DE69832909T2 - Verfahren zum bestimmen von l-phenylalanin und ein l-phenylalaninsensor - Google Patents
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Description
- Gebiet der Erfindung
- Diese Erfindung betrifft einen Biosensor, durch welchen die Konzentration von L-Phenylalanin, enthalten in verschiedenen Proben, schnell und einfach quantifiziert werden kann ohne aufwendige Vorbehandlungen. Genauer gesagt betrifft sie einen Biosensor, der in der Quantifizierung von L-Phenylalanin, enthalten in biologischen Proben (Blut, Urin, Speichel, Schweiß, etc.), Nahrungsmittelproben und dgl., durch ein elektrochemisches Messverfahren unter Verwendung von L-Phenylalanindehydrogenase etc. nützlich ist. Dieses Verfahren ist insbesondere von Bedeutung bei dem Massenscreening von Neugeborenen auf Phenylketonurie (PKU), einem Aminosäurestoffwechselfehler, in einem früheren Stadium, oder Überwachen des täglichen Lebens von Patienten, die unter dieser Krankheit leiden.
- Hintergrund der Erfindung
- L-Phenylalanin ist eine wichtige Aminosäure, welche eine der essentiellen Aminosäuren ist und in großen Mengen in biologischen Proben sowie in Nahrungsmitteln und Getränken, welche als L-Phenylalaninquellen genutzt werden, enthalten ist. Auf der anderen Seite ist die als PKU bekannte Krankheit einer der typischen erblichen Aminosäurestoffwechselfehler, worin Tyrosin infolge eines Mangels an L-Phenylalanindehydrogenase nicht synthetisiert wird und somit L-Phenylalanin sich in einer abnormal hohen Menge im Blut ansammelt. Wenn sie sich entwickeln kann, induziert PKU eine schwerwiegende intellektuelle Störung, Sprachstörung, amelanotisches Symptom, etc.
- Um diese Krankheit zu verhindern, ist ein Massenscreening an Neugeborenen weit verbreitet in Japan und im Ausland durchgeführt worden. Als ein typisches Beispiel von Verfahren zur Bestimmung von L-Phenylalaninkonzentrationen im Blut ist die Guthrie-Methode verwendet worden, unter Verwendung eines getrockneten Bluttropfens, und hat stark zur frühen Diagnose beigetragen.
- So identifizierte Patienten mit PKU sollen eine Diättherapie haben, welche ihre Aufnahme an L-Phenylalanin begrenzt. Das heißt, solche Patienten sollten speziell zubereitete Mahlzeiten mit der Entfernung oder Reduktion von L-Phenylalanin haben, zumindest bis zum Ausgewachsensein, vorzugsweise während ihres gesamten Lebens. Da L-Phenylalanin eine der essentiellen Aminosäuren für den menschlichen Körper ist, sollte die L-Phenylalaninkonzentration genau reguliert werden, so dass es in der maximalen Menge aufgenommen werden kann, ohne Hirnstörungen etc. zu induzieren, jedoch in der Mindestmenge, die benötigt wird zum Wachstum des Körpers. Daher ist es bei der Behandlung von PKU wesentlich, nicht nur den Phenylalaninlevel im Blut, sondern auch die Phenylalaninaufnahme mit den täglichen Nahrungsmitteln zu überwachen.
- Unter diesen Umständen umfassen Beispiele für Verfahren zur Bestimmung von L-Phenylalanin unter Verwendung von Blutproben die Flüssigchromatographiemethode (Journal of Chromatography, Band 274, S. 318 (1983)) und den Bioassay unter Verwendung von getrockneten Bluttropfen, d.h. das Verfahren gemeinhin bekannt als die Guthrie-Methode (Pediatrics, Band 32, S. 338 (1963)). Beim ersteren Verfahren ist es notwendig, die Proben einer spezifischen Vorbehandlung zu unterwerfen und teure Messinstrumente zu verwenden. Obwohl die letztere Methode bequem ausgeführt werden kann, dauert es lange, um die Reaktion zu beenden, und die Ergebnisse müssen mit dem bloßem Auge begutachtet werden. Somit leidet jedes dieser Verfahren unter manchen Probleme unter dem Gesichtspunkt der Einfachheit und Schnelligkeit der Quantifizierung.
