CN115078341B - 一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂及其应用 - Google Patents

一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的试剂及其应用，属于生物分析检测技术领域；所述用于检测葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的试剂包括独立包装的试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括NP‑40。本发明试剂R1中的NP‑40具有溶血功能，能够溶解脂质破坏红细胞。采用本发明的试剂检测葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶时，无需采用溶血剂或纯化水对全血样本预先进行溶血处理，有效解决了现有试剂仅能用于检测预先经过溶血处理的全血样本的技术问题，简化了操作，避免了溶血处理对测定过程的干扰，提高了测定结果的准确性。

Description

一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂及其应用。
背景技术
G6PD是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的简称，是一种存在于人体红细胞内，协助葡萄糖进行新陈代谢的一种重要的酶类，在这个代谢过程中会产生NADPH（还原型辅酶Ⅱ）以保护红细胞免受氧化物质的威胁。G6PD缺乏时，若身体接触到具有氧化性的特定物质或服用了这类药物，红血球就容易被破坏而发生急性溶血反应。此外，G6PD对于磷酸戊糖旁路至关重要，而该途径可为髓鞘脂酸形成提供NADPH。
G6PD缺乏症俗称蚕豆病，是遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病。
目前，市场上有很多筛查G6PD缺乏症的试剂。筛查过程中需要对待测样本（全血）预先进行溶血处理，具体是将待检全血和溶血剂，摇匀静置15~30min破坏红细胞后，再进行测试；或者是将待检全血和纯水混合后，充分摇匀15~30 min才能充分溶解。这个过程不仅增加了检测耗时，而且部分葡萄糖-6-磷酸脱酶会随时间推移而失活，影响测试结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂及其应用，采用本发明的试剂检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶无需溶血剂和溶血处理，使用纯化水混匀全血样本即可，本发明能够摆脱溶血环境的干扰，能够提高测试结果的准确性。
本发明提供了一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂，包括独立包装的试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下浓度的组分：40~60mmol/LTris-HCl缓冲液、8~11g/LNaCl和0.06~0.1g/L NP-40；所述试剂R1的pH值为8.0~8.2；
所述试剂R2包括以下浓度的组分：40~60mmol/LMOPS缓冲液、1.5~2.5g/LMgCl2.6H2O、0.3~0.8g/L防腐剂、2.0~2.8g/L G6P和2~2.5g/L NADP；所述MOPS缓冲液的pH值为5.5~6.1；
所述试剂R2的pH值为5.0~6.5。
优选的，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8~8.4。
优选的，所述试剂R1的pH值为8.1。
优选的，所述试剂R2还包括海藻糖；所述试剂R2中海藻糖的浓度为3~8g/L。
优选的，所述试剂R2的pH值为5.5。
优选的，所述防腐剂包括NaN3。
本发明还提供了上述方案所述的试剂在制备检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的产品中的应用。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法，包括以下步骤：
对全血进行离心，收集下层组分；
将所述下层组分复溶于水中得到全血样本；
将上述方案所述试剂中的试剂R1、全血样本和上述方案所述试剂中的试剂R2依次加样到全自动生化分析仪中，进行分析，读取检测结果；
所述R1、全血样本和R2的体积比为180:2:60。
优选的，所述离心的转速为2000~4000rpm。
优选的，所述下层组分和水的体积比为1:50。
