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Beschreibung
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zu der Patentanmeldung "Verfahren zum elektro-chemischen Nachweis
eines Enzymsubstrats und dafür zeeizneter Elektrode" Die Erfindung betrifft eine
Elektrode und ein Verfahren zu ihrer Anwendung zum Nachweis eines Enzymsubstrats
in einer wässrigen Probe, wobei das Substrat Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD)
in Gegenwart eines Enzyms reduziert. Die Elektrode umfaßt einen elektrochemischen
Sensor oder Fühler, an dem NAD und das Enzym in innigen elektrochemischen Kontakt
immobilisiert sind. Wenn das entsprechende Potential angelegt Lrd, wird alles reduziertes
NAD (NADH), das durch die enzymatische Reaktion zwischen dem nachzuweisenden Substrat
und NAD gebildet worden ist, elektrochemisch oxidiert, wodurch NAD zurückgeführt
bzw. rückgebildet wirdlund es nicht erforderlich ist-NAD als verbrauchbare Reagenz
zuzusetzen. Der während der elektrochemischen Rückbildung von NAD an der Elektrode
entwickelte
Strom ist eine Funktion der Menge des nachzuweisenden
Substrats in der Probe und wird vorzugsweise unter Bedingungen des stationären Zustands
gemessen.
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Man erhält daher eine reagenzlose Elektrode zum Nachweis bzw. zur
Bestimmung von physiologisch wichtigen Substanzen wie Lactat und Glukose.
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Die Erfindung betrifft Elektroden und Verfahren zu ihrer Anwendung
zum Nachweis von Enzymsubstraten in wässrigen Proben. Insbesondere- betrifft die
Erfindung Elektroden, bei denen ein Enzym mit einem elektrochemischen Sensor fest
verbunden ist, um ein einheitliches Prüfmittel zum Nachweis bzw. zur Bestimmung
eines Substrats des Enzyms zu bilden.
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Eine grundliegende Entwicklung in der Verwendung von Enzymen für chemische
Analysen war die Entwicklung von Enzymelektroden. Bei derartigen Vorrichtungen werden
die Bildung oder der Verbrauch eines Reagenzes oder Produktes einer Enzymkatalysierten
Reaktion üblicherweise potentiometrisch oder amperometrisch überwacht. Bei diesen
Enzymelektroden wurde das Enzym wirksam immobilisiert durch Verbinden oder Vernetzen
mit einer unlöslichen Matrix oder durch Einschluß hinter eine semipermeable Membran,
die eine Abgabe des hochmolekularen Enzyms an die Umgebung verhindert. Updike und
Hicks verfolgten als erste die Oxidation von Glukose in einem Gel, indem Glukoseoxidase
immobilisiert war (immobilized glucose oxidase)durch elektrochemische Uberwachung
eines der Reaktionspartners nämlich molekularen Sauerstoff (Nature 214: 986 1967).
Seitdem wurden zahlreiche Elektrodensysteme für verschiedene Substrate entwickelt.
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Potentiometrische Sensoren für Glukose, Penicillin und Harnstoff wurden
entwickelt, während amperometrische Enzym elektroden konstruiert wurden zur Messung
von Aminosäuren, Alkoholen, Aldehyden und Glukose0 Allgemeine Ubersichten über
die
Entwicklung von Enzymelektroden finden sich in nChem, und Eng,News" 1975, S. 29
und Science 180:380(1973).
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Wie bei immobilisierten Enzymen haben in den letzten Jahren die Untersuchungen
und Anwendungen von immobilisierten Coenzymen zugenommen. Der Ausdruck "immobilisiertes
Coenzym" ist so erweitert worden, daß er sowohl an eine Matrix gebundene unlösliche
Nukleotide als auch wasserlösliche hochmolekulare Derivate von Nukleotiden umfaßt.
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an Die Anwendung von einer Matrix gebundenen Nukleotiden ist im allgemeinen
begrenzt auf die Affinitätschromatographie.
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Bei diesem Verfahren werden durch eine chromatographische Säule hindurchgehende
Enzyme aufgrund ihrer relativen Affinität zu einem spezifisch bindenden Substrat,
Coenzym oder Analogen davon abgetrennt. Das Substrat oder Coenzym ist an eine wasserunlösliche
Matrix, wie Cellulose oder Agarose,gebunden. Lowe und Dean haben eine ausführliche
Monographie hierüber veröffentlicht ("Affinity Chromatography" John Wiley &
Sons (London, 1974)).
