JP3403390B2 - 基質の定量方法およびバイオセンサ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、血液、尿、唾液、汗などの生体試料や食
品、環境試料などの種々の試料に含まれる基質を煩雑な
前処理を必要としない簡便でしかも迅速な基質の定量方
法およびバイオセンサに関する。具体的には、導電性材
料を用いて形成された電極系と種々の試薬からなる反応
を用いた基質の定量方法およびそれを利用したバイオセ
ンサに関する。

発明の背景 従来より、脱水素酵素および補酵素を用いた基質の定
量は、臨床検査、食品分析等の分析化学分野において利
用価値が認められている。脱水素酵素および補酵素を触
媒として用いる酵素反応は、試料中に含まれる基質を特
異的に酸化するとともに、補酵素を還元する反応のこと
であり、生体内では数百種類もの脱水素酵素反応が確認
されている。この酵素反応は、試料中の基質の定量また
は酵素活性の測定等に応用できることから非常に重要な
反応であり、一般に、反応によって生成した還元型補酵
素を検出することで測定が行われる。

この反応から生成した還元型補酵素を定量する方法と
して、液体クロマトグラフィ (Analytical Biochemistr
y, Vol.146, p.118 (1985)) および紫外領域の吸光光度
法 (Clinical Chemistry, Vol.22, p.151(1976)) 等が
ある。さらに還元型補酵素と酸化剤、例えばテトラゾリ
ウム塩類（特開平９−２８６７８４，Analyst, Vol.12
0, p.113(1995))、フェリシアン化物、キノン類、シト
クロム類、金属イオン等を用いて酸化還元反応を行い、
生成した還元物質を可視領域の吸光光度法で定量する方
法等もある。しかし、これらの方法では、希釈や分離等
の前処理を必要とすることから簡便でしかも迅速な測定
とは言い難く、さらに大がかりで高価な測定装置を必要
とするなどの問題もある。

近年、酵素反応から生成した還元型補酵素を簡便でし
かも迅速に定量する方法として、電気化学的に検出する
バイオセンサが用いられてきている。この場合の検出方
法として、還元型補酵素を直接電気化学的に検出する方
法が考えられる (Analytica Chimica Acta, Vol.336,p.
57 (1996))。しかし、還元型補酵素は、電子伝達による
酸化還元反応が困難であることから、電極上での還元型
補酵素の直接酸化は高い印加電位を必要とする。この高
い印加電位により電極の汚損または共存物質による影響
が起こる。この点を改善するため、バイオセンサに関し
て発表された多くの報告および特許出願公開公報では、
電子メディエータを用いることにより問題を解決しよう
と取り組んでいる (特開平１０−１６５１９９)。現在、
バイオセンサに用いられる電子メディエータとして、フ
ェナジン類の１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム
メチルサルフェート（１−メトキシ ＰＭＳ） (Analys
t, Vol.119,p.253(1994))やメルドラブルー(Analytica
Chimica Acta, Vol.329,p.215(1996))、フェリシアン化
物 (Analytical Chemistry, Vol.59, p.2111(1987))、
フェロセン (Analytical Chemistry, Vol.70, p.4320(1
998))、キノン類 (Biosensors & Bioelectronics, Vol.
11, p.1267(1996)) 等がある。これらの電子メディエー
タは、還元型補酵素との酸化還元反応によって還元さ
れ、生成した還元型電子メディエータは電極上で電位印
加により容易に酸化還元反応する。そのため、直接還元
型補酵素を電極により酸化する場合に比べ、より低い印
加電位による検出が可能になる。

本発明発明者らもこれまでに種々の脱水素酵素と補酵
素の酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ⁺）および電子メディエータの１−メトキシ ＰＭ
Ｓを反応試薬に用いて、電極系と一体化させたバイオセ
ンサ（特開平１０−２０１５５３，ＰＣＴ／ＪＰ９８／
０３１９４）を考案し、種々の基質に対して簡便でしか
も迅速な定量が可能なバイオセンサを構築してきた。こ
れらのバイオセンサは、導電性材料を用いて印刷手法に
よって形成した作用極と対極を対向させた電極間に、反
応試薬をすべて担持した吸収性担体を配置したバイオセ
ンサであり、各基質濃度に依存する直線的できわめて良
好な応答電流が確認されている。しかし、その後の検討
から、これらのバイオセンサは基質の低濃度領域におけ
る応答電流が試料中の共存物質の影響を受けやすいとい
う改善の余地が見出された。その原因として、電子メデ
ィエータの標準酸化還元電位が非常に低いために、還元
型電子メディエータは容易に試料中の共存物質である酸
化還元物質と反応する化学的に不安定な物質であること
が考えられた。その結果、基質の低濃度領域における応
答電流のばらつきおよび低下が生じていたものと考えら
れる。したがって、応答電流が安定でしかも高精度な定
量をするには、さらに改善する必要があった。

