋白水解产物的试剂溶液在25℃储存14天，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

试剂的制备

制备了具有下列组成的试剂。

PIPES-NaOH 50mM pH 7.0

Triton X-100  1g/L

甘油激酶(Toyobo，GYK-301)2,000U/L

丝胶蛋白水解产物2g/L

对比实施例4

按照实施例4制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用2g/L牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。试剂溶液在与实施例4中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表4所示，发现甘油激酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表4]

表4：丝胶蛋白水解产物对甘油激酶溶液的稳定效果

实施例5

将以下描述的含有胆固醇氧化酶(Toyobo，COO-321)和丝胶蛋白水解产物的试剂溶液在52℃储存1小时或在40℃储存7天，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

试剂的制备

制备了具有下列组成的试剂。

磷酸钾缓冲液50mM pH 7.0

胆固醇氧化酶(Toyobo，COO-321)2,000U/L

丝胶蛋白水解产物4g/L

对比实施例5

按照实施例5制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用4g/L牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。试剂溶液在与实施例5中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表5所示，发现胆固醇氧化酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表5]

表5：丝胶蛋白水解产物对胆固醇氧化酶溶液的稳定效果

实施例6

将以下描述的含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Toyobo，G6D-321)和丝胶蛋白水解产物的试剂溶液在25℃储存14天，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

试剂的制备

制备了具有下列组成的试剂。

磷酸钾缓冲液50mM pH 7.0

Triton X-100  1g/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Toyobo，G6D-321)3,000U/L

丝胶蛋白水解产物  1g/L

对比实施例6

按照实施例6制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用1g/L牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。试剂溶液在与实施例6中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表6所示，发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表6]

表6：丝胶蛋白水解产物对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的稳定效果

实施例7

将以下描述的含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Toyobo，PPC-301)和丝胶蛋白水解产物的试剂溶液在9℃或25℃储存24小时，测定剩余的活性比率(储存后的活性与制备后当时的活性的比率)。

试剂的制备

制备了具有下列组成的每种试剂。

Tris-HCl 50mM pH 8.0

Triton X-100  1g/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Toyobo，PPC-301)5,000U/L

丝胶蛋白水解产物  0.2到20g/L

对比实施例7

按照实施例7制备试剂溶液，只是不加入丝胶蛋白水解产物。试剂溶液在与实施例7中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表7所示，发现磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表7]

表7：丝胶蛋白水解产物对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶溶液的稳定效果

实施例8

在1g胆固醇氧化酶(Toyobo，COO-321)粉末溶解在10ml蒸馏水中形成的溶液中，加入0.5g丝胶蛋白水解产物以制备胆固醇氧化酶溶液。然后将溶液冷冻干燥以制备含有丝胶蛋白水解产物的胆固醇氧化酶粉末。将冷冻干燥粉末在50℃储存14天，测定剩余的活性比率(在50℃储存后的活性与储存前的活性的比率)。

对比实施例8

按照实施例8制备胆固醇氧化酶粉末，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用0.5g牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。粉末在与实施例8中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表8所示，发现胆固醇氧化酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表8]

表8：丝胶蛋白水解产物对胆固醇氧化酶粉末的稳定效果

实施例9

在1g PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶(Toyobo，GLD-321)粉末溶解在10ml蒸馏水中形成的溶液中，加入0.5g丝胶蛋白水解产物以制备PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶溶液。然后将溶液冷冻干燥以制备含有丝胶蛋白水解产物的PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶粉末。将冷冻干燥粉末在37℃储存21天，测定剩余的活性比率(在37℃储存后的活性与储存前的活性的比率)。

对比实施例9

按照实施例9制备PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶粉末，只是不加入丝胶蛋白水解产物或用0.5g牛血清白蛋白(Sigma，组分V)代替。粉末在与实施例9中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表9所示，发现PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表9]

