JPH0525071B2

JPH0525071B2 -

Info

Publication number: JPH0525071B2
Application number: JP60272618A
Authority: JP
Inventors: Enu Watsushubaan Uiriamu; Aaru Kutsuku Eueru; Emu Datsupen Guren
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1985-12-05
Publication date: 1993-04-09
Also published as: US4672029A; EP0184437B1; EP0184437A3; DE3586044D1; CA1258857A; EP0184437A2; JPS61138163A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、過酸化水素又は反応して過酸化水素
を生成する被分析物を測定するのに有用な新規化
合物、色原体組成物、要素及び方法に関する。本
発明は、特に、臨床化学、即ち、生物学的液体の
分析に有用である。〔従来の技術〕過酸化水素及び化学又は酵素反応の結果として
過酸化水素を生成する化合物を検出し、定量的に
測定することは、多くの分野で重要である。これ
らは、例えば、酸素の存在で化学的物質又は生物
学的物質（しばしば被分析物と言われる）、例え
ばグルコース、コレステロール、尿酸、リパー
ゼ、トリグリセリド、クレアチンキナーゼ等の酵
素分析の際に生成する過酸化水素の検出に重要で
ある。試験試料中に存在する被分析物の量は、生
成し、検出される過酸化水素の量から測定されう
る。このような分析において過酸化水素を検出又は
定量するための公知組成物は、一般に、過酸化物
活性を有する物質、例えばペルオキシダーゼ、及
び過酸化水素及び過酸化物様物質の存在で検出可
能な変化（例えば有色染料に酸化）を受ける物質
を含む。このような検出可能な変化を受ける物質
は種々あり、例えばモノアミン類、ジアミン類、
フエノール類、ロイコ染料及び他の公知色素又は
色素形成剤である。過酸化水素の検出は、ペルオキシダーゼの存在
で発色性カツプラー及び酸化可能な顕色化合物、
例えば４−アミノアンチピリンの反応によつても
行われた。この目的に使用された発色性カツプラ
ーはＮ−置換アニリン類、例えば米国特許第
4396714号明細書に記載されているものである。〔発明が解決しようとする問題点〕従来の色素形成性物質は、一般に、過酸化水素
測定用指示薬として有用であるが、分析すべき過
酸化水素の濃度が低すぎて、このような指示薬か
ら充分に検出可能な色を生成しない場合がある。
若干の場合には、この欠点を、色素形成物質の使
用量を増加することによつて克服することができ
る。しかしながら、被分析物の濃度が最初低いか
又は試験試料の高度希釈が必要である場合には、
このような物質はこのような場合になお充分に検
出可能な色を生じない。被分析物濃度が低いというこのような問題は、
被分析物測定を乾式分析要素、例えば商業的に好
適な要素で試みる場合に特に重大である。このよ
うな場合には、このような要素中に存在する指示
薬又は試薬層は極めて薄く、色素形成性物質濃度
は必然的に低い。従つて、低レベルの被分析物か
ら又は高レベルの被分析物の異常に低い濃度から
形成される色の濃度は、むしろ低い。しかしなが
ら、低濃度で存在する被分析物を分析するためこ
のような要素を使用することは望ましい。〔問題点を解決するための手段〕公知分析法の問題点は、構造式：〔式中Ｒはホスホノもしくはスルホニウム又は
そのエステルもしくは塩を含む１価の水溶化基を
表し、R₁、R₂、R₃及びR₄はそれぞれ独立に水
素、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ
基、置換アルコキシ基、アリール基、置換アリー
ル基、アリールオキシ基、置換アリールオキシ
基、ハロゲン、アミノ基又はＲを表し、ＺはＮ−