本发明提供了一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂，包括独立包装的试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下浓度的组分：40~60mmol/LTris-HCl缓冲液、8~11g/LNaCl和0.06~0.1g/L NP-40；所述试剂R1的pH值为8.0~8.2；所述试剂R2包括以下浓度的组分：40~60mmol/LMOPS缓冲液、1.5~2.5g/LMgCl2.6H2O、0.3~0.8g/L防腐剂、2.0~2.8g/L G6P和2~2.5g/L NADP；所述MOPS缓冲液的pH值为5.5~6.1；所述试剂R2的pH值为5.0~6.5。本发明试剂R1中的NP-40具有溶血功能，能够溶解脂质破坏红细胞。采用本发明的试剂检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶时，无需采用溶血剂对全血样本预先进行溶血处理，使用纯化水混匀全血样本即可进行检测，有效解决了现有试剂仅能用于检测预先经过溶血处理的样本的技术问题，简化了操作，缩短了检测时间，避免了溶血处理对测定过程的干扰，提高了测定结果的准确性。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂，包括独立包装的试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下浓度的组分：40~60mmol/LTris-HCl缓冲液、8~11g/LNaCl和0.06~0.1g/L NP-40；所述试剂R1的pH值为8.0~8.2；
所述试剂R2包括以下浓度的组分：40~60mmol/LMOPS缓冲液、1.5~2.5g/LMgCl2.6H2O、0.3~0.8g/L防腐剂、2.0~2.8g/L G6P和2~2.5g/L NADP；所述MOPS缓冲液的pH值为5.5~6.1；
所述试剂R2的pH值为5.0~6.5。
在本发明中，所述试剂R1和R2的体积比优选为3:1。
在本发明中，所述试剂R1优选的包括以下浓度的组分：50mmol/LTris-HCl缓冲液、9g/L NaCl和0.08g/L NP-40。在本发明中，所述试剂R1的pH值优选为8.1。在本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值优选为8~8.4，更优选为8.2。在本发明中，所述NaCl用以维持体系中的离子；所述NP-40作为溶血剂，能够溶解脂质破坏红细胞，另外，在试剂R2添加前便可完成溶血过程，有效解决了普通试剂需要手动添加溶血剂的复杂耗时操作以及可能影响测值结果的现象。
本发明利用G-6-PD在NADP存在条件下催化葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，在340nm波长处测NADPH的生成速率来推算G-6-PD的浓度。然而，NADP在酸性环境中更稳定，有利于其运输和长期保存，但NADP在酸性环境中活性较差，不能充分参与反应，这便与其长期保存的最适pH产生矛盾。因而本发明将NADP放在试剂R2中，将pH调节为酸性，维持其稳定性，而试剂R1中pH调节为碱性，通过设定试剂R1和R2的体积比为3:1，使整个试剂反应时，处于碱性的环境，以发挥NADP的最大酶活性。
在本发明中，所述试剂R2优选的包括以下浓度的组分：50mmol/LMOPS缓冲液、2g/LMgCl2.6H2O、0.5g/L防腐剂、2.5g/L G6P和2.3g/L NADP；所述MOPS缓冲液的pH值优选为5.8~6.0；在本发明中，所述试剂R2的pH值优选为5.5；所述试剂R2优选的还包括海藻糖，所述海藻糖作为稳定剂，以提高试剂稳定性；所述试剂R2中海藻糖的浓度优选为3~8g/L，更优选为5g/L。在本发明中，所述MgCl2.6H2O的加入有利于增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性；所述G6P作为底物。在本发明中，所述防腐剂优选的包括NaN3。
本发明还提供了上述方案所述的试剂在制备检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选的包括试剂盒。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法，包括以下步骤：
对全血进行离心，收集下层组分；
将所述下层组分复溶于水中得到全血样本；
将上述方案所述试剂中的试剂R1、全血样本和上述方案所述试剂中的试剂R2依次加样到全自动生化分析仪中，进行分析，读取检测结果；
所述R1、全血样本（S）和R2的体积比为180:2:60。
在本发明中，所述离心的转速优选为2000~4000rpm，更优选为2500~3500rpm，最优选为3000rpm。
在本发明中，所述下层组分和水的体积比优选为1:50。
在本发明中，所述试剂R1和全血样本的加样间隔时间优选为60s；所述全血样本和试剂R2的加样间隔时间优选为4min。
在本发明中，所述全自动生化分析仪优选为东芝2000全自动生化分析仪。在本发明中，所述分析的方法优选为速率法；所述分析的主波长优选为340nm；所述分析的副波长优选为380nm；所述分析的加样量优选为：R1 180μl、S 10μl 和R2 60μl；所述分析的反应类型优选为上升反应；所述分析的时间优选为5min；所述分析的读点数优选为22-31。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂制备
本发明实施例的主要试剂的配制如下：
试剂R1：50mmol/LTris-HCl缓冲液、0.9%的NaCl和0.08g/L的NP-40，pH为8.2。