- Es sind auch Bestimmungsmethoden mit der Verwendung von Enzymen berichtet worden, z.B. ein Verfahren mit der Verwendung von L-Phenylalaninammoniumlyase (Methods of Enzymatic Analysis, Band 8, S. 405 (1985)), ein Verfahren mit der Verwendung von L-Phenylalaninoxidase (Clinica Chimica Acta, Band 136, S. 131 (1984)) und ein Verfahren zur Verwendung von L-Phenylalanindehydrogenase (veröffentlichte Japanische Patentschrift Nr. 63-129996 (A)). In diesen Dokumenten wird auf die Nützlichkeit dieser Verfahren zur Quantifizierung hingewiesen. Insbesondere wird das Verfahren zur Bestimmung von Phenylalanin in Blut mit der Verwendung von L-Phenylalanindehydrogenase im Detail durch Hummel et al. (Analytical Biochemistry, Band 170, S. 397 (1988)) und Wendel et al. (Analytical Biochemistry, Band 180, S. 91 (1989), Clinical Chimica Acta, Band 192, S. 165 (1990)) beschrieben. In jedem dieser Verfahren wird das als Probe verwendete Blut verschiedenen Vorbehandlungen unterworfen und dann wird die Enzymreaktion durchgeführt. Außerdem kann die Quantifizierung nicht durchgeführt werden, ohne die Verwendung von teuren und relativ großen Messinstrumenten (ein Spektrophotometer etc.).
- In den vergangenen Jahren sind Biosensoren, insbesondere Sensoren, die Enzyme verwenden, intensiv entwickelt worden. Durch diese ist es möglich geworden, einfach und mit hoher Genauigkeit Blutglucosespiegel zu bestimmen, wie in
EP 0 351 891 und WO 86/07632 offenbart. -
US 5,695,947 beschreibt einen Sensor zur amperometrischen Bestimmung von Cholesterin zur direkten Messung von freiem und Gesamtcholesterin in biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma oder Vollblut und in Nahrungsmittelzubereitungen. - Obwohl vor kurzem durch Huang et al. Versuche unternommen wurden, L-Phenylalanin zu bestimmen (Analytical Chemistry, Band 70, S. 991 (1998)), bleiben nach wie vor eine Anzahl von Problemen zu lösen, um den Sensor einer praktischen Verwendung zuzuführen.
- In diesem Verfahren wird eine Kohlenstoffpaste, enthaltend L-Phenylalanindehydrogenase, gemischt mit zwei anderen Enzymen (d.h. Salicylathydroxylase und Tyrosinase) in ein Röhrchen gefüllt (1,2 mm × 1,5 mm × 30 mm), welches mit einem Kupferdraht als Leitdraht ausgestattet ist. Nach dem Polieren der Elektrodenoberfläche wird es als Arbeitselektrode verwendet. Eine Detektionseinheit, zusammengesetzt aus dieser Arbeitselektrode, einer Referenzelektrode aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) und eine Gegenelektrode, hergestellt aus Platin, wird an einen Reaktor angeschlossen, um dadurch eine Bestimmungseinheit herzustellen. Die Bestimmung wird durchgeführt durch Mischen eines Puffers, einer Salicylsäurelösung und oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+) in dem Reaktor, Hinzufügen einer Probe und Berechnen der L-Phenylalaninkonzentration aus dem Antwortstrom erhalten nach der Reaktion unter Verwendung eines Computers. So kann Phenylalanin in einem Konzentrationsbereich von 20 bis 150 μM quantifiziert werden, und die Detektionsempfindlichkeit ist 5 μM. Jedoch bleiben immer noch Probleme zu lösen, z.B. die Stabilität der Antwort und die Lagerstabilität der so konstruierten Enzymelektrode.
- Obwohl die oben beschriebene Biosensortechnologie es gerade möglich macht, L-Phenylalanin unter Verwendung von L-Phenylalanindehydrogenase zu bestimmen, ist eine schnelle und einfache Quantifizierung immer noch unmöglich, da es in diesem Verfahren nötig ist, Reagenzien und Instrumente vorzubereiten und aufwendige Prozeduren und Verfahrensschritte durchzuführen. Obwohl es für Patienten mit PKU wünschenswert ist, dass L-Phenylalanin einfach zu Hause bestimmt werden kann, um den Blut L- Phenylalaningehalt und Nahrungsmittel und Getränke zum Kochen zu untersuchen, ist dies zur Zeit immer noch schwierig.
- Unter diesen Umständen ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, mit welchem L-Phenylalanin sehr genau, schnell und einfach quantifiziert werden kann, ohne die Verwendung von vielen Reagenzien, großen Messeinrichtungen oder Instrumenten, aufwendigen Vorbehandlungen oder speziellen Techniken, sowie ein Bestimmungsverfahren dafür.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Um das oben beschriebene Ziel zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung einen L-Phenylalaninsensor zur Verfügung, zusammengesetzt aus einem Elektrodensystem, welches zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, gebildet auf einem isolierenden Träger, und eine Reagensreaktionsschicht, welche als Reaktionsreagens zumindest L-Phenylalanindehydrogenase, NAD+ oder oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP+) als Coenzym und einen Elektronenvermittler enthält und in besagtes Elektrodensystem integriert ist, worin die besagte Reagensschicht einen absorbierenden Träger zum Einführen einer bestimmten Menge einer Probe in die Reagensschicht umfasst, und ein Verfahren zur Bestimmung von L-Phenylalanin, durch welches L-Phenylalanin elektrochemisch einfach durch Hinzufügen einer Probe zu dem oben beschriebenen Sensor ohne aufwendige Vorbehandlungen bestimmt werden kann.