置換５員又は６員置換又は非置換縮合環の核を完
成するのに必要な炭素原子を表す〕を有する発色
性カツプラーを含んでなる、過酸化水素又は反応
して過酸化水素を生成しうる被分析物の測定用色
原体組成物によつて克服される。本発明は、更に、前記の色原体組成物を含んで
なる、過酸化水素又は水性液体中で反応して過酸
化水素を生成しうる被分析物の測定用の乾式分析
要素を提供する。更に、本発明は、前記の色原体と液体試料とを
物理的に接触させて有色色素を生成させる工程、
及びその色素を検出する工程を含んでなる、過酸
化水素又は水性液体中で反応して過酸化水素を生
成しうる被分析物の測定方法を提供する。〔実施態様〕本発明の実施に有用な発色性カツプリング化合
物は、キノリン環又はインドール環の窒素原子に
結合する１価の水溶化性基を少なくとも１個有す
るＮ−置換キノリン又はインドール化合物（又は
飽和された対応化合物）である。これらの化合物
は、或いは、化合物の色素形成能を損なわない限
り、１個以上の他の置換基を有していてもよい。特に、有用なヘテロ環式化合物は、構造式：〔式中Ｒはホスホノもしくはスルホニウム又は
そのエステルもしくは塩を含む１価の水溶化基、
又はそれと均等なエステル又は塩（例えばアルカ
リ金属塩）を表す〕で表される。例えば、Ｒは、
好ましくは炭素原子数１〜６のアルキル基（例え
ばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピ
ル基、ブチル基、ペンチル基等）、好ましくは炭
素原子数５〜10のシクロアルキル基（例えばシク
ロペンチル基、シクロヘキシル基等）、又は好ま
しくは核における炭素原子数６〜10のアリール基
（例えばフエニル基、ｐ−メチルフエニル基、ナ
フチル基等）であつて、それぞれ前記の１価の水
溶化性基を１個以上含むものであつてよい。Ｒに
ついて定義した基は、必要に応じて、１個以上の
他の非可溶化置換基（例えばアルコキシ基、ハロ
ゲン、アミノ基、ニトロ基等）を含んでいてよ
く、オキソ基、チオ基、カルボニル基、カルボン
アミド基、スルホンアミド基又は従来公知の他の
結合基によつて一緒に結合される付加的基を含ん
でいてよい。Ｒ基は、発色性カツプラーに水溶性
を付与して、そのカツプラーが下記の分析に容易
に利用されるようにする。Ｒは、１個以上のスルホ基又はホスホノ基又は
それと均等なエステル若しくは塩で置換されたア
ルキル基であるのが好ましい。溶解性が最良であ
るためには、Ｒは −（CH₂）_n−SO₃Ｍ又は −（CH₂）_n−PO（OR₅）（OR₆）〔式中ｍは１〜５を表し、Ｍは適当な陽イオン
（例えば水素、アルカリ金属、アンモニウム等）
を表し、R₅及びR₆はそれぞれ独立に水素又は炭
素原子数１〜５のアルキル基（例えばメチル基、
エチル基、イソプロピル基等）を表す〕である。
Ｒは−（CH₂）_n−SO₃Ｍ（式中ｍは１〜５を表す）
であるのが最も好ましい。これらの好ましいＲ基
中のアルキレン鎖の水素原子の１個以上が前記の
ように他の可溶化基又は非可溶化基で置換されて
いてよい。前記の構造式において、R₁、R₂、R₃及びR₄が
それぞれ独立に水素、好ましくは炭素原子数１〜
10の置換若しくは非置換アルキル基（例えばメチ
ル基、エチル基、イソプロピル基、クロロメチル
基、２−ヒドロキシエチル基、メトキシメチル
基、ベンジル基等）、好ましくは炭素原子数１〜
10の置換若しくは非置換アルコキシ基（例えばメ
トキシ基、エトキシ基、ベンジルオキシ基等）好
ましくは核における炭素原子数６〜10の置換若し
くは非置換アリール基（例えばフエニル基、キシ
リル基、ｐ−メトキシフエニル基、ナフチル基、
ｍ−スルホフエニル基等）、好ましくは核におけ
る炭素原子数６〜10の置換若しくは非置換アリー
ルオキシ基（例えばフエノキシ基等）、ハロゲン
（例えば弗素、塩素、臭素等）、アミノ基（第一
級、第二級又は第三級）又は前記のようなＲ基で
ある。 R₁、R₂、R₃及びR₄は、それぞれ独立に水素、
炭素原子数１〜３の置換若しくは非置換アルキル
基、炭素原子数１〜３の置換若しくは非置換アル
コキシ基又はハロゲンであるのが好ましい。これ