试剂R2：50mmol/L MOPS缓冲液、2.00g/L MgCl2.6H2O、2.35g/LNADP、2.5g/LG6P、0.5%的保护剂以及0.5g/L的防腐剂。
试剂1：
1、称量50mmol/L的Tris配制缓冲液，调pH为8.2±0.2；
2、添加NaCl使其浓度为0.9%；
3、添加0.08g/L的NP-40。
试剂2：
1、称量50mmol/L的MOPS配制缓冲液，调pH为5.8±0.3；
2、添加2g/LMgCl2.6H2O搅拌至溶解；
3、添加2.5g/LG6P搅拌至溶解；
4、添加2.35g/L的NADP搅拌至溶解；
5、添加5g/L海藻糖搅拌至溶解；
6、添加0.5g/L的NaN3；
7、最后调pH至5.5。
需要注意的是，在配制试剂R2的过程中，添加缓冲原料后必须将pH调至酸性，否则也会影响NADP的稳定性。
对比例1
对比例1与实施例1相比，对比例1试剂R1中未添加表面活性剂NP-40。
试剂R1：
1、称量50mmol/L的Tris配制缓冲液，调pH为8.2；
2、添加NaCl使其浓度为0.9%。
试剂R2：
1、称量50mmol/L的Tris配制缓冲液，调pH为5.5；
2、添加2g/LMgCl2.6H2O搅拌至溶解；
3、添加2.5g/LG6P搅拌至溶解；
4、添加2.35g/L的NADP搅拌至溶解；
5、添加5g/L海藻糖搅拌至溶解；
6、添加0.5g/L的NaN3；
7、最后调pH至5.5。
对比例2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂制备
与实施例1相比，试剂2的pH不一致，具体操作如下，
试剂R1：
1、称量50mmol/L的Tris配制缓冲液，调pH为8.2±0.2；
2、添加NaCl使其浓度为0.9%；
3、添加0.08g/L的NP-40。
试剂R2：
1、称量50mmol/L的MOPS配制缓冲液，调pH为7.9±0.3；
2、添加2g/LMgCl2.6H2O搅拌至溶解；
3、添加2.5g/LG6P搅拌至溶解；
4、添加2.35g/L的NADP搅拌至溶解；
5、添加0.5g/L的NaN3；
6、添加5g/L海藻糖搅拌至溶解；
7、最后调pH至7.9。
实施例2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂制备
与实施例1相比，试剂2不添加海藻糖，具体操作如下，
试剂R1：
1、称量50mmol/L的Tris配制缓冲液，调pH为8.2±0.2；
2、添加NaCl使其浓度为0.9%；
3、添加0.08g/L的NP-40。
试剂R2：
1、称量50mmol/L的MOPS配制缓冲液，调pH为5.8±0.3；
2、添加2g/LMgCl2.6H2O搅拌至溶解；
3、添加2.5g/LG6P搅拌至溶解；
4、添加2.35g/L的NADP搅拌至溶解；
5、添加0.5g/L的NaN3；
6、最后调pH至5.5。
实施例3 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂的性能验证
检测仪器：东芝2000全自动生化分析仪；
检测参数见表1。
表1 检测参数
Figure DEST_PATH_IMAGE001
1）与对比例1样本测值比对
实施例1无需对全血样本进行处理，全血样本直接放入生化分析仪样本仓中作为可测试样本。
对比例1和九强试剂需要进行样本预处理：
对比例1样本处理步骤：全血样本4℃下以3000r/min离心5min后去掉上清，吸取10μl下层全血，加入500μl纯化水混匀溶解，约10min后得到可测试样本。
九强试剂（购买自：北京九强生物技术股份有限公司）样本处理步骤：全血样本4℃下以3000r/min离心5min后去掉上清，吸取10μl下层全血，加入500μl溶血剂混匀溶解，约15min后得到可测试样本。
以体积比计，本发明（即R1中含NP40的）反应体系为：R1：S：R2=180:2:60，
而对比例和九强试剂的反应体系为：R1：S：R2=180:10:60。
全自动生化分析仪测试样本的步骤为：
根据参数表设置好参数，试剂R1和R2、以及样本S分别放置于生化分析仪对应位置上，设置好之后点击开始，生化分析仪会按照程序自动吸样，反应，然后读取结果。
首先仪器会按180μl吸取R1试剂，约60s会按2μl吸取S，经过4min后，按60μl吸取R2试剂，5min后反应结束，仪器自动呈现出样本测值结果参见表2。
表2
Figure 819409DEST_PATH_IMAGE002
根据该实验结果，实施例1在R1中添加NP-40测样本几乎与九强试剂测试的结果相吻合。而未添加的由于不能很好的破坏血细胞，不能准确测试该酶的值。
2）稳定性检测：
加热稳定性操作步骤：试剂放入37℃恒温干燥箱前的检测数据作为第一天的数据。
放入恒温干燥箱，第3、5、7、10、12、14天各检测一次，对比结果
要求：37℃偏差小于10%
实验数据如下：
质控品靶值：2400
校准曲线K因子为209559。
检测结果参见表3。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
长期稳定性检测操作步骤：将试剂密封保存至4℃的环境中，第1、2、4、5、7、9、10、11、12月各检测一次。
要求：偏差小于10%。