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An eine Matrix gebundene Formen von Nicotinamid-Adenosin-Dinukleotid
(NAD) können allgemein in zwei Gruppeneingeteilt werden, nämlich nicht-definierte
und definierte Polymere.
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Bei den nicht-definierten Arten ist - obwohl spezielle Syntheseverfahren
angewandt werdenlum das NAD an die unlösliche Matrix zu binden - die genaue Art
der tatsächlichen Bindung nicht vollständig klar. Diese Verfahren wurden bis zu
einem Punkt weiter entwickelt, daß derartige Materialien jetzt im Handel;erhältlich
sind. Die "definierten" Polymeren unterscheiden sich von den nichtdefinierten dadurch,
daß die genaue chemische Bindung zwischen Coenzym und Matrix genau charakterisiert
ist. Eine allgemeine Ubersicht über die Anwendung von immobilisierten Nukleotiden
zur Affinitätschromatographie findet sich in "Enzyme Technology Digest 3(1) : 2(1974).
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Eine Neuerung auf dem Gebiet der makromolekular gemachten Coenzymen
ist die Synthese von hochmolekul .ren wasserlöslichen . Derivaten von NAD. In den
letzten Jahren haben verschiedene Forschungsteams erfolgreich NAD an wasserlösliche
Polyäthylenamine und wasserslösliches Dextran gebunden. Diese . Derivate von NAD
zeigen nicht nur eine gute Coenzymwirksamkeit, sondern obwohl sie frei und normal
beweglich sind, sind sie ausreichend groß, um mit Hilfe semipermeabler Membranen
in kleinen Reaktionsvolumina eingeschlossen zu werden0 Nikotinamid-Adenin-Dlaukleotid
ist ein physiologisch wichtiges Coenzym, da es die treibende Kraft für viele enzymkatalysierte
Redoxreaktionen ist. So kommt es auf dem Gebiet der klinischen Chemie bei vielen
analytischen Methoden für verschiedene Enzyme vor, die entweder direkt oder indirekt
mit der Bildung oder dem Verbrauch von reduziertem NAD (NADH) in Zusammenhang gebracht
werden können0 Außerdem umfassen viele klinisch wichtige Substratanalysen die Anwendung
von EnzyRen, die NAD als Cofaktor benötigen.
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Praktisch beruhen alle diese Methoden auf der gektrophotometrischen
Messung von NADH bei 340 nm.
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Elektrochemisch wurde - obwohl sehr viel über die Reduktion von NAD
gearbeitet wurde z.B. Electroanal.Chem. 6:1(1973) (das hauptsächlich zu einem biologisch
inaktiven Dimer führt) -sehr wenig über die direkte Oxidation von NADH berichtet.
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Es wurde allgemein nicht NADH sauber an festen Elektroden in wässrigen
Lösungen oxidiert, da die Strom-Spannungs-Kurven schlecht definiert sind. So war
es notwendig, elektrochemische Mediatoren zu verwenden um Informationen über die
Oxidation von NADH auszuwerten oder zu erhalten (s.Clarke Bxidation-Reduction Potentials
of Organic Systems", The Williams & Wilkins Co Baltimore, 1960). In letzter
Zeit wurden Bedingungen beschriebens unter denen reproduzierbare Strom-Potentialkurven
erhalten
werden können für die direkte elektrochemische Oxidation von NADH (AnaleChem.47:1337
(1975)), wodurch die amperometrische Bestimmung von NADH im mikromolaren Bereich
möglich wurde. Die amperometrische Messung von NADH wird auch beschrieben in "Anal.Chem,Acta
78:281(1975)". ueber cyclische voltametrische Untersuchungen von NADH wird berichtet
in J.Amer.Chem.Soc.97:2591 (1975).
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Die Betonung der Anwendung von analytischen Sensoren mit Enzymen hat
sich auf Enzymelektroden konzentriert, bei denen verhältnismäßig einfache Enzyme
angewandt werden, von denen viele hydrolitische Enzyme sind.
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Während diese Untersuchungen wichtig waren, könnte die Vielseitigkeit
und klwendbarkeit von Enzymelektroden wesentlich verbessert werden, wenn Enzyme
die Cofaktoren benötigen, angewandt werden. Derartige Elektroden würden natürlich
erfordern daß das Coenzym kontinuierlich als Reagenz wieder zugegeben wird, solange
kein Verfahren entwickelt werden kann, bei dem das Coenzym in dem Volumen, in dem
die enzymatische Reaktion stattfindet, festgehalten oder rückgebildet werden kann.