- In dem L-Phenylalaninsensor gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein absorbierender Träger, enthaltend als Reaktionsreagens zumindest L-Phenylalanindehydrogenase, NAD+ oder NADP+ und einen Elektronenvermittler als eine Reagensreaktionsschicht zwischen den Elektroden eines Elektrodensystems positioniert, welches zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die einander auf einem isolierenden Träger gegenüberliegen, umfasst, und integriert mit dem Elektrodensystem. Infolge dieser Struktur kann sowohl die Enzymreaktion als auch die Elektrodenelektroden zwischen dem Elektronenvermittler und der Elektrodenoberfläche durchgeführt werden, und des weiteren kann der Sensor verkleinert werden. Die Verwendung des absorbierenden Trägers macht es auch möglich, eine Probe glatt in einer bestimmten Menge zuzuführen.
- Der Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Struktur wie oben beschrieben macht es möglich, einfach und hochgenau L-Phenylalanin, enthaltend in einer Probe, zu quantifizieren, ohne Verwendung von irgendwelchen teuren Spezialinstrumenten oder Hinzufügen von Reagenzien, wie einem Enzym, zu der Probe.
- Beschreibung der Erfindung
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Probe zu einem L-Phenylalaninsensor gemäß Anspruch 4 hinzugefügt, worin eine Elektrode und eine Reagensreaktionsschicht miteinander integriert sind. So wird das in der Probe enthaltene L-Phenylalanin in die Enzymreaktion durch L-Phenylalanindehydrogenase und NAD+ oder NADP+ eingeführt. Als Ergebnis wird Phenylpyruvat gebildet und NAD(P)+ wird zu NAD(P)H reduziert. In Verbindung damit wird der Elektronenvermittler durch den Elektronentransfer von NAD(P)H reduziert. Anschließend wird eine Spannung angelegt und dadurch wird der reduzierte Elektronenvermittler als Elektrodenreaktion oxidiert, wodurch das Entstehen eines Oxidationsstroms hervorgerufen wird. So kann L-Phenylalanin elektrochemisch im Hinblick auf den Antwortstrom, welcher zu der Substratkonzentration korrespondiert, quantifiziert werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren einen L-Phenylalaninsensor zur Verfügung, zusammengesetzt aus einem Elektrodensystem, welches zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, gebildet auf einem isolierenden Träger, und eine Reagensreaktionsschicht, welche Reaktionsreagenzien enthält und mit dem oben beschriebenen Elektrodensystem integriert ist, umfasst. In diesem L-Phenylalaninsensor enthält die Reagensreaktionsschicht einen absorbierenden Träger, enthaltend zumindest L-Phenylalanindehydrogenase, NAD+ oder NADP+ und einen Elektronenvermittler und ist positioniert in einem Teil, wo die Elektrodenreaktion zwischen diesen Elektroden auftritt, wodurch eine integrierte Struktur gegeben ist.
- Die Verwendung des absorbierenden Trägers in der Reagensreaktionsschicht macht es möglich, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um die Reaktionsreagenzien einfach zu bewahren unter Erreichen von hervorragender Lagerstabilität der Reagenzien und einer hervorragenden Antwortstabilität, ohne Prozessieren des Elektrodensystems noch Beeinträchtigen (z.B. Verschlechtern der Leistung) desselben. Darüber hinaus kann eine bestimmte Menge einer Probe dadurch schnell in die Reagensreaktionsschicht eingeführt werden. So kann L-Phenylalanin sehr genau und einfach in einer kurzen Zeit quantifiziert werden.
