CN116640655A - 一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒及其反应液和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物检测技术领域，具体公开了一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒及其反应液和制备方法。本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒包括反应装置、尿液纯化装置和标准液试剂瓶；反应装置内设有反应孔和校准孔，所述反应孔与校准孔负载有反应试剂，反应试剂包括以下重量比的组分：丝胶蛋白：琼脂糖：半乳糖氧化酶：过氧化物酶：半乳糖苷酶=（1.5‑5）：（2‑6）：（0.010‑0.015）：（0.10‑0.17）：（0.08‑0.12）；本申请还提供了用于制备上述尿半乳糖检测试剂盒的反应液。本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒能够在常温下储存至少12个月，并且检测结果准确性高，因此该尿半乳糖检测试剂盒能够实现家庭自测。

Description

一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒及其反应液和制 备方法
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒及其反应液和制备方法。
背景技术
乳糖不耐受是指因机体小肠黏膜表面缺乏乳糖酶而造成的乳糖消化、吸收障碍。乳糖不耐受分为先天性乳糖不耐受和后天性乳糖不耐受。其中，先天性乳糖不耐受是由机体先天性乳糖酶活性低下或缺乏所导致；而后天性乳糖不耐受是由于机体饮食不规律、营养不良等原因导致。当机体发生乳糖不耐受时，会产生腹胀、腹泻、腹痛等一系列症状，严重时可能会引起脱水、酸中毒、生长迟缓等。因此，对机体是否乳糖耐受的检测至关重要。
目前，乳糖耐受的检测方法有多种，包括乳糖耐受实验、尿半乳糖法、小肠灌注法、乳糖钡餐X线检查、粪便糖检测、氢气呼气试验、甲烷呼气法、13CO2呼气法等。其中，尿半乳糖法因其采样、操作简单方便，特异性和灵敏度较高，无需大型检测设备等优点得到了越来越多的认可，该方法是通过测定尿液中的半乳糖浓度来间接地反映乳糖的消化吸收状况，从而判断受试者是否乳糖耐受。目前，根据尿半乳糖法检测机理制备的试剂盒是通过对比试剂盒中反应孔与标准孔的显色深浅(显色深度与样本的半乳糖浓度为正比关系)，来迅速判读样本是否乳糖低于标准；反应孔的颜色较标准孔浅，即可表明样本的半乳糖含量低于标准液，从而间接地评估乳糖的消化吸收及乳糖耐受情况。因此该方法具有方便、快捷等优点，适用于家庭自测。
然而，目前使用的尿半乳糖检测试剂盒还存在一些问题。例如：尿半乳糖测试酶在常温下容易失活，导致酶联显色反应无法发生，进而造成检测结果偏低，形成误判。另外，现有的试剂盒中均使用了试剂垫、滤棉或试纸等吸附支撑材质，故在反应显色后会出现渗透阻碍，导致反应部位颜色不均匀，形成色斑，进而易造成误判、错判，影响检测准确率。
发明内容
为了解决相关技术中尿半乳糖测试酶在常温下容易失活及反应显色易形成色斑的问题，获得一种能够常温储存，并且检测准确率高的尿半乳糖检测试剂盒。本申请提供一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒及其反应液和制备方法。
第一方面，本申请提供一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒，所述尿半乳糖检测试剂盒包括反应装置、尿液纯化装置和标准液试剂瓶；
所述反应装置内设有反应孔和校准孔，所述反应孔与校准孔负载有反应试剂，所述反应试剂包括以下重量比的组分：
