DE69919224T2 - Verfahren zur bestimmung eines substrates, und biosensor - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die geeignete und schnelle Quantifizierung von Substraten, enthalten in verschiedenen Proben, wie z.B. biologischen Proben, wie Blut, Urin, Spucke und Schweiß, Nahrungsmitteln und Umgebungsproben und einen Biosensor. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren für die Quantifizierung eines Substrats durch Reaktionen unter Verwendung eines Elektrodensystems, hergestellt aus elektrisch leitenden Materialien und verschiedenen Reagenzien und einen Biosensor unter Verwendung desselben.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Es wurde angenommen, dass Quantifizierungsverfahren von Substraten unter Verwendung von Dehydrogenasen und Coenzymen auf dem Gebiet der analytischen Chemie für klinische Überprüfungen, die Nahrungsmittelanalyse, usw. nützlich sind. Eine Enzymreaktion unter Verwendung einer Dehydrogenase und eines Coenzyms als Katalysatoren bedeutet eine Reaktion, wodurch ein Substrat, enthalten in einer Probe, spezifisch oxidiert und gleichzeitig das Coenzym reduziert wird. Es wurde bestätigt, dass etliche Hundert Dehydrogenasereaktionen in vivo auftreten. Diese Enzymreaktionen sind sehr wichtig, da sie auf die Quantifizierung von Substraten in Proben, die Messung der Enzymaktivitäten, usw. anwendbar sind. Bei diesen Messverfahren werden reduzierte Coenzyme, gebildet durch die Reaktionen, nachgewiesen.
- Diese als Reaktionsprodukte gebildeten reduzierten Coenzyme werden durch Flüssigchromatographie (Analytical Biocemistry, Bd. 146, S. 118 (1985)), UV-Absorptionsspektroskopie (Clinical Chemistry, Bd. 22, S. 151 (1976)) und ähnliche quantifiziert. Man bedient sich auch eines Verfahrens, das das Unterziehen eines reduzierten Coenzyms gegenüber einer Redoxreaktion mit einem Oxidans umfasst, gewählt aus Tetrazoliumsalzen (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 286784/97, Analyst, Bd. 120, S. 113 (1995)), Ferricyaniden, Chinonen, Cytochromen, Metallionen, usw. und dann die Quantifizierung des reduzierten Produkts, das so gebildet wurde, durch Absorptionsspektroskopie im sichtbaren Bereich. Keines dieser Verfahren ermöglicht jedoch eine geeignete und schnelle Messung, da es hier notwendig ist, Vorbehandlungen, wie eine Verdünnung oder Abtrennung, durchzuführen. Ein anderes Problem ist dasjenige, dass große und teure Messapparate notwendig sind, wenn diese Verfahren verwendet werden.
- In den letzten Jahren wurden Biosensoren vom elektrochemischen Detektionstyp als Mittel verwendet um günstig und schnell reduzierte Coenzyme, gebildet durch Enzymreaktionen, zu quantifizieren. In diesen Fällen wird vorhergesagt, dass reduzierte Coenzyme direkt elektrochemisch nachweisbar wären. (Analytica Chimica Acta, Bd. 336, S. 57 (1996)). Reduzierte Coenzyme können jedoch kaum Redoxreaktionen über einen Elektronentransfer durchlaufen. Daher ist es notwendig, ein hohes Potential für eine direkte Oxidation eines reduzierten Coenzyms an den Elektroden anzulegen. Die Anbringungen eines solchen hohen Potentials führt jedoch zu Verschmutzung und Schäden an den Elektroden oder induziert Effekte von coexistierenden Stoffen. Versuche um diese Probleme zu lösen, wurden durch Verwendung von Elektronenmediatoren durchgeführt, wie aus einer Anzahl von Berichten und Patenten im Hinblick auf Biosensoren ersichtlich ist, die soweit veröffentlicht wurden (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 165199/98). Beispiele für in Biosensoren verwendete Elektronenmediatoren beinhalten zum jetzigen Zeitpunkt Phenanzinderivate, wie z.B. 1-Methoxy-5-methylphenanzinmethylsulfat (1-Methoxy PMS) (Analyst, Bd. 119, S. 253 (1994)), Meldola's Blue (Analytica Chimica Acta, Bd. 329, S. 215 (1996)), Ferricyanide (Analytical Chemistry, Bd. 59, S. 2111 (1987)), Ferrocen (Analytical Chemistry, Bd. 70, S. 4320 (1998) und Chinone (Bioscience & Bioelectronics, Bd. 11, S. 1267 (1996)). Ein solcher Elektronenmediator wird durch eine Redoxreaktion mit einem reduzierten Enzym reduziert und der so gebildete reduzierte Elektronenmediator durchläuft einfach eine Redoxreaktion durch Anlegen eines Potentials an Elektroden. Daher kann der Nachweis durch Anlegen eines niedrigeren Potentials durchgeführt werden im Vergleich zu dem Fall einer Oxidation eines reduzierten Coenzyms direkt an Elektroden.
