CN101386881B - 电化学活性高分子辅酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电化学活性高分子辅酶及其制备方法，电化学活性高分子辅酶是在高分子的骨架上通过化学反应引入电子媒介体和辅酶。所述电子媒介体为邻苯二酚残基或间苯二酚残基。所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。本发明电化学活性高分子辅酶参与脱氢酶的催化反应，电化学活性基团作为电子媒介体在较低的电位下催化生成的还原型辅酶在电极表面的氧化再生。本发明制备的电化学活性高分子辅酶适应多种脱氢酶，易于在电极表面固定化，且固定化后辅酶和电子媒介体分子不易流失，适用于无试剂化传感器的构筑。

Description

电化学活性高分子辅酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种电化学活性高分子辅酶及其制备方法，属于生物电化学领域。
背景技术
以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶NADP+)为电子受体的脱氢酶是所有氧化还原酶中最大的一类。据不完全统计有超过四百种的脱氢酶以NAD+或NADP+作为辅酶，如常见的醇脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，谷氨酸脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。其基本催化反应方程式如下(式中E代表脱氢酶)。
Figure G2008101527628D00011
在脱氢酶催化反应中，辅酶NAD+或NADP+作为电子和氢的受体，反应后生成还原型辅酶NADH或NADPH。对反应中产生的还原型辅酶的测定是构筑脱氢酶电化学生物传感器的基础。由于基于辅酶的脱氢酶数量众多，因此开发此类传感器具有极其重要的意义[M.J.LoboA.J.Miranda，P.
Figure G2008101527628D0001091731QIETU
，Electroanalysis，1997，9，191]。
但此类脱氢酶电化学生物传感器的构筑中，常遇到以下技术难点。反应中生成的还原型辅酶NADH或NADPH在裸电极上的直接电化学氧化过电位高(通常在+1.0V以上)，副反应严重。一般的解决办法是采用电子媒介体修饰电极。常用的电子媒介体包括醌类衍生物，二茂铁及其衍生物以及多种有机染料等[L.Gorton，E.Domínguez，Rev.Mol.Biotechnol.2002，82，371]。除此之外，小分子量水溶性辅酶的固定化是困扰脱氢酶传感器构筑的另一个难点。虽然经典的戊二醛法可以将脱氢酶和辅酶交联固定在电极表面，但酶的活性会受到化学反应的影响；也有将脱氢酶和辅酶直接与碳糊混合得到碳糊修饰电极的报道[J.Wang and N.Naser，Electroanalysis，1995，7，362.]。但小分子量辅酶易于流失，传感器的稳定性不佳[R.Antiochiaand L.Gorton，Biosens.Bioelectron.2007，22，1611；D.J.Weiss，M.Dorris，L.Loh and L.Peterson，Biosens.Bioelectron.2007，22，2436.]。由于辅酶在电极表面固定化困难，因此很多脱氢酶传感器在分析中需要在分析体系中加入NAD+或NADP+[P.C.Pandey，S.Upadhyay，B.C.Upadhyay，and H.C.Pathak，Anal.Biochem.1998，260，195]，这样不仅操作复杂，而且由于辅酶本身价格昂贵，辅酶的一次性使用导致分析成本较高。
为了解决辅酶固定化的难点，陆续有新的方法出现，高分子辅酶就是其中之一[S.Suye，Y.Aramoto，M.Nakamura，I.Tabata and M.Sakakibara，Enzyme Microb.Technol.2002，30，139.]。通过化学方法将辅酶连接到高分子骨架上可以得到高分子辅酶。高分子辅酶由于本身分子量提高，因此固定化后辅酶难以从电极表面脱离。同时，高分子化还有利于的辅酶稳定性。高分子辅酶已经开始用于脱氢酶传感器的制备。但上述文献中，电子媒介体和高分子辅酶需要分别固定，操作步骤较繁琐。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种电化学活性高分子辅酶。
本发明的第二个目的是提供一种电化学活性高分子辅酶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种电化学活性高分子辅酶，是在高分子的骨架上通过化学反应引入电子媒介体和辅酶。
所述电子媒介体为邻苯二酚残基或间苯二酚残基。
所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，是由下述步骤组成：
(1)将40～120mg 3，4-二羟基苯甲醛或2，4-二羟基苯甲醛溶解在15～100mL乙醇或甲醇中，得到溶液A；
(2)将200～500mg聚乙烯亚胺或聚丙烯胺溶解在20～60mL乙醇或甲醇中，得到溶液B；
(3)在20～35℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌1～3小时，冷却至0℃～4℃，加入15～40mg硼氢化钠，反应1～3小时，反应生成物经真空干燥后，用2～8mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温下在蒸馏水中透析12～36小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；
(4)将3～8g丁二酸酐溶解在30～50mL二甲基亚砜中，加入180～300mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20～35℃反应12～36小时，加入40～90mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤2～4次，将沉淀加入到2～5ml质量百分浓度为5～15％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4～6，反应0.5～2小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子200～500mg，在0℃～4℃反应12～24小时，反应产物在4℃在50～100mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析12～48小时，再在蒸馏水中透析12～48小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
所述步骤(1)优选的是：将70～90mg 3，4-二羟基苯甲醛或2，4-二羟基苯甲醛溶解在45～70mL乙醇或甲醇中，得到溶液A。
