DE10202893A1

DE10202893A1 - Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben

Info

Publication number: DE10202893A1
Application number: DE2002102893
Authority: DE
Inventors: Rainer Feldbruegge
Original assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Current assignee: ICB INSTITUT FUER CHEMO- UND BIOSENSORIK GMBH, 4814
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2003-08-07
Also published as: EP1506311A2; WO2003062459A3; WO2003062459A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben, bei dem das Methylglyoxal zunächst oxidativ in Pyruvat umgewandelt wird, das im Anschluß in einen Verstärkungszyklus eingespeist wird, bei den NADH verbraucht und/oder Wasserstoffperoxid erzeugt werden. Diese wiederum können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben, bei dem das Methylglyoxal zunächst oxidativ in Pyruvat umgewandelt wird, das im Anschluß in einen Verstärkungszyklus eingespeist wird, bei den NADH verbraucht und/oder Wasserstoffperoxid erzeugt werden. Diese wiederum können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.
Methylglyoxal besitzt eine enorme physiologische Bedeutung, weswegen spezifische und hochempfindliche Bestimmungsmethoden auf diesem Gebiet von großer Bedeutung sind. Methylglyoxal kann aus Triosephosphat, der Metabolisierung von Keton-Körpern sowie bei der Verstoffwechselung von Threonin entstehen und wird durch Glyoxalase weiter abgebaut. Methylglyoxal reagiert dann mit Proteinen unter Bildung von Imidazolon-Derivaten und bis-Lysyl-Quervernetzungen. Diese Quervernetzung der Proteine kann zur Stabilisierung von Kollagen und damit zur Verdickung von Membranen führen.
Die Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Proben ist häufig begleitet durch weitere Komponenten, die mittels klassischer analytischer Methoden nur mit großem Aufwand abzutrennen sind.
Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Bestimmungsverfahren bereitzustellen, mit dem eine spezifische Bestimmung von Methylglyoxal bei gleichzeitig hoher Empfindlichkeit realisiert werden kann. Weiterhin sollte die einfache Handhabbarkeit des Verfahrens und ein geringer Kostenaufwand gegeben sein.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. In den Ansprüchen 18 bis 21 sind die Verwendungen dieses Verfahrens beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben bereitgestellt, das auf den folgenden Reaktionsschritten beruht.

a) Zunächst wird in der Probe vorliegendes Methylglyoxal mittels einer enzymatischen Oxidation in Pyruvat umgesetzt. Alternativ ist es auch möglich, daß die Oxidation auf chemischem und/oder elektrochemischem Wege erfolgt.
b) Das Pyruvat wird in eine enzymatische Verstärkungsreaktion eingespeist, bei der es zur Bildung von Wasserstoffperoxid und dem Verbrauch von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid in protonierter Form (NADH) kommt.
c) NADH, Wasserstoffperoxid und/oder deren Umsetzungsprodukte können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.

Das Verfahren kann dabei sowohl in separaten Reaktionsschritten als auch in einem Eintopf-Verfahren durchgeführt werden.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß aufgrund der Tatsache, daß die beiden Reaktionsschritte A) und B) auf spezifischen Reaktionen beruhen, eine spezifische Bestimmungsmethode mit hoher Empfindlichkeit bereitgestellt werden kann.
Vorzugsweise wird die enzymatische Oxidation mit einer Aldehyd-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ durchgeführt. Ebenso sind aber sämtliche aus dem Stand der Technik bekannten und hierzu befähigten Enzyme, insbesondere Dehydrogenasen, für diesen Oxidationsschritt einsetzbar.
Alternativ kann die enzymatische Oxidation auch mit einem Gemisch aus Glyoxalase I und Glyoxalase II durchgeführt werden. In Gegenwart von reduziertem Glutathion kommt es zur Oxidation des Methylglyoxals zu S-Lactoylglutathion mittels Glyoxalase I. In einem weiteren Schritt erfolgt dann die Umsetzung des S- Lactoylglutathions zu Lactat.
Wird eine chemische Oxidation durchgeführt, so erfolgt diese bevorzugt unter Einsatz von Kaliumpermanganat. Darüber hinaus sind auch die aus dem Stand der Technik bekannten elektrochemischen Oxidationsmethoden geeignet.
Die in Schritt B) beschriebene enzymatische Verstärkungsreaktion beruht bevorzugt auf zwei sich wiederholenden Reaktionsschritten:

A) Das Pyruvat wird mittels Lactat-Dehydrogenase und/oder 2-Hydroxyacid-Dehydrogenase zum Lactat reduziert, wobei die Konzentration an NADH abnimmt.

In Schritt

A) erfolgt die Oxidation des Lactats mittels Lactat-Oxidase, 2-Hydroxyacid-Oxidase und/oder Lacta-Malat-Transhydrogenase zum Pyruvat, wobei es hier zur Bildung von Wasserstoffperoxid kommt. Das so gebildete Pyruvat kann dann wieder als Edukt für Schritt A) verwendet werden, worauf dann der Verstärkungseffekt dieses zyklischen Reaktionsschemas beruht.

