JPS6121546B2

JPS6121546B2 -

Info

Publication number: JPS6121546B2
Application number: JP9389680A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Midorikawa; Hideo Motonaga; Masahiro Naito
Original assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK
Current assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK
Priority date: 1980-07-11
Filing date: 1980-07-11
Publication date: 1986-05-27
Also published as: JPS5721352A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はコリンエステラーゼ活性測定のための
新規基質及びその基質を用いるコリンエステラー
ゼの活性測定方法に関する。コリンエステラーゼ（以下Ch―Ｅと記す）は
コリンエステルをコリンと有機酸とに加水分解す
る酵素の総称である。生体内には、性質の異なる２つのCh―Ｅが存
する。その１つは真性Ch―Ｅと呼ばれる赤血
球、神経系、筋肉等に含まれており、アセチルコ
リン又はアセチル―β―メチルコリンを特異的に
分解する。他の１つはプソイドCh―Ｅとよばれ
血清、肝臓、膵臓に含まれており、ベンゾイルコ
リンを特異的に分解し、ブチルコリンのような比
較的炭素鎖の長い脂肪酸のコリンエステルを好ん
で分解する。それらのCh―Ｅの中で病気の診断に利用され
ているのはプソノイドCh―Ｅであつて、就中、
血清Ch―Ｅの活性測定は極めて重要である。即
ち、血清Ch―Ｅは肝臓で生成され、血中に供給
されるが、肝疾患とくに肝実質障害により、その
活性が低下するから、その活性の測定は肝機能検
査の１つとして重要な位置をしめている。また、
有機リン濃薬による中毒や抗Ch―Ｅ剤使用時な
どにおける診断、治療上にも不可欠なものであ
る。 Ch―Ｅ活性定のための方法は既にいくつか知
られているが、その何れもコリン誘導体をCh―
Ｅの基質として用いている。しかし、それらには
いずれも一長一短があり、新しい合成基質と新し
い測定方法の開発が望まれていた。従来の測定法とは、凡その通りである。 (1) アセチルコリンを基質として用いる△PH法
［高橋・紫田、医学と生物学：20，96
（1951）］：アセチルコリンはCh―Ｅによつて
酢酸とコリンに分解され、生成した酢酸により
PHが変化する。そこで、反応時間に対応するPH
の変化量（△PH）をフエノールレツドなどのPH
指示薬を用いて測定し、Ch―Ｅの活性を求め
る。しかし、この方法は指示数の蛋白誤差がお
こる、反応の進行に従い、赤→橙→黄色と色
調が変化し、極大波長が移動を起す、反応の
進行とともに反応液中のPHが変化するので、一
定の酵素反応のための至適PHが保てない、測
定に長時間（60分）を要し、かつ操作が煩雑で
ある、基質アセチルコリンが不安定である、
などの欠点を有している。 (2) 基質のチオコリン誘導体（アセチルチオコリ
ンなど）をCh―Ｅによつて分解せしめ、生成
したチオコリンをジチオビスニトロ安息香酸
（DTNB）と反応させると黄色化合物になる。
これを比色測定する方法［Garry，P.J.Clin.
Chem，11(2)：91（1965）］この方法は黄色に呈するため、ピリルビンの
影響を強くうける。また、グルタチオンなどの
SH基を含有する薬剤を投与した被検者の血清
の場合は、誤つた高値を示すため検体盲検を必
要とする、という致命的な欠陥がある。 (3) ベンゾイルコリンを基質として用いるコリン
オキシダーゼ法［五味邦英，臨床病理特集第
29号：145（1977）］：ベンゾイルコリンをCh―Ｅによつてコリン
と安息香酸に分解し、生成したコリンをコリン
オキシダーゼで分解させ、過酸化水素とベタイ
ンにする。生成した過酸化水素はパーオキシダ
ーゼの存在下で４―アミノアンチピリンとフエ
ノールとの酸化的縮合反応をおこし、赤色のキ
ノン色素を生成するから、このキノン色素を生
成するので、これを比色することによりCh―
Ｅ活性を測定する。この方法は測定時間が20分ですみ、操作も２
工程であるため、上記(1)と(2)の方法に比べて、
簡易、迅速に精度よく測定ができる。しかし、
使用する基質ベンゾイルコリンは安定性が悪
く、正確な測定が困難である。更に、血清中の
共存物質であるビリルビン、アスコルビン酸及
びグルタチオン等の還元性物質の影響を受けて
誤差を生ずるという欠点を有している。この問題は、基質としてオルソメチルベンゾイ
ルコリン（オルソトルオイルコリン）を用いる方
法（日本特開昭54―136895号）にも共通してい
る。その上、これらの基質液は試薬調製後短時間
に使用しなければならない。本発明者等は、従来のCh―Ｅ活性測定法を改
良すべく鋭意研究した結果、優れた性質を有する
新規な基質を見出すとともに、該基質を用いる新
基なCh―Ｅ活性の測定法を見出し、本発明を完
成した。本発明でCh―Ｅ活性測定用基質として用いら
れる、本発明のｐ―ヒドロキシベンゾイルコリン
類は、一般式（式中Ｒは水素又はメトキシ基を、Ｘはハロゲ
ン原子を表す。）で示される。本発明の化合物は水に対する溶解性が良好な
上、溶解後の安定性が、従来知られていた基質に
比して次表に示す如く極めて優れている。

