WO2004083452A1 - グルコース－６－リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断方法 - Google Patents

グルコース－６－リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断方法 Download PDF

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WO2004083452A1
WO2004083452A1 PCT/JP2004/003577 JP2004003577W WO2004083452A1 WO 2004083452 A1 WO2004083452 A1 WO 2004083452A1 JP 2004003577 W JP2004003577 W JP 2004003577W WO 2004083452 A1 WO2004083452 A1 WO 2004083452A1
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carrier
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PCT/JP2004/003577
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Fumihiko Kawamoto
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Dojindo Laboratories Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing a carrier of glucose 16-phosphate dehydrogenase abnormality using a water-soluble tetrazolium salt compound.
  • Glucose 16-phosphate dehydrogenase dysfunction (Dalco 6-phosphate dehydrogenase is abbreviated as “G6PD” in the present specification, and glucose 16-phosphate dehydrogenase ) Is one of the genetic disorders and is the most well-known and frequent enzyme disorder in the world. It is estimated that about 400 million people worldwide carry the mutated gene, mainly in tropical countries (Rulinger et al., Nature, 376, 246, 1995; Ganzakowski et al., American Journal of Human Genetics, 56 , 294, 1995).
  • G6PD is an enzyme in the erythrocyte that oxidizes dalcos-6-phosphate to 6-phosphodalconolactone and reduces the coenzyme NADP + to NADPH at the first stage of the pentose phosphate cycle.
  • G6PD In abnormal G6PD, G6PD produced by genetic abnormality does not have normal activity, and NADPH is not sufficiently produced. As a result, the amount of reduced daltathione decreases, the oxidative defense ability of red blood cells and hemoglobin decreases, and hereditary non-spherical hemolytic anemia results. Many patients with G6PD abnormalities are clinically asymptomatic, but develop acute hemolytic anemia attacks when exposed to triggers such as the administration of the antimalarial drug primaquine. Primaquine is widely used as an eradication drug for vivax malaria infection, and is also used as a drug to prevent the transmission of P. falciparum by reproductive mothers.
  • the G6PD enzyme gene is located on the long arm of the X chromosome (Xq28). Mutations in this enzyme gene cause abnormalities in various G6PD activities, causing neonatal jaundice and acute hemolytic anemia.
  • G6PD disorder is a sex-linked recessive disorder in which the majority of patients are hemizygous males, but are transmitted to the child by both the mother and father. Therefore, it is also necessary to detect heterozygous women in whom only one X gene is abnormal, ie, carriers of G6PD abnormalities.
  • carriers of G6PD abnormalities have normal G6PD of about the same level as that of healthy subjects to more than half, it is necessary to accurately identify whether they are carriers by conventional diagnostic methods. Was impossible. Therefore, development of a highly sensitive method capable of accurately selecting carriers has been desired.
  • the fluorescent spot method has been recommended as a standard screening method by the International Committee for Standard Blood Tests, but it is extremely difficult to detect carriers of G6PD abnormalities, and Pujades et.al (Int. J. Hematol., 69, 234, 1999) evaluated this method and reported that all 12 heterozygous female G6PD abnormalities were diagnosed as normal.
  • the MTTZPMS method diagnoses G6PD enzyme dysfunction by reacting NADPH produced by the G6PD enzyme with MTT, a formazan substrate, and measuring the color development of the resulting formazan. It is a great way to do it. However, MTT reacts nonspecifically with hemoglobin, causing dark brown to red Since the color changes, if blood is used as a sample without pretreatment, the color development of formazan cannot be measured accurately. To solve this problem,
  • An object of the present invention is to provide a diagnostic method capable of accurately and easily determining whether or not a carrier of G6PD abnormality is a carrier.
  • a carrier diagnosis method for G6PD abnormalities that has the simplicity of operation in the field and enables accurate diagnosis even when blood collected from a subject is subjected to a test without pretreatment.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, as a formazan substrate, a water-soluble tetrazolium salt disclosed in Patent No. 25757348. By conducting the formazan method using the compound, it was found that the presence or absence of G6PD abnormality carrier could be determined very simply and with high sensitivity without pretreatment of the blood from the subject.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention provides a method for diagnosing a carrier of glucose-16-phosphate dehydrogenase abnormality, comprising the following steps:
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a nitro group, a cyano group, a carbonyl group, or a halogen
  • R 3 represents an alkyl group or an alkoxyl group
  • M represents an alkali metal or ammonium.
  • the above method wherein R 1 and R 2 are each a dinitro group and R 3 is a methoxy group, and the above method wherein M is sodium.