らの基の少なくとも２個、例えばR₂及びR₄が水
素であるのが更に好ましい。R₁、R₂、R₃及びR₄
がそれぞれ水素であるのが最も好ましい。Ｚは、Ｎ−置換５員又は６員縮合環の核を完成
する（例えばインドール環、キノリン環、ジヒド
ロインドール環、テトラヒドロキノリン環を形成
する）ため必要な炭素原子を表す。環のこの縮合
部分は、飽和されているか又は１個の不飽和炭素
−炭素二重結合を含んでいてよい。縮合部分は、
前記のR₁、R₂、R₃及びR₄について定義した基を
含めて（それらの基に限定するものではない）１
個以上の置換基を有していてよい。Ｚは、環の飽
和部分を完成するのが好ましい。Ｚは、飽和６員
縮合環の核を完成する（即ち、Ｎ−置換テトラヒ
ドロキノリンを形成する）ため必要な炭素原子を
表すのが更に好ましい。縮合環の好ましい置換基
は、ハロゲン及び炭素原子数１〜３の置換又は非
置換アルキル基である。縮合環は飽和されてい
て、かつ非置換であるのが最も好ましい。ある実施態様では、本発明の新規発色性カツプ
ラーは、Ｒが１個以上のホスホノ基又はそれと均
等なエステル若しくは塩を有するものを表す前記
構造式で表される。このような実施態様では、
R′は−（CH₂）_n−PO（OR₅）（OR₆）（式中ｍは１〜５であり、R₅及びR₆はそれぞ
れ独立に水素又は前記のような炭素原子数１〜５
のアルキル基を表す）であるのが好ましい。前記
構造式におけるR₁、R₂、R₃及びR₄はそれぞれ独
立に水素、炭素原子数１〜３の置換若しくは非置
換アルキル基、炭素原子数１〜３の置換若しくは
非置換アルコキシ基又はハロゲンを表し、Ｚが前
記のようなＮ−置換６−員縮合環の核を完成する
ために必要な炭素原子を表すのが更に好ましい。
この縮合環部分は飽和されているのが好ましい。
Ｒ基のアルキレン鎖の水素原子の１個以上が、Ｒ
について先に一般的に記載したような可溶化基又
は非可溶化基で置換されていてもよい。本発明の色原体組成物に有用な発色性カツプラ
ーの例を以下に挙げる。＊印を付けた化合物が好
ましい。最後の３種の化合物は代表的新規ホスホ
ノ基含有発色性カツプラーである。発色性カツプ
ラーと４−アミノアンチピリンとの反応によつて
形成される有色色素のλ_naxも示す。及び前記の発色性カツプラーは、過酸化水素及び過
酸化物活性（以下に定義する）を有する化合物の
存在で、酸化可能な顕色化合物と反応して有色色
素を生成する。このような多数の顕色化合物を本
発明に使用することができ、例えば２−アミノア
ンチピリン、４−アミノアンチピリン、２−チオ
フエンカルボン酸、ヒドラジド、ベンジジン及び
その同族体、３−メチル−２−ベンゾチアリノン
ヒドラゾン、ｐ−フエニレンジアミン及びｐ−ア
ミノフエノールが挙げられる（但し、これらに限
定されるものではない）。好ましい酸化可能な顕
色化合物は、４−アミノアンチピリンである。有色色素形成反応は、下記の代表的反応によつ
て説明される：本発明に有用な発色性カツプラーは、多数の合
成方法のいずれかで製造することができる。一般
に、これらは還元されたキノリン又はインドール
をＲ基を含むアルキル化剤と反応させることによ
つて製造することができる。アルキル化剤は、ヘ
テロ環の窒素原子と反応してその窒素原子上の水
素原子を置換する。Ｎ−スルホアルキル置換基を含むカツプラーを
得るには、還元されたキノリン又はインドールを
適当な溶剤中でサルトンと反応させるか、又は適
当なハロゲン化アルコールと反応させ、これをそ
の後、Ｎ−スルホアルキル置換基に代えることに
よつて該化合物を製造するのが好ましい。好まし
い発色性カツプラーの製造法の詳細については、
以下に記載する。他の有用な製造方法は、米国特
許第4282144号明細書に一般的に説明されており、
参考として本明細書に含める。Ｎ−ホスホノ置換基を有する本発明の新規発色
性カツプラーは、一般に、還元されたキノリン又
はインドールを適当な溶剤中で臭素化ホスホネー
ト化合物と反応させることによつて製造される。
有用なＮ−ホスホノ発色性カツプラーの製造法の
詳細は、下記の例１及び２に示す。本発明の色原体組成物は、溶液分析及び乾式要