【表】なお、Ｄ―ヒドロキシ―３―メトキシベンゾイ
ルコリンも、ほぼ同様の安定性を示す。本発明の化合物を用いた基質液は、表１に示す
通り従来の基質液と比べると安定（冷暗所保存で
２週間以上）で、そのため操作が容易であつて、
かつ正確なCh―Ｅ活性の測定を可能にする。本発明の化合物は、常法によつて製造すること
が出きる。即ち、例えば、ｐ―アセトキシ安息香
酸クロライド又はその誘導体を有機溶媒に溶解、
Ｎ―Ｎ―ジメチルエタノールアミンを加えて反応
させ、反応完了後、冷却下ハロゲン化メチルを加
えて反応させる。その後、析出した結晶を分離
し、これをＮ，Ｎ―ジメチルホルムアミドとヒド
ラジンヒドラートに溶解させて目的物を得ること
ができる。ハロゲン化物として、ヨード、クロー
ルなどの塩が用いられる。本発明のもう１つの目的は、上記の化合物を基
質とするCh―Ｅ活性測定方法を提供するにあ
る。従来のCh―Ｅ活性の測定法は、前述の通りの
欠点を有している。例えば、コリンオキシダーゼ
法、ジオチオビスニトロ安息香酸（DTNB）法な
どは、血清中のアスコルビン酸、ダルタチオン、
ビリルビンなどの夾雑物による影響によつて誤つ
た測定値を招くという大きな欠点がある。という
のも、コリンオキシダーゼ法においては基質に
CH―Ｅが作用した場合に生成するコリンをコリ
ンオキシダーゼによつて分解し感酸化水素とし、
この過酸化水素を定量的に着色物質に導き比色測
定するため、血清中の還元物質による影響が不可
避的である。また、ジチオビスニトロ安息香酸
（DTNB）法は、基質とCh―Ｅとの作用により生
成するチオコリンのSH基とDTNBとを反応さ
せ、生成する５―チオ―２―ニトロ安息香酸
（TNB）を比色するものであるが、その際、TNB
は412nmに極大吸収があるため、460nm付近に極
大吸収を有るビリルビンの影響を強くうける。し
かし、グルタチオン、システインなどのSH剤を
投与した血清の場合は類似反応のために、誤つて
高いCh―Ｅの活性値を示す。本発明の血清Ch―Ｅ活性測定方法においては
アスコルビン酸、グルタチオン、ビリルビンなど
の雑物による影響を受けることがなく、それ故
に、その結果は正確であり、かつ操作が極めて簡
単である。本発明のコリンエステラーゼ活性の測定法は、
Ｐ―ヒドロキシベンゾイルコリン又はその誘導体
を基質として用い、Ch―Ｅの酵素作用によつて
生成するＰ―ヒドロキシ安息香酸又はその誘導体
を、酸化剤の存在下、４―アミノアンチピリンと
酸化縮合して着色化合物に導き、比色定量するこ
とにより血清中のCh―Ｅ活性を測定する光学的
方法である。本発明の基質は、しかし、Ch―Ｅの酵素作用
により生成した酸による溶液のPH変化を測定する
方法、或いは生成するコリンにコリンオキシダー
ゼを作用せしめる発色法を用いる方法にも適用出
来る。本発明の測定方法で用いる基質のCh―Ｅ反応
の至適PHは7.5〜9.5の間であり、特にPH8.5が望ま
しい。また、発色時の至適PHは８〜10.3の間にあ
り、特にPH9.2が望ましい。 PHを保つための緩衝剤としては、Ch―Ｅ酵素
反応系ではバルビタール酸塩、グリシルグリシ