Je nachdem, ob die Oxidation zum Pyruvat oder Lactat erfolgt ist, kommt es zu einem unterschiedlichen Einstieg in den Verstärkungszyklus. Liegt Pyruvat vor, beginnt der Zyklus mit Schritt A), liegt Lactat vor, beginnt der Zyklus mit Schritt B).
Vorzugsweise erfolgt die Detektion des NADH auf optischem Wege. Da sich im Verlaufe der zyklischen Verstärkungsreaktion die Menge an NADH reduziert, wird somit der Verbrauch an NADH registriert.
NADH kann in einer Variante mittels einer Absorptionsmessung zwischen 320 und 380 nm, bevorzugt bei 340 nm detektiert werden. Alternativ ist es aber auch möglich, daß NADH mittels einer Fluoreszenzmessung zwischen 440 und 480 nm, bevorzugt bei 460 nm detektiert wird, wobei auch eine Kombinationsmessung in Frage kommt. In Anwesenheit von Wasserstoffperoxid, Peroxidase und einem im Bereich der Fluoreszenzstrahlung von NADH absorbierenden Farbstoff kann vorzugsweise eine verstärkte Abnahme der Fluoreszenzstrahlung detektiert werden, da die Intensität der Fluoreszenzstrahlung durch den absorbierenden Farbstoff zusätzlich reduziert wird.
Auch eine elektrochemische Bestimmung von NADH mittels Sensoren kann vorzugsweise durchgeführt werden. Wird das Wasserstoffperoxid detektiert, so sind hierfür alle aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren anwendbar. Bevorzugt erfolgt dies über eine Farbreaktion mittels Peroxidase und einem Farbstoff, der über eine Absorbtions- und/oder Fluoreszenzmessung detektiert wird. In gleicher Weise kann vorzugsweise auch eine elektrochemische Bestimmung des Wasserstoffperoxids mittels Sensoren durchgeführt werden.
In einer Variante des Verfahrens kann in Schritt B) bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion NADH- Peroxidase zugesetzt werden, wodurch im Zusammenhang mit dem Wasserstoffperoxid eine doppelt so schnelle Konzentrationsabnahme von NADH zu beobachten ist. Eine weitere Verstärkung kann dadurch erzielt werden, indem bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion Lactat-Malat-Dehydrogenase in Verbindung mit Malic- Enzyme eingesetzt wird.
Bei Vorliegen einer gasförmigen Probe kann das Methylglyoxal mittels Kryo-Fokussierung auskondensiert werden und anschließend im Kondensat die Bestimmung erfolgen.
Um störende Einflüsse von chemisch verwandten Komponenten in der Probe zu verhindern, kann vor Schritt a) in der Probe vorliegendes Pyruvat und/oder Lactat einer enzymatischen Umsetzung unterzogen werden, so daß diese keine weitere Störung der Bestimmung hervorrufen. Dies kann vorzugsweise dadurch erfolgen, daß für die enzymatische Umsetzung D-Lactat-Dehydrogenase, Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, Pyruvat-Carboxylase Pyruvat-Decarboxylase, Transferasen, z. B. Glutaminpyruvat-Transferase, Lactat- Monooxygenase, Lactat-Racemase, Opine-Dehydrogenasen, z. B. Octopine-Dehydrogenase, Propionat-CoA- Transferase, Acetolactat-Synthase und/oder Dikinasen, z. B. Phosphat-Pyruvat-Dikinasen eingesetzt werden.
Als weitere Alternative des Verfahrens kann nach Schritt A) der Gesamtgehalt an Aldehyd in der Probe enzymatisch bestimmt werden.
Verwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt bei der Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Proben. Gerade im Hinblick auf diabetische Erkrankungen stellt die physiologische Methylglyoxal-Konzentration im Körper eine große Bedeutung. Hierzu zählen beispielsweise diabetische Komplikationen wie Nierenversagen und Linsentrübung. Bevorzugt wird das Verfahren zur Bestimmung von Methylglyoxal in Atemluft oder Atemkondensat eingesetzt. Aber auch die Bestimmung von Mehtylglyoxal in weiterem physiologischen Flüssigkeiten, z. B. in Vollblut, in Plasma, in Serum, in Speichel und/oder in Urin ist möglich.
Weitere Anwendungsfelder für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Bestimmungen von Methylglyoxal in Desinfektionsmitteln sowie die Kontrolle des Methylglyoxalgehaltes bei dessen Herstellungsprozesses. Aber auch bei der analytischen Bestimmung des Methylglyoxalgehaltes in Lebensmitteln oder anderen Konsumgütern findet das Verfahren vorzugsweise Anwendung.
Anhand der folgenden beiden Figuren und des folgenden Beispiels soll das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne diese auf diese Ausführungsformen einzuschränken.
Fig. 1 zeigt eine Kalibrationsgerade im Konzentrationsbereich bis 50 nmol/ml Methylglyoxal.
Fig. 2 zeigt die gleiche Kalibrationsgerade im Konzentrationsbereich bis 5 nmol/ml Methylglyoxal.