Ein wichtiger Fortschritt zur Herstellung eines derartigen Sensors mit rückgebildetem
Coenzym ist angegeben in Biochim.Biophys.
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Acta 370:329(1974). Bei diesen Enzym werden zwei Enzyme angewandt,
eines um die analytische Reaktion dirchzuführen und eines um ein in Form eines Derrivats
vorliegendes NADH wieder in ein in Form eines Derrivats vorliegendes NAD rückzubilden.
Dieses System erfordetjedoch die Zugabe eines verbrauchbaren Reagenzes,nämlic eines
Enzymsubstrats um zu ermöglichen, daß das Coenzym wieder rückgebildet wird.
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Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen reagenzlosen,
d.h. kein Reagenzerfordernden elektrochemischen
Sensor zu entwickeln
zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines Substrats einer iEnzymreaktion, die von dem
Vorhandensein von NAD abhängt. Unter einem "reagenzlosen" Sensor ist ein Sensor
zu verstehen, der alle not--wendigen chemischen Bestandteile enthält und ohne Zugabe
eines weiteren Reagenzes arbeiten kann.
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Die Erfindung betrifft eine Elektrode zum Nachweis und zur Bestimmung
eines Enzymsubstrats, das Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) in Gegenwart eines
Enzyms reduziert, wobei die Elektrode einen elektrochemischen Sensor enthält, in
dessen unmittelbarem elektrochemischem Kontakt das Enzym mit NAD immobilisiert ist.
Das immobilisierte NAD ist in einer Menge vorhanden, die als solche nicht ausreicht,
um als verbrauchbares Reagenz-bei der enzymatischen Reaktion mit dem nachzuweisenden
Substrat zu dienen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum elektrochemischen
Nachweis dieses Substrates, bei dem man die wässrige Probe mit NAD und dem Enzym
zusammenbringt, ein elektrisches Potential an die Elektrodenoberfläche in der Probe
anlegt, das ausreicht, um alles entstehende reduzierte NAD elektrochemisch zu oxidieren,
und nun den elektrischen Strom in der Probe mit Hilfe dieser Elektrode mißt, während
das Potential angelegt ist, der eine Funktion des in der Probe nachzuweisenden Substrats
ist. Das NAD und das Enzym sind vorzugsweise fest mit dem elektrogemischen Sensor
in Form der erfindungsgemäßen Elektrode verbunden0 Bei dem Verfahren wird die Strommessung
vorzugsweise unter Bedingung des Gleichgewichtszustands durchgeführt.
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Nictonamid-Ådenin-Dinukleotidphosphat (NADP) kann hierbei anstelle
von NAD verwendet werden0 Das NAD und das Enzym werden an dem Sensor immobilisiert
durch physikalischen Einschluß oder Abfangen zwischen einer Oberfläche des Sensors
und einer semipermeablen Membran oder
indem sie chemisch an eine
Matrix gebunden werden, die in innigem elektrochemischem Kontakt mit einer Oberfläche
des Sensors gebracht ist. Man erhält damit einen reagenzlosen Sensor, der besonders
geeignet ist zum Nachweis von Substraten von NAD abhängigen Enzymen wie Dehydrogenasen.
Sensoren für derartige physiologisch wichtige Substanzen wie Lactat und Glukose
werden erhalten durch Auswahl der entsprechenden Dehydrogenasen.
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Bei den beiliegenden Zeichnungen zeigt Fig. 1 ein Reaktionsschema,
das die Erfindung erläutert; Fig. 2 eine schematische Darstellung einer elektrochemischen
Zelle, wie sie bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt wird;
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Elektrode; Fig. 4 in
einem Diagramm die Empfindlichkeit der Elektroden auf die Lactatkonzentration und
in Fig. 5 ist die Empfindlichkeit in Abhängigkeit vom pH-Wert gezeigt, wobei die
Bedingungen die gleichen sind wie in Fig. 4 mit der Ausnahme, daß der pH-Wert geändert
wird, während die Lactatkonzentration bei 4,5 mmolar gehalten wird.