  • the compound represented by the general formula (I) is 2- (2-methoxy-14-nitropheninole) -13- (412-tropheninole) -5- (2,4-disulfophenyl) )-2H tetrazolium mononatrium salt; the above method wherein the coloring reagent is 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate; represented by the general formula (I) The compound is 2- (2-methoxy-4-nitropheninole) 1-3- (412-tropheninole) -5- (2,4-disnolephophenyl) _2H tetrazolium mononatridium salt, And the above-mentioned method, wherein the color-forming reagent is 1-methoxy-5-
  • the present invention provides a reagent for diagnosing the carrier of glucose-6-phosphate dehydrogenase abnormality, preferably a reagent in the form of a solution, which is represented by the above general formula (I).
  • the present invention provides a reagent comprising the above compound and a coloring reagent.
  • the compound represented by the general formula (I) is 2- (2-methoxy-4,2-tropheninole) -13- (4-ditropheninole) -15- (2,4-disnorlehoffin) Nore)
  • the above-mentioned reagent which is a monosodium salt of 1 H tetrazolium, and wherein the color-forming reagent is 1-methoxy-5-methylpanadinium methyl sulfate.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing the carrier of glucose-16-lysic acid dehydrogenase abnormality, which comprises the compound represented by the above general formula (I) and a coloring reagent. Is done. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing a solution after mixing a blood sample and a WST-8 / 1-methoxy PMS reaction solution. In the figure, the results are shown at 15, 60, and 120 minutes after mixing from above.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of comparison of the photosensitivity between the WST-8 / 1-methoxy method (the present invention) and the MTT / PMS method.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the absorbance at 450 nm of the sample shown in FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the method of the present invention is a method for diagnosing the carrier of G6PD abnormality, comprising mixing a reaction solution containing a compound represented by the general formula (I) and a coloring reagent, and blood collected from a subject.
  • the method is characterized by including a step of measuring the color development of the obtained mixture.
  • the term “carrier” refers to a condition in which the G6PD gene present on one of the two X chromosomes of a woman is normal and the G6PD gene present on the other X chromosome is associated with a G6PD disorder. It means having an anomaly to give. Also, the term “carrier” needs to be interpreted in the broadest sense, including a symptomatic carrier with mild symptoms if no G6PD disorder is present.
  • the method of the present invention provides that the subject is a carrier of the G6PD disorder. It is a method that can easily and accurately determine whether or not a subject is a subject, and includes a step of measuring G6PD activity using a subject's blood as a sample.
  • R 1 and R 2 may be the same or different.
  • a halogen means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or a chlorine atom.
  • R 1 is a nitro group
  • R 2 is a nitro group.
  • the alkyl group represented by R 3 may be linear or branched, and for example, an alkyl group having about 1 to 6 carbon atoms, more preferably about 1 to 4 carbon atoms can be used.
  • examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isoptyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group.
  • the alkoxyl group represented by R 3 may be linear or branched, and for example, an alkoxyl group having about 1 to 6 carbon atoms, more preferably about 1 to 4 carbon atoms can be used. More specifically, mention may be made of a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group, a butoxy group, an isoptoxy group, a tert-butoxy group, and the like. Most preferred as R 3 is a methoxy group.
  • Examples of the alkali metal represented by include lithium, sodium, and potassium. M may also be an ammonia. Most preferred as M is sodium.
  • WST-8 Sometimes abbreviated as "WST-8”. ).
  • the method of the present invention is not limited to the method using this specific compound.
  • the compound represented by the general formula (I) can be produced by the method disclosed in Japanese Patent No. 2757348.
  • the above-mentioned compounds are also highly water-soluble and produce formazan, which enables accurate and simple quantitative enzyme reaction measurements. Suitable for performing on flights.
  • the compound since the compound does not react with hemoglobin, accurate measurement is possible even in a measurement using a blood sample.
  • the term “measurement” should be interpreted in the broadest sense to include a measurement performed for the purpose of qualitative or quantitative determination, or detection by visual inspection or the like.
  • the measurement can be performed, for example, visually or using a measuring device.
  • a measuring device for example, an ELISA reader can be used.
  • coloring reagent used in the present invention an appropriate compound that can serve as a hydrogen ion transporter can be used.
  • various reagents are known as color-forming reagents, in the method of the present invention, 1-methoxy-5-methinolevanadinium methylsulfate (tomethoxy-5-methylphenazinium methylsulfa1: e, It is preferable to use Kishi PMS (commercially available from Dojin Chemical Research Laboratories).
  • 1-Methoxy-5-methylphenazine and methylsulfate are highly sensitive to phenazine methsulfate (PMS) used in the conventional formazan method (Fairbanks & Beutler, Blood, 20, 591, Compared to 1962), it is more resistant to light and suitable for diagnosis in the field.
  • PMS phenazine methsulfate
  • the method of the present invention is a method known as the formazan method (MTT / PMS method: 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-dibutane-2H tetrazolium ⁇ Bromide (MTT) And phenazine methosulfate (PMS), which is a coloring reagent, can be used.
