Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben, bei dem das Methylglyoxal zunächst oxidativ in Pyruvat umgewandelt wird, das im Anschluß in einen Verstärkungszyklus eingespeist wird, bei den NADH verbraucht und/oder Wasserstoffperoxid erzeugt werden. Diese wiederum können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.
Methylglyoxal besitzt eine enorme physiologische Bedeutung, weswegen spezifische und hochempfindliche Bestimmungsmethoden auf diesem Gebiet von großer Bedeutung sind. Methylglyoxal kann aus Triosephosphat , der Metabolisierung von Keton-Körpern sowie bei der Verstoffwechselung von Threonin entstehen und wird durch Glyoxalase weiter abgebaut. Methylglyoxal reagiert dann mit Proteinen unter Bildung von Imidazo-
Ion-Derivaten und bis-Lysyl-Quervernetzungen. Diese Quervernetzung der Proteine kann zur Stabilisierung von Kollagen und damit zur Verdickung von Membranen führen.
Die Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Proben ist häufig begleitet durch weitere Komponenten, die mittels klassischer analytischer Methoden nur mit großem Aufwand abzutrennen sind.
Ausgehend hiervon war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Bestimmungsverfahren bereitzustellen, mit dem eine spezifische Bestimmung von Methylglyoxal bei gleichzeitig hoher Empfindlichkeit realisiert werden kann. Weiterhin sollte die einfache Handhabbarkeit des Verfahrens und ein geringer Kostenaufwand gegeben sein.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merk- malen des Anspruchs 1 gelöst. Die weiteren abhängigen
Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. In den Ansprüchen 18 bis 21 sind die Verwendungen dieses Verfahrens beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Methylglyoxal in flüssigen und/oder gasförmigen Proben bereitgestellt, das auf den folgenden Reaktionsschritten beruht.
a) Zunächst wird in der Probe vorliegendes Methylglyoxal mittels einer enzymatischen Oxidation in Pyruvat umgesetzt . Alternativ ist es auch möglich, daß die Oxidation auf chemischem und/oder elektrochemischem Wege erfolgt.
b) Das Pyruvat wird in eine enzymatische Verstärkungsreaktion eingespeist, bei der es zur Bildung von Wasserstoffperoxid und dem Verbrauch von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid in protonier- ter Form (NADH) kommt .
c) NADH, Wasserstoffperoxid und/oder deren Umsetzungsprodukte können im Anschluß detektiert und quantifiziert werden.
Das Verfahren kann dabei sowohl in separaten Reaktionsschritten als auch in einem Eintopf-Verfahren durchgeführt werden.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß aufgrund der Tatsache, daß die beiden Reaktionsschritte A) und B) auf spezifischen Reaktionen beruhen, eine spezifische Bestimmungsmethode mit hoher Empfindlichkeit bereitgestellt werden kann.
Vorzugsweise wird die enzymatische Oxidation mit einer Aldehyd-Dehydrogenase in Gegenwart von NAD+ durchgeführt . Ebenso sind aber sämtliche aus dem Stand der Technik bekannten und hierzu befähigten En- zy e, insbesondere Dehydrogenasen, für diesen Oxida- tionsschritt einsetzbar.
Alternativ kann die enzymatische Oxidation auch mit einem Gemisch aus Glyoxalase I und Glyoxalase II durchgeführt werden. In Gegenwart von reduziertem
Glutathion kommt es zur Oxidation des Methylglyoxals zu S-Lactoylglutathion mittels Glyoxalase I. In einem weiteren Schritt erfolgt dann die Umsetzung des S- Lactoylglutathions zu Lactat.
Wird eine chemische Oxidation durchgeführt, so erfolgt diese bevorzugt unter Einsatz von Kaliumperman- ganat . Darüber hinaus sind auch die aus dem Stand der Technik bekannten elektrochemischen Oxidationsmetho- den geeignet.
