DE3940072A1

DE3940072A1 - Enzymatische indikatorreaktion

Info

Publication number: DE3940072A1
Application number: DE19893940072
Authority: DE
Inventors: Andreas Dipl Ing Bueckmann; Reinhard Dr Renneberg
Original assignee: Akademie der Wissenschaften der DDR
Current assignee: Akademie der Wissenschaften der DDR
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 1991-06-06

Description

Enzymatische Indikatorreaktion

Die Erfindung betrifft eine enzymatische Indikatorreaktion unter Verwendung immobilisierter Oxidase und Dehydrogenase (in Gegenwart eines Cofaktors) und Rückführung des Reaktionspro dukts in das Ausgangsprodukt (Enzymsubstrat).

Es ist bereits bekannt, daß man das Produkt einer Indikator reaktion, beispielsweise einer Oxidase, mit Hilfe eines cofak torabhängigen Enzyms, beispielsweise einer Dehydrogenase, zum Ausgangsprodukt rezyklisieren kann. Dazu verwendbare Enzym schichten oder Enzymmembranen sowie Enzymsensoren, wie Elektro den, FETS oder Thermistoren, gehören zum Stand der Technik. Nach der Rezyklisierung kann das Substratmolekül vom Indikator enzym erneut umgewandelt werden. Die Verstärkung des Signals der Indikatorreaktion ist der Anzahl der Rezyklisierungen direkt proportional. Allerdings müssen große Mengen an Cofak tor, beispielsweise NADH, zugesetzt werden, da der Cofaktor stöchiometrisch verbraucht wird. Eine mit Hilfe einer Oxidase als Indikatorenzym durchgeführte Indikatorreaktion läßt sich beispielsweise folgendermaßen wiedergeben:

Bekannt ist beispielsweise, daß das Signal einer Enzymelektrode für Glucose verstärkt werden konnte, wobei Glucoseoxidase (GOD) und Glucosedehydrogenase (GDH) gekoppelt worden waren; Schubert et al., Anal. Chim. Acta, 169 (1985) 391-396. Ähnliche Verstär kungssysteme wurden für Lactat unter Verwendung von Lactatoxi dase und Lactatdehydrogenase (Mizutani et al., Chem. Lett., (1984) 199-202) und unter Verwendung von Cytochrom b2 und Lac tatdehydrogenase (Schubert et al., Anal. Chim. Acta, 169 (1985) 391-396) sowie für NADH unter Verwendung von Peroxidase und Glukosedehydrogenase beschrieben (loc. cit.). Auch wurde mit einem Enzymthermistor eine 1000-fache Verstärkung erreicht, wobei Lactatoxidase mit Lactatdehydrogenase und Katalase gekop pelt wurden; Scheller et al., Anal. Chem., 57 (1985) 1740-1743.

Für alle diese bekannten Verstärkungen mußte jedoch NADH in großen Mengen der Meßlösung zugesetzt werden. Da der ver brauchte Cofaktor (NAD⁺) nach der Messung verworfen wurde, fie len die Messungen teuer aus. Durch den hohen Verbrauch teurer Cofaktoren sind die bisher bekannten Lösungen für eine Signal verstärkung praktisch kaum nutzbar.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine enzymatische Indikatorreak tion vorzusehen, bei dem der Cofaktor regeneriert werden kann.

Erfindungsgemäß wird dazu eine enzymatische Indikatorreaktion unter Verwendung immobilisierter Oxidase und immobilisierter Dehydrogenase (in Gegenwart eines Cofaktors bzw. Coenzyms) unter Rückführung des Reaktionsprodukts in das Ausgangsprodukt (Enzymsubstrat) vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

- immobilisiertes NAD/NADH als Cofaktor und
- eine weitere immobilisierte Dehydrogenase verwendet und mit ihrer Hilfe für den Cofaktor regeneriert.

Dazu werden eine Oxidase und Dehydrogenase verwendet, die auf einem Träger immobilisiert sind, der in dem wäßrigen Medium un löslich ist, in dem man die Indikatorreaktion ablaufen läßt. Zum Stand der Technik vergleiche man Scheller et al. in: GBF Monograph 10, Biosensors Int. Workshop, (1987) 38-49, Braun schweig. Als Träger kann man eine Membran verwenden, die von dem wäßrigen Medium durchströmt wird. Der Fachmann ist mit der Immobilisierung von Oxidasen und Dehydrogenasen vertraut; vgl. beispielsweise Scheller et al. in: GBF Monograph 10, Biosensors Int. Workshop, (1987) 38-49), Braunschweig.