  • MTT / PMS method 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-dibutane-2H tetrazolium ⁇ Bromide (MTT) And phenazine methosulfate (PMS), which is a coloring reagent, can be used.
  • MgCl 2 and NADP which are enzyme substrates
  • appropriate salts such as MgCl 2 and saponin for hemolysis can be added to the reaction solution, if necessary.
  • As the reaction solution for example, a 0.05M Tris buffer or a 0.05 buffer solution can be used.
  • the reaction solution and blood can be mixed in a microtube or in a well of a microplate.
  • blood collected from a subject may be used as a sample without pretreatment, and may be subjected to a pretreatment adopted by a force MMT method or the like before the reaction. After leaving the mixed solution for several minutes to several hours, stop the reaction and measure the color of the solution.
  • a method for terminating the reaction a method of lowering the mixed solution to 4 degrees or a method of adding 1. an aqueous hydrochloric acid solution may be employed.
  • an aqueous hydrochloric acid solution because the red color of hemoglobin is faded by the addition of the aqueous hydrochloric acid solution and the orange color of the formed formazan becomes clear.
  • the addition amount is, for example, about 10 ⁇ L when the reaction is performed on an 800 ⁇ L scale.
  • blood spotted on filter paper, coagulated blood, or a frozen blood sample can also be used. Measurements can be made qualitatively visually, which is suitable for field surveys. It is also possible to perform quantitative measurement by absorbance analysis.
  • Table 1 shows examples of reaction compositions for visual measurement assuming use in field surveys and for quantitative measurement using an ELISA reader and a 96-well microplate. Composition of reaction solution Quantitative measurement by qualitative measurement using ELISA reader for visual inspection for field test Standard method Economic method
  • a reagent containing the general formula (I) and a coloring reagent may be prepared in advance, and blood may be added thereto.
  • a reagent is provided, for example, in the form of a solution, but is convenient because it can be stored for a long time even at room temperature.
  • the general formula (I) and the coloring reagent can be provided in separate packaging forms, and can be provided together in one kit.
  • a reaction solution containing the general formula (I) and the coloring reagent can be prepared at the time of use and diagnosis can be performed immediately. It is desirable to combine a buffer solution for preparing a reaction solution with the kit.
  • WST-8 was used as the compound represented by the general formula (I), and 1-methoxy (PMS) was used as a coloring reagent.
  • reaction solution containing the following reagents was prepared as the reaction solution.
  • (D) Comparison between WST-8 / 1-Methoxy PMS method and MTT / PMS method The color development of the method (C) (WST-8 / 1-methoxy PMS method) and the MTT / PMS method were compared for the following 10 samples. The results are shown in FIG. Tubes 1 to 5 show the results of the WST-8 / 1-methoxy PMS method, and tubes 6 to 10 show the results of the MTT / PMS method. Tubes 1 and 2. Negative control before and 10 minutes after exposure to sunlight (reaction solution without blood only); Tubes 3 and 4. G6PD abnormalities before and after 10 minutes exposure to sunlight Negative control group for blood; tube 5.
  • the MTT / PMS method changed the two negative controls to false positives after only one minute exposure to sunlight (tubes 7 and 9).
  • the WST-8 / 1-methoxy PMS method showed no change after 5 minutes of exposure. After 10 minutes of exposure, a faint color developed in these controls (tubes 2 and 4), after which the color developed in proportion to the exposure time, but the WST-8 / 1-Methoxy PMS method was the MTT / PMS method. It is clear that it is more resistant to light when compared to.
  • the method of the present invention it is possible to accurately and easily determine whether or not the subject is a carrier of G6PD abnormality.
  • the method of the present invention has the simplicity of being operable even in the field, and enables accurate diagnosis even when blood from a subject is subjected to a test without pretreatment.