表9：丝胶蛋白水解产物对PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶粉末的稳定效果

实施例10

在1g肌酸酐氨酰水解酶(Toyobo，CNH-211)粉末溶解在10ml蒸馏水中形成的溶液中，加入0.5g丝胶蛋白水解产物以制备肌酸酐氨酰水解酶溶液。然后将溶液冷冻干燥以制备含有丝胶蛋白水解产物的肌酸酐氨酰水解酶粉末。将冷冻干燥粉末在37℃储存21天，测定剩余的活性比率(在37℃储存后的活性与储存前的活性的比率)。

对比实施例10

按照实施例10制备肌酸酐氨酰水解酶粉末，只是不含丝胶蛋白水解产物。粉末在与实施例10中相同的条件下储存，并测定剩余的活性比率。

如表10所示，发现肌酸酐氨酰水解酶由丝胶蛋白水解产物稳定化。

[表10]

表10：丝胶蛋白水解产物对肌酸酐氨酰水解酶粉末的稳定效果

实施例11到16和对比实施例11

辣根过氧化物酶标记的抗体的稳定效果

对比实施例11

将用含有5g/L牛血清白蛋白(Nacalai Tesque)的20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)稀释8000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(AmershamBiosciences)通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

实施例11

将用含有5g/L丝胶蛋白水解产物的20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)稀释8000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Amersham Biosciences)通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

实施例12

将丝胶蛋白水解产物溶解在蒸馏水中，使浓度为100g/L，然后在121℃高压热处理20分钟。将用含有5g/L高压热处理过的丝胶蛋白水解产物的20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)稀释8000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Amersham Biosciences)通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

实施例13

将用含有5g/L丝胶蛋白水解产物和0.2g/L 4-氨基安替比林(Nacalai Tesque)的20mM MOPS缓冲液(pH 7.0)稀释8000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Amersham Biosciences)通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

实施例14

将用含有5g/L丝胶蛋白水解产物和0.2g/L 4-氨基安替比林(Nacalai Tesque)的20mM MOPS缓冲液(pH 6.5)稀释8000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Amersham Biosciences)通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

实施例15

抗体固相微孔板试剂的制备

将用50mM碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释的10μg/ml的山羊抗小鼠Fc抗体(Sigma)，以50μL/孔的量分加在ELISA板(Sumitomo Bakelite)的孔中。将微孔板置于室温1小时，使抗体与板结合。然后将孔中的液体完全取出。然后，在微孔板的孔中以300μL/孔的量分加用蒸馏水稀释4倍的Block Ace(Dainippon Pharmaceutical)。将微孔板置于室温1小时进行阻断。将孔中的液体完全取出。以300μL/孔的量在孔中分加含有0.5g/L Tween 20的10mM磷酸生理缓冲液(pH 7.2)，然后将其从孔中取出，并将该步骤重复3次，以此进行洗板(在后文中称为PBS-T清洗)。然后将微孔板用于测量。

实施例16

小鼠IgG的测量

用含有0.1％BSA的磷酸盐缓冲液稀释小鼠IgG(Chemicon)以制备含有64、128或256ng/ml小鼠IgG的样品。用于稀释的缓冲液被用作0ng/ml的样品。然后，将每种样品以50μL/孔的量分加在ELISA板的孔中(N＝2)，将微孔板在室温放置1小时进行反应。在对板进行PBS-T清洗后，将对比实施例和实施例中制备的每种标记的抗体溶液以50μL/孔的量分加在孔中。将微孔板在室温放置1小时进行反应。在对板进行PBS-T清洗后，在每个孔中加入50μL TMB+(Dako)作为酶反应混合物，将微孔板在黑暗条件下在室温放置10分钟进行反应。通过在每个孔中加入50μL 1N硫酸然后搅拌混合物来终止酶反应。然后，使用读微板器在450nm到650nm处测量微孔板的O.D.。吸光度以小鼠IgG浓度/剂量依赖性的方式增加。