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Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
daß eine analytische Vorrichtung zur Messung von Substraten von NAD- oder NADP-abhängigen
Enzymen zur Verfügung gestellt wird, die eine elektrochemische Reaktion zeigt und
die keine Zugabe von irgendwelchen Reagenzen erfordert. Die folgenden allgemeinen
Gleichungen geben eine Vielzahl von Reaktionen an, für die das erfindungsgemäße
Verfahren angewandt werden kann.
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Substrat + NAD Substrat + NADP
Produkt + NADH Produkt + NADPH
Die Zusammenstellung von Reaktionen,
die diesen Gleichungen folgenlist angegeben in 111974 Clinical und Diagnostic Catalogue
of Calbiochem 10933 North Torrey Pines Road, La Jolla California11. Bei dieser allgemeinen
Reaktion dient das Enzym als Katalysator und wird daher nicht verbraucht. Das NAD/NADH-System
wird wirksam in einem Katalysatorsystem umgewandelt, indem es immobilisiert wird1
und ein elektrisches Potential an die Umgebung angelegt wird, das geeignet ist,
um etwa vorhandenes NADH zu NAD zu oxidieren. Man erhält dabei ein reagenzloses
analytisches System. Die Meßempfindlichkeit ergibt sich direkt aus der elektrochemischen
Oxidation von NADC, da ein deratiger Prozeß Elektronen an einen äußeren Stromkreis
abgibt, . wodurch die Stromänderung meßbar wird. Die Gesamtreaktion ist schematisch
in Figur 1 dargestellt bezüglich dem Nachweis von Lactat.
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Der elektrochemische Sensor kann aus irgendeinem Material bestehen,
das ein geeigneter Leiter für die Elektrizität ist z.B. einem Metall wie Platin
oder glasartigem Kohlenstoff, wie es in dem folgenden Beispiel beschrieben ist.
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Die Art, auf die NAD oder NADP und das Enzym auf der Oberfläche der
Elektrode fmmobilsiert werden, ist nicht kritisch, solange diese in innigem elektrochemischem
Kontakt mit dem Sensor und miteinander stehen. Bezüglich Immobilisierungsverfahren,
die allgemein ohne stärkere Modifizierung angewandt werden können, wird hingewiesen
auf Affinity Chromatography von C.R. Lowe und P.D.G.Dean, J. Wiley 1974; Immobilized
Enzymes Biochemical Applications of Synthetic Polymers von GoJ H. Melrose, in Review
of Pure and Applied Chemistry, 21, 83, 1971.
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nach Die Messung des Stroms der Bestimmungsreaktion, der eine
Funktion
der zu bestimmenden Unbekannten ist, wird vorzugsweise unter Bedngung des stationären
Zustands durchgeführt. Diese Bedingungen stellen sicher, daß gut definierte Strom-Spannungs-Kurven
erzeugt werden, wodurch die quantitative Reaktion der Elektrode auf die Reoxidation
von NADH erleichtert wird. Eine detaillierte Diskussion der elektrochemischen Messung
im stationären Zustand, wie sie erfindungsgemäß anwendbar ist,findet sich in Anal.Chem.
46:1952 (1974 und Anal.Chem. 47:1337(1975).
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Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele
näher erläutert.
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Die Erfindung wird erläutert durch die durch Lactatdehydrogenase (LDH)
katalysierte Oxidation zDn Lactat zu Pyruvat mit der entsprechenden Reduktion von
NAD zu NADH und die Reoxidation des entstandenen NADH zu NAD und die elektrische
Messung, wie in Fig. 1 angegeben.
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Das Substrat Lactat diffundiert durch die semipermeable Membran, die
die immobilisierte Lactat-Dehydrogenase (LDH) enthält. An der Stelle der Reaktion
wird das Lactat chemisch zu Pyruvat oxidiert, während NAD (das hinter der Membran
festgehalten oder auf ihr fixiert ist) enzymatisch zu NADH umgewandelt wird.
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Das entstehende NADH wird dann an der Elektrodenoberfläche zu NAD
rückoxidiert und steht erneut für das Enzym zur Verfügung. Um ein wirksames Reagenz
mit einem Lactatsensor zu erhalten, muß eine elektrochemische Rückbildung von NADH
zu NAD oder-wenn der Sensor reduzierend wirSvon NAD zu NADH innerhalb des enzymatischen
Reaktionsvolumens eintreten.