丝胶蛋白：琼脂糖：半乳糖氧化酶：过氧化物酶：半乳糖苷酶＝(1.5-5)：(2-6)：(0.010-0.015)：(0.10-0.17)：(0.08-0.12)；
所述标准液试剂瓶的内容物为标准液，所述标准液包含0.15-0.2g/L的D-半乳糖。
本申请提供了一种尿半乳糖检测试剂盒，该尿半乳糖检测试剂盒能够在常温下储存至少12个月，并且检测结果的准确性在90％以上。因此该试剂盒能够用于家庭储备，方便快速地实现尿半乳糖自测，实现身体健康状况的监测与防护。另外，本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒与相关技术中的尿半乳糖检测试剂盒相比，不含有吸附支撑材质，因此在反应显色过程中，该试剂盒避免了相关技术中反应显色造成的渗透阻碍现象，有效减少色斑的生成，提高检测的准确率。
优选地，所述反应孔与校准孔上均覆盖有铝箔。
优选地，所述标准液还包含氯化钠0.8-1.0g/L。
在一个具体的实施方案中，所述标准液包含0.18g/L的D-半乳糖；即标准液的浓度为1mmol/L。
第二方面，本申请提供一种用于制备尿半乳糖检测试剂盒的反应液。
一种用于制备尿半乳糖检测试剂盒的反应液，所述反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白1.5-5g/L、琼脂糖2-6g/L、半乳糖氧化酶0.010-0.015g/L、过氧化物酶0.10-0.17g/L和半乳糖苷酶0.08-0.12g/L。
本申请提供了一种包含丝胶蛋白和琼脂糖的反应液，由于该反应液中含有丝胶蛋白，丝胶蛋白一方面能够提升反应液中半乳糖氧化酶的稳定性，使得半乳糖氧化酶在长时间的常温储存下依然具备较高的活性；另一方面丝胶蛋白还能取代相关技术中的试剂垫、滤棉或试纸等吸附支撑材质，大大节省制备材料，且能够避免因吸附支撑材质带来的检测缺陷。
本申请中，丝胶蛋白在成膜后具有很好的力学性能及网状结构，能够使半乳糖氧化酶等物质负载于其网状结构中，有效代替相关技术中的吸附支撑材质。并且丝胶蛋白与反应液各物质之间的生物相容性好，利于反应液的长时间稳定保存。琼脂糖是一种线性多聚物，其溶解后会形成良好的半固体状凝胶，因此具有很好的稳固性。本申请的缓冲支持剂中加入琼脂糖，琼脂糖能否辅助丝胶蛋白进行成膜固定反应液。并且琼脂糖还能对酶起到一定的辅助保护作用，使酶能够在长时间的常温保存在依然保持较高的活性。
本申请中，琼脂糖可以为Seakem HE琼脂糖、Seakem HEEO琼脂糖、Seakem ME琼脂糖、Seakem HGT琼脂糖、Seakem HGT(P)琼脂糖或IsoGel琼脂糖。
本申请中，琼脂糖还可以为普通琼脂糖、低熔点琼脂糖、低电渗琼脂糖或高强度琼脂糖。
优选地，所述琼脂糖为Seakem HEEO琼脂糖。
本申请中，过氧化物酶选自超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、羟基过氧化物酶(GAT)和乳过氧化物酶(LP)
优选地，所述过氧化物酶为超氧化物歧化酶(SOD)或羟基过氧化物酶(GAT)。
本申请中，半乳糖苷酶选自邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃糖苷(x-Gal)、氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选地，所述半乳糖苷酶为邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)或氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)。
在一些实施方案中，所述丝胶蛋白的含量可以为：1.5-2g/L、1.5-2.5g/L、1.5-3.5g/L、2-2.5g/L、2-3.5g/L、2-5g/L、2.5-3.5g/L、2.5-5g/L或3.5-5g/L。