使用通过ELISA获得的结果，计算了256ng/ml样品和0ng/ml样品之间吸光度的差别。计算出从试验获得的吸光度差别与从使用在4℃储存的标记的抗体进行的相应的试验获得的吸光度差别的比率，求出比率的立方根。因此确定了抗体每天的剩余活性比率。结果显示在表11中。当使用实施例中含有丝胶蛋白水解产物的标记抗体溶液时，与使用牛血清白蛋白的对比实施例相比，观察到了较高的剩余活性比率，因此发现了丝胶蛋白水解产物的稳定效果。即使是在丝胶蛋白水解产物被高压热处理后稳定效果也没有失去。通过使丝胶蛋白水解产物和可以作为过氧化物酶的底物的物质共存，能够进一步提高剩余活性比率。

[表11]

表11：丝胶蛋白水解产物对辣根过氧化物酶标记的抗体的稳定效果

	对比实施例11	实施例11	实施例12	实施例13	实施例14
						每天的剩余活性比率(％)	85	96	96	99	99

实施例17到21和对比实施例12和13

对碱性磷酸酶标记的抗体的稳定效果

(1)实施例17

碱性磷酸酶标记的抗体的制备

使用200μg小鼠抗CEA单克隆抗体克隆5905(Medix Biochemica)和与抗体的氨基基团结合的标记试剂盒(Dojindo，LK12)，按照试剂盒随附的说明制备了碱性磷酸酶标记的抗体。简单来说，将100μL试剂盒中随附的清洗缓冲液放置到随附的过滤管中，用吸管轻轻混合。将管以8000xg离心10分钟。再加入100μL清洗缓冲液后，将管在同样条件下再离心1次。在试剂盒随附的NH2-反应性ALP中，加入10μL随附的反应缓冲液，通过吸管吹动进行溶解。将全部溶液加到过滤管的膜上，在该膜上已经浓缩了抗体，然后通过吸管吹动与膜上的抗体混合。将管在37℃放置2小时。然后在管中加入190μL试剂盒随附的储存缓冲液，通过吸取回收200μL标记的抗体，它可以用作碱性磷酸酶标记的抗CEA单克隆抗体。

(2)对比实施例12

将用含有1mM氯化镁、0.1mM氯化锌和1g/L叠氮化钠的0.1MTris-HCl缓冲液(pH 7.4)稀释8000倍的碱性磷酸酶标记的抗-CEA单克隆抗体通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

(3)对比实施例13

将用含有20g/L牛血清白蛋白(Nacalai Tesque)、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌和1g/L叠氮化钠的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)稀释8000倍的碱性磷酸酶标记的抗-CEA单克隆抗体通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

(4)实施例18

将用含有20g/L丝胶蛋白水解产物、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌和1g/L叠氮化钠的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)稀释8000倍的碱性磷酸酶标记的抗-CEA单克隆抗体通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

(5)实施例19

将丝胶蛋白水解产物溶解在蒸馏水中，使浓度为100g/L，然后在121℃高压热处理20分钟。将用含有20g/L高压热处理过的丝胶蛋白水解产物、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌和1g/L叠氮化钠的0.1MTris-HCl缓冲液(pH 7.4)稀释8000倍的碱性磷酸酶标记的抗-CEA单克隆抗体通过γ-射线灭菌的0.22-μm滤膜进行过滤，然后在γ-射线灭菌的聚丙烯容器中在4℃或25℃储存3天。

(6)实施例20

抗-CEA抗体固相微孔板试剂的制备

将用50mM碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释的10μg/ml的小鼠抗-CEA单克隆抗体克隆5909(Medix Biochemica)，以50μL/孔的量分加在黑色聚苯乙烯分析微孔板(Corning)的孔中。将微孔板置于室温1小时，使抗体与板结合。然后将孔中的液体完全取出。然后，在微孔板的孔中以300μL/孔的量分加用蒸馏水稀释4倍的Block Ace(DainipponPharmaceutical)。将微孔板置于室温1小时进行阻断。将孔中的液体完全取出。以300μL/孔的量在孔中分加含有0.5g/L Tween 20的10mMTris盐缓冲液(pH 7.5)，然后将其从孔中除去，并将该步骤重复3次，以此进行洗板(在后文中称为TBS-T清洗)。然后将微孔板用于测量。