所述步骤(2)优选的是：将300～400mg聚乙烯亚胺或聚丙烯胺溶解在30～50mL乙醇或甲醇中，得到溶液B。
所述步骤(3)优选的是：在25～30℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌2小时，冷却至1℃～3℃，加入20～28mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用3～6mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温下在蒸馏水中透析24小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子。
所述步骤(4)优选的是：将5～6g丁二酸酐溶解在35～45mL二甲基亚砜中，加入220～260mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，25～30℃反应24小时，加入50～80mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤3次，将沉淀加入到3～4ml质量百分浓度为10％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4.5～5.5，反应1小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子300～400mg，在1℃～3℃反应16～20小时，反应产物在4℃在60～70mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析24～36小时，再在蒸馏水中透析24～36小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
本发明的优点：
(1)本发明在高分子骨架上同时引入电子媒介体和辅酶基团，得到了具有电子媒介体活性和辅酶生物活性的双功能高分子衍生物-电化学活性高分子辅酶。
(2)本发明制备的电化学活性高分子辅酶参与脱氢酶的催化反应，电化学活性基团作为电子媒介体在较低的电位下催化生成的还原型辅酶在电极表面的氧化再生。
(3)本发明制备的电化学活性高分子辅酶适应多种脱氢酶，易于在电极表面固定化，且固定化后辅酶和电子媒介体分子不易流失，适用于无试剂化传感器的构筑。
附图说明
图1为实施例1中起始反应物聚乙烯亚胺(PEI，1号曲线)，中间产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚(PEI-DHB，2号曲线)和最终产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(PEI-DHB-NAD，3号曲线)的紫外吸收光谱图。
图2为PEI-DHB-NAD和乙醇脱氢酶在加入乙醇前(4号曲线)和加入乙醇后(5号曲线)的紫外吸收光谱。
图3PEI(6号曲线)，PEI-DHB-NAD(7号曲线)和邻苯二酚(8号曲线)的循环伏安曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法：
(1)将80mg3，4-二羟基苯甲醛(3，4-DHB)溶解在25mL乙醇中得到溶液A；
(2)将300mg聚乙烯亚胺(PEI)溶解在30mL乙醇中，得到溶液B；
(3)在室温下，将3，4-DHB乙醇溶液缓慢滴加到PEI乙醇溶液中，充分搅拌1小时，冷却至0℃，加入28mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用3mL蒸馏水溶解，水溶液经过滤后，滤液在室温下在蒸馏水中透析24小时，透析液经真空干燥后得到电化学活性高分子(PEI-DHB)；
(4)将8g丁二酸酐溶解在40mL二甲基亚砜中，加入240mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，室温下反应24小时，加入60mL丙酮形成沉淀，沉淀物经过滤后，沉淀用丙酮洗涤3次，将所得沉淀加入到3ml质量百分浓度为10％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，用稀HCl将pH调节到4.7，反应1小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子(PEI-DHB)300mg，在4℃下反应12小时，反应产物在4℃下在50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中透析24小时，再在蒸馏水中透析24小时，透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶(PEI-DHB-NAD)。
图1为实施例1中起始反应物聚乙烯亚胺(PEI，1号曲线)，中间产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚(PEI-DHB，2号曲线)和最终产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(PEI-DHB-NAD，3号曲线)的紫外吸收光谱图。
由图1可知起始反应物聚乙烯亚胺(PEI)在200-400nm之间没有明显的吸收峰；中间产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚(PEI-DHB)在256nm处出现明显的吸收峰，属于酚类基团中苯环的特征吸收；最终合成产物聚乙烯亚胺-邻苯二酚-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(PEI-DHB-NAD)在260nm处出现吸收峰，属于辅酶NAD的特征吸收。
实施例1中PEI-DHB-NAD的辅酶生物活性表征见图2。
图2为PEI-DHB-NAD和乙醇脱氢酶在加入乙醇前(4号曲线)和加入乙醇后(5号曲线)的紫外吸收光谱。
由图2中可以看出，加入乙醇后，在340nm处产生新的吸收峰。该处的吸收归属于下面反应中产生的还原型辅酶NADH的特征吸收，说明PEI-DHB-NAD中的辅酶(NAD)基团具有生物活性，能参与脱氢酶的生化反应。
Figure G2008101527628D00041
实施例1中PEI-DHB-NAD的电化学表征见图3。
图3中PEI(6号曲线)，PEI-DHB-NAD(7号曲线)和邻苯二酚(8号曲线)的循环伏安曲线。
从图3中可以看出，反应物PEI在0-+0.7V之间没有氧化还原峰；而产物PEI-DHB-NAD在+0.35V处出现明显的氧化峰，且峰位与邻苯二酚相同。
实施例2
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法：
(1)将60mg2，4-二羟基苯甲醛(2，4-DHB)溶解在15mL乙醇中，得到溶液A；
(2)将240mg聚丙烯胺(PAA)溶解在45mL乙醇中，得到溶液B；
