WO2003062459A2 - Verfahren zur spezifischen bestimmung von methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen proben - Google Patents

Verfahren zur spezifischen bestimmung von methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen proben Download PDF

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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the invention relates to a method for the specific determination of methylglyoxal in liquid and / or gaseous samples, in which the methylglyoxal is first oxidatively converted into pyruvate, which is then fed into an amplification cycle in which NADH is consumed and / or hydrogen peroxide is generated. These in turn can then be detected and quantified.
  • Methylglyoxal has an enormous physiological importance, which is why specific and highly sensitive methods of determination are of great importance in this area. Methylglyoxal can arise from triose phosphate, the metabolism of ketone bodies and the metabolism of threonine and is further broken down by glyoxalase. Methylglyoxal then reacts with proteins to form imidazo- Ion derivatives and bis-lysyl cross-links. This cross-linking of the proteins can lead to the stabilization of collagen and thus to the thickening of membranes.
  • methylglyoxal in physiological samples is often accompanied by other components that can only be separated with great effort using classic analytical methods.
  • Claims show advantageous further developments. Claims 18 to 21 describe the uses of this method.
  • a method for the specific determination of methylglyoxal in liquid and / or gaseous samples is provided, which is based on the following reaction steps.
  • methylglyoxal present in the sample is converted into pyruvate by means of an enzymatic oxidation. Alternatively, it is also possible for the oxidation to take place chemically and / or electrochemically.
  • the pyruvate is fed into an enzymatic amplification reaction, in which hydrogen peroxide is formed and nicotinamide adenine dinucleotide is consumed in protonated form (NADH).
  • the process can be carried out both in separate reaction steps and in a one-pot process.
  • the enzymatic oxidation is preferably carried out with an aldehyde dehydrogenase in the presence of NAD + .
  • an aldehyde dehydrogenase in the presence of NAD + .
  • all of the enzymes known from the prior art and capable of doing so, in particular dehydrogenases, can also be used for this oxidation step.
  • the enzymatic oxidation can also be carried out with a mixture of Glyoxalase I and Glyoxalase II. In the presence of reduced
  • Glutathione leads to the oxidation of methylglyoxal to S-lactoylglutathione by means of glyoxalase I.
  • the S-lactoylglutathione is converted to lactate. If a chemical oxidation is carried out, this is preferably carried out using potassium permanganate.
  • the electrochemical oxidation methods known from the prior art are also suitable.
  • step B) The enzymatic amplification reaction described in step B) is preferably based on two repetitive reaction steps:
  • step B) the lactate is oxidized to the pyruvate by means of lactate oxidase, 2-hydroxyacid 0xidase and / or lactate malate transhydrogenase, with the formation of hydrogen peroxide.
  • the pyruvate thus formed can then be used again as an educt for step A), on which the reinforcing effect of this cyclic reaction scheme is based.
  • step A the cycle begins with step A
  • step B the cycle begins with step B
  • the NADH is preferably detected optically. Since the amount of NADH is reduced in the course of the cyclical reinforcement reaction, the consumption of NADH is thus registered.
  • NADH can be detected in a variant by means of an absorption measurement between 320 and 380 nm, preferably at 340 nm. Alternatively, however, it is also possible for NADH to be detected by means of a fluorescence measurement between 440 and 480 nm, preferably at 460 nm, a combination measurement also being possible. In the presence of. Hydrogen peroxide, peroxidase and a dye which absorbs NADH in the region of the fluorescent radiation, an increased decrease in the fluorescent radiation can preferably be detected, since the intensity of the fluorescent radiation is additionally reduced by the absorbing dye.
  • An electrochemical determination of NADH by means of sensors can also preferably be carried out. If the hydrogen peroxide is detected, all methods known from the prior art can be used for this. This is preferably carried out via a color reaction using peroxidase and a dye which is detected via an absorption and / or fluorescence measurement. In the same way, an electrochemical determination of the hydrogen peroxide can preferably also be carried out by means of sensors.
  • NADH peroxidase can be added in step B) in the enzymatic amplification reaction, which in connection with the hydrogen peroxide is twice as fast
  • NADH concentration of NADH
  • a further amplification can be achieved by using lactate-malate dehydrogenase in connection with malic enzymes in the enzymatic amplification reaction. If a gaseous sample is available, the methylglyoxal can be condensed out by means of cryofocusing and the determination can then be carried out in the condensate.