在一个具体的实施方案中，所述丝胶蛋白的含量还可以为：1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3.5g/L或5g/L。
在一些实施方案中，所述琼脂糖的含量可以为：2-4g/L或4-6g/L。
在一个具体的实施方案中，所述琼脂糖的含量还可以为：2g/L、4g/L或6g/L。
在一些实施方案中，所述半乳糖氧化酶含量可以为：0.01-0.012或0.012-0.015g/L。
在一些具体的实施方案中，所述半乳糖氧化酶含量还可以为：0.008g/L、0.010g/L、0.012g/L或0.015g/L。
优选地，所述反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白2-3.5g/L、琼脂糖2-4g/L、半乳糖氧化酶0.012-0.015g/L、过氧化物酶0.10-0.17g/L和半乳糖苷酶0.08-0.12g/L。
优选地，所述反应液还包括表面活性剂0.07-0.15mL/L和显色剂1-3g/L。
本申请中，表面活性剂选自吐温80、吐温20、Triton X-100、NP40或山梨醇。
优选地，所述表面活性剂为吐温80。
本申请中，显色剂选自4-氨基安替吡啉和3-甲基-2-并噻唑啉酮腙盐酸水合物(MBTH)。
优选地，所述显色剂为4-氨基安替吡啉。
优选地，所述反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白2.5g/L、Seakem HEEO琼脂糖3g/L、吐温80 0.1mL/L、半乳糖氧化酶0.012g/L、超氧化物歧化酶0.13g/L、4-氨基安替吡啉2g/L和邻硝基苯-β-D-半乳糖苷0.1g/L。
本申请中，反应液是采用磷酸盐缓冲液进行配制的，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5-7.8。
在一个具体的实施方式中，所述磷酸盐缓冲液为PBK缓冲液(KH2PO4/K2HPO4)。
本申请中，反应液的pH为7.5
第三方面，本申请提供一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒的制备方法。
一种前述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：将前述反应液分别滴加到前述试剂盒的反应孔与校准孔中，并在37-40℃、N2环境下干燥20-60min，由此在所述反应孔和校准孔中负载反应试剂。
在一个具体的实施方案中，所述干燥温度还可以为37℃或40℃。
本申请提供的尿半乳糖试剂盒在使用时，将待测尿液滴加至反应孔中，将标准液滴加至所述校准孔中，待校准孔与反应孔显色后，以校准孔的显色为标准，将反应孔的显色与校准孔的显色进行对比。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供的常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒中含有丝胶蛋白，丝胶蛋白能够提升酶的稳定性，使酶在长时间的常温储存下依然保持较高的活性。通过试验检测，本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒能够在常温下保存至少12个月，因此该尿半乳糖检测试剂盒能够用于家庭自测，具有方便、快捷、检测准确率高等优点，能够实现身体的健康监测与防护。
2.本申请提供的常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒与相关技术中的尿半乳糖检测试剂盒相比，由于在反应液中包含丝胶蛋白，因此无需使用试剂垫、滤棉或试纸等吸附支撑材质，避免了试剂盒在检测显色时发生渗透阻碍，进而减少色斑的产生，由此，本申请的试剂盒具有更高的检测准确率。