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Description

明 細 書 グルコース一 6—リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断方法 技術分野
本発明は、 水溶性テトラゾリゥム塩化合物を用いたグルコース一 6—リン酸脱 水素酵素異常症の保因の診断方法に関する。
背景技術
グルコース一 6—リン酸脱水素酵素異常症 （以下、 本明細書においてダルコ一 スー 6—リン酸脱水素酵素を 「G6PD」 と略し、 グルコース一 6—リン酸脱水素酵 素異常症を 「G6PD」 異常症と略す場合がある。 ） は遺伝子疾患の一つであり、 世 界で最もよく知られ、 かつ頻度の高い酵素異常症である。 熱帯諸国を中心に、 世 界ではおよそ 4億人が変異遺伝子の保有者と推測されている（Ruwende et al.， Nature, 376, 246, 1995； Ganzakowski et al. , American Journal of Human Genetics, 56, 294, 1995)。 G6PDはペントースリン酸回路の最初の段階でダルコ ース _ 6—リン酸を 6-ホスホダルコノラクトンに酸化すると同時に、補酵素 NADP+ を NADPHに還元する酵素で、 赤血球内酵素の 1つである。
G6PD異常症では、遺伝子異常により産生される G6PDは正常活性を有しておらず、 NADPHが十分に産生されない。そのため還元型ダルタチオン量が低下し、赤血球や ヘモグロビンの酸化防御能が低下し、 遺伝性非球状性溶血性貧血となる。 多くの G6PD異常症患者は臨床的には無症状であるが、 抗マラリア薬であるプリマキンの 投与などの誘因により暴露された際に急激な溶血性貧血発作をきたす。 プリマキ ンは、 三日熱マラリア感染の根絶療法薬として広く使用されており、 また、 熱帯 熱マラリァの生殖母体による伝播を防止するための薬としても使用されているた め、 熱帯諸国等において、 G6PD異常症の有無をあらかじめ診断することは重要で める ushii et al. , Japanese Journal of Parasitology, 43, 312, 1994) 0 こ のような理由から、 野外で簡便に診断を行うことができる方法の開発が求められ ている。
G6PD酵素遺伝子は、 X染色体長腕 （Xq28) に位置しており、 この酵素遺伝子に変 異が起きると様々な G6PD活性に異常が見られ、 新生児黄疸や急性溶血性貧血など を引き起こす。 G6PD異常症は伴性劣性遺伝形式をとる疾患で、 患者の大部分はへ ミ接合体の男性であるが、 父親のみならず母親からも子供に伝わる遺伝子疾患で ある。 そのため、片方の X遺伝子のみが異常であるへテロ接合体の女性、すなわち G6PD異常症の保因者の検出も必要である。 しかしながら、 G6PD異常症の保因者の 場合には健常者と同程度から半分以上の正常 G6PDを有しているため、 従来の診断 方法では保因者であるか否かを正確に特定することは不可能であった。このため、 保因者を正確に選別できる高感度な方法の開発が切望されていた。
G6PD異常症の診断として今日までに多くの方法が発表されている。 熱帯諸国等 での野外調查にも適応できる方法としては、蛍光スポット法 (Beutler, Blood, 28, 553, 1966； Beutler and Mitchell, Blood, 32, 816， 1968) 、 ホルマザン基質で ある 3- (4, 5-ジメチル- 2-チアゾリル）- 2， 5 -ジフヱニル- 2Hテトラゾリゥム ·プロ マイド（MTT)と発色試薬であるフエナジンメ トサルフェート（PMS)を使ったホルマ ザン法 （MTT/PMS法： Fairbanks and Beutler, Blood, 20, 591, 1962； Fuji i et al. , Acta Haematologica Japonica, 47, 185， 1984； Hirono et al. , Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 26, 1, 1998)など力 S知られて!/ヽる。 蛍光スポット法は、 標準血液検査のための国際委員会により標準スクリーン- ング法として推薦を受けた方法であるが、 G6PD異常症保因者の検出は極めて難し く、 Pujades et. al (Int. J. Hematol. , 69, 234, 1999) は、 この方法について 評価検討を行い、 12例全てのへテロ接合性の女性 G6PD異常症が正常として診断さ れたことを報告している。 MTTZPMS法は、 G6PD酵素で産生された NADPHとホルマザ ン基質である MTTを反応させ、 生じるホルマザンの発色を測定することにより、 G6PD酵素異常症診断を行うものであり、 電気の供給のない野外でも実施できる優 れた方法である。 しカ し、 MTTがへモグロビンと非特異的に反応して暗褐色から赤 色に変化するため、 血液を前処理せずに検体として用いるとホルマザンの発色を 正確に測定することができないという問題がある。 この問題を解决するため、
