KR20030014691A - 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 알파-옥소알데히드를검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 α-옥소알데히드를 검출하는 방법으로서, 호흡 공기 샘플에서 하나 이상의 α-옥소알데히드가 존재하는지 분석하고, 이러한 분석 결과로부터 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 α-옥소알데히드의 존재를 도출해 내는 방법에 관한 것이다.
Description
오랜 당뇨병, 즉 인슐린 의존성 또는 비인슐린 의존성 당뇨병의 결과로서 발생하는, 신장 손상 또는 수정체의 혼탁과 같은 합병증은 검출되기 어려우며, 흔히 만기(late stage)에서만 검출될 수 있다. 이러한 합병증 및 파생적인 질병의 공동 원인은 반응성 대사 산물에 있는데, 이러한 대사 산물은 콜라겐, 효소 또는 그 밖의 세포 성분과 함께 글리콜레이트를 형성하고, 이러한 메카니즘에 의해 세포 독소로서 작용할 수 있다. 이러한 질병에 대한 해당 마아커(marker)는 현 기술 상태에 따르면 실험실의 복잡한 혈액 분석법을 통해서 검출될 수 있다.
지난 3-4년에는, 오랜 당뇨병 과정에서의 파생 질병을 규명하기 위한 실험에서 세포독성 α-옥소알데히드가 중요하고, 원인이 되는 역할을 함을 보여주었다[참조: Beisswenger et al. (1999) Diabetes, Volume 48, p. 198-202]. 따라서, 이와 관련하여, 특히 메틸글리옥살과 같은 α-옥소알데히드의 역할과 관련하여, 글리옥살 또는 3-데옥시글루쿠론이 논의된다. 이러한 물질들은 적혈구에서 형성되고, 전혈, 혈장 및 혈청에서 매우 낮은 농도로 발생한다.
이와 관련하여, α-옥소알데히드 메틸글리옥살이 특히 흥미롭다. 메틸글리옥살은 케톤체의 대사물인 트리오스 포스페이트로부터, 그리고 트레오닌의 대사 동안에 발생할 수 있으며, 이후 글리옥살라아제에 의해 분해된다. 이후, 메틸글리옥살은 단백질과 반응하여 이미다졸론 유도체 및 비스-라이실 가교물질을 형성시킨다. 이러한 단백질의 가교는 콜라겐의 안정화와 그 결과로 막의 비후(thickening)를 유발할 수 있다. 따라서, 이들 반응은 신부전 및 수정체 혼탁과 같은 당뇨병 합병증의 적어도 일부를 설명해 준다.
당뇨병의 경우에 지금까지 일반적인, 비동반 혈당 측정은 전혈, 혈장 또는 혈청에서의 순간적인 메틸글리옥살 농도에 대해 어떠한 직접적인 결론도 제공하지 못한다.
따라서, 현 기술 상태에 따르면, α-옥소알데히드의 측정은 오로지 침입적으로, 즉 혈장으로부터 수행된다. 인슐린 의존성 당뇨병을 앓고 있는 환자의 경우에, 토르날리 티. 제이(Thornally T. J)에 의해 건강한 비교 시험 대상자와 비교하여 5 내지 6배 높고, 인슐린 의존성 당뇨병을 앓고 있는 환자의 경우에는 2 내지 3배 높은 혈장내 직접적인 메틸글리옥살 농도를 검출할 수 있었다[참조: "Advanced Glycation and the development of diabetic complications. Unifying the involvement of glucose, methylglyoxal and oxidative stress" Endocrinology and Metabolism, 1996, , 149-166]. 대안으로서는, 소변에서의 α-옥소알데히드의측정이 가능할 수 있지만, 이것은 예측되는, 생리적으로 컨디셔닝된 매우 낮은 소변 중의 농도는 매우 고도의 분석 복잡성을 요구하기 때문에 문헌에는 기술되어 있지 않다. 따라서, 혈장내 α-옥소알데히드의 직접 측정이 필요하다.
현 기술 상태에 따른 이러한 특정 방법에 따르면, 전혈, 혈장 및 혈청 중의 메틸글리옥살과 같은 α-옥소알데히드의 요망되는 감소에 대한 정기적인 검사 및 가능한 주사기에 의한 약물 투여는 매우 많은 비용이 든다.
WO 98/57 145 A1은 적합한 기체상 샘플의 분석에 의해 질병과 같은 생물학적 상태를 조기 검출하는 방법을 기술하고 있다.
WO 99/56 790 A2는 당뇨병 진단에 사용되는 호흡 테스트를 이행하기 위한 진단 킷(kit)을 기술하고 있다.
DD 219 287 A1은 측정 큐벳, 필터, 렌즈 및 전력 공급 단위를 사용하여 방사선 흡수를 기초로 하여 호흡 기체 중의 아세톤 농도를 선택적으로 측정한 것을 근거로, 당뇨병의 경우에 혈당을 검사하는 측정 장치를 기술하고 있다.