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Eine elektrochemische Zelle wie sie bei der Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens angewandt werden kann, wird schematisch in Fig. 2 dargestellt,-wobei
die Elektrodenlösung von der Eintritts öffnung A zu der Austrittsöffnung B in den
Elektrodenzellenblock S strömt. Die Arbeitselektroden-Zuleitung C ist verbunden
mit einer glasartigen Kohlenstoff-Elektrode N. Die zu untersuchende Lösung wird-durch
die Eintrittsöffnung D in die Kammer L eingeleitet und aus dieser abgeleitet. Die
Kammer L ist von der Elektrodenlösung in dem Zellenblock S durch eine semipermeable
Membran M getrennt, wenn die beiden Blöcke zusammengebracht wrden, abgedichtet durch
den Ring 0.
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Die Membran M ist eine normale Dialyse-Membran oder eine Membran,
in der LDH-NAD immobilisiert istl oder eine Cellulose-Dialyse-Membran.
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Die Kammer G enthält die Ag/AgCl-Vergleichslösung und Gegenelektrode
H, wobei die Vergleichslösung bei E eintritt und bei I austritt. Die Glasfritte
K liegt zwischen Arbeitselektrode und Bezugselektrode T.
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Die Bezugselektrode T und der Zellenblock S bestehen aus Plexiglas.
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Eine schematische Darstellung einer Elektrode, die zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt werden kann, ist in Fig. 3 angegeben.
Dabei ist 10 die Elektrode aus glasartigem Kohlenstoff mit einem Quecksilberkontakt
12. Das Ende des Elektrodenblocks ist mit der Membran 14 bedeckt, die durch die
Ringe 16 dicht mit dem Block verbunden ist und einen Raum 20 zwischen der Membran
und
dem Ende der Elektrode bildet, der mit der NAD-Enzym-Lösung
durchspült wird, die zu der Eintrittsöffnung- 22 ein-und der Auslaßöffnung 24 austritt.
Die BezugseleZctrode 26 taucht in die als Substrat bei der Analyse angewandte Lactatlösung.
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Die Membranen mit dem immobilisierten LDH-NAD wurden hergestellt durch
Ausgießen einer dünnen Schicht von LDH-NAD direkt auf die Oberfläche einer celluloseartigen
Dialyse-Membran. Das Verfahren ist verwandt demjenigen, das entwickelt worden ist
von Broun et al "Biotechn.Bioeng.15, 359 (1973)". Bei einer typischen Arbeitsweise
wurde eine Lösung von 8 mg/ml NAD und 6 mg/ml LDH hergestellt durch Lösen von 8
mg NAD in 750 /ul einer O,1m NaCl- und 0,05 m-Phosphatbufferlösung (pH 7,4) und
anschließenle Zugabe von 250 /ul nicht-dialysierter handelsüblicher LDH (24,5 mg/ml).
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Das Mischen wurde durchgeführt, indem die Lösung vorsichtig in eine
1 ml Spritze aufgezogen wurde.
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Die Versuchseinordnung war so ausgebildet, daß vermieden wurde, daß
das Enzym oder Coenzym extremen Potentialen ausgesetzt wurde. So wurde der glasige
Kohlenstoff vorbehandelt, bevor die Membran über die Elektrode gebracht wurde. Das
wurde erreicht, indem man das Elektrodenlager des Zellblocks (Fig.2) in eine tragende
Elektrolytlösung legte, die in der Probenkammer einer H-Zelle enthalten war. Eine
Ag/AgCl- Bezugselektrode wurde in die Vergleichskammer der H-Zelle eingeführt, die
mit 0,10 m KCl gefüllt war. Anschließends vurdve die Elektrode vorbehandelt, Anoden-
und Kathodenindem man jeweils Potentiale von 1,35 Vanlegte.
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Nach dieser Vorbehandlung wurde die Lösung von dem Elektrodenblock
mit destilliertem Wasser abgespült, die Membran über dieElektrode gegeben, wobei
die das immobilisierte Enzym4 enthaltende Seite sich auf der Seite der Elektrode
befandlund die Membran.wurde mit dem Ring 0 befestigt und die Durchflußzelle zusammengestellt.