- Kurze Beschreibung der Figuren
-
1 ist eine diagrammatische Darstellung der Elemente der Ausführungsform des L-Phenylalaninsensors gemäß der vorliegenden Erfindung. -
2 ist eine Grafik, welche die Antwortdaten auf den Elektronenvermittler in Beispiel 2 zeigt. -
3 ist eine Grafik, welche die Antwortdaten auf L-Phenylalanin (Standardlösungen) in Beispiel 3 zeigt. -
4 ist ein Reaktionsmodell der Bestimmung von L-Phenylalanin. -
5 ist eine Grafik, welche die Antwortdaten auf L-Phenylalanin (Blutproben) in Beispiel 4 zeigt. -
6 ist eine diagrammatische Darstellung, die die Zusammensetzung einer Ausführungsform des tragbaren L-Phenylalaninsensors gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt. -
7 ist eine Grafik, welche die Korrelation zwischen der L-Phenylalaninkonzentration, bestimmt durch den tragbaren L-Phenylalaninsensor von Beispiel 6 und die L-Phenylalaninkonzentration, bestimmt durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), zeigt. -
8 ist eine Grafik, welche die Korrelation zwischen der L-Phenylalaninkonzentration, bestimmt durch den tragbaren L-Phenylalaninsensor von Beispiel 7, und die L-Phenylalaninkonzentration, bestimmt unter Verwendung eines Aminosäurequantifikationskits vom Enzymverfahren-Typ der klinischen Chemie zeigt. - In diesen Abbildungen hat jedes Symbol die folgende Bedeutung:
1 : isolierender Träger,2 : Arbeitselektrode;3 : Gegenelektrode,4 : Isolierschicht;5 : absorbierender Träger;11 : Probe;12 : L-Phenylalaninsensor;13 : tragbares Messgerät für den L-Phenylalaninsensor;14 : Schalter;15 : Timer;16 : Spannungsquelle;17 : Detektor;18 : Prozessor (CPU); und19 : Display. - Beste Art zur Durchführung der Erfindung
- Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Elektrodensystem kann aus einem beliebigen leitenden Material hergestellt werden ohne besondere Einschränkungen. Als Material kann Iridium, Osmium, Kohlenstoff, Gold, Silber, Silber/Silberchlorid, Eisen, Kupfer, Nickel, Platin, Platinschwarz, Palladium, Lutenium, Rhodium, etc. sowie Legierungen dieser Metalle verwendet werden. Als Ergebnis der Untersuchung verschiedener Materialien ist bekannt, dass Kohlenstoffmaterialien als Arbeitselektrode in dem Elektrodensystem des L-Phenylalaninsensors gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft sind, da sie weniger teuer und chemisch stabil sind.
- Der Begriff "Kohlenstoffmaterialien", wie hierin verwendet, bedeutet allgemein Kohlenstoff enthaltende Materialien. Die hierin verwendbaren Kohlenstoffmaterialien sind nicht limitiert. Das heißt, jene die weit verbreitet in den sogenannten Kohlenstoffelektroden verwendet werden, können dafür verwendet werden. Zum Beispiel kann Kohlefaser, Kohlenschwarz, Kohlenstoffpaste, glasförmiger Kohlenstoff, Graphit und dergleichen verwendet werden.
- Durch Verwendung eines solchen Kohlenstoffmaterials werden Elektroden auf dem isolierenden Träger durch ein konventionelles Verfahren gebildet. Im Allgemeinen wird das Kohlenstoffmaterial zu einer Paste verarbeitet unter Verwendung eines Harzbinders etc. Dann wird die Paste einem Siebdruck unterworfen und durch Erhitzen getrocknet, wodurch die Elektroden gebildet werden. Es ist auch möglich, dass ein Führungsdraht zum Verbinden des Elektrodenteils an die Bestimmungseinheit durch Siebdruck in einer solchen Weise zur Verfügung gestellt wird, dass ein Silberführungsteil den Kohlenstoffelektrodenteil berührt.
- Beispiele für den isolierenden Träger umfassen Glas, Glasepoxid, Keramik, Kunststoffe und dergleichen. Ein beliebiges Material kann dazu ohne Einschränkungen verwendet werden, solange es nicht bei dem Schritt des Druckens zum Bilden des Elektrodenteils oder in dem Schritt des Hinzufügens der Probe beschädigt wird. Zum Beispiel sind Kunststofffolien, hergestellt aus Polyester, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polystyrol, Polypropylen etc., nicht teuer. Wenn man des weiteren die Haftfähigkeit gegenüber leitfähiger Tinte und Verarbeitbarkeit berücksichtigt, wurde herausgefunden, dass eine Polyesterfolie hierin vorteilhaft ist.
- Das Druckverfahren ist nicht auf Siebdruck limitiert, sondern es können auch andere Verfahren (Tiefdruck, Offset-Druck, Inkjet-Druck, etc.) darauf verwendet werden.
- Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende L-Phenylalanindehydrogenase kann eine beliebige sein, solange sie NAD+ oder NADP+ als Coenzym verwendet. Das heißt, Enzyme verschiedenen Ursprungs und solche, die davon durch Genrekombinationsverfahren erhalten wurden, können dafür verwendet werden. Beispiele davon umfassen Enzyme, hergestellt von Bakterien, die zum Genus Actinomyces gehören, Mikroorganismen, die zum Genus Sporosarcina gehören, Bakterien, die zum Genus Bacillus gehören, Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören und Bakterien, die zum Genus Rhodococcus gehören. Unter allen ist infolge ihrer thermophilen Natur die von Thermoactinomyces intermedius stammende L-Phenylalanindehydrogenase wenig von dem Trocknungsschritt zum Bilden der Reagensreaktionsschicht beeinflusst und besitzt exzellente Substratspezifität und Reaktivität. Daher ist sie als das Enzym, das den L-Phenylalaninsensor in der vorliegenden Erfindung ausmacht, bevorzugt.
- Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Elektronenvermittler ist nicht besonders beschränkt, solange es eine Substanz ist, die elektrochemisch durch NADH oder NADPH, gebildet durch die Enzymreaktion, reduziert wird, und an der Elektrode oxidiert wird. Zum Beispiel können dafür Chinone, Zytochrome, Viologene, Phenazine, Phenoxazine, Phenothiazine, Ferricyanide, Ferredoxine, Ferrocen und Derivate davon verwendet werden. Unter allen sind Phenazine bezüglich der Antwortstabilität hervorragend. Insbesondere ist gefunden wurden, dass 1-Methoxy-5-methylphenadiniummethylsulfat (1-Methoxy PMS) in der vorliegenden Erfindung als Elektronenvermittler vorteilhaft ist, da es hervorragende Lagerstabilität in der Reagensreaktionsschicht und Antwortstabilität in der Elektrodenreaktion aufweist.
- Der Begriff "Reagensreaktionsschicht", wie hierin verwendet, bedeutet eine Schicht, welche in Kontakt mit dem Elektrodensystem ist und die Reaktionsreagenzien enthält und in welcher die Reagenzien mit L-Phenylalanin in einer Probe reagieren. Sie enthält zumindest L-Phenylalanindehydrogenase, NAD+ oder NADP+ und einen Elektronenvermittler. Als Ergebnis der Enzymreaktion und der Elektrodenreaktion zwischen dem Elektronenvermittler und der Elektrodenoberfläche kann der Antwortstrom elektrochemisch in dieser Schicht gemessen werden. Um diese Reagensreaktionsschicht zu bilden, können verschiedene weit verbreitete Verfahren eingesetzt werden.
- Zum Beispiel wird eine Reagenslösung auf die Elektroden getropft und dann getrocknet. Alternativ wird eine Reagenslösung durch ein poröses Material (ein Nylonvlies etc.) absorbiert, getrocknet und dann auf die Elektroden gegeben. Nach Untersuchung verschiedener Verfahren zeigte es sich als bevorzugt in der Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung, dass die Reagensreaktionsschicht eine Struktur hat, gebildet durch das Zurverfügungstellen eines absorbierenden Trägers, welcher erhalten wird unter Verwendung eines Polymermaterials etc., Auftropfen von einzelnen Reagenzien oder einer Mischung davon und Trocknen, oder Eintauchen eines Polymermaterials etc. in eine Reagenslösung und Trocknen, auf einem Teil, wo die Elektrodenreaktion zwischen zumindest der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode in dem Elektrodensystem auftritt.
- Durch Verwendung der Reagensreaktionsschicht, umfassend den absorbierenden Träger, kann eine bestimmte Menge einer Probe schnell hinzugefügt werden, ohne dass spezielle Instrumente für den Schritt des Probenhinzufügens verwendet werden müssten, infolge der Absorptivität des absorbierenden Trägers. Des weiteren kann dadurch der L-Phenylalaninsensor einfach hergestellt werden ohne direkt den Elektrodenreaktionsteil zu prozessieren.
- Der absorbierende Träger kann aus einem beliebigen Material hergestellt werden, solange es hydrophil ist und eine Lösung absorbieren kann. Zum Beispiel können dafür Fasern (Glasfaser, Silikafaser, Cellulosefaser etc.), Carboxymethylcellulose, Diethylaminoethylcellulose, Celluloseacetat, ein gemischter Celluloseester, Nylonvlies, Nitrocellulose, Polyethersulfon, Polyestervlies, Polytetrafluorethylen (PTFE), Polypropylen etc. verwendet werden. Unter all diesen ist bekannt, dass Cellulosefaser als der absorbierende Träger in dem L-Phenylalaninsensor gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ist. Dies liegt daran, dass, wenn ein Enzym, NAD+ oder NADP+ und ein Elektronenvermittler zu Cellulosefaser hinzugefügt werden, diese Substanzen stabil bleiben können, ohne unter einem Verlust an Funktion zu leiden und nicht in ungewünschter Weise in dem Detektionsschritt beeinträchtigt werden, wodurch eine hochgenaue Quantifizierung gewährleistet wird.
- Beispiele
- Nun wird die vorliegende Erfindung detaillierter durch Bezug auf die folgenden Beispiele dargestellt werden. Es wird jedoch klargestellt, dass die Erfindung nicht als darauf begrenzt anzusehen ist.