결론적으로, 현 기술 상태에 따른 상기 방법들은 매우 복잡하고, 많은 비용이 들어, 이에 따라 지금까지는 전혈, 혈장 또는 혈청에서 α-옥소알데히드 함량을 측정하기 위한 정기적인 통상의 검사에는 적합하지 않았다.
본 발명은 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 α-옥소알데히드를 검출하는 방법에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명의 목적은 간편하고, 경제적이고, 신뢰성있는 방식으로 이행될 수 있는, 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 α-옥소알데히드를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적은 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 α-옥소알데히드를 검출하는 방법으로서, 호흡 공기 샘플에서 하나 이상의 α-옥소알데히드가 존재하는지 분석하고, 이 분석 결과로부터 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청 중의 α-옥소알데히드의 존재를 도출해 냄을 특징으로 하는 방법에 의해 달성된다. 본 발명에 따른 방법의 유리한 개선점은 종속항에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 방법은, 예를 들어, 조사가 환자 자체에 대해 이루어지는 것이 아니라, 환자의 호흡 공기 샘플(즉, 호흡 기체 및/또는 호흡 응축물)에 대해 이루진다는 사실에 근거한다. 이러한 방법을 사용할 경우, α-옥소알데히드 또한 호흡 공기 중에서 검출되는 것이다. 명백하게, 혈장 중에 주로 존재하는 α-옥소알데히드는 추가로 막을 쉽게 통과할 수 있어 호흡 기체 또는 호흡 응축물 중에서 검출될 수 있다. 추가로, 아세톤과 같은 다른 공지된 마아커와는 대조적으로, α-옥소알데히드는 대사적으로 특이적이고, 공기중 어디에서나 발생하는 것은 아니다. 따라서, 전혈, 혈장 및 혈청 중의 α-옥소알데히드 형성을 간단하고, 경제적이고, 신뢰성있게, 정기적이고, 비침입적으로 모니터링하는 것이 당뇨병의 경우에 가능하여, 적합한 약물에 의해, 가능성있는 당뇨병의 파생적 질병에 대한 위험성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 오랜 당뇨병을 앓고 있는 환자의 경우에는 당뇨병 합병증을 피하기 위한 새로운 전략을 도입해야 할 가능성이 있다. 예를 들어, 혈액 중 α-옥소알데히드의 농도는 소위 스캐빈져(scavenger) 화합물을 투여하므로써 감소될 수 있는 가능성이 있다. 이러한 유형의 치료법은 본 발명에 따른 비침입성 시험 방법에 의해 지지되며, 단순히 통상적인 조건으로 가능하다.
샘플의 채취는 해당 샘플링 백 및/또는 적합한 샘플 용기에 불어 넣거나, 호흡 공기를 임핀저(impinger)를 통과하도록 유도하므로써 수행될 수 있다. 이러한 임핀저는 직접 검출(형광에 의해 또는 광도측정에 의해)을 위한, 또는 크로마토그래피 측정을 위한 유도체화 매질로 충전될 수 있다. 전기화학적, 분광학적(예를 들어, IR 분광학적), 효소학적 또는 면역화학적 검출을 위한 시제를 임핀저에 충전시키는 것 또한 가능하다.
검출 방법 중 하나는 메틸글리옥살을 글리옥살라아제를 사용하여 효소에 의해 전환시키고, 이후 개질된 센서로 락테이트를 측정하는 것에 관련된다.
따라서, 본원 발명에서는, 호흡 공기 샘플의 모든 성분, 즉, 호흡 공기 및 호흡 응축물이 α-옥소알데히드 함량의 분석에 적합하다.
본 발명에 따른 방법의 예가 이후에 기술된다.
본 실시예에서, 제 II형 당뇨병을 앓고 있는 여성 환자의 호흡 공기 샘플을 취하여 α-옥소알데히드 글리옥살 및 메틸글리옥살에 대해 조사하였다. 쭈렉(Zurek) 등의 문헌(Analyst 1999, Vol. 124, p. 1291-1295)에 따른 DNPH 방법을 조사 방법으로서 사용하였다.
호흡 공기의 샘플링은 다음과 같이 이행하였다: 부피 30리터 들이의 샘플 백(본원에서는 테들라®백(Tedlar®bag))에 시험자/환자에 의해 튜브가 있는 마우스피스(mouthpiece)를 통해 호흡 공기를 불어 넣었다.
테들라 백을 통한 샘플링은 이후 수집 단계를 거쳐 형성되는 부피를 처리할수 있도록 이행되었다.
샘플링 이후, 형성되는 공기 부피(부피 유량 2ℓ/분인 경우에 20ℓ)를 수거 물질을 함유하는 카르투슈(cartouche)를 통해 백으로부터 펌프에 의해 흡입시켰다. 시판되는 카르투슈에 수거 물질로서 2,4-디니트로페닐히드라진(Supelco: article no. 5055358)로 피복된 실리카 겔을 충전시켰다. α-옥소알데히드를 하기 반응식에 따라 2,4-디니트로히드라존으로 반응시켰으며, 반응물이 실리카겔 상에 잔류하였다:
이후, 형성된 유도체를 카르투슈로부터 4ml의 아세토니트릴로 용리시키고, 얻어진 용출물을 건조 감소시켰다. 남아 있는 잔류물을 다시 500㎕의 아세토니트릴로 용해시켰다. 20㎕의 분취액을 분석용 HPLC 시스템에 옮겼다.