  • pyruvate and / or lactate present in the sample can be subjected to an enzymatic conversion before step a), so that these do not cause any further interference in the determination.
  • This can preferably be done by using D-lactate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, pyruvate oxidase, pyruvate carboxylase, pyruvate decarboxylase, transferases, e.g. Glutamine pyruvate transferase, lactate
  • Monooxygenase, lactate racemase, opine dehydrogenases, e.g. Octopine dehydrogenase, propionate-CoA transferase, acetolactate synthase and / or dikinases, e.g. Phosphate Pyruva dikinases can be used.
  • the total content of aldehyde in the sample can be determined enzymatically after step A).
  • the method according to the invention is preferably used in the determination of methylglyoxal in physiological samples.
  • the physiological concentration of methylglyoxal in the body is particularly important with regard to diabetic diseases. These include, for example, diabetic complications such as kidney failure and lens clouding.
  • the method for determining methylglyoxal in breathing air or breathing condensate is preferably used.
  • the determination of methylglyoxal in other physiological liquids for example in whole blood, in plasma, in serum, in saliva and / or in urine, is also possible. Further applications for the method according to the invention are the determination of methylglyoxal in disinfectants and the control of the methylglyoxal content in its production process.
  • the method is also preferably used for the analytical determination of the methylglyoxal content in foods or other consumer goods.
  • Fig. 1 shows a calibration line in the concentration range up to 50 nmol / ml methylglyoxal.
  • Fig. 2 shows the same calibration line in the
  • the implementation of the method according to the invention relates to a sample volume of
  • a solution B with the following composition is also prepared:
  • Solution B is then also freeze-dried.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben, bei dem das Methylglyoxal zu­nächst oxidativ in Pyruvat umgewandelt wird, das im Anschluss in einen Verstärkungszyklus eingespeist wird, bei den NADH verbraucht und/oder Wasserstoff­peroxid erzeugt werden. Diese wiederum können im An­schluss detektiert und quantifiziert werden.

Description

Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben, bei dem das Methylglyoxal zunächst oxidativ in Pyruvat umgewandelt wird, das im Anschluß in einen Verstärkungszyklus eingespeist wird, bei den NADH verbraucht und/oder Wasserstoffperoxid erzeugt werden. Diese wiederum können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.
Methylglyoxal besitzt eine enorme physiologische Bedeutung, weswegen spezifische und hochempfindliche Bestimmungsmethoden auf diesem Gebiet von großer Bedeutung sind. Methylglyoxal kann aus Triosephosphat , der Metabolisierung von Keton-Körpern sowie bei der Verstoffwechselung von Threonin entstehen und wird durch Glyoxalase weiter abgebaut. Methylglyoxal reagiert dann mit Proteinen unter Bildung von Imidazo- Ion-Derivaten und bis-Lysyl-Quervernetzungen. Diese Quervernetzung der Proteine kann zur Stabilisierung von Kollagen und damit zur Verdickung von Membranen führen.
Die Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Proben ist häufig begleitet durch weitere Komponenten, die mittels klassischer analytischer Methoden nur mit großem Aufwand abzutrennen sind.
Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Bestimmungsverfahren bereitzustellen, mit dem eine spezifische Bestimmung von Methylglyoxal bei gleichzeitig hoher Empfindlichkeit realisiert werden kann. Weiterhin sollte die einfache Handhabbarkeit des Verfahrens und ein geringer Kostenaufwand gegeben sein.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merk- malen des Anspruchs 1 gelöst. Die weiteren abhängigen
Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. In den Ansprüchen 18 bis 21 sind die Verwendungen dieses Verfahrens beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben bereitgestellt, das auf den folgenden Reaktionsschritten beruht.
a) Zunächst wird in der Probe vorliegendes Methylglyoxal mittels einer enzymatischen Oxidation in Pyruvat umgesetzt . Alternativ ist es auch möglich, daß die Oxidation auf chemischem und/oder elektrochemischem Wege erfolgt. b) Das Pyruvat wird in eine enzymatische Verstärkungsreaktion eingespeist, bei der es zur Bildung von Wasserstoffperoxid und dem Verbrauch von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid in protonier- ter Form (NADH) kommt .
c) NADH, Wasserstoffperoxid und/oder deren Umsetzungsprodukte können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.