DEAE - Sephadexケル法 (Hirono et. al. , Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 26, 1， 1998) など、 血液と MTTを直接反応させないようにするため の種々の改良法が研究されているが、 この改良法を用いても G6PD異常症の保因者 の検出は極めて困難であつた。 発明の開示
本発明の課題は、 G6PD異常症の保因者であるか否かを正確かつ簡便に判定可能 な診断方法を提供することにある。 特に、 野外でも操作可能な簡便性を備えてお り、 かつ被験者から採取した血液を前処理することなく試験に供した場合にも正 確な診断を可能にする G6PD異常症の保因診断方法を提供することが本発明の課題 本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 ホルマザン基質と して特許第 2 7 5 7 3 4 8号に開示された水溶性テトラゾリゥム塩化合物を用い たホルマザン法を行いることにより、 被験者からの血液を前処理することなく、 かつ極めて簡便かつ高感度に G6PD異常症の保因の有無を判定できることを見出し た。 本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。 ' すなわち、 本発明は、 グルコース一 6—リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断 方法であって、 下記の工程：
(A) 下記の一般式 （I ) ：
Figure imgf000006_0001
(式中、 R1および R2はそれぞれ独立に水素原子、 ニトロ基、 シァノ基、 力ルポ キシル基、 またはハロゲンを示し、 R 3はアルキル基またはアルコキシル基を示 し、 Mはアルカリ金属またはアンモニゥムを示す)
で表される化合物及び発色試薬を含有する反応液と被験者から採取した血液とを 混合する工程、 および
(B) 前記工程 (A) で得られた混合液の発色を測定する工程
を含む方法を提供するものである。
本発明の好ましい態様によれば、 R1および R 2がそれぞれ二トロ基であり、 R 3がメ トキシ基である上記の方法、 及ぴ Mがナトリゥムである上記の方法が提供 される。 さらに好ましい態様として、 一般式 （I) で表される化合物が 2— (2 —メ トキシ一 4—ニトロフエ二ノレ) 一 3— (4一二トロフエ二ノレ） - 5— ( 2， 4 _ジスルホフエニル) ― 2 Hテトラゾリゥムモノナトリゥム塩である上記方 法；発色試薬が 1—メ トキシー 5—メチルフエナジニゥム ·メチルサルフェート である上記の方法；一般式 (I) で表される化合物が 2— (2—メ トキシー 4一 ニトロフエ二ノレ） 一 3— （4一二トロフエ二ノレ） - 5 - (2, 4—ジスノレホフェ ニル) _ 2Hテトラゾリゥムモノナトリゥム塩であり、 かつ発色試薬が 1—メ ト キシー 5—メチルフエナジニゥム ·メチルサルフエ一トである上記方法；及び被 験者から採取した血液を前処理することなく上記反応液と混合する上記の方法が 提供される。 また、 別の観点からは、 グルコース— 6—リン酸脱水素酵素異常症の保因の診 断のための試薬、 好ましくは溶液の形態の試薬であって、 上記一般式 （I ) で表 される化合物と発色試薬とを含む試薬が本発明により提供される。 特に好ましい のは、 一般式 （I ) で表される化合物が 2— （2—メトキシー4一二トロフエ二 ノレ） 一 3— ( 4—二トロフエ二ノレ） 一 5— （2， 4一ジスノレホフヱ二ノレ） 一 2 H テトラゾリゥムモノナトリウム塩であり、 発色試薬が 1ーメ トキシー 5—メチル フヱナジニゥム 'メチルサルフェートである上記試薬である。 また、 グルコース 一 6—リジ酸脱水素酵素異常症の保因の診断のためのキッ卜であって、 上記一般 式（ I )で表される化合物と発色試薬とを含むキットも本発明により提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 血液試料と WST - 8/1 -メ トキシ PMS反応液の混合後の溶液を示した図 である。 図中、 上から混合後 15分、 60分、 およぴ 120分の結果を示す。
第 2図は、 WST- 8/1 -メトキシ法 (本発明) と MTT/PMS法の光感受性を比較した結 果を示した図である。
第 3図は、第 2図に示したサンプルの 450nmで吸光度を測定した結果を示した図 である。 発明の実施するための最良の形態
本発明の方法は、 G6PD異常症の保因の診断方法であって、 一般式 （I ) で表さ れる化合物と発色試薬とを含有する反応液、 及び被験者から採取した血液を混合 し、 得られた混合液の発色を測定する工程を含むことを特徴としている。
本明細書において、 「保因」 の用語は女の 2本の X染色体のうちの一方に存在 する G6PD遺伝子が正常であり、 もう一方の X染色体上に存在する G6PD遺伝子が G6PD異常症に闋与する異常を有することを意味している。また、 「保因」の語は、 G6PD異常症を全く発病していない場合のほ力 軽い症状を示す兆候性保因を含め て最も広義に解釈する必要がある。 本発明の方法は、 被験者が G6PD異常症の保因 者であるか否かを簡便かつ正確に判定できる方法であり、 被験者の血液を試料と して G6PDの活性を測定する工程を含んでいる。