素分析の両方に使用することができる。組成物
は。場合により過酸化物活性又は水性環境で組成
物のPHを４〜11に維持する緩衝剤を含んでいてよ
い。本発明の実施に有用な過酸化物活性を有する物
質は、過酸化物様物質としても知られており、過
酸化水素又は別の過酸化物による他の物質の酸化
を触媒することができる。このような物質は、天
然及び合成ペルオキシダーゼ、チトクローム、ヘ
ミン、ヘモグロビンの種々の形態、アルカリヘマ
チン、チオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、タングス
テン酸及びその塩、モタブデン酸及びその塩、ク
ロム酸塩等である。ペルオキシダーゼは特に有用
な過酸化物様物質である。色素形成及び所定の分析に必要な反応に適する
PHに組成物を維持する実質的に任意の緩衝剤を本
発明の組成物に使用することができる。一般に、
PHは４〜11の範囲に維持されるが、特定のPHは分
析する特定の被分析物及びそれに使用される試薬
に左右される。例えば、液体をウリカーゼを使用
して尿酸について分析する場合、組成物のPHは一
般に８〜９に維持される。グリコースオキシダー
ゼを使用して液体をグルコースについて分析する
場合には、組成物のPHは一般に４〜７に維持され
る。種々の分析に有用な緩衝剤は、炭酸塩、硼酸
塩、燐酸塩、りんご酸塩、マレイン酸塩、グルタ
ル酸塩、トリス物質、例えばトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン、及び文献に公知の他のも
のを含む。本発明の色原体組成物は、発色性カツプラーを
酸化可能な顕色化合物と混合することによつて溶
液分析に使用するため製造することができる。更
に、付加的物質を混合することができる。代表的
色原体組成物の製造及び使用の詳細を下記の例３
及び４に示す。本発明の色原体組成物を溶液分析に使用する場
合、一般に発色性カツプラーは10^-3モル以下、好
ましくは５×10^-5〜５×10^-4モルの濃度で存在す
る。酸化可能な顕色化合物は、カツプラーと反応
するのに充分な量で存在する。例えば、顕色化合
物は一般に10ミリモル以下、好ましくは0.5〜２
ミリモルの量で存在する。組成物の任意成分（例
えば緩衝剤、表面活性剤、過酸化物様物質等）の
有用な量は、当業者には知られている。本発明の色原体組成物を、水性液体、例えば生
物学的液体（例えばヒト又は動物の全血、血清、
血漿、排泄物、髄液、尿等）中の過酸化水素を生
成しうる被分析物（即ち、過酸化水素を生成する
反応又は反応系列に関与しうる被分析物）の測定
に使用することもできる。この組成物を、分析中
に被分析物と反応して過酸化水素を生成する適切
な反応組成物（１種の試薬又は試薬の組合せ）と
共に使用することもできる。反応組成物を分析前
又は分析中に色原体組成物と混合することができ
る。この方法で測定される被分析物は、グリコー
ス、トリグリセリド、尿酸、リパーゼ、コレステ
ロール、ガラクトース、アミノ酸、クレアチンキ
ナーゼ及び他の、臨床化学の当業者に公知のもの
を含む。例えば、尿酸を測定するには、反応組成
物はウリカーゼである。コレステロールを測定す
るには、反応組成物はコレステロールオキシダー
ゼ及びコレステロールエステルヒドロラーゼを含
む。所定の被分析物について、当業者は他の反応
組成物を適応させることができる。所定の分析に
適当な試薬の量は、臨床化学の当業者に知られて
いる。本発明方法は、溶液分析及び乾式要素分析に適
用することができる。溶液分析では、一般に、色
原体組成物を適当な容器（例えば試験官、シヤー
レ、ビーカー、キユベツト等）中で液体試験試料
と物理的に接触させ、混合する。生ずる溶液を比
較的短い時間、例えば約５分、適当な温度（例え
ば約37℃）で静置する。次いで、過酸化水素の存
在で発色性カツプラーと顕色化合物との反応で生
じる色素の量を測定することによつて試料を評価
する。色素の量を、試料中に初めに存在した過酸
化水素又は被分析物の存在の結果として生成した