発明の要旨 本発明は上記の課題を解決するために、導電性材料を
用いて形成された電極系と、少なくとも脱水素酵素と補
酵素と電子メディエータに加えて、さらにテトラゾリウ
ム塩類からなる反応試薬とを用いた、基質の定量方法お
よびバイオセンサを提供するものである。

本発明による方法と従来の還元型補酵素の直接酸化あ
るいは種々の電子メディエータを用いた方法を比較する
と、化学的に安定なホルマザンを最終的に生成させてい
るため、変動の少ない応答電流が得られる。また、応答
電流の大幅な増大ならびに検出感度の向上が見られるこ
とから、さらに低濃度領域での基質の定量が可能となる
ことが挙げられる。これより、試料中の基質の高精度な
定量が実現される。

発明の説明 本発明によれば、導電性材料を用いて形成された少な
くとも作用極と対極からなる電極系と、少なくとも脱水
素酵素と補酵素と電子メディエータおよびテトラゾリウ
ム塩類からなる反応試薬とを用いた基質の定量方法、お
よび電極系と反応試薬を一体化させ、簡便でしかも迅速
な定量が可能なバイオセンサを提供するものである。

本発明において、試料中の基質は反応試薬である脱水
素酵素および補酵素による特異的な酵素反応によって還
元型補酵素を生成する。この還元型補酵素は、すみやか
に電子メディエータおよびテトラゾリウム塩類との酸化
還元反応が進行し、化学的に安定なホルマザンを最終的
に生成する。続いて電極系に電位を印加することでホル
マザンを電気化学的に変化させ、その際に生じる応答電
流を検出する。この応答電流が基質濃度に依存すること
から、基質の定量が可能となる。上記一連の反応を概略
的に図５に示す。また、最終的に反応するテトラゾリウ
ム塩類および最終的に生成されるホルマザンは図６に示
すような基本的な構造式を有する。

本発明における測定可能な基質とは、脱水素酵素を触
媒として、還元型補酵素を生成する脱水素酵素反応のあ
らゆる基質が挙げられる。この酵素反応を用いること
で、基質の定量をはじめ、酵素活性の測定等の応用も可
能となる。このように、非常に広範囲な基質をもちいる
ことができ、さまざまな測定への応用が可能となる。具
体的には、アルコール、ガラクトース、グルコース、コ
レステロール、乳酸、フェニルアラニン、ロイシン等が
基質として挙げることができるが、その他、非常に多岐
に渡る基質の測定が可能であることは明らかである。

本発明では、化学的に安定なホルマザンを最終的に生
成させているため、変動の少ない応答電流が得られる。
基質からのホルマザン生成への反応は、すみやかにかつ
定量的に生じていることが前述の可視領域の吸光光度法
で既に確認されており（特開平９−２８６７８４，Anal
yst, Vol.120,p.113(1995))、本発明によって、さらに
電極系による検出が可能なことが明らかになり、より有
用な定量方法が創出された。その結果、我々がこれまで
に構築したバイオセンサの基質１ｍＭに対する電流密度
は、約４〜１２μＡ／ｃｍ²であり、また従来のバイオ
センサ、例えばフェリシアン化物 (Analytical Chemist
ry, Vol.59, p.2111(1987))、フェロセン（Analytical
Chemistry, Vol.70, p.4320(1998)）、キノン類 (Biose
nsors & Bioelectronics, Vol.11, p.1267(1996)) を電
子メディエータに用いたバイオセンサの電流密度は、そ
れぞれ、約２μＡ／ｃｍ² (p.2114, Fig.6より算出)、
約６μＡ／ｃｍ² (p.4323, Fig.4より算出)、約１０μ
Ａ／ｃｍ² (p.1273, Fig10) であるのに対し、本発明の
バイオセンサでは約１２０μＡ／ｃｍ²であることか
ら、応答電流の大幅な増大ならびに検出感度の向上が見
られ、さらに低濃度領域における基質の定量が可能とな
った。このことから、本発明の基質の定量方法およびバ
イオセンサを用いることにより、基質の高精度な定量が
実現された。

図面の簡単な説明 図１は本発明の一実施例におけるバイオセンサの構成
部分の分解図であり； 図２は実施例２におけるバイオセンサの基本応答を示
すグラフであり； 図３は実施例３における還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に対する応答の結果を示
すグラフであり； 図４は実施例４におけるＬ−フェニルアラニンに対す
る応答の結果を示すグラフであり； 図５は本発明の反応模式図であり； 図６はテトラゾリウム塩類およびホルマザンの基本の
構造式である。

上記図中の符号は次のように説明される： １は絶縁性支持体；２は作用極；３は対極；４は絶縁
層；５は吸収性担体である。

好適具体例の説明 本発明に用いられる電極系としては、導電性物質であ
り、電気化学的に安定であれば特に制限はなく、材料に
ついてはカーボン、金、銀、銀／塩化銀、ニッケル、白
金、白金黒およびパラジウム等、ならびにそれらの合金
を使用することができる。その中でも種々の材料を検討
した結果、カーボン材料が安価で化学的に安定してお
り、本発明における電極系の作用極として好ましいこと
を見出した。

ここでのカーボン材料とは、カーボンを含む材料全般
を意味する。利用できるカーボン材料は特に制限される
ものではなく、従来のカーボン電極において使用されて
いるものであれば良く、例えばカーボンファイバ、カー
ボンブラック、カーボンペースト、グラッシーカーボ
ン、グラファイト等を使用することができる。

このようなカーボン材料は常套の方法によって絶縁性
の支持体上に電極部分として形成される。通常、カーボ
ン材料を樹脂バインダー等によりペースト状にしたもの
をスクリーン印刷し、それを加熱乾燥することにより形
成できる。

絶縁性支持体としては、ガラス、ガラスエポキシ、セ
ラミックス、プラスチック等が挙げられるが、電極部分
の印刷形成の際や試料の添加の際に侵されない物質であ
れば特に制限はない。例えばポリエステル、ポリエチレ
ン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリ
プロピレン等のプラスチックフィルムが安価であり、さ
らに導電性インクとの密着性や加工性の良さから、ここ
ではポリエステルフィルムが好ましいことを見出した。

印刷方法としては、スクリーン印刷に限定されること
は特になく、その他、グラビア印刷、オフセット印刷、
インクジェット印刷等が応用できる。

本発明の測定可能な基質としては、脱水素酵素を触媒
として、還元型補酵素を生成することが可能な基質であ
れば特に制限はなく、あらゆる基質の定量が可能であ
る。たとえば、アラニン、アルコール、アルデヒド、イ
ソクエン酸、ウリジン−５’−ジホスフォ−グルコー
ス、ガラクトース、ギ酸、グリセリルアルデヒド−３−
リン酸、グリセロール、グリセロール−３−リン酸、グ
ルコース、グルコース−６−リン酸、グルタミン酸、コ
レステロール、サルコシン、ソルビトール、炭酸、乳
酸、３−ヒドロキシ酪酸、ピルビン酸、フェニルアラニ
ン、フルクトース、６−ホスフォグルコン酸、ホルムア
ルデヒド、マンニトール、リンゴ酸、ロイシン等が利用
できる。

本発明に用いられる脱水素酵素としては還元型補酵素
を生成する酵素であれば特に制限はなく、また由来につ
いても特に限定されることはない。例えばアラニン脱水
素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵
素、イソクエン酸脱水素酵素、ウリジン−５’−ジホス
フォ−グルコース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵
素、ギ酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、グリセロール−
３−リン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵
素、コレステロール脱水素酵素、サルコシン脱水素酵
素、ソルビトール脱水素酵素、炭酸脱水素酵素、乳酸脱
水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ピルビン酸
脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、フルクトー
ス脱水素酵素、６−ホスフォグルコン酸脱水素酵素、ホ
ルムアルデヒド脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素、
リンゴ酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素等が利用でき
る。

電子メディエータとしては、還元型補酵素およびテト
ラゾリウム塩類とすみやかに酸化還元反応を行う物質で
あれば特に制限はない。例えばキノン類、ジアホラー
ゼ、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェ
ノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、
フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等を用
いることができる。その中でもフェナジン類がここでは
応答の安定性が見られ、特に１−メトキシ ＰＭＳは保
存安定性が良いことや還元型補酵素およびテトラゾリウ
ム塩類との反応性も優れることから、本発明における電
子メディエータとして好ましいことを見出した。

テトラゾリウム塩類としては、ホルマザンを生成する
ものであれば特に制限はなく、その中でも２−（４−ヨ
ードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−
（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウ
ム，１ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）は還元したときに生
成されるホルマザンが水溶性で化学的に安定であり、ま
た生成したホルマザンが電極系において特異的な応答を
示すことから、本発明におけるテトラゾリウム塩類とし
て好ましいことを見出した。

実施例 以下に、本発明の一実施例について具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ バイオセンサの作製 図１は、バイオセンサの一実施例を示したもので、構
成部分の分解図である。

ポリエステルフィルム（ダイアホイルヘキスト（株）
製）の絶縁性支持体１に導電性グラファイトインク（日
本アチソン（株）製）を用いて作用極２を、導電性銀／
塩化銀インク（日本アチソン（株）製）を用いて対極３
をスクリーン印刷し、加熱乾燥（６０℃，１時間）し
た。次に両極の一部分に絶縁性塗料（日本アチソン
（株）製）を用いて絶縁層４を形成し加熱乾燥（６０
℃，１時間）することにより電極系を印刷形成した。

酵素反応の至適ｐＨを調整するための緩衝成分は、作
用極２上に吸着、乾燥（４０℃，１５分間）させ固定化
した。

電子メディエータである１−メトキシ ＰＭＳ（(株)
同仁化学研究所製）は、対極３上に吸着、乾燥（４０
℃，１５分間）させ固定化した。

テトラゾリウム塩類であるＷＳＴ−１（(株) 同仁化
学研究所製）と脱水素酵素および補酵素は、リン酸緩衝
溶液（ｐＨ８．０，２０ｍＭ）に溶解させたのち、セル
ロース繊維（アドバンテック東洋（株）製）からなる吸
収性担体５に吸着、乾燥（４０℃，１５分間）させ固定
化した。

緩衝成分を固定化した作用極２と１−メトキシ ＰＭ
Ｓを固定化した対極３を対向させ、その電極系の電極間
にＷＳＴ−１と脱水素酵素および補酵素および含有させ
た吸収性担体５を配置してバイオセンサとした。

実施例２ バイオセンサの基本応答の測定 実施例１で作製したバイオセンサの基本応答を測定し
た結果を図２に示す。

ここでは、前記バイオセンサにＮＡＤＨを含む標準溶
液と含まない標準溶液をそれぞれ５μＬ添加した。すな
わち、添加したＨＡＤＨと１−メトキシ ＰＭＳおよび
ＷＳＴ−１の酸化還元反応によりホルマザンが生成され
る。本結果はホルマザンのサイクリックボルタモグラム
を示す（掃印速度：５０ｍＶ／秒）（北斗電工（株）製
ＨＺ−３０００)。実線がＮＡＤＨ（１．５ｍＭ）を
含む標準溶液を用いたときの結果であり、破線がＮＡＤ
Ｈを含まない標準溶液を用いたときの結果である。

本結果から、約＋５００ｍＶに酸化ピークが現れ、ホ
ルマザンの特異的な応答電流が得られた。

実施例３ ＮＡＤＨの定量 試料と脱水素酵素および補酵素を反応させた際に生成
される還元型補酵素であるＮＡＤＨを実施例１で作製し
たバイオセンサを用いて測定を行った結果を図３に示
す。

ＮＡＤＨを含む試料を５μＬ添加し、６０秒後に対極
を基準に、ここでは＋７００ｍＶの電位を印加して（北
斗電工（株）製 ＨＺ−３０００）、その時の応答電流
値を測定した（北斗電工（株）製 ＨＺ−３０００）。