(7)实施例21

CEA的测量

小鼠IgG的测量

用含有0.1％BSA的磷酸生理缓冲液稀释CEA抗原以制备含有5、20或80ng/ml CEA的样品。用于稀释的缓冲液被用作0ng/ml的样品。然后，将每种样品以50μL/孔的量分加在ELISA板的孔中(N＝2)，将微孔板在37℃放置1小时进行反应。在对板进行TBS-T清洗后，将对比实施例3和实施例8中制备的每种标记的抗体溶液以50μL/孔的量分加在孔中。将微孔板在37℃放置1小时进行反应。在对板进行TBS-T清洗后，在每个孔中加入50μL APS-5(Lumigen)作为酶反应混合物。将微孔板在37℃放置20分钟进行反应。然后使用Luminoscan(Labsystems)测量微孔板的荧光信号。荧光的强度以CEA浓度/剂量依赖性的方式增加。

使用获得的结果，计算了80ng/ml样品和0ng/ml样品之间荧光强度的差别。计算出从试验获得的荧光强度差别与从使用在4℃储存的标记的抗体进行的相应的试验获得的荧光强度差别的比率，求出比率的立方根。因此确定了抗体每天的剩余活性比率。结果显示在表12中。正如从对比实施例中看到的那样，按照常规技术加入牛血清白蛋白，增加了碱性磷酸酶标记的抗体的稳定性。令人吃惊的是，当使用实施例中含有丝胶蛋白水解产物的标记抗体溶液时，观察到了更高的剩余活性比率，因此发现了丝胶蛋白水解产物对于碱性磷酸酶标记的抗体具有增强的稳定效果。即使是在丝胶蛋白水解产物被高压热处理后稳定效果也没有失去。

[表12]

表12：丝胶蛋白水解产物对碱性磷酸酶标记的抗体的稳定效果

	对比实施例12	对比实施例13	实施例18	实施例19
					每天的剩余活性比率(％)	68	94	99	99

工业实用性

根据本发明，增加生物分子例如酶或标记的抗体的稳定性是可能的，因此，含有生物分子的组合物的效力可以维持较长的时间。具体来说，本发明特别适于在临床实验室检验领域中使用的诊断试剂。因此，本发明对于工业世界有极大的贡献。

Claims (20)

1.稳定生物分子的方法，包括使下列(a)和(b)彼此共存：

(a)生物分子；以及

(b)丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物。

2.权利要求1的方法，其中的生物分子存在于溶液中。

3.权利要求1的方法，其中的生物分子存在于冷冻干燥的组合物中。

4.权利要求1的方法，其中的丝胶蛋白和/或其水解产物来自于从茧丝或生丝提取的天然存在的丝胶蛋白。

5.权利要求1的方法，其中的丝胶蛋白的等价物是通过遗传工程技术获得的。

6.权利要求1的方法，其中的生物分子是蛋白。

7.权利要求1的方法，其中的生物分子是酶。

8.权利要求1的方法，其中的生物分子是标记的抗体。

9.含有稳定化的生物分子的组合物，其中下列(a)和(b)在组合物中彼此共存：

(a)生物分子；以及

(b)丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物。

10.权利要求9的液体组合物，其中的生物分子存在于溶液中。

11.权利要求9的组合物，其中的生物分子存在于冷冻干燥的组合物中。

12.权利要求9的组合物，其中的丝胶蛋白和/或其水解产物来自于从茧丝或生丝提取的天然存在的丝胶蛋白。

13.权利要求9的组合物，其中的丝胶蛋白的等价物是通过遗传工程技术获得的。

14.权利要求9的组合物，其中的生物分子是蛋白。

15.权利要求9的组合物，其中的生物分子是酶。

16.权利要求9的组合物，其中的生物分子是标记的抗体。

17.生产含有稳定化的生物分子的组合物的方法，包括使丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物与生物分子共存的步骤。

18.用于稳定生物分子的组合物，含有丝胶蛋白和/或其水解产物或等价物。

19.用于诊断的试剂盒，含有权利要求9的包含稳定化的生物分子的组合物。

20.生物传感器，含有权利要求9的包含稳定化的生物分子的组合物。