- Die WO-A-97/14965 offenbart einen amperometrischen Biosensor zum Nachweis von Fructosamin in einer Körperflüssigkeitsprobe. Der Assay involviert die elektroenzymatische Reduktion eines Fructosamins, katalysiert durch die Fructosamindehydrogenase in Gegenwart von NADH und einem Tetrazoliumsalz. Die Konzentration von Fructosamin ist proportional zu dem gemessenen Anodenstrom, erzeugt durch die Oxidation des elektroenzymatisch erzeugten Formazans an der Arbeitselektrode. Die US-A-4,816,394 offenbart einen Assay zum Nachweis von 3-Hydroxysteroid in einer Probe durch Reduktion mit einer Dehydrogenase in Gegenwart von NADH, einem Tetrazoliumsalz und einem Phenazinmethosulphat. Die Menge des Analyten wird spektrophotometrisch durch die Menge von erzeugtem Formazan während der enzymatischen Reaktion bestimmt.
- Die vorliegenden Erfinder haben Biosensoren vom integrierten Typ entwickelt, bestehend aus einem Reaktionsreagens, das verschiedene Dehydrogenasen umfasst, oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+) als Coenzym und einem Elektronenmediator 1-Methoxy PMS mit einem Elektrodensystem (japanische Patentanmeldung Nr. 201553/98; WO 00/04378 (PCT/JP98/03194)) und haben Biosensoren konstruiert, wodurch verschiedene Substrate günstig und schnell quantifiziert werden können. Bei diesen Biosensoren ist ein absorbierender Träger, der die gesamten Reaktionsreagenzien trägt, zwischen einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode lokalisiert, die aus elektrisch leitfähigen Materialien hergestellt und durch das Druckverfahren gebildet werden. Es wird bestätigt, dass dadurch ein sehr günstiger linearer Reaktionsstrom, abhängig von der Konzentration jedes Substrats, erhalten werden kann. Darauffolgende Studien haben jedoch ergeben, dass auch diese Biosensoren noch an einem Problem leiden. Der Reaktionsstrom in dem Bereich einer niedrigen Substratkonzentration neigt nämlich dazu, von coexistierenden Stoffen beeinflusst zu werden. Das liegt anscheinend daran, dass die Elektronenmediatoren aufgrund ihres sehr niedrigen Redox-Potentials chemisch instabil sind und daher dazu neigen Redoxreaktionen mit Redox-Stoffen, die ebenfalls in den Proben vorliegen, zu durchlaufen, was zu einer Fluktuation und einer Abnahme des Reaktionsstroms in dem Bereich einer niedrigen Substratkonzentration führt. Um eine hoch akkurate Quantifizierung mit einem stabilen Reaktionsstrom durchzuführen, ist es daher notwendig, das System weiter zu verbessern.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats unter Verwendung eines Elektrodensystems bereit, bestehend aus elektrisch leitenden Materialien und einem Reaktionsreagenz, umfassend mindestens eine Dehydrogenase, ein Coenzym, einen Elektronenmediator und ein Tetrazoliumsalz und einen Biosensor.