3.本申请将反应液中各组分的含量控制在以下范围内：丝胶蛋白2-3.5g/L、琼脂糖2-4g/L、表面活性剂0.07-0.15mL/L、半乳糖氧化酶0.012-0.015g/L、过氧化物酶0.10-0.17g/L、显色剂1-3g/L和半乳糖苷酶0.08-0.12g/L，能够使获得尿半乳糖检测试剂盒的检测准确率＞90％。
附图说明
图1本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒的反应装置俯视示意图(1是反应孔，2是校准孔)。
图2是利用本申请实施例3提供的尿半乳糖检测试剂盒在37℃环境下保存12个月后检测获得的检测结果。
图3是利用本申请对比例3提供的尿半乳糖检测试剂盒在37℃环境下保存12个月后检测获得的检测结果。
具体实施方式
第一方面，本申请提供一种反应液。该反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白1.5-5g/L、琼脂糖2-6g/L、表面活性剂0.07-0.15mL/L、半乳糖氧化酶0.010-0.015g/L、过氧化物酶0.10-0.17g/L、显色剂1-3g/L和半乳糖苷酶0.08-0.12g/L；反应液中采用的溶剂为磷酸盐缓冲液，浓度为50-200mmol/L，pH为7.5-7.8。
本申请上述反应液的制备方法包括以下步骤：首先将丝胶蛋白、琼脂糖和表面活性剂溶于磷酸盐缓冲液中，获得缓冲支持剂；然后将半乳糖氧化酶、显色剂和过氧化物酶依次加入到所述缓冲支持剂中，充分溶解；再向所述缓冲支持剂中加入半乳糖苷酶，充分溶解，获得反应液。
第二方面，本申请提供一种尿半乳糖检测试剂盒，该尿半乳糖检测试剂盒包括反应装置、尿液纯化装置和标准液试剂瓶；
其中，反应装置内设有反应孔和校准孔，所述反应孔与校准孔负载有反应试剂，所述反应试剂中的组分来自于反应液；
标准液试剂瓶的内容物为标准液，所述标准液包括以下含量的组分：D-半乳糖0.15-0.2g/L、氯化钠0.8-1.0g/L，溶剂为水。
第三方面，本申请提供一种尿半乳糖检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)反应试剂的负载：将反应液分别滴加到试剂盒的反应孔与校准孔中，并在37-40℃、N2环境下干燥20-60min，由此在所述反应孔与校准孔中负载反应试剂。
(2)尿液纯化装置：使用专利ZL2004200880978记载的尿液纯化装置；
(3)配制标准液：按照配比制备标准液。
本申请中，丝胶蛋白的CAS号为60650-88-6，购自上海麦克林生化有限公司；琼脂糖购自科赛特科技有限公司；半乳糖氧化酶的CAS号为9028-79-9；超氧化物歧化酶的CAS号为9054-89-1：D-半乳糖的CAS号为59-23-4；其余原料、试剂、溶剂等均可通过商购获得。
以下结合制备例、实施例、性能检测试验对本申请作进一步详细说明。
制备例1-5
制备例1-5分别提供一种反应液，不同之处在于：反应液中丝胶蛋白的添加量，具体如表1所示。
上述反应液的制备方法，包括以下步骤：首先将丝胶蛋白、3gSeakem HEEO琼脂糖和0.1mL吐温80溶于1L磷酸盐缓冲液中，获得缓冲支持剂；然后以上述缓冲支持剂为溶剂，将缓冲支持剂加热至溶解，平衡温度后向其中加入0.12g半乳糖氧化酶，充分溶解，再加入2g 4-氨基安替吡啉，充分溶解，再加入0.13g超氧化物歧化酶，充分溶解，最后加入0.1g邻硝基苯-β-D-半乳糖苷，充分溶解，获得反应液。
表1制备例1-5提供的反应液中丝胶蛋白的添加量
制备例 丝胶蛋白(g)
1 1.5
2 2
3 2.5
4 3.5
5 5
制备例6-8
制备例6-8分别提供一种反应液，不同之处在于：反应液中琼脂糖的类型及添加量，具体如表2所示。
表2制备例6-8提供的反应液中琼脂糖的类型及添加量
制备例9-11
制备例9-11分别提供一种反应液，不同之处在于：反应液中半乳糖氧化酶的添加量，具体如表3所示。