(3)在20℃，将2，4-DHB乙醇溶液缓慢滴加到PAA乙醇溶液中，搅拌1小时，冷却至0℃，分批加入20mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用3mL蒸馏水溶解，水溶液经过滤后，滤液在室温下在蒸馏水中透析24小时，透析液经真空干燥后得到电化学活性高分子(PAA-DHB)；
(4)将6g丁二酸酐溶解在30mL二甲基亚砜中，加入200mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，25℃反应24小时，加入60mL丙酮形成沉淀，沉淀物经过滤后，用丙酮洗涤3次，将所得沉淀物加入到3ml质量百分浓度为10％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，用稀HCl将pH调节到4.7，反应1小时后，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子(PAA-DHB)300mg，在4℃下反应12小时，反应产物在4℃在50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH7.0)中透析24小时，再在蒸馏水中透析24小时，透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶(PAA-DHB-NAD)。
实施例3
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法：
(1)将40mg 3，4-二羟基苯甲醛溶解在45mL乙醇中，得到溶液A；
(2)将400 mg聚乙烯亚胺溶解在50mL乙醇中，得到溶液B；
(3)在25℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌2小时，冷却至0℃，加入15mg硼氢化钠，反应1小时，反应生成物经真空干燥后，用2mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温(25℃)在蒸馏水中透析12小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；
(4)将3g丁二酸酐溶解在30mL二甲基亚砜中，加入180mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，30℃反应12小时，加入40mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤2次，将沉淀加入到2ml质量百分浓度为10％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为5.5，反应0.5小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子300mg，在1℃反应16小时，反应产物在4℃在60mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析12小时，再在蒸馏水中透析12小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
实施例4
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法：
(1)将120mg 3，4-二羟基苯甲醛溶解在100mL甲醇中，得到溶液A；
(2)将500mg聚丙烯胺溶解在60mL甲醇中，得到溶液B；
(3)在35℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌3小时，冷却至1℃，加入40mg硼氢化钠，反应3小时，反应生成物经真空干燥后，用8mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温(35℃)下在蒸馏水中透析36小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；
(4)将8g丁二酸酐溶解在50mL二甲基亚砜中，加入300mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20℃反应36小时，加入90mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤4次，将沉淀加入到5ml质量百分浓度为15％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4.5，反应2小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子500mg，在0℃反应24小时，反应产物在4℃在70mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析48小时，再在蒸馏水中透析48小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
实施例5
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法：
(1)将70mg 2，4-二羟基苯甲醛溶解在70mL乙醇中，得到溶液A；
(2)将200mg聚乙烯亚胺溶解在20mL乙醇中，得到溶液B；
(3)在25℃下，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌1小时，冷却至3℃，加入15mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用5mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温(25℃)下在蒸馏水中透析18小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；
(4)将6g丁二酸酐溶解在35mL二甲基亚砜中，加入220mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，35℃反应18小时，加入50mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤3次，将沉淀加入到4ml质量百分浓度为5％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为6，反应1小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子200mg，在3℃反应12小时，反应产物在4℃在50mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析36小时，再在蒸馏水中透析36小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
实施例6
一种电化学活性高分子辅酶的制备方法：