- Im Vergleich mit den konventionellen Verfahren mit direkter Oxidation reduzierter Coenzyme oder der Verwendung verschiedener Elektronenmediatoren ermöglicht es das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, die Fluktuation im Reaktionsstrom zu reduzieren, da ein chemisch stabiles Formazan als Endprodukt gebildet wird. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist weiterhin der Reaktionsstrom deutlich erhöht und die Detektionsempfindlichkeit erhöht, was es ermöglicht, ein Substrat in einem niedrigeren Konzentrationsbereich zu quantifizieren. Dementsprechend kann ein Substrat in einer Probe mit hoher Genauigkeit quantifiziert werden.
- BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats durch Verwendung eines Elektrodensystems bereit, bestehend aus mindestens einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, bestehend aus elektrisch leitenden Materialien und einem Reaktionsreagens, umfassend mindestens eine Dehydrogenase, ein Coenzym, einen Elektronenmediator und ein Tetrazoliumsalz und einen Biosensor, worin das Reaktionsreagens und das Elektrodensystem integriert sind und der eine günstige und schnelle Quantifizierung ermöglicht.
- In der vorliegenden Erfindung durchläuft das Substrat in der Probe eine spezifische Enzymreaktion unter der Wirkung der Dehydrogenase und des Coenzyms, enthalten in dem Reaktionsreagens zur Bildung eines reduzierten Coenzyms. Dann schreitet eine Redoxreaktion schnell zwischen diesem reduzierten Coenzym und dem Elektronenmediator und dem Tetrazoliumsalz voran und ein chemisch stabiles Formazan wird als Endprodukt gebildet. Als nächstes wird das Formazan elektrochemisch durch das Anlegen eines Potentials an das Elektrodensystem verändert und der so sich ergebende Reaktionsstrom nachgewiesen. Weil dieser Reaktionsstrom von der Substratkonzentration abhängt, kann das Substrat so quantifiziert werden.
5 zeigt grob das Verfahren einer Reihe von Reaktionen, wie oben beschrieben.6 zeigt die zugrundeliegende Strukturformel des Tetrazoliumsalzes, das im Endeffekt reagiert und des Formazans, das als Endprodukt gebildet wird. - Das Substrat, das gemäß der vorliegenden Erfindung quantifizierbar ist, involviert alle Substrate in Dehydrogenierungsreaktionen, wodurch reduzierte Coenzyme unter Verwendung von Dehydrogenasen als Katalysator gebildet werden. Die Verwendung einer solchen Enzymreaktion ermöglicht nicht nur die Quantifizierung eines Substrats, sondern auch die Messung der Enzymaktivität, usw. Substrate in einem extrem großen Bereich sind nämlich in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar, was sie auf verschiedene Messungen anwendbar macht. Besondere Beispiele des Substrats beinhalten Alkohole, Glactose, Glucose, Cholesterin, Milchsäure, Phenylalanin und Leucin. Es ist jedoch klar, dass verschiedene andere Substrate durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung quantifizierbar sind.
- Da ein chemisch stabiles Formazan als Endprodukt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung gebildet wird, kann eine Reduktion in der Fluktuation des Reaktionsstroms erhalten werden. Es wurde bereits durch das oben beschriebene Spektroskopieverfahren bestätigt, dass die Reaktion zur Bildung eines Formazans aus einem Substrat glatt und quantitativ fortschreitet (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 286784/97, Analyst, Bd. 120, S. 113 (1995)). Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde weiter geklärt, dass der Nachweis unter Verwendung eines Elektrodensystems durchgeführt werden kann und so wurde ein nützlicheres Quantifizierungsverfahren etabliert. Im Ergebnis ist daher eine Stromdichte von ungefähr 120 μA/cm2 durch den Biosensor der vorliegenden Erfindung etabliert worden und so wird der Reaktionsstrom deutlich erhöht und die Detektionsempfindlichkeit verbessert, da die Stromdichte von konventionellen Biosensoren Bereiche von ungefähr 4 bis 12 μA/cm2 pro mM eines Substrats konstruierten und die Stromdichten der existierenden Biosensoren unter Verwendung von Ferricyaniden als Elektronenmediator (Analytical Cemistry, Bd. 59, S. 2111 (1987)), Ferrocen (Analytica Chemistry, Bd. 70, S. 4320 (1998) und Chinonen (Bioscience & Bioelectronics, Bd. 11, S. 1267 (1996)) bei jeweils ungefähr 2 μA/cm2 (berechnet aus