Man kann das als Cofaktor verwendete NAD/NADH auf einem Makro molekül, beispielsweise Polyethylenglykol (PEG), immobilisie ren, beispielsweise PEG mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 20 000. Der Fachmann ist mit der Immobilisierung des Cofaktors auf Makromolekülen vertraut; vgl. beispielsweise Biocatalysis, 1 (1987) 173-186 und Adv. Biochem. Engineering, 39 (1989) 1-56.

Der immobilisierte Cofaktor wird dabei in dem wäßrigen Medium, in dem man die Indikatorreaktion ablaufen läßt, vorzugsweise mit Hilfe einer oder mehrerer Membranen, die von dem wäßrigen Medium durchströmt werden können, in dem Bereich der immobili sierten Enzyme gehalten. Der Cofaktor kann also gemeinsam mit den Enzymen immobilisiert werden.

Um den Cofaktor wiederzuverwenden, ihn also wieder in den Oxidations zustand zu bringen, der für die Funktion der sub stratrezyklisierenden Dehydrogenase erforderlich ist, wird er findungsgemäß eine zweite Dehydrogenase, und zwar eine cofactor regenerierende Dehydrogenase zum System zugegeben. Wie be reits ausgeführt, ist diese cofaktorregenerierende Dehy drogenase gleichfalls immobilisiert. Dieses System benötigt für seine Funktion lediglich die Zugabe eines ersten Substrats (S¹) für das Indikatorenzym und eines zweiten Substrats (S²) für die cofaktorregenerierende Dehydrogenase.

Da der Cofaktor fortlaufend regeneriert wird, ist das erfin dungsgemäße Verfahren äußerst ökonomisch. Es wird lediglich das Substrat (S²) der cofaktorregenerierenden Dehydrogenase ver braucht.

Wenn man als cofaktorregenerierende Dehydrogenase Formiatdehydrogenase (FDH) wählt, kann man als Substrat (S²) billiges Formiat einsetzen.

Das beanspruchte Verfahren sei durch folgende Gleichungen sche matisch erläutert:

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl Substrate von Oxidasen als auch Substrate von Dehydrogenasen einer Indikator reaktion unterworfen werden.

Die Indikatorreaktion kann mit einem amperometrischen Sensor (Elektrode) bestimmt werden, der beispielsweise den Sauerstoff verbrauch bzw. die Wasserstoffperoxid-Bildung der Oxidase mißt.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele mit Figuren näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine Kalibrationskurve für Glucose als Indikatorenzym- Substrat und Formiat als Substrat für die cofaktorregenerie rende Dehydrogenase;

Fig. 2 eine Kalibrationskurve für L-Lactat als Indikatorenzym- Substrat und Formiat als Substrat für die cofactorregenerie rende Dehydrogenase; und

Fig. 3 eine Kalibrationskurve für L-Alanin als Indikatorenzym- Substrat.

Beispiel 1 (Glukosemessung mit Signalverstärkung; Fig. 1)

Es wurde eine Enzymschicht hergestellt, indem man die gewählten Enzyme in Gelatine einschloß. Diese Enzymschicht trug pro cm² folgende Substanzen: 46 U Glukoseoxidase (GOD), 100 U Glukosedehydrogenase (GDH), 2 mg PEG-NAD⁺ und 20 U Formiatde hydrogenase (FDH). Die Schicht wurde auf einen amperometrischen Sensor aufgebracht und danach mit einer Teflonmembran für eine Sauerstoffverbrauchsmessung bei -0,6 V bedeckt. Alternativ wurde die Schicht auf einen amperometrischen Sensor aufge bracht, der mit einer Dialysemembran für eine Wasserstoffper oxid-Messung bei +0,6 V bedeckt war. Zur Verstärkung des Glu kosesignals wurde der Meßlösung, einem Phosphatpuffer von pH 6,5 einer Konzentration von 0,1 Mol/l, Natriumformiat einer Endkon zentration von 5 Mol/l zugesetzt. Das Glukosesignal wurde 2- bis 3-fach im Vergleich zu Messungen verstärkt, bei denen kein Natriumformiat zugesetzt worden war.