Die in Schritt B) beschriebene enzymatische Verstärkungsreaktion beruht bevorzugt auf zwei sich wiederholenden Reaktionsschritten:
A) Das Pyruvat wird mittels Lactat-Dehydrogenase und/oder 2-Hydroxyacid-Dehydrogenase zum Lactat reduziert, wobei die Konzentration an NADH abnimmt .
In Schritt
B) erfolgt die Oxidation des Lactats mittels Lac- tat-Oxidase, 2-Hydroxyacid-0xidase und/oder Lac- ta-Malat-Transhydrogenase zum Pyruvat, wobei es hier zur Bildung von Wasserstoffperoxid kommt . Das so gebildete Pyruvat kann dann wieder als Edukt für Schritt A) verwendet werden, worauf dann der Verstärkungseffekt dieses zyklischen ReaktionsSchemas beruht.
Je nachdem, ob die Oxidation zum Pyruvat oder Lactat erfolgt ist, kommt es zu einem unterschiedlichen Einstieg in den Verstärkungszyklus. Liegt Pyruvat vor, beginnt der Zyklus mit Schritt A) , liegt Lactat vor, beginnt der Zyklus mit Schritt B) .
Vorzugsweise erfolgt die Detektion des NADH auf optischem Wege. Da sich im Verlaufe der zyklischen Ver- Stärkungsreaktion die Menge an NADH reduziert, wird somit der Verbrauch an NADH registriert .
NADH kann in einer Variante mittels einer Absorptionsmessung zwischen 320 und 380 nm, bevorzugt bei 340 nm detektiert werden. Alternativ ist es aber auch möglich, daß NADH mittels einer Fluoreszenzmessung zwischen 440 und 480 nm, bevorzugt bei 460 nm detektiert wird, wobei auch eine Kombinationsmessung in Frage kommt. In Anwesenheit von .Wasserstoffperoxid, Peroxidase und einem im Bereich der Fluoreszenzstrah- lung von NADH absorbierenden Farbstoff kann vorzugsweise eine verstärkte Abnahme der Fluoreszenzstrahlung detektiert werden, da die Intensität der Fluoreszenzstrahlung durch den absorbierenden Farbstoff zusätzlich reduziert wird.
Auch eine elektrochemische Bestimmung von NADH mittels Sensoren kann vorzugsweise durchgeführt werden. Wird das Wasserstoffperoxid detektiert, so sind hierfür alle aus dem Stand der Technik bekannten -Verfah- ren anwendbar. Bevorzugt erfolgt dies über eine Farbreaktion mittels Peroxidase und einem Farbstoff, der über eine Absorbtions- und/oder Fluoreszenzmessung detektiert wird. In gleicher Weise kann vorzugsweise auch eine elektrochemische Bestimmung des Wasser- stoffperoxids mittels Sensoren durchgeführt werden.
In einer Variante des Verfahrens kann in Schritt B) bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion NADH- Peroxidase zugesetzt werden, wodurch im Zusammenhang mit dem Wasserstoffperoxid eine doppelt so schnelle
Konzentrationsabnahme von NADH zu beobachten ist. Eine weitere Verstärkung kann dadurch erzielt werden, indem bei der enzymatischen Verstärkungsreaktion Lac- tat-Malat-Dehydrogenase in Verbindung mit Malic- Enzyme eingesetzt wird.
Bei Vorliegen einer gasförmigen Probe kann das Methylglyoxal mittels Kryo-Fokussierung auskondensiert werden und anschließend im Kondensat die Bestimmung erfolgen.
Um störende Einflüsse von chemisch verwandten Komponenten in der Probe zu verhindern, kann vor Schritt a) in der Probe vorliegendes Pyruvat und/oder Lactat einer enzymatischen Umsetzung unterzogen werden, so daß diese keine weitere Störung der Bestimmung hervorrufen. Dies kann vorzugsweise dadurch erfolgen, daß für die enzymatische Umsetzung D-Lactat-Dehydro- genase, Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, Pyruvat-Carboxylase Pyruvat-Decarboxylase, Transferasen, z.B. Glutaminpyruvat-Transferase, Lactat-
Monooxygenase, Lactat-Racemase, Opine-Dehydrogenasen, z.B. Octopine-Dehydrogenase, Propionat-CoA- Transferase, Acetolactat-Synthase und/oder Dikinasen, z.B. Phosphat-Pyruva -Dikinasen eingesetzt werden.