(1)将90mg 2，4-二羟基苯甲醛溶解在100mL甲醇中，得到溶液A；
(2)将500mg聚丙烯胺溶解在60mL甲醇中，得到溶液B；
(3)在30℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌3小时，冷却至4℃，加入40mg硼氢化钠，反应3小时，反应生成物经真空干燥后，用6mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温
(30℃)下在蒸馏水中透析24小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；
(4)将5g丁二酸酐溶解在45mL二甲基亚砜中，加入260mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，室温下反应24小时，加入80mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤4次，将沉淀加入到4ml质量百分浓度为12％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4，反应1.5小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子400mg，在4℃反应20小时，反应产物在4℃在100mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析24小时，再在蒸馏水中透析24小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
实施例7
将实施例1中合成的电化学活性高分子辅酶(PEI-DHB-NAD)10mg溶解在0.8mL蒸馏水中，得到溶液C；将1mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解在1mL蒸馏水中，得到溶液D；将50μL溶液C和10μL溶液D混合，超声震荡30s。取上述混合溶液15μL滴加到经过抛光和电化学处理的金电极表面，用氮气吹干。电极表面用透析膜覆盖并固定，可得到用于检测葡萄糖-6-磷酸的生物电极。
用实施例1合成的电化学活性高分子辅酶还可以制备检测乙醇的生物电极。
本发明的电化学活性高分子辅酶适用于各种基于辅酶的脱氢酶生物电极的制备。

Claims (7)

1.一种电化学活性高分子辅酶，其特征是在高分子的骨架上通过化学反应引入电子媒介体和辅酶，所述电子媒介体为邻苯二酚残基或间苯二酚残基。
2.根据权利要求1所述的一种电化学活性高分子辅酶，其特征是所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
3.一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，其特征是由下述步骤组成：
(1)将40～120mg 3，4-二羟基苯甲醛或2，4-二羟基苯甲醛溶解在15～100mL乙醇或甲醇中，得到溶液A；
(2)将200～500mg聚乙烯亚胺或聚丙烯胺溶解在20～60mL乙醇或甲醇中，得到溶液B；
(3)在20～35℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌1～3小时，冷却至0℃～4℃，加入15～40mg硼氢化钠，反应1～3小时，反应生成物经真空干燥后，用2～8mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温下在蒸馏水中透析12～36小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子；
(4)将3～8g丁二酸酐溶解在30～50mL二甲基亚砜中，加入180～300mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20～35℃反应12～36小时，加入40～90mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤2～4次，将沉淀加入到2～5ml质量百分浓度为5～15％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4～6，反应0.5～2小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子200～500mg，在0℃～4℃反应12～24小时，反应产物在4℃在50～100mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析12～48小时，再在蒸馏水中透析12～48小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
4.根据权利要求3所述的一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，其特征是所述步骤(1)为：将70～90mg 3，4-二羟基苯甲醛或2，4-二羟基苯甲醛溶解在45～70mL乙醇或甲醇中，得到溶液A。
5.根据权利要求3所述的一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，其特征是所述步骤(2)为：将300～400mg聚乙烯亚胺或聚丙烯胺溶解在30～50mL乙醇或甲醇中，得到溶液B。
6.根据权利要求3所述的一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，其特征是所述步骤(3)为：在25～28℃，将所述溶液A缓慢滴加到溶液B中，搅拌2小时，冷却至1℃～3℃，加入20～50mg硼氢化钠，反应2小时，反应生成物经真空干燥后，用3～6mL蒸馏水溶解，过滤，滤液在室温下在蒸馏水中透析24小时，析液经干燥后得到电化学活性高分子。
7.根据权利要求3所述的一种电化学活性高分子辅酶的制备方法，其特征是所述步骤(4)为：将5～6g丁二酸酐溶解在35～45mL二甲基亚砜中，加入220～260mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，25～30℃反应24小时，加入50～80mL丙酮，有沉淀析出，过滤后，沉淀用丙酮洗涤3次，将沉淀加入到3～4ml质量百分浓度为10％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，调节pH为4.5～5.5，反应1小时，加入步骤(3)制备的电化学活性高分子300～400mg，在1℃～3℃反应16～20小时，反应产物在4℃在60～70mmol/L的pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析24～36小时，再在蒸馏水中透析24～36小时；透析液经冷冻真空干燥，得到电化学活性高分子辅酶。
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