6 , S. 2114), ungefähr 6 μA/cm2 (berechnet aus4 , S. 4323) und ungefähr 10 μA/cm2 (10 , S. 1273) liegen. Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung die Quantifizierung eines Substrats in einem niedrigeren Konzentrationsbereich. So kann ein Substrat mit hoher Genauigkeit unter Verwendung des Quantifizierungsverfahrens und des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung quantifiziert werden. - KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 ist ein Diagramm, das schematisch die Konstitution des Biosensors in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung darstellt. -
2 ist eine Graphik, die die fundamentalen Reaktionen des Biosensors gemäß Beispiel 2 dargestellt. -
3 ist eine Graphik, die das Ergebnis der Reaktion gegenüber reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) in Beispiel 3 dargestellt. -
4 ist eine Graphik, die die Ergebnisse der Reaktion auf L-Phenylalanin in Beispiel 4 darstellt. -
5 ist eine Reaktionsmodellansicht der vorliegenden Erfindung. -
6 zeigt die Strukturformeln von Tetrazoliumsalzen und Formazanen. - Die in den obigen Figuren angegebenen Symbole haben die folgenden Bedeutungen:
1 steht für einen isolierenden Träger;2 steht für eine Arbeitselektrode;3 steht für eine Gegenelektrode;4 steht für eine isolierende Schicht und5 steht für einen absorbierenden Träger. - BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
- Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Elektrodensystem kann willkürlich eines sein ohne besondere Begrenzung, solange es aus elektrisch leitenden Materialien besteht und elektrochemisch stabil ist. Beispiele für hierfür verwendbare Materialien beinhalten Kohlenstoff, Gold, Silber, Silber/Silber-Chlorid (Ag/AgCl), Nickel, Platin, Platinmohr, Palladium und Legierungen dieser Metalle. Als Ergebnis der Überprüfung verschiedener Materi alien wurde festgestellt, dass Kohlenstoffmaterialien als Arbeitselektrode in dem Elektrodensystem der vorliegenden Erfindung günstig sind, da sie weniger teuer und chemisch stabil sind.
- Die Bezeichnung "Kohlenstoffmaterialien", wie hier verwendet, bedeutet Materialien, die Kohlenstoff enthalten. Alle in konventionellen Kohlenstoffelektroden verwendeten Kohlenstoffmaterialien sind hier ohne eine besondere Begrenzung verwendbar. Z.B. kann man eine Kohlenstofffaser, Ruß, Kohlenstoffpaste, Glaskohlenstoff, Graphit und ähnliches verwendet werden.
- Unter Verwendung eines solchen Kohlenstoffmaterials wird eine Elektrode auf dem isolierenden Träger durch allgemein verwendete Verfahren gebildet. In der Regel wird das Kohlenstoffmaterial zu einer Paste unter Verwendung eines Harzbindemittels, usw. Sieb-bedruckt, und dann durch Erwärmung getrocknet, um dadurch eine Elektrode zu bilden.
- Der isolierende Träger kann aus Glas, Glasepoxy, Keramik, Kunststoff, usw. bestehen, obwohl das Material nicht darauf begrenzt ist, solange es bei dem Schritt der Bildung der Elektroden durch Druck oder durch Zugabe einer Probe nicht beschädigt wird. Es ist z.B. möglich, Kunststofffolien, bestehend aus Polyester, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polystyrol, Polypropylen, usw. zu verwenden. Es wurde festgestellt, dass Polyesterfolien hier vorzuziehen sind, da sie weniger teuer sind und ausgezeichnete Haftungsfähigkeit an leitende Tinten, wie auch ausgezeichnete Verarbeitungseigenschaften aufweisen.
- Das Druckverfahren ist nicht auf einen Siebdruck beschränkt, sondern man kann sich z.B. des Tiefdrucks, Offset-Drucks oder Tintenstrahldrucks bedienen.
- Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu quantifizierende Substrat ist nicht besonders begrenzt, solange es ein reduziertes Coenzym unter Verwendung einer Dehydrogenase als Katalysator bilden kann. So kann nämlich jedes Substrat quantifiziert werden. Man kann sich z.B. des Alanins bedienen, der Alkohole, Aldehyde, Isozitronensäure, Uridin-5'-diphosphoglucose, Galactose, Ameisensäure, Glycerylaldehyd-3-phosphat, Glycerol, Glycerol-3-phosphat, Glucose, Glucose-6-phosphat, Glutaminsäure, Cholesterin, Sarcosin, Sorbitol, Carbonsäure, Milchsäure, 3-Hydroxybuttersäure, Brenztraubensäure, Phenylalanin, Fructose, 6-Phosphogluconsäure, Formaldehyd, Mannit, Äpfelsäure, Leucin, usw.
- Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Dehydrogenase ist nicht besonders begrenzt, so lange sie als Enzym in der Lage zur Bildung eines reduzierten Coenzyms ist. Der Ursprung der Dehydrogenase ist ebenfalls nicht begrenzt. Man kann z.B. eine Alanindehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase, Isozitratdehydrogenase, Uridin-5'- diphosphoglucosedehydrogenase, Galactosedehydrogenase, Formatdehydrogenase, Glycerylaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Glycerindehydrogenase, Glycerin-3-phosphatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glutamatdehydrogenase, Cholesterindehydrogenase, Sarcosindehydrogenase, Sorbitoldehydrogenase, Carbonatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, 3-Hydroxybuttersäuredehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase, Phenylalanindehydrogenase, Fructosedehydrogenase, 6-Phosphogluconatdehydrogenase, Formaldehyddehydrogenase, Mannitdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Leucindehydrogenase, usw. verwenden.
- Der Elektronenmediator ist nicht besonders begrenzt, solang er schnell eine Redoxreaktion mit einem reduzierten Coenzym oder einem Tetrazoliumsalz durchlaufen kann. Man kann z.B. Chinone, Diaphorase, Cytochrome, Biologen, Phenazine, Phenoxazine, Phenothiazine, Ferricyanide, Ferredoxine, Ferrocen und Derivate davon, usw. verwenden. Unter all diesen zeigen die Phenanzine eine hohe Reaktionsstabilität. Insbesondere wurde festgestellt, dass 1-Methoxy PMS als Elektronenmediator der vorliegenden Erfindung vorzuziehen ist und zwar aufgrund seiner verbesserten Lagerungsstabilität und Reaktivität mit reduzierten Coenzymen und Tetrazoliumsalzen.
- Das Tetrazoliumsalz ist nicht besonders begrenzt solange es Formazan bilden kann. Unter allen wurde festgestellt, dass 2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliummononatriumsalz (WST-1) als in der vorliegenden Erfindung zu verwendendes Tetrazoliumsalz vorzuziehen ist, da es ein wasserlösliches und chemisch stabiles Formazan durch Reduktion bereitstellt und das so gebildete Formazan eine spezifische Reaktion im Elektrodensystem zeigt.
- BEISPIELE
- Die Erfindung wird jetzt im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele illustriert.
- BEISPIEL 1: KONSTRUKTION DES BIOSENSORS
-
1 ist ein Diagramm, das schematisch die Konstitution des Biosensors in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung darstellt. - Auf einem isolierenden Träger
1 , hergestellt aus einer Polyesterfolie (hergestellt von Diafoil Hoechst Co.) wurden eine Arbeitselektrode2 und eine Gegenelektrode3 jeweils durch Siebdruck unter Verwendung einer leitenden Graphittinte (hergestellt von Acheson Japan Ltd.) und einer leitenden Ag/AgCl-Tinte (hergestellt von Acheson Japan Ltd.), gefolgt von einem Trocknen durch Erwärmung (60°C, 1 Stunde) gebildet, wodurch ein Elektrodensystem gebildet wurde. - Eine Pufferkomponente, die für die Einstellung des pH-Werts der Enzymreaktion auf ein optimales Niveau verwendet wurde, wurde an der Arbeitselektrode