Die verschiedenen Durchflußkanäle und -kammern wurden dann mit der entsprechenden
Lösung gefüllt. Um einen Strom im stationären Zustand bei 0,75 V zu erhalten, wurde
die angelegte Spannung zunächst auf + 0,90 V erhöht und dann wieder auf +0,75 V
herabgesetzt. Dieser Wechsel zwischen einem höheren . Anodenpotential und 0,75 V
wurde bei 0,80 V wiederholt. Man ließ ungefähr 20 min vergehen, um einen im wesentlichen
stationären Zustand des Stroms bei diesem Potential zu erreichen.
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Um während der Einstellung des stationären Zustands Reagenz zu sparen,
wurde die Pumpgeschwindigkeit auf wenige Zehntel eines ml/min herabgesetzt. Zur
Bestimmung em fin lic en der t Blektrodenwude ale Pumpgeschwindigkeit für die Pumpen
auf 1,75 ml/min erhöht. Ein Strom im stationären Zustand wurde in der kein Reagenz
enthaltenen (blank) tragenden Elektrolytlösung eingestellt. Dann wurde das Pumpen
augenblicklich unterbrochen und die Leitung für die Lösung der Probe an de nProbenvorratsbehälter
angeschlossen. Dann wurde erneut gepumpt. Sobald die Probenlösung in die Kammer
für diese Lösung eintrat, begann die Stromstärke zu steigen, da das enzymatisch
gebildete NADH elektrochemisch oxidiert wurde.
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stärke Schließlich wurde eineneue. und höhere. Strom im stationären
Zustand erreicht üblicherweise ungefähr 3 bis 4 min nach dem ersten Einleiten der
Lactatprobe. Um die Probe von Membran und aus der Kammer auszuspülen, wurde das
Pumpen
unterbrochen, die Leitung für die Probe erneut mit einem
Reservoir für die tragende, kein Reagenz enthaltende Lösung verbunden und erneut
gepumpt. Der Strom fiel dann auf den ursprünglichen Wert des stationären Zustands.
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Die Bildungsgeschwindigkeit von NADH und damit der Oxidationsstrom
im stationären Zustand wurden bestimmt durch den Durchfluß des Lactats durch die
Membran, der seinerseits abhängt von der Lactatkonzentration. Die 13mpSindlichkeit
des Elektrodensystems auf eine gegebene Lactatkonzentration wurde angenommen als
die Differenz zwischen ddm schwächeren anfänglichen Strom im stationären Zustand
und dem schließlich auftretenden höheren Strom im stationären Zustand.
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Zwei Arten von Eleltrodensystemen wurden bei den Versuchen angewandt.
Im Beispiel 1 wurde eine Elektrode aus glasigem Kohlenstoff angewandt, die mit einer
Glutaraldehyd-LDH-NAD-Membran bedeckt war. Im Beispiel 2 wurde ene LDH- und AGNAD-Elektrode
angewandt, bei der LDH und AGNAD zwischen der glasigen Kohlenstoff-Eektrode und
der bedeckenden Dialyse-Membran eingeschlossen waren.
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Die an NAD gebundene Agarose (AGNAD) wurde hergestellt durch Homogenisieren
einer kleinen Menge AGNAD innerhalb in von 3 min einem Gewebehomogenisator. Die
Homogenisierung dient dazu, die Agaroseperlen in kleinere Teilchen zu zerteilen
und es wird angenommen, daß das zu einer besseren Wechselwirkung zwischen dem AGNAD
und der Elektrodenoberfläche führt. Das AGNAD-Gel wurde dann gewaschen und mit einem
gleichen Volumen einer LDH-Vorratslösung vermischt, die ungefähr 50 /ug/ml in deren
tragenden Lösung enthielt.
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Um die LDH-AGNAD-Elektrode herzustellen, wurde die Durchflußzelle
zusammengestellt und die Elektrode aus glasigem Kohlenstoff - wie oben beschrieben
- vorbehandelt. Die Elektrode wurde dann mit einer Dialyse-Membran bedeckt, nachdem
Anteile der LDH-AGNAD"Suspension zwischen die Membran und die Elektrodenoberfläche
mit Hilfe einer kleinen Spritze eingeführt worden waren, die mit der Eintrittsöffnung
für die Elektrodenlösung verbunden war. Die visuelle Untersuchung nach dem Einspritzen
ergab eine dünne aber deckende Schicht von AGNAD Gel über der Elektrodenoberfläche,
die auf eine Dicke von 0,1 bis 0,2 mm geschätzt wurde. Vor Bestimmung der Empfindlichkeit
auf Lactat wurde die Probenkammer gründlich gespült, um durch Dialyse etwa niedermolekulare
Verunreinigungen zu entfernen, die durch das nicht-dialysierte LDH eingeführt worden
waren. Da das LDH ein sehr viel höheres MOlekular; gewicht (140 000) besitzt als
es die Dialyse-Membran abtrennt (6000), wird das LDH festgehalten, aber ist noch
frei beweglich in dem kleinen Reaktionsvolumen zwischen der Dialyse-Membran und
der Elektrode.