Nach Erfassung des Signals wurde die Meßzelle geleert und eine neue Pufferlösung, die Natriumformiat enthielt, zugesetzt. Bei kontinuierlichen Systemen, beispielsweise einem Flow-Injection- Assay (FIA) kann man 5 mMol Formiat/l der Pufferlösung zu setzen, um eine beständige Cofaktorregenerierung zu garantie ren.

Das Reaktionsschema war folgendermaßen:

Beispiel 2 (Lactatmessung mit Signalverstärkung; Fig. 2)

Es wurde eine Enzymschicht hergestellt, die pro cm² folgende Substanzen enthielt: 4 U Lactatoxidase (LOD), 20 U Lactatdehy drogenase (LDH), 20 U FDH und 2 mg PEG-NAD⁺. Zu einem Phosphat puffer von pH 7,0 einer Konzentration von 0,1 Mol/l wurden 5 mMol Natriumformiat/l zugesetzt. Die Messung erfolgte wie im Beispiel 1. Bei Formiatzugabe wurde eine etwa 5-fache Verstär kung im Vergleich zur unverstärkten Reaktion ohne Cofaktorre generierung erzielt. Das Reaktionsschema war folgendermaßen:

Beispiel 3 (Messung von L-Alanin; Fig. 3)

Bei der Messung der Aminosäure L-Alanin wurden die NAD⁺-abhän gige Alanindehydrogenase (15 U/cm²) mit LDH (20 U/cm²) und LOD (4 U/cm²) sowie NAD⁺-PEG (2 mg/cm²) coimmobilisiert. Da hier das zu vermessende Substrat gleichzeitig die Regenerierung des Co faktors bewirkt, benötigt das System keine weiteren Sub stratzusätze.

Der Sensor war bis zu 2,2 mMol/l linear von der Alaninkonzen tration abhängig. Der kleinste bestimmbare Wert lag bei 0,01 mMol Alanin/l. Da nur L-Alanin von der Alanindehydrogenase in Pyruvat umgewandelt wird, ist der Sensor hochspezifisch für L-Alanin.

Claims

1. Enzymatische Indikatorreaktion unter Verwendung immobili sierter Oxidase und immobilisierter Dehydrogenase (in Gegenwart von NAD/NADH) und Rückführung des Reaktionsproduktes in das Ausgangsprodukt (Enzymsubstrat), dadurch gekennzeichnet, daß man

- immobilisiertes NAD/NADH und
- eine weitere immobilisierte Dehydrogenase verwendet und mit ihrer Hilfe den Cofaktor regeneriert.

2. Enzymatische Indikatorreaktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Oxidase und Dehydrogenasen verwendet, die auf einem Träger immobilisiert sind, der in dem wäßrigen Medium unlöslich ist, in dem man die Indikatorreaktion ablaufen läßt.

3. Enzymatische Indikatorreaktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran als Träger verwendet, die von dem wäßrigen Medium durchströmt werden kann.

4. Enzymatische Indikatorreaktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man NAD/NADH verwendet, das auf einem Makromolekül, beispielsweise auf PEG, immobili siert ist und mit Hilfe einer oder mehrerer Membranen, die von dem wäßrigen Medium, in dem man die Indikatorreaktion ablaufen läßt, durchströmt werden können, in dem Bereich der immobili sierten Enzyme hält.

5. Enzymatische Indikatorreaktion nach Anspruch 4, dadurch ge kennzeichnet, daß man als die mindestens eine Membran die Mem bran gemäß Anspruch 3 verwendet.

6. Enzymatische Indikatorreaktion nach Anspruch 3, dadurch ge kennzeichnet, daß man NAD/NADH verwendet, das neben den Enzymen auf einer Membran gemäß Anspruch 3 immobilisiert ist.

7. Enzymatische Indikatorreaktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Substrat zur Co faktor-Regenerierung dem wäßrigen Medium zusetzt, in dem man die Indikatorreaktion ablaufen läßt.

8. Enzymatische Indikatorreaktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Indikatorreak tion sowohl für ein Oxidase-Substrat als auch für ein Dehy drogenase-Substrat durchführt.

9. Enzymatische Indikatorreaktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Indikatorreak tion mit einem amperometrischen Sensor mißt.

10. Amperometrischer Sensor zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er immobilisierte Oxidase, immobilisierte Dehydro genase, immobilisiertes NAD/NADH und eine weitere, den Cofaktor regenerierende Dehydrogenase trägt.