2 adsorbiert und durch Trocknen fixiert (40°C, 15 Minuten). - 1-Methoxy PMS (hergestellt von Dojindo Laboratories Co., Ltd.), das als Elektronenmediator diente, wurde an der Gegenelektrode
3 adsorbiert und durch Trocknen fixiert (40°C, 15 Minuten). - WST-1 (hergestellt von Dojindo Laboratories Co., Ltd.), verwendet als Tetrazoliumsalz, eine Dehydrogenase und ein Coenzym wurden in einem Phosphatpuffer (pH 8,0, 20 mM) gelöst, dann auf einem absorbierenden Träger
5 adsorbiert, hergestellt aus Cellulosefaser (hergestellt von Advantec Toyo) und durch Trocknen fixiert (40°C, 15 Minuten). - Die Arbeitselektrode
2 mit der darauf fixierten Pufferkomponente und die Gegenelektrode3 mit dem darauf fixierten 1-Methoxy PMS wurden gegenübergestellt und der absorbierende Träger, enthaltend WST-1, die Dehydrogenase und das Coenzym wurde zwischen diesen Elektroden des Elektrodensystems lokalisiert, wodurch ein Biosensor gebildet wurde. - BEISPIEL 2: MESSUNG DER FUNDAMENTALEN REAKTION DES BIOSENSORS
-
2 zeigt die Ergebnisse der Messung der fundamentalen Reaktionen des in Beispiel 1 konstruierten Biosensors. - In diesem Beispiel wurden 5 μl-Anteile einer Standardlösung, enthaltend NADH und einer andere Standardlösung, frei von NADH, dem oben beschriebenen Sensor zugefügt. Dann wurde ein Formazan durch die Redoxreaktion zwischen dem zugefügten NADH und 1-Methoxy PMS und WST-1 gebildet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen das cyclische Voltamogramm des Formazans (Sweep-Geschwindigkeit: 50 mV/sec; Modell HZ-3000, hergestellt von Hokuto Denko Corporation). Die durchgehende Linie zeigt das Ergebnis, erhalten unter Verwendung der Standardlösung, enthaltend NADH (1,5 mM), während die durchbrochene Linie das Ergebnis zeigt, erhalten durch Verwendung der NADH-freien Standardlösung.
- Wie diese Ergebnisse zeigen, erschien ein Oxidations-Peak bei ungefähr +500 mV vs. Ag/AgCl und so konnte ein Reaktionsstrom, charakteristisch für Formazan, erhalten werden.
- BEISPIEL 3: QUANTIFIZIERUNG VON NADH
-
3 zeigt das Ergebnis der Messung von NADH, das ein reduziertes Coenzym ist, gebildet durch Reaktion einer Probe mit einer Dehydrogenase und einem Coenzym unter Verwendung des Biosensors, konstruiert in Beispiel 1. - Sechzig Sekunden nach einer Zugabe von 5 μl einer Probe, die NADH enthält, wurde ein Potential bei +700 mV vs. Ag/AgCl angelegt (Modell HZ-3000, hergestellt von Hokuto Denko Corporation) durch Verwendung der Gegenelek trolle als Standard und der Reaktionsstrom wurde gemessen (Modell HZ-3000, hergestellt von Hokuto Denko Corporation).
- Als Ergebnis wurde eine Reaktion mit einer sehr guten Linearität in einem NADH-Konzentrationsbereich von 0 bis 1,5 mM erhalten.
- So wird erwartet, dass das Quantifizierungsverfahren und der Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung auf Enzymreaktionen unter Verwendung aller Dehydrogenasen und Coenzyme, die reduzierte Coenzyme bilden anwendbar sind.
- BEISPIEL 4: QUANTIFIZIERUNG VON L-PHENYLALANIN
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4 zeigt das Ergebnis der Messung einer Standardlösung, enthaltend L-Phenylalanin unter Verwendung eines Biosensors, konstruiert in Beispiel 1 unter Bezugnahme auf Beispiel 3. - In diesem Beispiel wurden 5 μl einer Standardlösung, enthaltend L-Phenylalanin, einem Biosensor zugefügt, konstruiert unter Verwendung einer L-Phenylalanindehydrogenase (EC 1.4.1.20, hergestellt von Unitika Ltd.). Nach 60 Sekunden wurde ein Potential bei +700 mV vs. Ag/AgCl unter Verwendung der Gegenelektrode als Standard angelegt und der Reaktionsstrom wurde gemessen.