過酸化水素の量に相関させることができる。この
ような評価は、肉眼で又は適当な比色検知装置及
び操作を用いて行うことができる。発色性カツプラー及び顕色化合物を、乾式又は
溶液分析用の診断試験キツトの一部として提供す
ることができる。溶液分析には、キツトの成分を
所定量を有する個々の包装で凍結乾燥試薬として
供給することができる。また、溶液を１回以上の
分析に充分な大きさのビン又は包装に入れて提供
することができる。必要に応じて、分析の実施に
適当な分析用具又は容器と共にキツトにして他の
試薬又は非反応性添加剤を供給することもでき
る。分析に必要な１種以上の試薬を含む乾式分析
要素（以下に説明）を診断試験キツトの一部とし
て包含させることもできる。吸収性担体材料、即ち、自立性吸収性又は吸水
性材料の薄いシート、例えば紙又はストリツプ
を含み、本発明の色原体組成物を含む乾式分析要
素を用いて本発明方法を利用することもできる。
このような要素は、更に過酸化物様物質を含んで
いるのが好ましい。このような要素は試験ストリ
ツプ、診断要素、浸漬ステイツク、診断剤等とし
て文献に知られている。乾式化学要素として使用する場合、本発明の組
成物を適当な吸収性担体材料中に吸収、含浸、被
覆又は他の適当な技法によつて配合することがで
きる。有用な吸収材料は、不溶性であり、水又は
生理学的液体、例えば尿又は血清にさらされたと
きにその構造的一体性を維持するものである。こ
のような要素を製造するため有用な材料及び操作
は、文献、例えば米国特許第3092465号、同第
3802842号、同第3915647号、同第3917453号、同
第3936357号、同第4248829号、同第4255384号及
び同第4270920号及び同第4312834号明細書並びに
英国特許第2052057号明細書に良く知られている。本発明の乾式分析要素は、担体材料として少な
くとも１つの多孔性拡散帯域を有するのが好まし
い。この帯域は自立性である（即ち、その一体性
を維持するのに充分堅い材料からなる）が、非多
孔性支持体上に担持されているのが好ましい。こ
のような支持体は、約200〜約900nmの波長の電
磁線を透過する、任意の適当な寸法安定性で、好
ましくは透明な（即ち、放射線透過性）物質であ
つてよい。特定の要素に選択される支持体は、意
図する検出方法（反射又は透過分光分析）に適合
すべきである。米国特許第4292272号、同第3992158号及び同第
4258001号明細書に記載されているような任意の
適当な繊維状又は非繊維状材料又はその一方若し
くは両方の混合物から多孔性拡散帯域を製造する
ことができる。他の有用な拡散帯域材料は、ドイ
ツ連邦共和国特許出願公開第3150102号公報及び
日本の特開昭57（1982）−101760号公報に記載され
ている。要素は１個より多数の帯域、例えば１個以上の
試薬帯域、拡散帯域、記録帯域、媒染帯域、放射
線遮断帯域、下塗帯域、バリア帯域、緩衝剤帯域
等を有していてよい。これらの帯域は、一般に相
互に液体接触する、即ち、液体、反応性組成物及
び反応生成物（例えば有色色素）が隣接帯域の重
ねられた領域の間を通過しうる。前記の参考文献
の他に、例えば、米国特許第4042335号、同第
4132528号及び4144306号明細書にも、要素の適当
な構成及び成分が記載されている。本発明の色原体組成物又はその成分は、特定の
分析に適当な要素にはどれにも配合することがで
きる。他の試薬又は添加剤の位置は、臨床化学の
分野の当業者に公知の任意の適当な帯域であつて
よい。本発明の要素においては、発色性カツプラー及
び他の試薬の量は、測定すべき被分析物に応じて
広く変動することができる。一般に、発色性カツ
プラーは3g／m²以下、好ましくは0.2〜1g／m²の
被覆量で存在する。過酸化物様物質は、当業者の
常識内の被覆量で存在することができる。例え
ば、ペルオキシダーゼについては、被覆量は一般
に、150000I.U.／m²以下、好ましくは40000〜
60000I.U.／m²である。酸化可能な顕色化合物は
一般に2g／m²以下、好ましくは0.2〜1g／m²の被