- Beispiel 1: Herstellung von Elektroden und absorbierendem Träger
-
1 ist eine diagrammatische Darstellung der Komponenten einer Ausführungsform des L-Phenylalaninsensors gemäß der vorliegenden Erfindung. - Auf einem isolierenden Träger
1 , hergestellt aus einem Polyesterfilm (hergestellt von Diafoil Hoechst), wurden eine Arbeitselektrode2 bzw. eine Gegenelektrode3 durch ein Siebdruckverfahren gebildet unter Verwendung einer leitenden Graphittinte (hergestellt durch Acheson) bzw. einer leitenden Silber/Silberchloridtinte (hergestellt durch Acheson) und durch Erhitzen getrocknet (60°C, 1 Stunde). Anschließend wurde eine Isolierschicht4 in einem Teil jeder Elektrode durch ein Siebdruckverfahren unter Verwendung einer isolierenden Tinte (hergestellt durch Acheson) hergestellt und durch Erhitzen getrocknet (60°C, 1 Stunde), wodurch ein Elektrodensystem durch das Druckverfahren gebildet wurde. - L-Phenylalanindehydrogenase (PheDH: EC 1.4.1.20, hergestellt von Unitika), als Coenzym verwendetes NAD+ (hergestellt von Oriental Yeast), und 1-Methoxy PMS (hergestellt von Dojin Kagaku Kenkyusho), verwendet als ein Elektronenvermittler, wurden in einem Boratpuffer (pH 8,0, 20 mM) aufgelöst, um eine gemischte Reaktionsreagenslösung zu ergeben, welche dann von einem absorbierenden Träger
5 , hergestellt aus einer Cellulosefaser (hergestellt von Advantec Toyo) absorbiert wurde und durch Erhitzen getrocknet wurde (40°C, 15 Minuten). So wurde ein die Reaktionsreagenzien enthaltender absorbierender Träger5 erhalten. - Der die Reaktionsreagenzien enthaltende absorbierende Träger
5 wurde als Reaktionsschicht in dem Elektrodenreaktionsteil des Elektrodensystems, umfassend die Arbeitselektrode2 und die Gegenelektrode3 , welche einander gegenüber positioniert sind, zur Verfügung gestellt, wodurch ein L-Phenylalaninsensor hergestellt wurde. - Beispiel 2: Bestimmung der Elektrodenreaktion
- In Bezug auf die Bestimmung der Elektrodenreaktion zeigt
2 die Oxidations-Reduktionsantwort-Daten auf 1-Methoxy PMS, verwendet als der Elektronenvermittler. - In diesem Beispiel wurde der in Beispiel 1 hergestellte L-Phenylalaninsensor verwendet und 5 μl eines L-Phenylalanin-freien Puffers (pH 10,5, 0,2 M Glycin-KCl-KOH) wurde zu der Endfläche des absorbierenden Trägers
5 in dem Sensor hinzugefügt. Das heißt, keine Enzymreaktion fand statt, da die Probe kein Substrat (d.h. L-Phenylalanin) enthielt. Daher zeigen diese Daten das zyklische Voltammogramm (Durchlaufrate: 20 mV/s, Modell HZ-3000, hergestellt von Hokuto Denko) von 1-Methoxy PMS. - In diesem Fall wurden die Endkonzentrationen der Reaktionsreagenzien in jeder Bestimmung wie folgt eingestellt: PheDH: 1 E, NAD+: 5 mM; und 1-Methoxy PMS: 0,5 mM.
- Die Spitzenspannung trat bei etwa –220 mV auf der Oxidationsseite und bei etwa –300 mV auf der Reduktionsseite auf. Somit wurde eine gute Redoxantwort beobachtet, ohne unter irgendwelchen unerwünschten Effekten, wie Störungen durch den absorbierenden Träger oder die darin enthaltenen Reaktionsreagenzien, zu erleiden.
- Beispiel 3: Quantifizierung von L-Phenylalanin (Standardlösungen)
- Unter Verwendung von L-Phenylalanin enthaltende Standardlösungen als Proben wurde die Bestimmung mit dem in Beispiel 1 hergestellten L-Phenylalaninsensor durchgeführt.
3 zeigt die Ergebnisse. - 5 μl jeder Probe wurden hinzugefügt. Nach 60 Sekunden wurde eine Spannung von –220 mV vs. Ag/AgCl (d.h. der Gegenelektrode) angelegt und der Antwortstrom wurde gemessen (Modell HZ-3000, hergestellt von Hokuto Denko).
- In diesem Fall wurden die Endkonzentrationen der Reaktionsreagenzien in jeder Bestimmung eingestellt wie folgt: L-Phenylalanindehydrogenase: 1 E; NAD+: 5 mM; und 1-Methoxy PMS: 0,5 mM.
- Wenn die Probe zu dem absorbierenden Träger
5 , der als Reagensreaktionsschicht dient, hinzugefügt wurde, durchlief L-Phenylalanin in der Probe die Enzymreaktion mit der L-Phenylalanindehydrogenase und NAD+, so dass Phenylpyruvat gebildet wurde. So wurde NAD+ zu NADH reduziert und weiter wurde 1-Methoxy PMS infolge eines Elektronentransfers reduziert. Anschließend wurde ein Oxidationsstrom von reduziertem 1-Methoxy PMS durch die Elektrodenreaktion infolge des Anlegens einer Spannung erhalten, wie oben beschrieben. Diese Stromstärke hängt von der Konzentration von L-Phenylalanin ab, welche das Substrat war.4 illustriert dieses Reaktionsmodell der L-Phenylalaninbestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung. - So wurden höchst vorteilhafte lineare Daten innerhalb eines L-Phenylalaninkonzentrationsbereichs von zwischen 0 bis 2 mM erhalten.