表3制备例9-11提供的反应液中半乳糖氧化酶的添加量
对比制备例1
对比制备例1提供一种反应液。该反应液与实施例3的不同之处在于：反应液中未添加丝胶蛋白。
对比制备例1提供的反应液由以下步骤制备而来：首先将3gSeakem HEEO琼脂糖和0.1mL吐温80溶于1L磷酸盐缓冲液中，获得缓冲支持剂；然后以上述缓冲支持剂为溶剂，将缓冲支持剂加热至溶解，平衡温度后向其中加入0.12g半乳糖氧化酶，充分溶解，再加入2g4-氨基安替吡啉，充分溶解，再加入0.13g超氧化物歧化酶，充分溶解，最后加入0.1g邻硝基苯-β-D-半乳糖苷，充分溶解，获得反应液。
实施例1
实施例1提供一种尿半乳糖检测试剂盒。该尿半乳糖检测试剂盒由反应装置、尿液纯化装置和标准液试剂瓶构成。
上述尿半乳糖检测试剂盒的制备方法为：
(1)制备反应装置：上述反应装置的本体图如图1所示，反应装置为PE材质，反应装置内设有反应孔1和校准孔2，反应孔和校准孔的直径为4mm。反应孔和校准孔上设有可视化窗口。上述反应装置的反应孔与校准孔负载有反应试剂，反应试剂通过以下方式负载：将制备例1提供的反应液分别滴加到反应孔与校准孔中，并在37℃、N2环境下干燥30min，然后在反应孔与校准孔上覆盖铝箔贴条避光常温储存。
(2)尿液纯化装置：使用专利ZL2004200880978记载的尿液纯化装置；
(3)配制标准液：将0.18g D-半乳糖、0.9g氯化钠溶于水中，获得浓度为1mmol/L的标准液。
实施例2-11
按照实施例1的方法分别制备实施例2-11的尿半乳糖检测试剂盒。不同之处在于：实施例2-11的尿半乳糖检测试剂盒的反应装置中，反应液分别来源于制备例2-11。
实施例12
按照实施例1的方法制备实施例12的尿半乳糖检测试剂盒。不同之处在于：实施例12中，反应试剂通过以下方式负载：将制备例1提供的反应液分别滴加到反应孔与校准孔中，并在40℃、N2环境下干燥30min。
对比例1
按照实施例1的方法分别制备对比例1的尿半乳糖检测试剂盒。不同之处在于：对比例1的尿半乳糖检测试剂盒的反应装置中，反应液来源于对比制备例1。
对比例2
按照实施例1的方法制备对比例2的尿半乳糖检测试剂盒。不同之处在于：对比例2中，反应试剂通过以下方式负载：将制备例1提供的反应液分别滴加到反应孔与校准孔中，并在45℃、N2环境下干燥30min。
对比例3
对比例3提供一种尿半乳糖反应试剂盒。
上述尿半乳糖检测试剂盒由反应装置、尿液纯化装置和标准液构成。
(1)反应装置：
(1-1)制备半半乳糖氧化酶垫：采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径为4.5mm的圆片，并将所述色谱层析纸载体在半半乳糖氧化酶液中浸泡2h，4℃干燥4h；半半乳糖氧化酶液中包含1.8×105U/m2半半乳糖氧化酶，pH＝6.8、100mmol/L磷酸盐缓冲液和质量百分浓度为10％蔗糖。
(1-2)制备过氧化物酶垫：采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径为4.5mm的圆片，并将所述色谱层析纸载体在过氧化物酶液中浸泡2h，4℃干燥4h；过氧化物酶液中包含1.2×105U/m2过氧化物酶，pH＝6.8、100mmol/L磷酸盐缓冲液和质量百分浓度为10％蔗糖。
(1-3)制备显色剂垫：采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径为4.5mm的圆片，并将所述色谱层析纸载体在显色剂液中浸泡2h，4℃干燥4h；显色剂液中包含5g/m24-氨基安替吡啉，6.75g/m2 3，5二氯二羟基苯磺酸和生理盐水。
(1-4)从而导向依次将显色剂垫、过氧化物酶垫和半乳糖氧化酶垫放入反应装置的校准孔与反应孔中，获得反应装置。
(2)尿液纯化装置：使用专利ZL2004200880978记载的尿液纯化装置；