역상 크로마토그래피의 원리에 따른 HPLC 방법을 분석을 위해 사용하였으며, 방법론적 파라미터(parameter)는 다음과 같다:
칼럼: 하이퍼실(Hypersil) BDS C 18, 칼럼 길이 10cm, 칼럼 직경: 4mm, 입도: 3㎛
이동상: 아세토니트릴과 물의 혼합물. 부피 유량 0.5ml/분
개시 조건: 아세토니트릴과 물의 혼합물(50:50; 부피비)
구배: 10분에 걸쳐 개시 조건 유지, 이후, 27분 이내로 아세토니트릴의 부피비를 100%로. 360nm 및 404nm에서 UV 검출에 의해 데이타를 검출하고, 휴렛 팩커드 켐-스테이션(Hewlett Packard Chem-Station)으로 기록하였다.
도 1:
물질의 동정을 보호하기 위해, 수거 카르투슈의 용출액 일부를 UV 검출기 이외에 입수가능한 질량 분광분석 검출기를 구비한 HPLC 시스템으로 상기 기술된 조건 하에서 분석하였다(도 1). 질량 분광분석 검출기는 분자량에 의해, 그리고 특징적인 분자 단편으로의 분자 분해에 의해 물질의 동정을 가능하게 한다.
소정량의 α-옥소알데히드 유도체를 용출액의 다른 일부에 첨가하고, 이 용액을 HPLC 및 UV 검출(표준 부가 원리)에 의해 분석하였다(도 2). 첨가량의 유도체에 의존하여, 크로마토그램에서 화합물의 해당 시그날이 증가하고 있으며, 이에 따라 동정이 확인된다.
도 1에서, 아세톤에 대한 피크 및 메틸글리옥살에 대한 피크가 즉각적으로 검출될 수 있다. 그러므로, 대사 산물인 메틸글리옥살은 호흡 공기 샘플에서 검출될 수 있고, 이에 따라, 비침입적으로, 및 즉각적으로, 대사 특이성을 기초로 하여 환자의 혈장 중에 메틸글리옥살이 존재하는지 도시된다. 메틸글리옥살은 어디에서나 발생하는 것은 아니기 때문에, 환자의 환경으로 인한 측정의 변형 및 측정의 착오 결과는 예상되는 것은 아니다.
비교되는 건강한 시험자에게 추가의 비교 시험을 하는 동안에, α-옥소알데히드는 그때까지 이들의 호흡 공기 중에서 전혀 검출될 수 없었다.
실시예로서, 비교되는 건강한 시험자의 호흡 공기 샘플을 상기 기술된 방법에 상응하게 조사하였다. 도 3은 건강한 시험자에 대한 크로마토그램 결과이다. α-옥소알데히드의 체류 시간 영역에서 어떠한 평가가능한 시그날도 검출될 수 없다. 메틸글리옥살 표준물질의 첨가 후, 도 4에 도시된 바와 같이 19.50분에 시그날이 나타났다.
Claims (9)
- 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청에서 α-옥소알데히드를 검출하는 방법으로서, 호흡 공기 샘플에서 하나 이상의 α-옥소알데히드가 존재하는지 분석하고, 이 분석 결과로부터 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청 중의 α-옥소알데히드의 존재를 도출해 냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 호흡 공기 샘플 중의 α-옥소알데히드의 농도를 측정하고, 이로부터 환자의 전혈, 혈장 및/또는 혈청 중의 α-옥소알데히드 농도를 도출해 냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 메틸글리옥살, 글리옥살 및/또는 3-데옥시글루쿠론(3-deoxyglucuron)이 α-옥소알데히드로서 검출됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 호흡 공기 샘플을 샘플 백 및/또는 적합 샘플 용기에 밀폐시키고/밀폐시키거나 임핀저(impinger)를 통해 유도함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 호흡 공기 샘플 중의 α-옥소알데히드를 유도체화 매질에 의해 유도체화시켜, 형성된 유도체를 측정함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 유도체를 형광측정에 의해, 광도측정에 의해 및/또는 크로마토그래피에 의해 검출함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 호흡 공기 샘플 중의 α-옥소알데히드를, 전기화학적으로, 분광분석에 의해, 효소학적으로, 및/또는 면역화학적으로 검출함으로써 측정함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 호흡 공기 샘플 중의 α-옥소알데히드를 질량 분석에 의해 측정함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 호흡 공기 샘플 중에 함유되어 있는 메틸글리옥살을, 글리옥살라제를 사용하여 락테이트로 전환시키고, 이후 락테이트를 센서에 의해 검출함을 특징으로 하는 방법.
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