- Beispiel 4: Quantifizierung von L-Phenylalanin (Blutproben)
- Unter Bezug auf Beispiel 3 wurde L-Phenylalanin bestimmt unter Verwendung von L-Phenylalanin-enthaltenden Blutproben.
5 zeigt die Ergebnisse. - 7,5 μl jeder Probe wurden auf den isolierenden Träger
5 des Sensors hinzugefügt. Nach 120 Sekunden wurde eine Spannung von –180 mV vs. Ag/AgCl (d.h. der Gegenelektrode) angelegt, und der Antwortstrom wurde gemessen. - In diesem Fall wurden die Endkonzentrationen der Reaktionsreagenzien in jeder Bestimmung wie folgt eingestellt: L-Phenylalanindehydrogenase: 2 E; NAD+: 5 mM; und 1-Methoxy PMS: 0,5 mM.
- So wurden höchst vorteilhafte lineare Daten innerhalb eines L-Phenylalaninkonzentrationsbereichs von zwischen 0 bis 2 mM erhalten.
- Beispiel 5: Herstellung einen tragbaren L-Phenylalaninsensors
-
6 ist eine diagrammatische Darstellung, die einen L-Phenylalaninsensor12 zeigt, entworfen unter Berücksichtigung der L-Phenylalaninmessung im täglichen Leben, und ein tragbares Messgerät13 zur vereinfachten Bestimmung. Nun wird das Bestimmungsverfahren beschrieben. - Der L-Phenylalaninsensor
12 wird in das tragbare Messgerät13 für den L-Phenylalaninsensor plaziert. Nach Hinzufügen einer Probe11 wird ein Schalter14 gedreht, um dadurch die Bestimmung von L-Phenylalanin zu beginnen. Nachdem die Enzymreaktion für eine bestimmte Zeitdauer fortschreitet, die durch einen Timer15 kontrolliert wird, wird eine bestimmte Spannung durch die Spannungsquelle16 an den Sensor angelegt. Die Antwortstromstärke, die so in dem Sensor gebildet wird, wird durch verschiedene Verfahren (Strom-Spannungstransformation, Analog-Digital-Transformation etc.) durch einen Detektor17 transformiert. Als Nächstes wird die Antwortstromstärke durch die CPU in eine L-Phenylalaninkonzentration umgerechnet, und das Ergebnis wird auf einem Display19 ausgegeben. - Beispiel 6: Korrelation zwischen L-Phenylalaninkonzentrationen, bestimmt durch den tragbaren L-Phenylalaninsensor und L-Phenylalaninkonzentrationen, bestimmt durch HPLC
- Bezüglich der L-Phenylalanin-enthaltenden Proben wurde die Korrelation unter Verwendung des tragbaren L-Phenylalaninsensors, hergestellt im obigen Beispiel 5, und HPLC untersucht.
7 zeigt die Ergebnisse. - Im Fall der HPLC (hergestellt von Hitachi) wurden Proben entproteinisiert und dann der Bestimmung der L-Phenylalaninkonzentration gemäß der oben beschriebenen Methode von Hayashi et al. (Journal of Chromatography, Band 274, S. 318 (1983)) unterworfen. Im Fall des tragbaren L-Phenylalaninsensors wurden dieselben Blutproben der Bestimmung ohne Entproteinisierung unterworfen.
- So wurde eine höchst vorteilhafte Korrelation (Korrelationskoeffizient: 0,971) in einem L-Phenylalaninkonzentrationsbereich von 0 bis 1,5 mM beobachtet.
- Beispiel 7: Korrelation zwischen L-Phenylalaninkonzentrationen, bestimmt durch den tragbaren L-Phenylalaninsensor und L-Phenylalaninkonzentrationen, bestimmt durch ein Aminosäure-Quantifizierungskit der klinischen Chemie vom Enzymverfahrenstyp.
- Wie im obigen Beispiel 6, wurden Blutproben, enthaltend L-Phenylalanin, der Bestimmung durch Verwendung des tragbaren L-Phenylalaninsensors, hergestellt in Beispiel 5, und einem Aminosäuresäure-Quantifizierungskit unterworfen, um dadurch die Korrelation zu untersuchen.
8 zeigt die Ergebnisse. - Im Fall des Aminosäure-Quantifizierungskits der klinischen Chemie (Enzaplate PKU-R, hergestellt von Tomakomai Clinical Laboratory), wurden Fluoreszenzintensitäten (Fluororite 1000, hergestellt von Dynatec Laboratories), korrespondierend mit den L-Phenylalaninkonzentrationen, gemäß den Instruktionen des Herstellers bestimmt.