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4 zeigt auch das Ergebnis der Messung unter Verwendung eines konventionellen Biosensors zum Vergleich. - Im Fall des konventionellen Biosensors wurden 5 μl einer Standardlösung, enthaltend L-Phenylalanin zugefügt und nach 60 Sekunden wurde ein Potential bei –220 mV vs. Ag/AgCl unter Verwendung der Gegenelektrode als Standard angelegt und der Reaktionsstrom wurde gemessen.
- Wenn dem Reaktionsreagens eine Probe zugefügt wird, durchläuft das Substrat in der Probe eine spezifische Enzymreaktion unter Wirkung der Dehydrogenase und des Coenzyms, die in dem Reaktionsreagens enthalten sind, um dadurch das reduzierte Coenzym zu bilden. Dann schreitet schnell eine Redoxreaktion zwischen diesem reduzierten Coenzym und dem Elektronenmediator und dem Tetrazoliumsalz fort und chemisch stabiles Formazan wird als Endprodukt gebildet. Darauffolgend wird ein Potential an das Elektrodensystem angelegt und so wird das Formazan elektrochemisch verändert. Dann wird der sich so ergebende Reaktionsstrom nachgewiesen. Weil dieser Reaktionsstrom von der Substratkonzentration abhängt, kann dadurch das Substrat quantifiziert werden.
5 zeigt eine Reaktionsmodellansicht der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben.6 zeigt die fundamentalen Strukturformeln von Tetrazoliumsalzen und Formazanen. - Im Ergebnis wurde eine Reaktion mit sehr guter Linearität in einem L-Phenylalaninkonzentrationsbereich von 0 bis 1 mM erreicht. Ein sehr großer Reaktionsstrom, der eine Stromdichte von ungefähr 120 μA/cm2 pro mM L-Phenylalanin zeigte, wurde erhalten.
- Obwohl man in den obigen Beispielen einen Biosensor verwendete, der ein Zwei-Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode involvierte, kann eine Quantifizierung mit höherer Genauigkeit ebenfalls durch Verwendung eines Drei-Elektrodensystems mit einer Referenzelektrode durchgeführt werden.
Claims (5)
- Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probe, welches umfasst: das Durchführen einer Enzymreaktion und einer Redoxreaktion zwischen einem Reaktionsreagens, umfassend gleichzeitig eine oder mehrere Dehydrogenasen, ein Coenzym, einen Elektronenmediator und ein Tetrazoliumsalz und der Probe, und Nachweisen eines Formazans, das als endgültiges Reaktionsprodukt gebildet wird, unter Verwendung eines Elektrodensystems, das aus elektrisch leitfähigen Materialien hergestellt ist, wobei der Reaktionsmechanismus dieses Verfahrens zusammengefasst wie in dem folgenden Reaktionsschema gezeigt ist:
- Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Substrat Alanin, ein Alkohol, ein Aldehyd, Isozitronensäure, Uridin-5'-diphospho-glucose, Galactose, Ameisensäure, Glycerylaldehyd-3-phosphat, Glycerin, Glycerin-3-phosphat, Glucose, Glucose-6-phosphat, Glutaminsäure, Cholesterin, Sarcosin, Sorbit, Carbonsäure, Milchsäure, 3-Hydroxybuttersäure, Pyruvinsäure, Phenylalanin, Fructose, 6-Phosphogluconsäure, Formaldehyd, Mannit, Äpfelsäure oder Leucin ist.
- Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Formazan elektrochemisch durch das Anlegen einer gewissen Spannung an das Elektrodensystem geändert wird und der so entstehende Reaktionsstrom nachgewiesen wird.
- Biosensor zum Nachweisen von Formazan unter Verwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, in den ein Reaktionsreagens, umfassend mindestens eine Dehydrogenase, ein Coenzym, einen Elektronenmediator und ein Tetrazoliumsalz, und ein Elektrodensystem, das aus mindestens einer Arbeitselektrode und einer Messelektrode, welche aus elektrisch leitfähigen Materialien hergestellt sind, integriert sind.
- Biosensor gemäss Anspruch 4, wobei das Formazan elektrochemisch durch das Anlegen einer gewissen Spannung an das Elektrodensystem geändert wird, und der so entstehende Reaktionsstrom nachgewiesen wird.
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