—般式 （I ) において、 R 1および R 2は同じでも異なっていてもよい。 本明細 書においてハロゲンとはフッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 または白ゥ素原子を 意味する。 R 1として最も好ましいのはニトロ基であり、 R 2として最も好ましい のはニトロ基である。 R 3で表されるアルキル基は直鎖状又は分枝鎖状のいずれ でもよく、 例えば、 炭素数 1から 6程度、 より好ましくは炭素数 1から 4程度の アルキル基を用いることができる。 より具体的には、 メチル基、 ェチル基、 n— プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、ィソプチル基、 s e c—プチル基、 t e r t—ブチル基などを挙げることができる。
R 3で表されるアルコキシル基は直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよく、 例え ば、 炭素数 1から 6程度、 より好ましくは炭素数 1から 4程度のアルコキシル基 を用いることができる。 より具体的には、 メ トキシ基、 ェトキシ基、 プロポキシ 基、 ィソプロポキシ基、 ブトキシ基、 ィソプトキシ基、 t e r tーブトキシ基な どを挙げることができる。 R 3として最も好ましいのはメ トキシ基である。 で 表されるアルカリ金属としては、 例えば、 リチウム、 ナトリウム、 カリウムなど を挙げることができる。 Mはまたアンモニゥムでもよい。 Mとして最も好ましい のはナトリゥムである。
本発明で用いられる水溶性テトラゾリゥム化合物として最も好ましいものは、
2一 ( 2—メ トキシー 4一二トロフエニル) - 3 - ( 4一二トロフエ二ノレ） - 5 - ( 2， 4 _ジスルホフエニル） _ 2 Hテトラゾリゥムモノナトリゥム塩（以下、
「WST - 8」 と略称する場合がある。 ） である。 もっとも、 本発明の方法はこの特定 の化合物を用いる方法に限定されることはない。
上記一般式 （I ) で表される化合物は特許第 2 7 5 7 3 4 8号に開示された方 法などにより製造することができる。上記化合物は、既に開示されているとおり、 産生されるホルマザンも高度に水溶性であり定量的な酵素反応測定を正確かつ簡 便に行うのに適している。 また、 該化合物はヘモグロビンと反応しないため、 血 液サンプルを用いた測定においても正確な測定が可能である。
本明細書において 「測定」 の用語は定性もしくは定量の目的のために行われる 測定、 または視認などによる検出を含む意味で最も広義に解釈しなければならな い。 測定は、 例えば視認または測定機器を使って行うことができ、 測定機器とし ては例えば ELISAリーダーなどを用いることができる。
本発明で用いられる発色試薬としては、 水素イオンの輸送体となり得る適当な 化合物を用いることができる。 発色試薬としては種々のものが知られているが、 本発明の方法では 1ーメ トキシー 5—メチノレフヱナジニゥム ·メチルサルフヱ一 卜（トメ 卜キシ- 5-methylphenazinium methylsulfa1:e、トメ 卜キシ PMSとして株式 会社同仁化学研究所から市販されている）を用いることが好ましい。 1—メ トキシ 一 5 _メチルフエナジニゥム ·メチルサルフエ一トは、 従来のホルマザン法に用 いられてきたフエナジンメ トサルフェート（PMS)が光感受性が強い（Fairbanks & Beutler, Blood, 20, 591, 1962)のに比較して、 光に対して抵抗性があり、 野外 での診断に適している。
本発明の方法は、 ホルマザン法として周知の方法 （MTT/PMS法：基質として 3- (4, 5-ジメチル- 2-チアゾリル） -2, 5 -ジブ工ニル- 2H テトラゾリゥム《ブロマイ ド (MTT)と発色試薬であるフエナジンメ トサルフェート（PMS)を用いる） に準じて 行うことができる。 反応液には、酵素基質である G-6- P及ぴ NADPのほか、必要に応 じて MgCl2などの適宜の塩類や溶血のためのサポニンなどを加えることができる。 反応液として、例えば 0. 05Mトリス緩衝液または 0. 05へぺス緩衝液などを用いるこ とができる。
本発明の方法の原理を以下のスキームに示す （スキーム中、 発色試薬として 1 -methoxy PMS, 一般式 （I ) の化合物として WST-8を用いた場合を示す） 。 G6PD 酵素により生成された NADPHの水素イオンが水素イオンの輸送体である発色試薬 ( 1 -methoxy PMS) の存在下で WST-8をホルマザンに変換する。 このホルマザン の発色を測定することにより G6PD酵素活性を測定することができる。 · G-6-PD
Figure imgf000010_0001
NADP NADPH
Formazan
Figure imgf000010_0002
WST-8
(orange color)
1-methoxy P S