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Die Systeme aus Membran und Elektrode wurden auf zwei Arten untersucht9
Bei der als "Verfahren mit zugesetztem NAD" bezeichnete.n Variante wird NAD als
Reagenz zusammen mit dem Lactatsubstrat zugesetzt. Bei dem anderen als "reagenzloses
Verfahren" bezeichnete Verfahren wird kein NAD als Reagenz zugesetzt, sondern es
ist nur das immobilisierte NAD vorhanden. Da bei dem Verfahren mit zugesetztem NAD
das NAD seiner natürlichen diffundierbaren Form im Uberist schuß zugesetzt wurde,
die Empfindlichkeit nur als Maß für die Aktivität des immobilisierten LDH anzusehen,
ist Andererseits - ~ bei dem reagenzlosen Verfahren die Empfindlichkeit als Maß
für die Aktivität des NAD und LDH zusehen,
die beide in ausreichender
Nähe zu den Elektroden immobilisiert waren, um das NAD enzymatisch in NADH umzuwandeln
und dieses wieder elektrochemisch zu NAD zurückzuoxidieren, das wieder für das Enzym
zur Verfügung stand.
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So ergibt das reagenzlose Verfahren in seiner Empfindlichkeit ein
relatives Maß für die Aktivität sowohl von dem immobilisierten Enzynals auch deml
beiltisierten Coenzym.
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Das Verhältnis der Empfind- des reagenzlosen Verfahrens zu der des
Verfahrens mit zugesetztem NAD gibt die relative Wirksamkeit des immobilisierten
NAD als .rückgebildetesCoenzym für das immobilisierte LDH nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren Die Abhängigkeit der Empfindlichkeit auf die Lactatkonzentration für eine
typische Glutaraldehyd-LDH-NAD"Membren ist in Figur 4 angegeben, für diedie Versuche
unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurden.
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Probelösunj2: 0,10 m NaCl, 0,05 m Phosphat (pH 8,0), Lactat und 1,Ommolar
NAD+ bei dem Verfahren mit zugesetztem NAD; Strömungsgeschwindigkeit 1,75 ml/min;
Elektrode aus glasigem Kohlenstoff, 3 mm, angelegte Spannung + 0,75 V, Gegenelektrode
Ag/AgCl in 0,10 m KC7 Es wurden verschiedene Membranen für jede Art der Messung
angewand.
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die stärke anbelangt, Was Werte- für ddieStrom-kann man sehen, daß
die untere Grenze der Bestimmung für das Elektrodensystem ungefähr b t nA betrug,
antsprechend dem normalen Rauschen entspricht. Damit betrug bei dem reagenzlosen
Verfahren die untere Nachweisgrenze für Lactat ungefähr 80 lum. Bei dem Verfahren
mit zugesetztem NAD entspricht die Grenze von 0,5 nA ungefähr 4 µm Lactat. Es X
zu bemerken, daß die
keit Verhältnisse der Empfindlich/der beiden
Verfahren nahezu über den gesamten untersuchten Bereich der Lactatkonzentration
konstant waren, was ein Zeichen ist für ähnliche Abhängigkeit der beiden Verfahren
von der Lactatkonzentration.
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Die Figur 4 zeigt die Empfindlichkeitskurven einer LDH-AGNAIElektrode,
die bei dem reagenzlosen Verfahren ungefähr die gleiche Empfindlichkeit besitzt,
wie eine Glutaraldehyd-LDH-NAD Elektrode. Für die LDH-AGNAl}Elektrode beträgt das
Verhältnis ungefähr 0,05,was nicht ganz so hoch ist das von Glutaraldehyd-LDH-NAD"Elektroden,
aber in der gleichen Größenordnung liegt.
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empfindlichkeit In Figur 5 wird die Elektroden-als Funktion des pH-Werts
für die beide Verfahren bet einertypische Glutaraldehyd-LDH-NAD-Elektrode in einem
Phosphatbuffersystem vergleichen.