(3)配制标准液：将0.122g半乳糖、0.01g迭氮钠溶于1L水中，获得标准液。
常温储存稳定性试验
对本申请实施例3及对比例3提供的尿半乳糖检测试剂盒的准确性与稳定性进行检测。具体过程如下：
1.试验对象：
处理组1：新制备的实施例3提供的尿半乳糖检测试剂盒100个；分为10组(每组10个)，分别由10个不同测试人员测试。
处理组2：实施例3提供的尿半乳糖检测试剂盒100个，并放在37℃环境下保存12个月；分为10组(每组10个)，分别由10个不同测试人员测试。
对照组：对比例3提供的尿半乳糖检测试剂盒100个，并放在37℃环境下保存12个月；分为10组(每组10个)，分别由10个不同测试人员测试。
2.试验方法：
(1)制备待测尿液：采集人体新鲜中段尿液(该被试48小时内未服用乳制饮品)；然后制备含有4mmol/L D-半乳糖、0.8-1.0g/L氯化钠的母液，溶剂为水；将母液与上述新鲜中段尿液混合，获得终浓度为1.05mmol/L的待测尿液。
(2)检测方法：利用处理组1、处理组2和对照组的尿半乳糖检测试剂盒氟上述待测尿液进行检测，检测方法如下：
将尿液纯化装置的密封帽取下，用吸管吸取2mL上述待测尿液尿液，注入到纯化装置中；盖上纯化装置密封帽，摇动混匀纯化装置20次左右。取下密封帽并与注射器相连接，轻轻推动注射器，弃去前几滴纯化尿液，然后向反应装置上的反应孔中滴两滴(约0.1mL)纯化尿液；紧接着在反应装置的校准孔中滴两滴(约0.1mL)标准液(1mmol/L)。将反应装置放在室温20分钟后，立即观察反应孔和校准孔显色深度并判读结果，同时观察显色部位是否存在色斑。统计10组试剂盒的合格率，结果如表4所示。处理组2反应装置的显色如图2所示；处理组反应装置的显色如图3所示。
判读标准：如果反应孔1显色较校准孔2深，说明被试尿中的半乳糖苷酶浓度＞1.0mmol/L，则判定为合格；如果反应孔1显色较校准孔2显色一致或反应孔1显色较校准孔2浅，说明被试尿中的半乳糖苷酶浓度≤1.0mmol/L，则判定为不合格。
(3)对上述处理组1、处理组2和对照组的合格率进行成对样本检测(t检验分析)，并判断检测结果的sig显著性，结果如表5所示。
表4处理组1、处理组2和对照组的测试结果即合格率统计
表5处理组1、处理组2和对照组的t检验分析结果
由表4的合格率及表5的t检验分析结果可知，对照组提供的尿半乳糖检测试剂盒在37℃储存12个月后，其反应装置不显色，或者显色部位存在明显颜色不均匀(色斑)，检测结果的合格率仅为10％；而处理组1提供的新制备的尿半乳糖检测试剂盒与处理组2提供的在37℃储存12个月后的尿半乳糖检测试剂盒，其反应装置的显色部位并没有颜色不均匀的问题，且检测结果的合格率均＞90％。并且通过t检验分析可知，处理组1与处理组2检测结果的sig＞0.05，表明处理组1与处理组2的合格率无显著差异；而处理组2与对照组检测结果的sig为0，表明处理组2与对照组的合格率有显著差异。因此，说明本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒的常温储存稳定性好，能够在常温下储存至少12个月，并且检测结果的准确率高。
结果验证
为了区别由于主观判断差异造成的误差，采用分光光度计对处理组2与对照组的检测结果进行验证。具体方法如下：
(1)配制浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L、1mmol/L、1.25mmol/L、1.5mmol/L的半乳糖溶液，并用水作为零点，分别加入到反应装置的反应孔中，10min后，在RGB分光光度计(波长为700.0nm的红光(R)，波长为546.1nm的绿光(G)，波长为435.8nm的蓝光(B)下测吸收值，通过公式计算，并以浓度值为横坐标，吸收值为纵坐标，建立吸收标准曲线。(显色的颜色深度与D-半乳糖浓度呈正比关系)