本発明の方法において、 反応液と血液との混合はマイクロチューブ内またはマイ クロプレートのゥエル内などで行うことができる。 本発明の方法では、 被験者か ら採取した血液を前処理せずに試料として用いることができる力 MMT法などで採 用されている前処理を施してから反応に供してもよい。 混合した溶液を数分から 数時間放置した後、 反応を停止して溶液の発色を測定する。 反応の停止方法とし ては、混合後の溶液を 4度に下げる方法、または 1. ON塩酸水溶液を添加する方法 などを採用すればよい。 塩酸水溶液の添加によりへモグロビンの赤色が退色し、 生成ホルマザンの橙色が明瞭となるため、塩酸水溶液を添加することが好ましい。 添加量は、 例えば反応を 800 μ Lスケールで行った場合には 10 μ L程度である。 本発明の方法では、 ろ紙にスポットされた血液や凝固した血液、 あるいは凍結し た血液試料を用いることもできる。 測定は定性的には視認で行うことが可能であ り、 これは野外調査に適している。 また、 吸光度分析により定量的測定を行うこ とも可能である。野外調査での使用を想定した視認による測定、およひ 'ELISAリー ダ一と 96穴マイクロプレートを用いた定量的な測定のための反応組成の例を表 1 に示す。 反応液の組成 野外試験用の視認に ELISA readerに よる定性的測定 よる定量的測定 標準法 経済的方法
800-μ] scale 400-μ1 scale 200-μ1 scale
水 760 μΐ 380 μΐ 190 μΐ
基質混合液 * 20 10 5
色素混合液 # 20 10 5
全血 5 2.5 1-1.5
* 100 niM MgCl2; 50 πιΜ G- 6- P及び 4 mM NADP (400 mM Tris- HC1緩衝液（pH 7. 2-7. 5) 中）
# 7. 5 mM WST-8及ぴ 0. 3 mM トメ トキシ PMS (水中)
また、 本発明の方法は、 試料として用いる血液に特別な前処理を必要としない ため、 一般式 （I ) 及び発色試薬を含む試薬をあらかじめ用意しておき、 そこに 血液を添加してもよい。 このような試薬は、 例えば溶液形態で提供されるが、 室 温でも長期間保存できるので便利である。 また、 一般式 （I ) 及ぴ発色試薬をそ れぞれ別の包装形態としておき、 それらを 1つのキットにまとめて提供すること もできる。 用時に一般式 （I ) 及び発色試薬を含む反応液を調製して直ちに診断 を行うことができるので、 このような形態も好ましい。 キットには反応液の調製 のための緩衝液を組み合わせておくことが望ましい。
実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。 本実施例においては一般式 ( I ) で表される 化合物として WST-8を用い、 発色試薬として 1 -メ トキシ（methoxy) PMSを用いた。
例 1
(A)試薬と試料 5mMの WST - 8と 0. 2mMの 1 -メ トキシ PMSが 0. ΙδΜ NaClに溶解されている市販の製 品 （株式会社同仁化学研究所） を使用した。 G6Pと NADPはべ一リンガー製、 NADPH はシグマ製を用いた。 血液試料として、 正常血液 (8. 0 IU/g Hb)と G6PD欠損症の血 液 （ビバリーヒル型； 0. 0 IU/g Hb) を日本人の提供者から得た。
(B)反応液の調製
反応液として以下の試薬を含む反応液を調製した。
(1) 5mM MgCl2および 0. 1%サポニンを含んだ 0. 05Mトリス緩衝液（あるいは 0. 05M へぺス緩衝液）、 pH7. 2-7. 5、 (2) 2. 5 mM G- 6- Pと 0. 2 mM NADP、 （3) WST- 8/1 -メ ト キシ PMS混合液。 WST- 8/1-メ トキシ PMS混合液は、 4°Cでは 3ヶ月、 - 20°Cでは 1年 間安定であり、 他の試薬は 4°Cで数ケ月安定であった。
(0視認による定性的測 結果
下記サンプルについて、 標準法の 800 x Lスケールで反応させた。 反応はマイク 口チューブで室温で行った。 1 . 血液無添加の陰性対照区； 2 . 基質 （G6P) を抜 いて血液を加えた陰性対照区； 3 . G6PD異常症血液； 4〜6 . G6PD異常症血液と 正常血液をそれぞれ 3： 1、 1： 1、 1： 3の割合で混ぜた血液 （これらは保因者の血 液に相当する） ；および 7 .正常血液。発色を写真撮影した結果を第 1図に示す。 正常血液 （第 1図、 チューブ 7 ) では室温反応で 1 5分後には強い橙色の発色 が認められた。 この橙色は、 二つの陰性対照区、 すなわち正常血液を基質無しで 反応させたもの (チューブ 2 ) および G6PD欠損血液 (チューブ 3 ) に見られるピ ンク色とは明らかに区別できた。正常血液では、約 1時間半後に最大値を示すが、 二つの陰性対照区およぴ別の陰性対照区である血液抜きの反応溶液では 2時間反 応させても全く発色は認められなかった。 これら 3つの対照区では、 2 4時間後 も全く発色が見られなかった。 —方、 25 - 50%の活性を有するサンプル (チュー ブ 4、 5 ) ではゆっくりとした発色が起こり、 視認によっても正常血液の発色と の区別が可能であった。