Das Verfahren kann dabei sowohl in separaten Reaktionsschritten als auch in einem Eintopf-Verfahren durchgeführt werden.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß aufgrund der Tatsache, daß die beiden Reaktionsschritte A) und B) auf spezifischen Reaktionen beruhen, eine spezifische Bestimmungsmethode mit hoher Empfindlichkeit bereitgestellt werden kann.
Vorzugsweise wird die enzymatische Oxidation mit einer Aldehyd-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD+ durchgeführt . Ebenso sind aber sämtliche aus dem Stand der Technik bekannten und hierzu befähigten En- zy e, insbesondere Dehydrogenasen, für diesen Oxida- tionsschritt einsetzbar.
Alternativ kann die enzymatische Oxidation auch mit einem Gemisch aus Glyoxalase I und Glyoxalase II durchgeführt werden. In Gegenwart von reduziertem
Glutathion kommt es zur Oxidation des Methylglyoxals zu S-Lactoylglutathion mittels Glyoxalase I. In einem weiteren Schritt erfolgt dann die Umsetzung des S- Lactoylglutathions zu Lactat. Wird eine chemische Oxidation durchgeführt, so erfolgt diese bevorzugt unter Einsatz von Kaliumperman- ganat . Darüber hinaus sind auch die aus dem Stand der Technik bekannten elektrochemischen Oxidationsmetho- den geeignet.
Die in Schritt B) beschriebene enzymatische Verstärkungsreaktion beruht bevorzugt auf zwei sich wiederholenden Reaktionsschritten:
A) Das Pyruvat wird mittels Lactat-Dehydrogenase und/oder 2-Hydroxyacid-Dehydrogenase zum Lactat reduziert, wobei die Konzentration an NADH abnimmt .
In Schritt
B) erfolgt die Oxidation des Lactats mittels Lac- tat-Oxidase, 2-Hydroxyacid-0xidase und/oder Lac- ta-Malat-Transhydrogenase zum Pyruvat, wobei es hier zur Bildung von Wasserstoffperoxid kommt . Das so gebildete Pyruvat kann dann wieder als Edukt für Schritt A) verwendet werden, worauf dann der Verstärkungseffekt dieses zyklischen ReaktionsSchemas beruht.
Je nachdem, ob die Oxidation zum Pyruvat oder Lactat erfolgt ist, kommt es zu einem unterschiedlichen Einstieg in den Verstärkungszyklus. Liegt Pyruvat vor, beginnt der Zyklus mit Schritt A) , liegt Lactat vor, beginnt der Zyklus mit Schritt B) .
Vorzugsweise erfolgt die Detektion des NADH auf optischem Wege. Da sich im Verlaufe der zyklischen Ver- Stärkungsreaktion die Menge an NADH reduziert, wird somit der Verbrauch an NADH registriert . NADH kann in einer Variante mittels einer Absorptionsmessung zwischen 320 und 380 nm, bevorzugt bei 340 nm detektiert werden. Alternativ ist es aber auch möglich, daß NADH mittels einer Fluoreszenzmessung zwischen 440 und 480 nm, bevorzugt bei 460 nm detektiert wird, wobei auch eine Kombinationsmessung in Frage kommt. In Anwesenheit von .Wasserstoffperoxid, Peroxidase und einem im Bereich der Fluoreszenzstrah- lung von NADH absorbierenden Farbstoff kann vorzugsweise eine verstärkte Abnahme der Fluoreszenzstrahlung detektiert werden, da die Intensität der Fluoreszenzstrahlung durch den absorbierenden Farbstoff zusätzlich reduziert wird.
Auch eine elektrochemische Bestimmung von NADH mittels Sensoren kann vorzugsweise durchgeführt werden. Wird das Wasserstoffperoxid detektiert, so sind hierfür alle aus dem Stand der Technik bekannten -Verfah- ren anwendbar. Bevorzugt erfolgt dies über eine Farbreaktion mittels Peroxidase und einem Farbstoff, der über eine Absorbtions- und/oder Fluoreszenzmessung detektiert wird. In gleicher Weise kann vorzugsweise auch eine elektrochemische Bestimmung des Wasser- stoffperoxids mittels Sensoren durchgeführt werden.