(2)取处理组2与对照组的检测后的反应装置各3个，采用RGB分光光度计测试上述反应装置的反应孔与校准孔的吸收值，然后根据吸收标准曲线换算成测试的浓度值，将换算浓度值与真实值进行对比，验证肉眼判读的准确性。结果如表6所示。
注：反应孔中待测尿液中的D-半乳糖浓度真实值为1.05mmol/L(＞1mmol/L)；校准孔中标准液的D-半乳糖浓度真实值为1.00mmol/L。
表6处理组2与对照组的反应孔与校准孔浓度验证结果
根据表6的检测结果可知，对照组的反应孔与校准孔的换算浓度值与真实值相差甚远，说明通过对照组反应装置的显色深度获取的浓度值并非真实值，故对照组2提供的尿半乳糖检测试剂盒的检测结果准确度较差。而处理组2的反应孔与校准孔的换算浓度值与真实值基本相同，说明处理组2反应装置的显色深度获取的浓度值与待测尿液中的D-半乳糖浓度是一致的，即利用本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒进行检测时，通过判读显色深度，能够获得准确的检测结果。因此，说明本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒的准确性好，通过肉眼判读即可获得准确的检测结果。
性能检测试验
对本申请实施例1-12、对比例1-3制得的尿半乳糖检测试剂盒进行性能检测，具体方法如下：1.制备检测液：
检测液①：将0.09g D-半乳糖、0.9g氯化钠溶于1L水中，获得D-半乳糖的浓度为0.5mmol/L的检测液①。
检测液②：将0.18g D-半乳糖、0.9g氯化钠溶于1L水中，获得D-半乳糖的浓度为1mmol/L的检测液②。
检测液③：将0.27g D-半乳糖、0.9g氯化钠溶于1L水中，获得D-半乳糖的浓度为1.5mmol/L的检测液③。
标准液：将0.18g D-半乳糖、0.9g氯化钠溶于1L水中，获得D-半乳糖的浓度为1mmol/L的标准液。
2.分别制备实施例1-12、对比例1-3的尿半乳糖检测试剂盒，每种90个(各分为3组，每组30个)。然后向反应装置的反应孔中滴入2滴(约0.1mL)检测液(各试剂盒的第1组滴加检测液①、第2组滴加检测液②、第3组滴加检测液③)；接着在反应装置的校准孔中均滴入2滴(约0.1mL)标准液。
3.将反应装置放置室温下20min，立即观察反应孔与校准孔的颜色深度，进行对比。校准孔显示红色，若第一组反应孔显色较校准孔浅，表明检测液的浓度＜1mmol/L，检测结果合格；若第二组反应孔显色与校准孔一致，表明检测液的浓度＝1mmol/L，检测结果合格；若第三组反应孔显色较校准孔深，表明检测液的浓度＞1mmol/L，检测结果合格。
4.检测结果如下表7所示。
表7实施例1-12、对比例1-3提供的尿半乳糖检测试剂盒的检测结果
根据表7的检测结果可知，本申请实施例1-12提供的尿半乳糖检测试剂盒的检测合格率≥80％，而对比例1-3提供的尿半乳糖检测试剂盒的检测合格率仅为45.6-74.4％，说明本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒的检测准确率较高。
进一步对比实施例1-5的检测结果可知，实施例1将丝胶蛋白的含量控制为1.5g/L时，制得的试剂盒的检测准确率为85.6％；实施例5将丝胶蛋白的含量控制为5g/L时，制得的试剂盒的检测准确率为88.9％；而实施例2-4中将丝胶蛋白的含量控制在2-3.5g/L时，制得的试剂盒的检测准确率为90.0-94.4％。说明，本申请进一步将丝胶蛋白的含量控制在2-3.5g/L时，制得的尿半乳糖检测试剂盒的检测准确性更高。
根据实施例3、实施例6-8的检测结果可知，实施例3、实施例6-7采用Seakem HEEO琼脂糖，制得的试剂盒的检测准确率＞90％，而实施例8采用Seakem HE琼脂糖，制得的试剂盒的检测准确率为87.8％。因此，说明采用Seakem HEEO琼脂糖来制备反应液，获得的尿半乳糖检测试剂盒的检测准确性更高。