覆量で存在する。他の種々の所望な任意試薬及び
添加剤は、当業者に公知の量で要素中に存在する
ことができる。本明細書において、I.U.は、所定
の酵素に関して標準的PH及び温度条件下で、１分
間に基質１マイクロモルの変換を触媒するのに必
要な酵素活性の国際単位を表す。本発明の一実施態様は、被分析物を測定するた
めの多層乾式分析要素である。この要素は、支持
体と、その上に順次、液体接触して、親水性結合
剤物質（天然又は合成）、例えばゼラチン又はポ
リアクリルアミドを含む親水性記録層、及び１）
被分析物と反応したときに過酸化水素を生成する
反応性組成物、２）過酸化物活性を有する物質及
び前記の色原体組成物を含む拡散層とを有する。
この要素は記録層と拡散層との間に放射線遮断層
を有していてもよい。この層は一般に適当な親水
性結合剤（例えばゼラチン）中に反射性顔料（例
えば二酸化チタン又は硫酸バリウム）を含む。本発明の好ましい実施態様では、要素の拡散帯
域は、被分析物であるグルコースと反応するグル
コースオキシダーゼ、過酸化物様物質（例えばペ
ルオキシダーゼ）、酸化可能な顕色化合物（例え
ば４−アミノアンチピリン）、分析の間（例えば
１〜100μlの全血試料のスポツトを付けたときに）
PHを４〜７の範囲に維持する適当な緩衝剤及び前
記の発色性カツプラーを含む。前記のグルコース測定要素における試薬の被覆
量は、当業者には良く知られている。例えば、グ
ルコースオキシダーゼは、一般に80000以下、好
ましくは40000〜60000I.U.／m²の被覆量で存在す
る。過酸化物様物質（例えばペルオキシダーゼ）
は、一般に80000以下、好ましくは40000〜
60000I.U.／m²を生じるのに有効な被覆量で存在
する。酸化可能な化合物であるアミノアンチピリ
ンは、一般に2g／m²以下、好ましくは0.2〜1g／
m²の被覆量で存在する。発色性カツプラーは、一
般に3g／m²以下、好ましくは0.2〜1g／m²の被覆
量で存在する。本発明の別の実施態様において、コレステロー
ル分析は、コレステロールオキシダーゼ、非イオ
ン表面活性剤又はプロテアーゼ、コレステロール
エステルヒドロラーゼ、過酸化物様物質（例えば
ペルオキシダーゼ）、酸化可能な顕色化合物（例
えば４−アミノアンチピリン）、分析の間PHを４
〜７の範囲に維持する適当な緩衝剤及び前記の適
当な発色性カツプラーを含む拡散／試薬帯域を利
用する。分析方法に応じて、種々の異なる要素を本発明
により製造することができる。所望の幅の長いテ
ープ、シート、スライド又はチツプを含めて種々
の形態で要素を形成することができる。本発明の分析は、手操作又は自動的に行われ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、過酸化水
素又は他の被分析物は、供給ロール、チツプ包装
物その他から要素を採取し、それを試験すべき液
体試料（例えば１〜100μl）と物理的に接触させ
ることによつて測定される。このような接触は、
任意の適当な方法、例えば要素を試料中に浸漬す
るか又は好ましくは要素に手又は機械で適当な分
散手段を用いて試料のスポツトを付けることによ
つて達成することができる。試料を適用した後、要素を、試験結果を得るの
を促進又は容易にするのに望ましい任意のコンデ
イシヨニング、例えばインキユベーシヨン、加熱
等にさらす。過酸化水素又は他の被分析物の測定は、酸化さ
れた顕色化合物が発色性カツプラーと反応して検
出可能な有色色素を生じる場合に行われる。この
色素は、肉眼又は適当な分光測光装置及び操作を
用いて検出することができる。下記の製造例及び実施例において、材料は下記
の出所から得たものである：デユポン社（デラウ
エア州ウイルミントン在）からのゾニル・エフエ
スエヌ（ZONYL FSN）表面活性剤、ガルフ・
アンド・ウエスターン・インダストリイーズ・イ
ンコーポレイテイド（Gulf ＆ Western
Industries，Inc.、ミシガン州サウスフイールド
在）からのルチル型二酸化チタン、ダブリユ・ア
ール・グレイス・アンド・カンパニイ（W.R.