In einer Variante des Verfahrens kann in Schritt B) bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion NADH- Peroxidase zugesetzt werden, wodurch im Zusammenhang mit dem Wasserstoffperoxid eine doppelt so schnelle
Konzentrationsabnahme von NADH zu beobachten ist. Eine weitere Verstärkung kann dadurch erzielt werden, indem bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion Lac- tat-Malat-Dehydrogenase in Verbindung mit Malic- Enzyme eingesetzt wird. Bei Vorliegen einer gasförmigen Probe kann das Methylglyoxal mittels Kryo-Fokussierung auskondensiert werden und anschließend im Kondensat die Bestimmung erfolgen.
Um störende Einflüsse von chemisch verwandten Komponenten in der Probe zu verhindern, kann vor Schritt a) in der Probe vorliegendes Pyruvat und/oder Lactat einer enzymatischen Umsetzung unterzogen werden, so daß diese keine weitere Störung der Bestimmung hervorrufen. Dies kann vorzugsweise dadurch erfolgen, daß für die enzymatische Umsetzung D-Lactat-Dehydro- genase, Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, Pyruvat-Carboxylase Pyruvat-Decarboxylase, Transferasen, z.B. Glutaminpyruvat-Transferase, Lactat-
Monooxygenase, Lactat-Racemase, Opine-Dehydrogenasen, z.B. Octopine-Dehydrogenase, Propionat-CoA- Transferase, Acetolactat-Synthase und/oder Dikinasen, z.B. Phosphat-Pyruva -Dikinasen eingesetzt werden.
Als weitere Alternative des Verfahrens kann nach Schritt A) der Gesamtgehalt an Aldehyd in der Probe enzymatisch bestimmt werden.
Verwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt bei der Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Proben. Gerade im Hinblick auf diabeti- sche Erkrankungen stellt die physiologische Methylglyoxal-Konzentration im Körper eine große Bedeutung. Hierzu zählen beispielsweise diabetische Komplikationen wie Nierenversagen und Linsentrübung. Bevorzugt wird das Verfahren zur Bestimmung von Methylglyoxal in Atemluft oder Atemkondensat eingesetzt. Aber auch die Bestimmung von Mehtylglyoxal in weiterem physio- logischen Flüssigkeiten, z.B. in Vollblut, in Plasma, in Serum, in Speichel und/oder in Urin ist möglich. Weitere Anwendungsf eider für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Bestimmungen von Methylglyoxal in Desinfektionsmitteln sowie die Kontrolle des Methyl - glyoxalgehaltes bei dessen Herstellungsprozesses .
Aber auch bei der analytischen Bestimmung des Methyl - glyoxalgehaltes in Lebensmitteln oder anderen Konsumgütern findet das Verfahren vorzugsweise Anwendung .
Anhand der folgenden beiden Figuren und des folgenden
Beispiels soll das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne diese auf diese Ausführungsformen einzuschränken .
Fig . 1 zeigt eine Kalibrat ionsgerade im Konzentrationsbereich bis 50 nmol/ml Methylglyoxal .
Fig . 2 zeigt die gleiche Kalibrat ionsgerade im
Konzentrationsbereich bis 5 nmol/ml Methylglyoxal .
Beispiel 1
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens be- zieht sich im folgenden auf ein Probenvolumen von
100 μl . Zunächst wird eine Lösung A mit der folgenden Zusammensetzung erstellt:
2 μl 10 mg/ml NAD 2 μl 10 mg/ml NADH
2 μl 0,1 U/μl D-Lactat Dehydrogenase
1 μl 3 M Kaliumchlorid (KCl)
2 μl 0,25 U/μl Lactat Oxidase
20 μl Polybutylensulfon (PBS) pH 7.2 Die Lösung A wird anschließend zur Eliminierung von Störsubstanzen 5 min in den Ingedienzien inkubiert und im Anschluß gefriergetrocknet .