Als weitere Alternative des Verfahrens kann nach Schritt A) der Gesamtgehalt an Aldehyd in der Probe enzymatisch bestimmt werden.
Verwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt bei der Bestimmung von Methylglyoxal in physiologischen Proben. Gerade im Hinblick auf diabeti- sche Erkrankungen stellt die physiologische Methylglyoxal-Konzentration im Körper eine große Bedeutung. Hierzu zählen beispielsweise diabetische Komplikationen wie Nierenversagen und Linsentrübung. Bevorzugt wird das Verfahren zur Bestimmung von Methylglyoxal in Atemluft oder Atemkondensat eingesetzt. Aber auch die Bestimmung von Mehtylglyoxal in weiterem physio- logischen Flüssigkeiten, z.B. in Vollblut, in Plasma, in Serum, in Speichel und/oder in Urin ist möglich.
Weitere Anwendungsf eider für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Bestimmungen von Methylglyoxal in Desinfektionsmitteln sowie die Kontrolle des Methyl - glyoxalgehaltes bei dessen Herstellungsprozesses .
Aber auch bei der analytischen Bestimmung des Methyl - glyoxalgehaltes in Lebensmitteln oder anderen Konsumgütern findet das Verfahren vorzugsweise Anwendung .
Anhand der folgenden beiden Figuren und des folgenden
Beispiels soll das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert werden, ohne diese auf diese Ausführungsformen einzuschränken .
Fig . 1 zeigt eine Kalibrat ionsgerade im Konzentrationsbereich bis 50 nmol/ml Methylglyoxal .
Fig . 2 zeigt die gleiche Kalibrat ionsgerade im
Konzentrationsbereich bis 5 nmol/ml Methylglyoxal .
Beispiel 1
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens be- zieht sich im folgenden auf ein Probenvolumen von
100 μl . Zunächst wird eine Lösung A mit der folgenden Zusammensetzung erstellt:
2 μl 10 mg/ml NAD 2 μl 10 mg/ml NADH
2 μl 0,1 U/μl D-Lactat Dehydrogenase
1 μl 3 M Kaliumchlorid (KCl)
2 μl 0,25 U/μl Lactat Oxidase
20 μl Polybutylensulfon (PBS) pH 7.2
Die Lösung A wird anschließend zur Eliminierung von Störsubstanzen 5 min in den Ingedienzien inkubiert und im Anschluß gefriergetrocknet .
Ferner wird eine Lösung B mit folgender Zusammensetzung hergestellt :
4 μl 3,5 U/μl L-Lactat Dehydrogenase
5 μl 0.1 U/μl Aldehyd Dehydrogenase 9 μl der Lösung A
Die Lösung B wird anschließend ebenfalls gefriergetrocknet .
Zur Eliminierung von Störsubstanzen werden 100 μl Probe zu Lösung A hinzugegeben und 10 min inkubiert. Die 100 μl werden im Anschluß zur Lösung B zugegeben, in der dann der NADH-Abbau im Photometer bei 340 nm und 37 °C bestimmt wird.
In Fig. 1 ist eine entsprechende Kalibrationsgerade für den Konzentrationsbereich zwischen 0 und 50 nmol/mml Methylglyoxal dargestellt. Hierin zeigt sich ein linearer Verlauf im Konzentrationsbereich zwischen 0 und 10 nmol/mml Mehtylglyoxal . Anschließend kommt es zu einer für derartige Bestimmungen typischen negativen Abweichung der Kalibrationsgerade. Verdeutlicht wird die Linearität im unteren Konzentrationsbereich durch die in Fig. 2 dargestellte Ka- librationsgerade im Bereich bis 5 nmol/mml Methyl- glyoxal .