(D) WST- 8/1 -メ トキシ PMS法と MTT/PMS法の比較 下記の 10サンプルについて上記（C)の方法（WST- 8/1-メトキシ PMS法）と MTT/PMS 法の発色を比較した。 結果を第 2図に示す。 チューブ 1 ~ 5は WST-8/1-メ トキシ PMS法、チューブ 6〜 1 0は MTT/PMS法の結果を示す。チューブ 1及び 2.太陽光に 暴露する前と 10分暴露後の陰性対照区 （血液無添加の反応液のみ） ；チューブ 3 および 4 . 太陽光に暴露する前と 10分暴露後の G6PD異常症血液の陰性対照区；チ ユーブ 5 .太陽光に暴露せずに 10分反応させた正常血液の陽性対照区；チューブ 6 および 7 ·太陽光に暴露する前と 1分暴露後の陰性対照区 （血液無添加の反応液の み） ；チューブ 8および 9 . 太陽光に暴露する前と 1分暴露後の G6PD異常症血液の 陰性対照区；チューブ 1 0 .太陽光に暴露せずに 60分反応させた正常血液の陽性対 照区。
第 2図に示すように、 MTT/PMS法ではわずか 1分太陽光に暴露するのみで、二つ の陰性対照区が偽陽性に変化した （チューブ 7と 9 ) 。 これに対して、 WST-8/1- メトキシ PMS法では 5分の暴露では全く変化が認められなかった。 10分の暴露では これらの対照区にかすかな発色が起こり （チューブ 2と 4 ) 、 以後暴露時間に比 例して発色が進んだが、 WST- 8/1-メ トキシ PMS法は MTT/PMS法に比較すると光に対 してより抵抗性を持つことが明らかである。
(E)定量的測定結果
定量的測定のために、 視認による定性的測定で用いた混合液から 100〜 200 /i L を取り、 450nmで測定した。 ブランクとして、基質溶液を抜いた反応液に 5 Lの血 液を添加し、 同様に 450nmで測定した。 また、 種々の濃度の NADPH液をブランクに 加え、 直ちに 450nmで測定して標準曲線を得た。 値は 5回の繰り返し実験の平均値 を示した。 酵素活性と吸光度との関係を示すダラフを第 3図に示した。 反応 60分 までは吸光度は直線的に増大した。 2時間反応させた場合、 6〜8 IUを示すサンプ ル （75%程度の活性） では最大値を超えたが、 25- 50%の活性 （2〜4 IU)では中間 値を示した。
これらの結果から、 WST - 8/1-メ トキシ PMS法で G6PD酵素の活性を定量的に測定 することが可能であり、 健常人よりも若干低下した G6PD酵素活性を与える保因者 も本発明の方法により確実に判定できることが示された。 産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 G6PD異常症の保因者であるか否かを正確かつ簡便に判 定可能である。 本発明の方法は野外でも操作可能な簡便性を備えており、 かつ被 験者からの血液を前処理することなく試験に供した場合にも正確な診断が可能で ある。

Claims

請求 の 範 囲
1. グルコース一 6—リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断方法であって、 下記 の工程：
(A) 下記の一般式 （I) ：
Figure imgf000015_0001
(式中、 R1および R2はそれぞれ独立に水素原子、 ニトロ基、 シァノ基、 カルボ キシル基、 またはハロゲンを示し、 R 3はアルキル基またはァルコキシル基を示 し、 Mはアルカリ金属またはアンモニゥムを示す）
で表される化合物及び発色試薬とを含有する反応液と被験者から採取した血液と を混合する工程、 および
(B) 前記工程 （A) で得られた混合液の発色を測定する工程
を含む方法。
2. ； R1および R2がそれぞれ-トロ基であり、 R3がメトキシ基である請求の範 囲第 1項に記載の方法。
3. Mがナトリゥムである請求項 2に記載の方法。
4. 一般式（I) で表される化合物が 2— （2—メ トキシー 4一二トロフエニル） 一 3— (4—ニトロフエ-ル） 一5— （2， 4一ジスルホフエニル） 一 2Hテト ラゾリゥムモノナトリゥム塩であり、 発色試薬が 1—メ トキシー 5—メチルフエ ナジニゥム ·メチルサルフェートである請求の範囲第 1項に記載の方法。
5. 被験者から採取した血液を前処理することなく上記反応液と混合する請求の 範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載の方法。
6. グルコース一 6—リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断のための試薬であつ て、 請求の範囲第 1項に記載の一般式 （I) で表される化合物と発色試薬とを含 む試薬。
7. 溶液の形態の請求の範囲第 1項に記載の試薬。
8. 一般式 （I) で表される化合物が 2_ (2—メ トキシー 4_ニトロフエニル） 一 3_ (4—二トロフエニル） 一5— (2， 4—ジスルホフエニル） 一 2Hテト ラゾリゥムモノナトリゥム塩であり、 発色試薬が 1—メトキシー 5—メチルフエ ナジニゥム ·メチルサルフェートである請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の試 薬。
9. グルコース _ 6 -リン酸脱水素酵素異常症の保因の診断のためのキットであ つて、 請求の範囲第 1項に記載の一般式 (I) で表される化合物と発色試薬とを 含むキット。
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