ン、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメ
タン、ピロリン酸塩などが用いられるが、特にバ
ルビタール酸塩が望ましい。また発色反応系にお
いてはホウ酸塩、２―アミノ―２―メチル―１―
プロパノール、ロイシン、グリシン、トリエタノ
ールアミンなどが用いられるが、特にホウ酸塩が
望ましい。しかし、酵素反応系、発色反応系のPH
が7.5〜10.3の間において緩衝能を維持できるも
のであれば、上記以外のものも使用出来る。酸化剤としては過ヨウ素酸塩、フエリシアン化
カリウム、過硫酸カリウム、過酸化水素、次亜塩
素酸、クロラミンＴなどが用いられるが、これら
の限定されない。本発明の基質からCh―Ｅの酵素作用により生
成する基質由来のＰ―ヒドロキシ安息香酸又はそ
の誘導体とカツプラーたる４―アミノアンチピリ
ンとが、酸化縮合されて生成する着色化合物は、
その極大吸収波長（λ max）が505〜510nmの
間にある。この場合、該物質の酸化縮合がPH８〜
10.3の間で進行する場合、血清の種類を問わず、
その極大吸収波長が短波長側へ経時的に移動す
る。しかし乍ら、それは、60分間で10〜15nm程
度であつて、Ch―Ｅの活性測定に大きな支障を
もたらすものではない（この点、第４〜ｂ図参
照）。ところで、この極大吸収波長の移動は発色液中
に、疎水性着換基を有するベンゼンスルホン酸誘
導体、安息香酸誘導体又は安息香酸エステル誘導
体を1mM以上の濃度で添加することにより防止
出来ることが判つた。（第４―ａ図）。それは恐ら
く、試料中のアルブミンがそれら化合物と結合す
るため、アルブミンによる障害が排除できるため
と思われる。それら誘導体としては、殊に、ｐ―
クロルベンゼンスルホン酸、ｐ―クロル安息香
酸、ｐ―ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ
―トルエンスルホン酸、ｐ―メチル安息香酸など
が用いられるが、これらに限定されない。本発明のCh―Ｅ活性測定法によつて得られる
効果は次の如くである。基質に用いる新基化合物は溶解後に非常に安
定であつて、経時的な変化を起すことがなく、
再現性よく測定できる。コリンオキシダーゼ法のように過酸化水素を
色素系に導いて測定しないから、ビリルビン、
アスコルビン酸及びグルタチオンなどの還元性
物質の影響を受けることがない。試薬にコリンオキシダーゼやパーオキシダー
ゼのような酵素を使用しないから安価である。検体ごとに血清ブランクをたてる必要がない
ので、簡易かつ迅速に測定でき、大量分析処理
が可能である。以上説明したように、本発明の新しいCh―Ｅ
活性測定方法によると、従来の方法の欠点を克服
し、正確にしかも簡単にCh―Ｅの活性値を測定
でき、また、従来の方法との相関も極めて良好で
ある。以下、実施例を挙げて詳細に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。実施例１Ｐ―ヒドロキシルベンゾイルコリン・ヨード塩
の製造Ｐ―アセトキシ安息香酸クロライド13.9ｇ