根据实施例3、实施例9-11的检测结果可知，实施例9-10将半乳糖氧化酶含量控制0.008-0.010g/L时，制得的尿半乳糖检测试剂盒的检测准确率为83.3-86.7％；实施例3、实施例11将半乳糖氧化酶含量控制0.012-0.015g/L时，制得的尿半乳糖检测试剂盒的检测准确率为93.3-94.4％；
根据实施例3.、实施例12、对比例2的检测结果可知，实施例3、实施例12将反应液干燥过程中，干燥温度控制在37-40℃时，获得的检测结果准确率为91.1-94.4％，而对比例2将反应液干燥过程中，干燥温度控制在45℃时，获得的检测结果准确率仅为45.6％。因此，说明本申请提供的尿半乳糖检测试剂盒的制备中，将反应液的干燥温度控制在37-40℃范围内，获得的尿半乳糖检测试剂盒的检测准确性更高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种常温储存的便携式尿半乳糖检测试剂盒，其特征在于，所述尿半乳糖检测试剂盒包括反应装置、尿液纯化装置和标准液试剂瓶；
所述反应装置内设有反应孔和校准孔，所述反应孔与校准孔负载有反应试剂，所述反应试剂包括以下重量比的组分：
丝胶蛋白：琼脂糖：半乳糖氧化酶：过氧化物酶：半乳糖苷酶=（1.5-5）：（2-6）：（0.010-0.015）：（0.10-0.17）：（0.08-0.12）；
所述标准液试剂瓶的内容物为标准液，所述标准液包含0.15-0.2g/L的D-半乳糖。
2.根据权利要求1所述的尿半乳糖检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔与校准孔上均覆盖有铝箔。
3.根据权利要求1或2所述的尿半乳糖检测试剂盒，其特征在于，所述标准液还包含氯化钠0.8-1.0g/L。
4.一种用于制备权利要求1-3任一项所述尿半乳糖检测试剂盒的反应液，其特征在于，所述反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白1.5-5g/L、琼脂糖2-6g/L、半乳糖氧化酶0.010-0.015g/L、过氧化物酶0.10-0.17g/L和半乳糖苷酶0.08-0.12g/L。
5.根据权利要求4所述的反应液，其特征在于，所述反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白2-3.5g/L、琼脂糖2-4g/L、半乳糖氧化酶0.012-0.015g/L、过氧化物酶0.10-0.17g/L和半乳糖苷酶0.08-0.12g/L。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的反应液，其特征在于，所述反应液还包括表面活性剂0.07-0.15mL/L和显色剂1-3g/L。
7.根据权利要求6所述的反应液，其特征在于，所述琼脂糖为Seakem HEEO琼脂糖。
8.根据权利要求7所述的反应液，其特征在于，所述反应液包括以下含量的组分：丝胶蛋白2.5g/L、Seakem HEEO琼脂糖3g/L、吐温800.1mL/L、半乳糖氧化酶0.012g/L、超氧化物歧化酶0.13g/L、4-氨基安替吡啉2g/L和邻硝基苯-β-D-半乳糖苷0.1g/L。
9.一种权利要求1-3中任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4-8中任一项所述的反应液分别滴加到所述反应孔与校准孔中，并在37-40℃、N2环境下干燥20-60min，由此在所述反应孔和校准孔中负载所述反应试剂。
10.根据权利要求9所述的尿半乳糖检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述干燥温度为37℃。
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