Ferner wird eine Lösung B mit folgender Zusammensetzung hergestellt :
4 μl 3,5 U/μl L-Lactat Dehydrogenase
5 μl 0.1 U/μl Aldehyd Dehydrogenase 9 μl der Lösung A
Die Lösung B wird anschließend ebenfalls gefriergetrocknet .
Zur Eliminierung von Störsubstanzen werden 100 μl Probe zu Lösung A hinzugegeben und 10 min inkubiert. Die 100 μl werden im Anschluß zur Lösung B zugegeben, in der dann der NADH-Abbau im Photometer bei 340 nm und 37 °C bestimmt wird.
In Fig. 1 ist eine entsprechende Kalibrationsgerade für den Konzentrationsbereich zwischen 0 und 50 nmol/mml Methylglyoxal dargestellt. Hierin zeigt sich ein linearer Verlauf im Konzentrationsbereich zwischen 0 und 10 nmol/mml Mehtylglyoxal . Anschließend kommt es zu einer für derartige Bestimmungen typischen negativen Abweichung der Kalibrationsgerade. Verdeutlicht wird die Linearität im unteren Konzentrationsbereich durch die in Fig. 2 dargestellte Ka- librationsgerade im Bereich bis 5 nmol/mml Methyl- glyoxal .

Claims

Patentansprüche
l. Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben bei dem
a) das Methylglyoxal durch eine enzymatische, chemische und/oder elektrochemische Oxidation zu
Pyruvat oder Lactat umgesetzt wird,
b) eine enzymatische Verstärkungsreaktion unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Verbrauch von NADH durchgeführt wird und
c) NADH, Wasserstoffperoxid und/oder deren Umsetzungsprodukte detektiert und quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Oxidation mit einer Aldehyd-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD+ durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidation mit einem Enzymgemsich aus Glyoxalase I und Glyoxalase II durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Oxidation mit Kaliumpermanganat durchgeführt wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Verstärkungsreaktion auf zwei sich wiederholen- den Reaktionsschritten beruht:
A) Reduktion des Pyruvats zum Lactat mittels Lactat-Dehydrogenase und/oder 2-Hydroxyacid- Dehydrogenase sowie
B) anschließende Oxidation des Lactats zum Pyru- vat mittels Lactat-Oxidase, 2-Hydroxyacid-
Dehydrogenase und/oder Lactat-Malat- Transhydrogenase .
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass NADH optisch detektiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6 , dadurch gekennzeichnet, dass NADH durch eine Ab- Sorptionsmessung zwischen 320 und 380 nm, bevorzugt bei 340 nm detektiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7 , dadurch gekennzeichnet, dass NADH durch eine Fluoreszenzmessung zwischen 440 und 480 nm, be- vorzugt bei 460 nm detektiert wird.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass NADH elektroche- misch mittels Sensoren detektiert wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid über eine Farbreaktion mittels Peroxidase und einem Farbstoff detektiert wird.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffper- oxid elektrochemisch mittels Sensoren quantifiziert wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion NADH-Peroxidase zugesetzt wird.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion Lactat-Malat- Transhydrogenase in Verbindung mit Malic-Enzyme verwendet wird.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die gasförmige Probe mittels Kryofokussierung kondensiert und im Kondensat die Bestimmung erfolgt.
15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) in der Probe vorliegendes Pyruvat und/oder Lactat einer enzymatischen Umsetzung derart unterzogen wird, daß durch diese keine Störung der Bestim- mung auftritt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass für die Umsetzung D-Lactat-Dehydrogenase, Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, Pyruvat-Carboxylase, Pyruvat-
Decarboxylase, Transferasen, z.B. Glutaminpyru- vat-Transferase, Lactat-Monooxygenase und/oder Lactat-Racemase eingesetzt wird.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt a) zusätzlich der Gesamtgehalt an Aldehyd der Probe enzymatisch bestimmt wird.
18. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung von Methylglyoxal in Atemluft oder Atemkondensat .
19. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Flüssigkeiten, z.B. Vollblut, Plasma, Serum, Speichel und Urin.
20. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Bestimmung von Methylglyoxal in Desinfektionsmitteln.
1. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Kontrolle des Methyl- glyoxalgehaltes bei dessen Herstellung.
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