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Die Kurve der Abhängigkeit vom pH-Wert für das reagenzlose Verfahren
zeigt ein Maximums in der Gegend von pH 8,0. Das Vorhandensein eines Maximum steht
in Übereinstimmung mit dem Verhalten des freien Enzyms (Maximum bei pH 8 - 9 in
Tris buffer) in Richtung von Lactat zu Pyruvat und ist vergleichbar mit demjenigen,
das angegeben wird für LDH, -das covalent an Sepharose gebunden ist. Das Fehlen
eines Maximums in der Kurve der pH-Abhängigkeit für das Verfahren, bei dem NAD zugesetzt
wird, wird der nicht ausreichenden Pufferkapazität für die wesentlich höhere NAD-Konzentraton
zugeschrieben und den damit verbundenen höheren Reaktionsgeschwindigkeiten, durch
die der pH-Wert in der Reaktionsschicht auf einen niedrigeren Wert gehalten wird,
als in der Umgebung.
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Das oben Gesagte zeigt die Durchführbarkeit des Verfahrens mit der
reagenzlosen Elektrode, bei dem NAD an die Matrix gebunden
istlzusammen
mit einer glasigen Kohlenstoff-Elektrode. Indem man das gebundene NAD in innigem
physikalischen Kontakt mit der Oberfläche der glasigen Kohlenstoff-Elektrode bringt,
kann das immobilisierte Enzym elektrochemischrückgebildet werden, sodaß es erneut
für das Enzym, in unmittelbarer Nähe, wieder vezfflgbar ist. Dadurch wird die Zugabe
des Coenzyms als Reagenz zu der Reaktion überflüssig.
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Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß das Konzept des erfindungsgemäßen
Verfahrens auf der Oxidation und Reduktion durch Elektronenübergang beruht im Gegensatz
zu dem Protonenübergang in hydrolytischen Analysen. Daher beruht die erfindungsgemäße
reagenzlose Analyse auf der Anwendung eines Substrats, das durch eine Membran diffundieren
kann und ein auf der gegenüberliegenden Seite der Membran eingeschlossenes, als
Katalysator wirkendes Coenzym oder Enzym reduziert oder oxidiert und bei dem die
Messung durchgeführt wird durch Anlegen eines Potentials, das im Stande ist, das
entstandene Coenzym rückzuoxidieren bzw. - reduzieren.
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Die oben angegebenen Voraussetzungen sind nicht nur bei Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
(NAD) und dessen Reduktionsprodukt NADH erfüllt, sondern auch von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat
(NADP) und dessen Reduktionsprodukt NADPH entsprechend der Gleichung NADP
NADPH Die oben angegebene Reaktion kann für reagenzlose Analysen gemäß der Erfindung
für verschiedene Bestimmungen angewandt werden z.B. von Glukose-6-phosphat (G-6-P)
als Produkt der
Reaktion von Adenosintriphosphat (ATP) und Glukose
in Gegenwart von Hexokinase gemäß der Gleichung Hexokinase ATP + Glukose
G-6-P + ADP Andere Substrate, die entsprechend den oben angegebenen Kriterien für
reagenzlose Analysen gemäß der Erfindung bestimmt werden können, sind unter anderem
Äthanol, das zu Acetaldehyd oxidiert wird, während NAD zu NADH reduziert wird in
Gegenwart von Alkoholdehydrogenase; Dihydroxy?aceton phosphat (DAP), das zu L-o('-Glycerinphosphat
(2-oLi-GP) reduziert wird, während NADH wieder zu NAD oxidiert wird in Gegenwart
des Enzyms Glycerinphosphatdehydrogenase; Oxalacetat (OAA)ldas zu L-Malat reduziert
wird, während NADH wieder zu NAD oxidiert wird in Gegenwart des Enzyms Malatdehydrogenase;
α-Ketobutyrat,das zu Üs-Hydroxybutyrat reduziert wird, während NADH zu NAD
oxidiert wird in Gegenwart des Enzyms clrHydroxybutyratdehydrogenasel und D-Fructose,
die zu Sorbit reduziert wird, wird, während NADH wieder zu NAD oxidiert wird in
Gegenwart von Sorbitdehydrogenase.
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Die oben angegebene Reaktion kann wie oben erwähnt umgekehrt werden.
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PatentansPrüche: