JP2002142798A - イヌリン測定方法 - Google Patents
イヌリン測定方法Info
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- JP2002142798A JP2002142798A JP2000338156A JP2000338156A JP2002142798A JP 2002142798 A JP2002142798 A JP 2002142798A JP 2000338156 A JP2000338156 A JP 2000338156A JP 2000338156 A JP2000338156 A JP 2000338156A JP 2002142798 A JP2002142798 A JP 2002142798A
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- measuring
- tetrazolium salt
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】イヌリンを簡便でかつ正確に測定する方法を提
供する。 【解決手段】イヌリンを酵素的に分解することにより生
成したフルクトースを測定するに際し、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナ
ーゼを用い、電子が１−メトキシ−５−メチルフェナジ
ニウムメチルスルフェートを介してテトラゾリウム塩に
伝達されることにより生成するホルマザン色素を測定す
ることを特徴とするイヌリン測定方法。
供する。 【解決手段】イヌリンを酵素的に分解することにより生
成したフルクトースを測定するに際し、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナ
ーゼを用い、電子が１−メトキシ−５−メチルフェナジ
ニウムメチルスルフェートを介してテトラゾリウム塩に
伝達されることにより生成するホルマザン色素を測定す
ることを特徴とするイヌリン測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イヌリンを正確に
測定するための方法、ならびにそのための試薬に関す
る。
測定するための方法、ならびにそのための試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】腎機能の一指標である糸球体濾過値（Ｇ
ＦＲ：glomerular filtration rate）は、一般にクレア
チニンなどの内因性物質、チオ硫酸ナトリウム、イヌリ
ン、放射性のＥＤＴＡやイオタラム酸などの外因性物質
を用いたクリアランス試験によって測定される。
ＦＲ：glomerular filtration rate）は、一般にクレア
チニンなどの内因性物質、チオ硫酸ナトリウム、イヌリ
ン、放射性のＥＤＴＡやイオタラム酸などの外因性物質
を用いたクリアランス試験によって測定される。
【０００３】クレアチニンクリアランスは、クレアチニ
ンが内因性物質であるため被験者への侵襲が少ないメリ
ットはあるが、測定の正確性に関して、尿細管からの分
泌があること、クレアチニン産生量が食事や運動などの
影響を受けること等の問題点が指摘されている。また、
チオ硫酸ナトリウムクリアランスは、チオ硫酸ナトリウ
ムが、強く陰性に帯電している近位尿細管腔において水
素イオンの多量分泌を促し、ＧＦＲに影響を与える可能
性が指摘されている。また、イオタラム酸をはじめとす
る放射性物質を用いたクリアランスは、放射性物質の取
り扱いに資格を要すること、放射性負荷に対する配慮が
必要であることなどに問題点の指摘がある。これらに対
し、イヌリンは完全に糸球体により濾過されるのでクリ
アランス測定に理想的な物質とされている。
ンが内因性物質であるため被験者への侵襲が少ないメリ
ットはあるが、測定の正確性に関して、尿細管からの分
泌があること、クレアチニン産生量が食事や運動などの
影響を受けること等の問題点が指摘されている。また、
チオ硫酸ナトリウムクリアランスは、チオ硫酸ナトリウ
ムが、強く陰性に帯電している近位尿細管腔において水
素イオンの多量分泌を促し、ＧＦＲに影響を与える可能
性が指摘されている。また、イオタラム酸をはじめとす
る放射性物質を用いたクリアランスは、放射性物質の取
り扱いに資格を要すること、放射性負荷に対する配慮が
必要であることなどに問題点の指摘がある。これらに対
し、イヌリンは完全に糸球体により濾過されるのでクリ
アランス測定に理想的な物質とされている。
【０００４】イヌリンクリアランスを測定する際には、
被験者の静脈にイヌリンを投与し、その前後で経時的に
単回または複数回採取した被験者の血漿および／または
尿についてイヌリン濃度を適当な方法で測定する。イヌ
リンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産
生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色さ
せる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑
で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースな
ど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘され
ている。特に反応が非特異であることは、クリアランス
に好適な物質としてのイヌリンの長所を損なう。中で
も、糖尿病性腎症などグルコース濃度が高い被験者の場
合には問題が大きい。
被験者の静脈にイヌリンを投与し、その前後で経時的に
単回または複数回採取した被験者の血漿および／または
尿についてイヌリン濃度を適当な方法で測定する。イヌ
リンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産
生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色さ
せる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑
で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースな
ど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘され
ている。特に反応が非特異であることは、クリアランス
に好適な物質としてのイヌリンの長所を損なう。中で
も、糖尿病性腎症などグルコース濃度が高い被験者の場
合には問題が大きい。
【０００５】そこで、イヌリンを簡便で正確に測定する
方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開
発されてきた。これらはイヌリンを一般にイヌリナーゼ
と呼ばれる酵素等を用いて単糖に分解し、生じたフルク
トースを種々の方法で測定するものである。
方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開
発されてきた。これらはイヌリンを一般にイヌリナーゼ
と呼ばれる酵素等を用いて単糖に分解し、生じたフルク
トースを種々の方法で測定するものである。
【０００６】例えば、特開昭６２−２０５７９９号公報
には、イヌリンが分解して出来た単糖であるフルクトー
スを、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ
ＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されている。た
だし、この方法は共役反応を触媒するヘキソキナーゼが
グルコースに対しても反応するため、グルコースを前も
って消去する必要がある。
には、イヌリンが分解して出来た単糖であるフルクトー
スを、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ
ＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されている。た
だし、この方法は共役反応を触媒するヘキソキナーゼが
グルコースに対しても反応するため、グルコースを前も
って消去する必要がある。
【０００７】また、ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．第３９巻、第
１１号、第２３３３〜２３３７頁、および臨床化学 第
１０巻、第６４〜６９頁（１９８１）には、フルクトー
スをソルビトールデヒドロゲナーゼと共役反応させＮＡ
ＤＨの減少を測定する方法が開示されている。この方法
も、前者の文献によれば、グルコース３００ｍｇ／ｄＬ
を試料に上乗せした際に、ソルビトール、マンニトー
ル、キシリトールの影響が全くなかったのに対し、グル
コースでは１．３ｍｇ／ｄＬ相当とごくわずかではある
が影響を受けることが報告されている。
１１号、第２３３３〜２３３７頁、および臨床化学 第
１０巻、第６４〜６９頁（１９８１）には、フルクトー
スをソルビトールデヒドロゲナーゼと共役反応させＮＡ
ＤＨの減少を測定する方法が開示されている。この方法
も、前者の文献によれば、グルコース３００ｍｇ／ｄＬ
を試料に上乗せした際に、ソルビトール、マンニトー
ル、キシリトールの影響が全くなかったのに対し、グル
コースでは１．３ｍｇ／ｄＬ相当とごくわずかではある
が影響を受けることが報告されている。
【０００８】そこで、理論上グルコースの影響を受けな
い方法が種々開発されてきた。例えば、臨床化学 第２
３巻、第１６４〜１６９頁（１９９４）には、フルクト
ースをフルクトキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応さ
せＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されている
が、この方法は感度が十分でなく、またフルクトキナー
ゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼの３種の酵素とアデノシン−３−リ
ン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（ＮＡＤＰ）の２種類の補酵素を必要とするの
で、妨害物質の影響を受けやすい、高価である等といっ
た欠点が考えられる。
い方法が種々開発されてきた。例えば、臨床化学 第２
３巻、第１６４〜１６９頁（１９９４）には、フルクト
ースをフルクトキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応さ
せＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されている
が、この方法は感度が十分でなく、またフルクトキナー
ゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼの３種の酵素とアデノシン−３−リ
ン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（ＮＡＤＰ）の２種類の補酵素を必要とするの
で、妨害物質の影響を受けやすい、高価である等といっ
た欠点が考えられる。
【０００９】また、特公昭５９−３５５９２号公報に
は、フルクトースを、酸素の存在下でＮＡＤまたはＮＡ
ＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナー
ゼ、および電子受容体であるフェロシアン化カリウムと
反応させ、生成するフェリシアン化カリウムを硫酸第二
鉄、デュパノール試薬と反応させて生じるプルシアンブ
ルーを測定する方法が開示されているが、この方法は反
応時間が長く操作も複雑なため、汎用の自動分析機に適
用させることが難しい等の欠点が考えられる。
は、フルクトースを、酸素の存在下でＮＡＤまたはＮＡ
ＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナー
ゼ、および電子受容体であるフェロシアン化カリウムと
反応させ、生成するフェリシアン化カリウムを硫酸第二
鉄、デュパノール試薬と反応させて生じるプルシアンブ
ルーを測定する方法が開示されているが、この方法は反
応時間が長く操作も複雑なため、汎用の自動分析機に適
用させることが難しい等の欠点が考えられる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
なイヌリン測定方法の問題点を解消し、イヌリンを正確
に測定する方法を提供するものである。
なイヌリン測定方法の問題点を解消し、イヌリンを正確
に測定する方法を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討を重ねた結果、イヌリンを酵
素的に分解し生成したフルクトースを測定するに際し、
ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としないフルクトー
スデヒドロゲナーゼを用い、電子受容体を介して酸素と
の反応により生成する過酸化水素を測定するイヌリン測
定方法において、電子が１−メトキシ−５−メチルフェ
ナジニウムメチルスルフェート（略称：１−メトキシ−
ＰＭＳ）を介してテトラゾリウム塩に伝達され、生成す
るホルマザン色素を測定することにより、イヌリンを感
度よく短時間で測定でき、さらには自動分析機への適応
も容易に出来ることを見出し、本発明を完成させるに至
った。
を達成するために鋭意検討を重ねた結果、イヌリンを酵
素的に分解し生成したフルクトースを測定するに際し、
ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としないフルクトー
スデヒドロゲナーゼを用い、電子受容体を介して酸素と
の反応により生成する過酸化水素を測定するイヌリン測
定方法において、電子が１−メトキシ−５−メチルフェ
ナジニウムメチルスルフェート（略称：１−メトキシ−
ＰＭＳ）を介してテトラゾリウム塩に伝達され、生成す
るホルマザン色素を測定することにより、イヌリンを感
度よく短時間で測定でき、さらには自動分析機への適応
も容易に出来ることを見出し、本発明を完成させるに至
った。
【００１２】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）イヌリンを酵素的に分解することにより生成した
フルクトースを測定するに際し、ＮＡＤ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を電子受容体と
しないフルクトースデヒドロゲナーゼを用い、電子が１
−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェ
ート（略称：１−メトキシ−ＰＭＳ）を介してテトラゾ
リウム塩に伝達されることにより生成するホルマザン色
素を測定することを特徴とするイヌリン測定方法。 （２）第一ステップとして内因性のグルコースおよび／
またはフルクトースをヘキソキナーゼで消去し、次いで
第二ステップとしてイヌリンを酵素的に分解することに
より生成したフルクトースを脱水素する過程でフルクト
ースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体の存在下テトラ
ゾリウム塩に電子を渡すことによって生成したホルマザ
ン色素を定量する（１）に記載のイヌリン測定方法。 （３）テトラゾリウム塩が式（Ｉ）〜（Ｖ）で示される
いずれかの水溶性ホルマザン色素を生成する化合物であ
る（１）または（２）に記載のイヌリン測定方法。
なる。 （１）イヌリンを酵素的に分解することにより生成した
フルクトースを測定するに際し、ＮＡＤ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を電子受容体と
しないフルクトースデヒドロゲナーゼを用い、電子が１
−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェ
ート（略称：１−メトキシ−ＰＭＳ）を介してテトラゾ
リウム塩に伝達されることにより生成するホルマザン色
素を測定することを特徴とするイヌリン測定方法。 （２）第一ステップとして内因性のグルコースおよび／
またはフルクトースをヘキソキナーゼで消去し、次いで
第二ステップとしてイヌリンを酵素的に分解することに
より生成したフルクトースを脱水素する過程でフルクト
ースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体の存在下テトラ
ゾリウム塩に電子を渡すことによって生成したホルマザ
ン色素を定量する（１）に記載のイヌリン測定方法。 （３）テトラゾリウム塩が式（Ｉ）〜（Ｖ）で示される
いずれかの水溶性ホルマザン色素を生成する化合物であ
る（１）または（２）に記載のイヌリン測定方法。
【化２】 （４）Ｒ１及びＲ２の２試薬からなるイヌリン測定用試
薬であって、Ｒ１に緩衝液、ヘキソキナーゼ、及びＡＴ
Ｐ（アデノシン−３−リン酸）、Ｒ２に緩衝液、イヌリ
ン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としな
いフルクトースデヒドロゲナーゼ、１−メトキシ−ＰＭ
Ｓ、及び式（Ｉ）〜（Ｖ）で示されるいずれかの水溶性
ホルマザン色素を生成するテトラゾリウム塩を含むこと
を特徴とするイヌリン測定用試薬。
薬であって、Ｒ１に緩衝液、ヘキソキナーゼ、及びＡＴ
Ｐ（アデノシン−３−リン酸）、Ｒ２に緩衝液、イヌリ
ン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としな
いフルクトースデヒドロゲナーゼ、１−メトキシ−ＰＭ
Ｓ、及び式（Ｉ）〜（Ｖ）で示されるいずれかの水溶性
ホルマザン色素を生成するテトラゾリウム塩を含むこと
を特徴とするイヌリン測定用試薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する
が、本発明がこれら実施例により特に限定されるもので
ないことは言うまでもない。
が、本発明がこれら実施例により特に限定されるもので
ないことは言うまでもない。
【００１４】本発明に使用するイヌリン分解酵素は、イ
ヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限
定されない。例えば、アスペルギルス（Aspergillus）
属、クリベロマイセス（Klyveromyces）属等の微生物等
から得られるエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８
０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）など
があり、市販品としては、エキソイヌリナーゼとエンド
イヌリナーゼの混合物である「Fructozyme」（ノボ・ノ
ルディスク社製）などが挙げられる。また、濃度につい
ても特に限定はなく、例えば反応時の濃度として１〜５
００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存
在させるのが好ましい。
ヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限
定されない。例えば、アスペルギルス（Aspergillus）
属、クリベロマイセス（Klyveromyces）属等の微生物等
から得られるエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８
０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）など
があり、市販品としては、エキソイヌリナーゼとエンド
イヌリナーゼの混合物である「Fructozyme」（ノボ・ノ
ルディスク社製）などが挙げられる。また、濃度につい
ても特に限定はなく、例えば反応時の濃度として１〜５
００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存
在させるのが好ましい。
【００１５】本発明に使用するフルクトースデヒドロゲ
ナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としない
ものであれば特に限定されない。例えばグルコノバクタ
ー（Gluconobacter）属等の微生物から得ることがで
き、市販品では東洋紡績株式会社製のＦＣＤ−３０１な
どが挙げられる。また濃度についても特に限定はなく、
例えば、反応時の濃度として好ましくは１〜５００単位
／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存在させる
のがより好ましい。
ナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としない
ものであれば特に限定されない。例えばグルコノバクタ
ー（Gluconobacter）属等の微生物から得ることがで
き、市販品では東洋紡績株式会社製のＦＣＤ−３０１な
どが挙げられる。また濃度についても特に限定はなく、
例えば、反応時の濃度として好ましくは１〜５００単位
／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存在させる
のがより好ましい。
【００１６】本発明で用いる電子受容体は、具体的には
１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフ
ェート（略称：１−ｍ−ＰＭＳ）である。イヌリン分解
工程で生成した単糖がフルクトースデヒドロゲナーゼの
存在下で脱水素される過程で、電子を１−ｍ−ＰＭＳを
介してテトラゾリウム塩に渡し、水溶性ホルマザン色素
を生成させる。この方法は、測定感度が高い、反応が早
くて簡便であることより自動分析機への適用が容易であ
るなどの利点を持つ好ましい方法である。
１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフ
ェート（略称：１−ｍ−ＰＭＳ）である。イヌリン分解
工程で生成した単糖がフルクトースデヒドロゲナーゼの
存在下で脱水素される過程で、電子を１−ｍ−ＰＭＳを
介してテトラゾリウム塩に渡し、水溶性ホルマザン色素
を生成させる。この方法は、測定感度が高い、反応が早
くて簡便であることより自動分析機への適用が容易であ
るなどの利点を持つ好ましい方法である。
【００１７】本発明の汎用自動分析機への適用は、例え
ば次のようにして行うことが出来る。第一ステップとし
て、内因性のグルコースおよび／またはフルクトースを
ヘキソキナーゼで消去し、次いで第二ステップとして、
イヌリンを酵素的に分解し生成したフルクトースを脱水
素する過程で、フルクトースデヒドロゲナーゼおよび電
子受容体の存在下テトラゾリウム塩に電子を渡し、生成
したホルマザン色素を定量する。試薬形態は特に限定さ
れないが、液状２試薬や、測定直前に複数のパーツを混
合するタイプのものでもよく、そのうちの一部がバイア
ルなどの固形製剤であってもよい。
ば次のようにして行うことが出来る。第一ステップとし
て、内因性のグルコースおよび／またはフルクトースを
ヘキソキナーゼで消去し、次いで第二ステップとして、
イヌリンを酵素的に分解し生成したフルクトースを脱水
素する過程で、フルクトースデヒドロゲナーゼおよび電
子受容体の存在下テトラゾリウム塩に電子を渡し、生成
したホルマザン色素を定量する。試薬形態は特に限定さ
れないが、液状２試薬や、測定直前に複数のパーツを混
合するタイプのものでもよく、そのうちの一部がバイア
ルなどの固形製剤であってもよい。
【００１８】本発明に使用するテトラゾリウム塩は特に
限定されるものではないが、水溶性ホルマザンを生成す
るものであることが望ましい。水溶性でない場合は反応
セルへの吸着などの不利益をもたらすのであまり好まし
くない。このような化合物としては、具体的には、例え
ば式（Ｉ）〜（Ｖ）に示されるものが好ましい。なかで
も、式（III）、（IV）で示されるものは測定波長が
（Ｉ）、（II）、（Ｖ）で示されるものより長波長領域
にあるため、ヘモグロビンやビリルビンなどの共存物質
の影響を回避することができるので、さらに好ましい。
市販品では、（株）同仁化学研究所のＷＳＴシリーズが
挙げられる。
限定されるものではないが、水溶性ホルマザンを生成す
るものであることが望ましい。水溶性でない場合は反応
セルへの吸着などの不利益をもたらすのであまり好まし
くない。このような化合物としては、具体的には、例え
ば式（Ｉ）〜（Ｖ）に示されるものが好ましい。なかで
も、式（III）、（IV）で示されるものは測定波長が
（Ｉ）、（II）、（Ｖ）で示されるものより長波長領域
にあるため、ヘモグロビンやビリルビンなどの共存物質
の影響を回避することができるので、さらに好ましい。
市販品では、（株）同仁化学研究所のＷＳＴシリーズが
挙げられる。
【００１９】
【化３】
【００２０】また、本測定系では、試料に由来するフル
クトースおよびグルコースを予め消去する手段を講じる
ことが望ましい。フルクトースが存在するとそのまま測
定値に上乗せされるし、またグルコースはコンタミ酵素
等により代謝されて測定値に影響を及ぼす可能性があ
る。本発明では、Ｒ１にヘキソキナーゼとＡＴＰを添加
することにより、グルコースおよびフルクトースを同時
に消去することを可能にした。ここで使用するヘキソキ
ナーゼは、グルコースおよびフルクトースに対する特異
性が高いものであれば特に限定されない。例えばサッカ
ロマイセス（Saccharomyces）属等の微生物から得るこ
とができ、市販品では東洋紡績株式会社製のＨＸＫ−３
０１などが挙げられる。また濃度についても特に限定は
なく、例えば反応時の濃度として好ましくは１〜５００
単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存在さ
せるのがより好ましい。
クトースおよびグルコースを予め消去する手段を講じる
ことが望ましい。フルクトースが存在するとそのまま測
定値に上乗せされるし、またグルコースはコンタミ酵素
等により代謝されて測定値に影響を及ぼす可能性があ
る。本発明では、Ｒ１にヘキソキナーゼとＡＴＰを添加
することにより、グルコースおよびフルクトースを同時
に消去することを可能にした。ここで使用するヘキソキ
ナーゼは、グルコースおよびフルクトースに対する特異
性が高いものであれば特に限定されない。例えばサッカ
ロマイセス（Saccharomyces）属等の微生物から得るこ
とができ、市販品では東洋紡績株式会社製のＨＸＫ−３
０１などが挙げられる。また濃度についても特に限定は
なく、例えば反応時の濃度として好ましくは１〜５００
単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存在さ
せるのがより好ましい。
【００２１】本発明のイヌリン測定方法には、必要に応
じて、上述したものに加えてさらにその他の添加剤を共
存せしめても良い。該添加剤としては、Ｎ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォニ
ックアシッド（略称：ＴＥＳ）などのグッド緩衝液や酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液をはじめとする各種緩衝液、
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のよう
な界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、アルブミン
やポリエチレングリコールなどの高分子化合物、アミノ
酸類、糖類、シクロデキストリン類等のような安定化
剤、抗生物質、アジ化ナトリウム等のような防腐剤、Ｅ
ＤＴＡ（又はその塩）等のようなキレート剤などが挙げ
られるが、特にこれらに限定されるものではない。
じて、上述したものに加えてさらにその他の添加剤を共
存せしめても良い。該添加剤としては、Ｎ−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォニ
ックアシッド（略称：ＴＥＳ）などのグッド緩衝液や酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液をはじめとする各種緩衝液、
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のよう
な界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、アルブミン
やポリエチレングリコールなどの高分子化合物、アミノ
酸類、糖類、シクロデキストリン類等のような安定化
剤、抗生物質、アジ化ナトリウム等のような防腐剤、Ｅ
ＤＴＡ（又はその塩）等のようなキレート剤などが挙げ
られるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２２】本発明におけるイヌリン測定用試薬は、Ｒ
１及びＲ２の２試薬からなる。Ｒ１には緩衝液、ヘキソ
キナーゼ、及びＡＴＰ（アデノシン−３−リン酸）を含
む。Ｒ１における緩衝液としては、ｐＨ４〜９である酢
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−
１，４−ビス（２−エタンスルフォニックアシッド））
緩衝液、ＭＥＳ（２‐モルフォリノエタンスルフォニッ
クアシッド）緩衝液などのグッド緩衝液などが挙げられ
る。また、Ｒ２には少なくとも緩衝液、イヌリン分解酵
素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としないフルク
トースデヒドロゲナーゼ、１−メトキシ−ＰＭＳ、及び
式（Ｉ）〜（Ｖ）で示されるいずれかの水溶性ホルマザ
ン色素を生成するテトラゾリウム塩を含むことを特徴と
する。Ｒ２における緩衝液としては、ｐＨ４〜９である
酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−
１，４−ビス（２−エタンスルフォニックアシッド））
緩衝液、ＭＥＳ（２‐モルフォリノエタンスルフォニッ
クアシッド）緩衝液などのグッド緩衝液などが挙げられ
る。また、Ｒ１・Ｒ２のいずれにおいても、さらに上述
したような種々の添加剤を含んでいてもよい。
１及びＲ２の２試薬からなる。Ｒ１には緩衝液、ヘキソ
キナーゼ、及びＡＴＰ（アデノシン−３−リン酸）を含
む。Ｒ１における緩衝液としては、ｐＨ４〜９である酢
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−
１，４−ビス（２−エタンスルフォニックアシッド））
緩衝液、ＭＥＳ（２‐モルフォリノエタンスルフォニッ
クアシッド）緩衝液などのグッド緩衝液などが挙げられ
る。また、Ｒ２には少なくとも緩衝液、イヌリン分解酵
素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としないフルク
トースデヒドロゲナーゼ、１−メトキシ−ＰＭＳ、及び
式（Ｉ）〜（Ｖ）で示されるいずれかの水溶性ホルマザ
ン色素を生成するテトラゾリウム塩を含むことを特徴と
する。Ｒ２における緩衝液としては、ｐＨ４〜９である
酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−
１，４−ビス（２−エタンスルフォニックアシッド））
緩衝液、ＭＥＳ（２‐モルフォリノエタンスルフォニッ
クアシッド）緩衝液などのグッド緩衝液などが挙げられ
る。また、Ｒ１・Ｒ２のいずれにおいても、さらに上述
したような種々の添加剤を含んでいてもよい。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明がこれら実施例により特に限定される
ものでないことは言うまでもない。
明するが、本発明がこれら実施例により特に限定される
ものでないことは言うまでもない。
【００２４】実施例１：イヌリン測定（日立７１７０自
動分析機への適用） １．試薬の調製 下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 Ｒ１（濃度はＲ１中） ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ １−メトキシ−ＰＭＳ ３０ｍｇ／Ｌ Ｒ２（濃度はＲ２中） ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０） ０．１５ｍｏｌ／Ｌ イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Fructozyme）
６０単位／ｍＬ フルクトースデヒドロゲナーゼ ２００Ｕ／ｍＬ テトラゾリウム塩 ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
動分析機への適用） １．試薬の調製 下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 Ｒ１（濃度はＲ１中） ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ １−メトキシ−ＰＭＳ ３０ｍｇ／Ｌ Ｒ２（濃度はＲ２中） ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０） ０．１５ｍｏｌ／Ｌ イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Fructozyme）
６０単位／ｍＬ フルクトースデヒドロゲナーゼ ２００Ｕ／ｍＬ テトラゾリウム塩 ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
【００２５】２．試料の調製 イヌリン水溶液を、０,２０,４０,６０,８０,１００ｍ
ｇ／ｄＬの各濃度に調製したものを用いた。
ｇ／ｄＬの各濃度に調製したものを用いた。
【００２６】３．測定 日立７１７０自動分析機を使用した。試料をそれぞれ
６．０μＬ添加後すぐにＲ１を１８０μＬを添加し混和
後３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を６０μ
Ｌ添加し５分間静置した後の２ポイントエンド法で４５
０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランク、基準液
（２０ｍｇ／ｄＬ）についても同様に測定し、次の式に
よりイヌリン濃度を求めた。
６．０μＬ添加後すぐにＲ１を１８０μＬを添加し混和
後３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を６０μ
Ｌ添加し５分間静置した後の２ポイントエンド法で４５
０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランク、基準液
（２０ｍｇ／ｄＬ）についても同様に測定し、次の式に
よりイヌリン濃度を求めた。
【００２７】
【数１】
【００２８】４．結果 表１に示す。１００ｍｇ／ｄＬまで良好な直線性が得ら
れている。
れている。
【００２９】
【表１】
【００３０】実施例２：内因性フルクトース、グルコー
スの消去能確認 １．試薬の調製 実施例１と同じ組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 ２．試料の調製 フルクトース水溶液 ０,２,４,６,８,１０ｍｇ／ｄＬの各濃度に調製した。 グルコース水溶液 ０,４００,８００,１２００，１６００,２０００ｍｇ／
ｄＬの各濃度に調製した。
スの消去能確認 １．試薬の調製 実施例１と同じ組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 ２．試料の調製 フルクトース水溶液 ０,２,４,６,８,１０ｍｇ／ｄＬの各濃度に調製した。 グルコース水溶液 ０,４００,８００,１２００，１６００,２０００ｍｇ／
ｄＬの各濃度に調製した。
【００３１】３．測定 日立７１７０自動分析機を使用した。試料をそれぞれ
６．０μＬ添加後すぐにＲ１を１８０μＬを添加し混和
後３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を６０μ
Ｌ添加し、５分間静置した後の２ポイントエンド法で４
５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランク、基準液
（２０ｍｇ／ｄＬ）についても同様に測定し、次の式に
よりイヌリン濃度を求めた。
６．０μＬ添加後すぐにＲ１を１８０μＬを添加し混和
後３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を６０μ
Ｌ添加し、５分間静置した後の２ポイントエンド法で４
５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランク、基準液
（２０ｍｇ／ｄＬ）についても同様に測定し、次の式に
よりイヌリン濃度を求めた。
【００３２】
【数２】
【００３３】４．結果 表２および表３に示す。フルクトースでは６ｍｇ／ｄＬ
程度まで、グルコースでは２０００ｍｇ／ｄＬまで良好
に消去できている。
程度まで、グルコースでは２０００ｍｇ／ｄＬまで良好
に消去できている。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
【発明の効果】上述したように、本発明は、簡便かつ正
確にイヌリン濃度を測定できる方法を提供することがで
きるものである。また、自動分析機への適用も容易であ
る。
確にイヌリン濃度を測定できる方法を提供することがで
きるものである。また、自動分析機への適用も容易であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/66 Ｇ０１Ｎ 33/66 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 BA01 DA30 DA32 FB01 FB05 FB11 2G054 AA06 CA21 CE01 CE08 EA04 JA09 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ67 QR04 QR07 QR41 QR42 QR51 QS20 QS28 QS36 QX01
Claims (4)
- 【請求項１】 イヌリンを酵素的に分解することにより
生成したフルクトースを測定するに際し、ＮＡＤ（ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を電
子受容体としないフルクトースデヒドロゲナーゼを用
い、電子が１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメ
チルスルフェート（略称：１−メトキシ−ＰＭＳ）を介
してテトラゾリウム塩に伝達されることにより生成する