Beispiel 1

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht sich im folgenden auf ein Probenvolumen von 100 µl. Zunächst wird eine Lösung A mit der folgenden Zusammensetzung erstellt:
2 µl 10 mg/ml NAD
2 µl 10 mg/ml NADH
2 µl 0,1 U/µl D-Lactat Dehydrogenase
1 µl 3 M Kaliumchlorid (KCl)
2 µl 0,25 U/µl Lactat Oxidase
20 µl Polybutylensulfon (PBS) pH 7.2
Die Lösung A wird anschließend zur Eliminierung von Störsubstanzen 5 min in den Ingedienzien inkubiert und im Anschluß gefriergetrocknet.
Ferner wird eine Lösung B mit folgender Zusammensetzung hergestellt:
4 µl 3,5 U/µl L-Lactat Dehydrogenase
5 µl 0.1 U/µl Aldehyd Dehydrogenase
9 µl der Lösung A
Die Lösung B wird anschließend ebenfalls gefriergetrocknet.
Zur Eliminierung von Störsubstanzen werden 100 µl Probe zu Lösung A hinzugegeben und 10 min inkubiert. Die 100 µl werden im Anschluß zur Lösung B zugegeben, in der dann der NADH-Abbau im Photometer bei 340 nm und 37°C bestimmt wird.
In Fig. 1 ist eine entsprechende Kalibrationsgerade für den Konzentrationsbereich zwischen 0 und 50 nmol/mml Methylglyoxal dargestellt. Hierin zeigt sich ein linearer Verlauf im Konzentrationsbereich zwischen 0 und 10 nmol/mml Mehtylglyoxal. Anschließend kommt es zu einer für derartige Bestimmungen typischen negativen Abweichung der Kalibrationsgerade. Verdeutlicht wird die Linearität im unteren Konzentrationsbereich durch die in Fig. 2 dargestellte Kalibrationsgerade im Bereich bis 5 nmol/mml Methylglyoxal.

Claims

1. Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben bei dem

a) das Methylglyoxal durch eine enzymatische, chemische und/oder elektrochemische Oxidation zu Pyruvat oder Lactat umgesetzt wird,

b) eine enzymatische Verstärkungsreaktion unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Verbrauch von NADH durchgeführt wird und

c) NADH, Wasserstoffperoxid und/oder deren Umsetzungsprodukte detektiert und quantifiziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Oxidation mit einer Aldehyd-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD⁺ durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidation mit einem Enzymgemsich aus Glyoxalase I und Glyoxalase II durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Oxidation mit Kaliumpermanganat durchgeführt wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Verstärkungsreaktion auf zwei sich wiederholenden Reaktionsschritten beruht:

A) Reduktion des Pyruvats zum Lactat mittels Lactat-Dehydrogenase und/oder 2-Hydroxyacid- Dehydrogenase sowie

B) anschließende Oxidation des Lactats zum Pyruvat mittels Lactat-Oxidase, 2-Hydroxyacid- Dehydrogenase und/oder Lactat-Malat- Transhydrogenase.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass NADH optisch detektiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass NADH durch eine Absorptionsmessung zwischen 320 und 380 nm, bevorzugt bei 340 nm detektiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass NADH durch eine Fluoreszenzmessung zwischen 440 und 480 nm, bevorzugt bei 460 nm detektiert wird.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass NADH elektrochemisch mittels Sensoren detektiert wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid über eine Farbreaktion mittels Peroxidase und einem Farbstoff detektiert wird.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid elektrochemisch mittels Sensoren quantifiziert wird.

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion NADH-Peroxidase zugesetzt wird.

13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion Lactat-Malat- Transhydrogenase in Verbindung mit Malic-Enzyme verwendet wird.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die gasförmige Probe mittels Kryofokussierung kondensiert und im Kondensat die Bestimmung erfolgt.

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) in der Probe vorliegendes Pyruvat und/oder Lactat einer enzymatischen Umsetzung derart unterzogen wird, daß durch diese keine Störung der Bestimmung auftritt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass für die Umsetzung D-Lactat-Dehydrogenase, Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, Pyruvat-Carboxylase, Pyruvat- Decarboxylase, Transferasen, z. B. Glutaminpyruvat-Transferase, Lactat-Monooxygenase und/oder Lactat-Racemase eingesetzt wird.

17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt a) zusätzlich der Gesamtgehalt an Aldehyd der Probe enzymatisch bestimmt wird.

18. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung von Methylglyoxal in Atemluft oder Atemkondensat.

19. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Flüssigkeiten, z. B. Vollblut, Plasma, Serum, Speichel und Urin.

20. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Bestimmung von Methylglyoxal in Desinfektionsmitteln.

21. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Kontrolle des Methylglyoxalgehaltes bei dessen Herstellung.