（0.07モル）をベンゼンに溶解し、Ｎ，Ｎ―ジメ
チルエタノールアミン25.5ml（0.28モル）を加え
てかきまぜながら室温で24時間反応させる。反応
終了後０℃に冷却しヨウ化メチル4.4ml（0.03モ
ル）を滴下しながらかきまぜ反応させる。析出し
た結晶をロ過し次いでＮ，Ｎ―ジメチルホルムア
ミド100mlに溶解させ、続いてヒドラジンヒドラ
ー３ｇ（0.06モル）を加える。減圧下でＮ，Ｎ―
ジメチルホルムアミドを留去すると結晶状のｐ―
ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩4.0ｇ
（16.3％）が得られる。融点： 233〜236℃ 元素分析値： C₁₂H₁₈INO₃ （分子量
36.2）ＣＨＮ実測値：41.22 5.30 3.20 計算値：41.04 5.18 3.99 実施例２４―ヒドロキシ―３―メトキシベンゾイルコリ
ン・ヨード塩の製造４―アセトキシ―３―メトキシ安息香酸クロラ
イド16.0ｇ（0.07モル）をベンゼンに溶解し、
Ｎ，Ｎ―ジメチルエタノールアミン25.5ml（0.28
モル）を加えてかきまぜながら室温で24時間反応
させる。反応終了後、０℃に冷却しヨウ化メチル
4.4ml（0.03モル）を滴下しながら反応させる。
析出した結晶をロ過し次いでＮ，Ｎ―ジメチルホ
ルムアミド100mlに溶解、続いてヒドラジンとヒ
ドラート３ｇ（0.06モル）を加える。減圧下で
Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミドを留去すると、４
―ヒドロキシ―３―メトキシベンゾイルコリン・
ヨード塩の結晶4.6dl（16％）が得られる。融点： 215.5〜217℃ 元素分析値： C₁₃CH₂₀INO₄ （分子量
381.2）ＣＨＮ実施値： 40.91 5.30 2.63 計算値： 40.96 5.30 3.68 実施例３ (1) 試薬の調製イ基質緩衝液ｐ―ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩
1.5mM、塩化ナトリウム0.3M、４―アミノア
ンチピリン10mMを含有するPH8.5，50mMバル
ビタール酸ナトリウム緩衝液を調整するロ発色液ネオスチグミン5mM、過ヨウ素酸カリウム
15mMp―クロルベンゼンスルホン酸2mMを含
有するPH9.2，0.1Mホウ酸カリウム緩衝液を調
製する。ハ標準液（200IU／ｌ）ｐ―ヒドロキシ安息香酸の2mM水溶液。 (2) 測定操作法基質緩衝液1.0mlに各段階に希釈された試料
（血清）0.05mlを加えよく混合し、37℃の恒温槽
で10分間インキユベートする。次いで、発色液
2mlを加え発色させ、試薬ブランク（試料と同様
に操作して造る）を対照として試料溶液の吸光度
を505nmで測定する。濃度既知のｐ―ヒドロキシ
安息香酸標準液を同様の操作で発色させ、その吸
光度を下記の比例計算によりCh―Ｅの活性値を
求める。その結果を表２に示す。［計算式］ Ch―Ｅ活性値＝（Ａ試料―Ａブランク／Ａ標準液―Ａブ
ランク）×200 (注)：式中Ａは吸光度を示す