实验数据如表4所示
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE006
结论：就长期稳定性的性能检测，实施例1和实施例2的稳定性远优于对比例2，然后实施例1的稳定性略优于实施例2，说明试剂的pH对该试剂的稳定起到决定性作用，另外，保护剂可以提高试剂的稳定性。
3）线性
操作步骤：将高浓度样本稀释成六个浓度梯度，由于样本浓度过高，将之前设置为209559的K值改为4109，即缩小51倍，用实施例1试剂测试线性样本，结果如表5所示：
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE007
由实验结果得出，线性相关性良好，R²>0.9900，相对偏差也在要求范围内。
4）精密度
实施例1所述试剂盒使用两个不同浓度的质控品，每个浓度测18次，评估试剂盒的重复性，实验结果如表6所示：
表6
浓度一 浓度二
1 1345 2410
2 1311 2424
3 1304 2417
4 1357 2451
5 1303 2447
6 1386 2471
7 1344 2416
8 1321 2397
9 1325 2418
10 1347 2428
11 1318 2437
12 1397 2432
13 1395 2416
14 1367 2422
15 1306 2433
16 1322 2450
17 1341 2419
18 1350 2405
均值 1341.06 2427.39
SD 29.47 17.94
CV 2.20% 0.74%
结论：试剂盒的批内重复性分别为2.20%和0.74%.，符合标准要求。
5）准确度评估
用产品配套的质控品作为样本使用实施例1试剂进行检测，每个样本测试5次，测试结果如表7所示：
表7
质控1 质控2
靶值 1938 2400
1 1926 2397
2 1937 2413
3 1918 2408
4 1947 2411
5 1950 2379
均值 1936 2401
偏差 -0.10% 0.06%
通过实验结果可以看出，实施例1试剂测试的准确度高，偏差很小。
6）抗干扰实验
在同一份人样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测试。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率，实验结果表明血红蛋白、胆红素、甘油三酯以及维生素C的加入量不超过以下含量（表8）时，对检测结果无显著干扰（回收率在90%~110%之间）。
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE008
7）空白吸光度
以蒸馏水为样本进行检测，测试后所得试剂空白吸光度为0.0138。
由以上结果可以得出，本发明不需溶血剂高效准确测试病人的G6PD，同时具有稳定性好、灵敏度高、线性范围广成本低等优势，方便医院检测人类葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种非诊断目的的检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法，包括以下步骤：
对全血进行离心，收集下层组分；
将所述下层组分复溶于水中得到全血样本；
将试剂R1、全血样本和试剂R2依次加样到全自动生化分析仪中，进行分析，得到检测结果；
所述R1、全血样本和R2的体积比为180:2:60；
所述试剂R1包括以下浓度的组分：40~60mmol/L Tris-HCl缓冲液、8~11g/L NaCl和0.06~0.1g/L NP-40；所述试剂R1的pH值为8.0~8.2；
所述试剂R2包括以下浓度的组分：40~60mmol/L MOPS缓冲液、1.5~2.5g/L MgCl2·6H2O、0.3~0.8g/L防腐剂、2.0~2.8g/L G6P和2~2.5g/L NADP；所述MOPS缓冲液的pH值为5.5~6.1；所述试剂R2的pH值为5.0~6.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8~8.4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂R1的pH值为8.1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂R2还包括海藻糖；所述试剂R2中海藻糖的浓度为3~8g/L。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述试剂R2的pH值为5.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述防腐剂包括NaN3。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为2000~4000rpm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下层组分和水的体积比为1:50。
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