本結果から、ＮＡＤＨが０〜１．５ｍＭの濃度領域で
直線的なきわめて良好な応答が得られた。

このように還元型補酵素を生成するあらゆる脱水素酵
素および補酵素を用いた酵素反応への応用が期待でき
る。

実施例４ Ｌ−フェニルアラニンの定量 実施例３を参考に、Ｌ−フェニルアラニンを含む標準
溶液を試料として、実施例１で作製したバイオセンサを
用いて測定を行った結果を図４に示す。

ここでは脱水素酵素としてＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素（ＥＣ １．４．１．２０）（ユニチカ（株）
製）を用いて作製したバイオセンサに、Ｌ−フェニルア
ラニンを含む標準溶液を５μＬ添加し、６０秒後に対極
を基準に＋７００ｍＶの電位を印加して、応答電流値を
測定した。

また、比較のため従来のバイオセンサを用いて測定を
行った結果も図４に示す。

なお、従来のバイオセンサでは、Ｌ−フェニルアラニ
ンを含む標準溶液を５μＬ添加し、６０秒後に対極を基
準に−２２０ｍＶの電位を印加して、応答電流値を測定
したものである。

反応試薬に試料を添加すると、試料中の基質は反応試
薬である脱水素酵素および補酵素による特異的な酵素反
応によって還元型補酵素を生成する。この還元型補酵素
は、すみやかに電子メディエータおよびテトラゾリウム
塩類との酸化還元反応が進行し、化学的に安定なホルマ
ザンを最終的に生成する。続いて電極系に電位を印加す
ることでホルマザンを電気化学的に変化させ、その際に
生じる応答電流を検出する。この応答電流が基質の濃度
に依存することから、基質の定量が可能となる。以上、
本発明の反応模式図を図５に示す。また、テトラゾリウ
ム塩類およびホルマザンの基本の構造式を図６に示す。

本結果から、Ｌ−フェニルアラニンが０〜１ｍＭの濃
度領域で直線的なきわめて良好な応答が得られた。ま
た、Ｌ−フェニルアラニン１ｍＭに対する電流密度は約
１２０μＡ／ｃｍ²と非常に大きな応答電流が得られ
た。

なお、上記実施例では作用極と対極のみの２電極系を
含むバイオセンサを使用したが、参照極を加えた３電極
系を用いれば、より正確な定量が可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 健治 北海道札幌市北区新川二条２丁目12−20 株式会社札幌イムノ・ダイアグノステ ィック・ラボラトリー内 (56)参考文献 特開 平９−286764（ＪＰ，Ａ) 米国特許5387515（ＵＳ，Ａ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも脱水素酵素と補酵素と電子メデ
   ィエータおよびテトラゾリウム塩類からなる反応試薬と
   試料とにより酵素反応および酸化還元反応を生じさせ、
   反応の最終生成物であるホルマザンを導電性材料を用い
   て形成された電極系を用いて検出することを特徴とする
   前記試料中の基質の定量方法。
2. 【請求項２】基質がアラニン、アルコール、アルデヒ
   ド、イソクエン酸、ウリジン−５’−ジホスフォ−グル
   コース、ガラクトース、ギ酸、グリセリルアルデヒド−
   ３−リン酸、グリセロール、グリセロール−３−リン
   酸、グルコース、グルコース−６−リン酸、グルタミン
   酸、コレステロール、サルコシン、ソルビトール、炭
   酸、乳酸、３−ヒドロキシ酪酸、ピルビン酸、フェニル
   アラニン、フルクトース、６−ホスフォグルコン酸、ホ
   ルムアルデヒド、マンニトール、リンゴ酸またはロイシ
   ンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記電極系にある一定の電位を印加するこ
   とで前記ホルマザンを電気化学的に変化させ、その際に
   生じる応答電流を検出することを特徴とする請求項１記
   載の方法。
4. 【請求項４】前記反応試薬と導電性材料を用いて形成さ
   れた少なくとも作用極と対極からなる電極系を一体化さ
   せ、請求項１記載の方法を用いて前記ホルマザンを検出
   するためのバイオセンサ。
5. 【請求項５】前記電極系にある一定の電位を印加するこ
   とで前記ホルマザンを電気化学的に変化させ、その際に
   生じる応答電流を検出することを特徴とする請求項４記
   載のバイオセンサ。