【表】

【表】実施例４ (1) 試薬の調整イ基質緩衝液ｐ―ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩
1.5mM、塩化ナトリウム0.3Mを含有するPH
8.5，50mMバルビタール酸ナトリウム緩衝液
を調製する。ロ停止液蒸留水に４―アミノアンチピリン30mMとネ
オスチグミン15mMを溶解する。ハ発色液過ヨウ素酸カリウム15mM、ｐ―クロルベン
ゼンスルホン酸2mMを含有するPH9.2，0.1Mホ
ウ酸カリウム緩衝液を調製する。ニ標準液（200IU/1）ｐ―ヒドロキシ安息香酸の2mM水溶液。 (2) 測定操作法基質緩衝液1.0mlに試料（血清）0.05mlを加え
よく混合し、37゜Ｃの恒温槽で10分間インキユベ
ートする。次いで、停止液0.5mlを入れる。その
後、発色液2mlを加え発色させ、試薬ブランク
（試料と同様に操作して造る）を対照として試料
溶液の吸光度を505nmで測定する。濃度既知のｐ
―ヒドロキシ安息香酸標準液を同様の操作で発色
させ、その吸光度を前記の比例計算式によりCh
―Ｅの活性値を求める。その結果を表３に示すと
ともに、添付第１図に、このように測定した結果
と紫田・高橋法で測定した結果とを示す。また、
血清中にアスコルビン酸を含む検体を測定した結
果と、血清中にビリルビン（デイド社）を含む検
体を測定した結果とを第２図及び第３図に示す。

【表】

【表】実施例５イ基質緩衝液４―ヒドロキシ―３―メトキシベンゾイルコ
リン・ヨード社塩1.5ml、塩化ナトリウム
0.3M、４―アミノアンチピリン10mMを含有す
るPH8.5，50mMバルビタール酸ナトリウム緩
衝液を調製する。ロ発色液実施例３のロ．と同様に調製する。ハ標準液（200IU/1）３―メトキシ―４―ヒドロキシ安息香酸の
2mM水溶液。 (2) 測定操作法実施例３の(2)と同様に測定操作し、その結果
を表４に示す。

【表】実施例６ (1) 試薬の調製イ基質緩衝液４―ヒドロキシ―３―メトキシベンゾイルコ
リン・ヨード塩1.5mM、塩化ナトリウム0.3M
を含有するPH8.5，50mMバルビタール酸ナト
リウム緩衝液を調製するロ停止液実施例４のロ．と同様に調製する。ハ発色液実施例４のハ．と同様に調製する。ニ標準液（200IU/1）実施例５のハ．と同様に調製する。 (2) 測定操作法実施例４の(2)と同様に測定操作し、その結果
を表５に示す。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は、アセチルコリンを用いた△PH法と本
発明の測定法との活性値による相関図、第２図は
血清アスコルビン酸の影響を示し、第３図は血清
ビリルビンの影響を示し、第４―ａ図はＰ―クロ
ルベンゼンスルホン酸を添加した場合、第４―ｂ
図は無添加の場合の極大吸収波長（λ max）の
移動を示し、第５図はＰ―ヒドロキシベンゾイル
コリン・ヨード塩の、第６図は４―ヒドロキシ―
３―メトキシベンゾイルコリン・ヨード塩の赤外
吸収スペクトルを表す。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中、Ｒは水素又はメトキシ基を、またＸは
ハロゲン原子を意味する）で示されるコリン誘導
体。２一般式（式中、Ｒは水素又はメトキシ基を、また、Ｘ
はハロゲン原子を意味する）で示されるコリン誘
導体を基質として用い、酵素作用により生成した
ｐ―ヒドロキシ安息香酸又はその誘導体を、場合
により、極大吸収波長の移動防止剤としての疎水
性置換基を有するベンゼンスルホン酸誘導体、安
息香酸誘導体又は安香酸エステル誘導体の存在
下、比色法により測定することを特徴とするコリ
ンエステラーゼ活性の測定方法。３一般式（式中、Ｒは水素又はメトキシ基を、また、Ｘ
はハロゲン原子を意味する）で示されるコリン誘
導体を基質として用い、酵素作用により生成した
ｐ―ヒドロキシ安息香酸、またはその誘導体、極
大吸収波長の移動防止剤としてのｐ―クロルベン
ゼンスルホン酸、ｐ―クロル安息香酸、ｐ―ヒド
ロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ―トルエンス
ルホン酸、ｐ―メチル安息香酸の存在下、比色法
により測定することを特徴とする特許請求の範囲
２によるコリンエステラーゼ活性の測定法。