- So wurde eine höchst vorteilhafte Korrelation (Korrelationskoeffizient: 0,959) innerhalb eines L-Phenylalaninkonzentrationsbereichs von 0 bis 1,5 mM beobachtet.
- Obwohl ausschließlich ein Zweielektroden-System, umfassend ein Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, verwendet wurde, kann die Bestimmung mit erhöhter Genauigkeit durch Verwendung eines Dreielektroden-Systems, umfassend eine Referenzelektrode, durchgeführt werden.
- Wie oben diskutiert, macht es die vorliegende Erfindung möglich, einen L-Phenylalaninsensor einfach herzustellen, worin Reaktionsreagenzien, wie ein Enzym und eine Elektrode, miteinander integriert sind, unter Verwendung der Druckmethode. So kann in einer Probe enthaltenes L-Phenylalanin hoch genau und einfach elektrochemisch innerhalb einer kurzen Zeitdauer einfach durch Hinzufügen einer geringen Menge der Probe quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit spezieller Messeinrichtungen oder Instrumente, Techniken oder langwierigen Vorbehandlungen.
- Durch Verwendung des L-Phenylalaninsensors und eines tragbaren Messgeräts für diesen Sensor können darüber hinaus verschiedene Messbedingungen vereinfacht werden, und so kann die Quantifizierung ohne zeitliche oder örtliche Beschränkungen einfach durchgeführt werden.
Claims (10)
- Verfahren zur Bestimmung von L-Phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe zu einem L-Phenylalaninsensor hinzugefügt wird, welcher zusammengesetzt ist aus einem Elektrodensystem, das umfasst: zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, gebildet auf einem isolierenden Träger, und eine Reagensreaktionsschicht, die als Reaktionsreagens zumindest L-Phenylalanindehydrogenase, NAD+ oder NADP+ als Coenzym und einen Elektronenvermittler enthält und in besagtes Elektrodensystem integriert ist, worin die besagte Reagensschicht einen absorbierenden Träger zum Einführen einer bestimmten Menge einer Probe in die Reagensschicht umfasst, woraufhin L-Phenylalanin elektrochemisch quantifiziert wird.
- Verfahren zur Bestimmung von L-Phenylalanin gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Elektrodensystem durch ein Druckverfahren unter Verwendung eines leitenden Materials gebildet wird und die besagte Arbeitselektrode aus einem Material hergestellt ist, das hauptsächlich Kohlenstoff umfasst.
- Verfahren zur Bestimmung von L-Phenylalanin gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Elektronenvermittler Phenazin enthält.
- L-Phenylalaninsensor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Struktur hat, die gebildet ist aus einem Elektrodensystem, umfassend: zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, gebildet auf einem isolierenden Träger, und eine Reagensreaktionsschicht, die als Reaktionsreagens zumindest L-Phenylalanindehydrogenase, NAD+ oder NADP+ als Coenzym und einen Elektronenvermittler enthält und in besagtes Elektrodensystem integriert ist, worin besagte Reagensschicht einen absorbierenden Träger für das Einbringen einer bestimmten Menge einer Probe in die Reagensschicht umfasst.
- L-Phenylalaninsensor gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Elektrodensystem durch ein Druckverfahren unter Verwendung eines leitenden Materials gebildet wird, und die besagte Arbeitselektrode aus einem Material hergestellt ist, das hauptsächlich Kohlenstoff umfasst.
- L-Phenylalaninsensor gemäss Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Elektronenvermittler ein Phenazin umfasst.
- L-Phenylalaninsensor gemäss einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Elektrodensystem, umfassend zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die auf einem isolierenden Träger einander gegenüberliegend ausgebildet sind, der besagte absorbierende Träger an einer Stelle liegt, an der die Elektrodenreaktion zwischen diesen Elektroden stattfindet.
- L-Phenylalaninsensor gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in dem besagten Elektrodensystem, umfassend zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, der absorbierende Träger, enthaltend die Reaktionsreagenzien, der zwischen besagten Elektroden positioniert ist, als Reaktionsschicht für sowohl die Enzymreaktion zwischen einer Probe und dem Reaktionsreagens und der Elektrodenreaktion zwischen dem Elektronenvermittler und der Elektrodenoberfläche dient.
- L-Phenylalaninsensor gemäss Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte absorbierende Träger, der die Reaktionsreagenzien enthält und als Reaktionsschicht für die Enzymreaktion und die Elektrodenreaktion dient, hydrophil ist.
- L-Phenylalaninsensor gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte absorbierende Träger, der die Reaktionsreagenzien enthält und als Reaktionsschicht für die Enzymreaktion und die Elektrodenreaktion dient, teilweise vor Kontakt mit der Umgebung durch das besagte Elektrodensystem geschützt ist, umfassend zumindest eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die einander gegenüberliegen, und das besagte Elektrodensystem als zumindest eine schützende Schicht für den besagten absorbierenden Träger dient.
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