ホルマザン色素を測定することを特徴とするイヌリン測
定方法。 - 【請求項２】 第一ステップとして内因性のグルコース
および／またはフルクトースをヘキソキナーゼで消去
し、次いで第二ステップとしてイヌリンを酵素的に分解
することにより生成したフルクトースを脱水素する過程
でフルクトースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体の存
在下テトラゾリウム塩に電子を渡すことによって生成し
たホルマザン色素を定量する請求項１に記載のイヌリン
測定方法。 - 【請求項３】 テトラゾリウム塩が式（Ｉ）〜（Ｖ）で
示されるいずれかの水溶性ホルマザン色素を生成する化
合物である請求項１または２に記載のイヌリン測定方
法。 【化１】 - 【請求項４】 Ｒ１及びＲ２の２試薬からなるイヌリン
測定用試薬であって、Ｒ１に緩衝液、ヘキソキナーゼ、
及びＡＴＰ（アデノシン−３−リン酸）、Ｒ２に緩衝
液、イヌリン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受
容体としないフルクトースデヒドロゲナーゼ、１−メト
キシ−ＰＭＳ、及び式（Ｉ）〜（Ｖ）で示されるいずれ
かの水溶性ホルマザン色素を生成するテトラゾリウム塩
を含むことを特徴とするイヌリン測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000338156A JP2002142798A (ja) | 2000-11-06 | 2000-11-06 | イヌリン測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000338156A JP2002142798A (ja) | 2000-11-06 | 2000-11-06 | イヌリン測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002142798A true JP2002142798A (ja) | 2002-05-21 |
Family
ID=18813410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000338156A Withdrawn JP2002142798A (ja) | 2000-11-06 | 2000-11-06 | イヌリン測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002142798A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004083452A1 (ja) * | 2003-03-17 | 2004-09-30 | Dojindo Laboratories Co., Ltd. | グルコース－６－リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断方法 |
| JP2009268477A (ja) * | 2009-08-18 | 2009-11-19 | Toyobo Co Ltd | イヌリン定量法および定量試薬 |
| CN103091409A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-05-08 | 江苏艾兰得营养品有限公司 | 一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法 |
| CN108562564A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-09-21 | 青岛大学 | 一种用于菊糖酶活度检测的碳量子点及制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000093196A (ja) * | 1998-09-25 | 2000-04-04 | Asahi Chem Ind Co Ltd | カイロイノシトールの定量方法 |
| WO2000057166A1 (fr) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory | Procede d'analyse de substrat et biocapteur |
-
2000
- 2000-11-06 JP JP2000338156A patent/JP2002142798A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000093196A (ja) * | 1998-09-25 | 2000-04-04 | Asahi Chem Ind Co Ltd | カイロイノシトールの定量方法 |
| WO2000057166A1 (fr) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory | Procede d'analyse de substrat et biocapteur |
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| CN108562564A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-09-21 | 青岛大学 | 一种用于菊糖酶活度检测的碳量子点及制备方法和应用 |
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