Grace ＆ Co.、メリーランド州バルチモア在）
からのダキサド（DAXAD）30表面活性剤、シグ
マ・ケミカル（Sigma Chemical、ミズーリ州セ
ントルイス在）からのグルコースオキシダーゼ、
マイルス・ラボラトリーズ（Miles
Laboratories、インデイアナ州エルカールト在）
からのペルオキシダーゼ、ケルコ（Kelco、ニユ
ージヤージイ州クラーク在）からのケルザン
（KELZAN）シツクナー。残りのものは常用の操
作を用いて製造したものであるか、又はイースト
マン・オーガニツク・ケミカルス（Eastman
Organic Chemicals、ニユーヨーク州ロチエスタ
ー在）から入手したものである。ゾニル・エフエ
スエヌ（ZONYL FSN）、ダキサド（DAXAD）
及びケルザン（KELZAN）は、商標である。製造例Ａ：Ｎ−スルホプロピルテトラヒドロキノリンの製
造攪拌機及び還流冷却器を装着した丸底フラスコ
中にテトラヒドロキノリン50.0g、１，３−プロ
パンスルトン48.8g及び試薬級アセトニトリル溶
剤500mlを入れた。混合物を還流器を付けて窒素
雰囲気下に一夜加熱した。反応混合物を氷浴の温
度に冷却し、生じる白色固体沈澱物をロ過し、冷
アセトニトリルで洗浄した。融点200℃以上の粗
製生成物が58g（60％）の収量で得られた。該磁
気共鳴（NMR）及び質量分析は、標記化合物の
構造と一致することを示した。製造例Ｂ：３−（Ｎ−２，３−ジヒドロインドリル）プロ
パンスルホン酸の製造試薬級アセトニトリル50ml中のジヒドロインド
ール（4.76g、40ミリモル）及び１，３−プロパ
ンスルトン（4.88g、40ミリモル）の混合物を窒
素雰囲気下に加熱し、一夜還流した。室温に冷却
し、次いで氷浴の温度に冷却した後、生じる白色
固体をロ過し、冷アセトニトリルで洗浄した。収
量は8.1g（84％）であり、生成物は200℃より高い
融点を有していた。核磁気共鳴（NMR）及び元
素分析は、標記化合物の構造と一致することを示
した。NMR（D₂Ｏ）：7.45（ｓ，4H）、2.8−4.0
（ｍ，8H）、2.2（ｔ，2H）．下記の実施例は、本発明の実施を説明するため
示すものである。例１２−Ｎ−キノリルエチルホスホン酸の製造２−Ｎ−キノリルエチルホスホン酸ジエチル
2.5g（8.3ミリモル）及び濃塩酸10mlの混合物を20
時間還流した。次に、溶液を冷却し、真空下に濃
縮した。残渣をCH₃CNに溶かし、溶剤を除去し
て、白色固体2.5gを得た。核磁気共鳴（NMR）
及び質量分析は、固体が示した構造を有すること
を示した。¹Ｈ NMR（D₂Ｏ）：2.0（ｍ，4H）、2.7
（ｔ，2H）、3.5（ｍ，4H）、7.25（ｓ，4H）．分子
量は241である。例２２−Ｎ−キノリルエチルホスホン酸ジエチルの
製造テトラヒドロキノリン（5.3g，40ミリモル）及
びブロモエチルジエチルホスホネート（10.8g、
44ミリモル）を試薬アセトニトリル100ml中で混
合した。触媒量（10％）の沃化ナトリウムを添加
し、溶液を窒素下に48時間還流した。次いで、反
応混合物を室温に冷却し、溶剤を真空下に除去す
る。過剰のホスホネート出発原料を蒸溜により除
去した。生ずる粗製生成物（5g）をNMR分析に
よつて測定したところ、示した構造を有してい
た。¹Ｈ NMR（CDCl₃）：1.25（ｔ，6H）、2.0（ｍ，
4H）、2.65（ｔ，2H）、3.2（ｔ，2H）、3.55（ｍ，
2H）、4.1（ｍ，4H）、6.6（ｍ，2H）、6.9（ｍ，
2H）．化合物の分子量は297である。例３グルコースの分析に有用な乾式分析要素下記の乾式分析要素を使用して下記の方法でグ
ルコースについて全血試料を分析した。

【表】

【表】ヒトの全血の別々の試料に種々の量のグルコー
ス（58〜516mg／dl）を添加した。各試料の10μl
を前記の分析要素の試料上に滴下した。室温で３
分後、常用の分光光度系で580nmで反射濃度を記
録した。各全血試料を３回同様に試験した。平均
反射濃度を下記の第表に示す。第表試料グルコース濃度(mg/dl) 平均反射濃度 58 0.40 118 0.63 234 0.99 332 1.20 422 1.27 516 1.33 例４〜６種々の発色性カツプラーを使用したグルコース
の分析発色性カツプラーとしてＮ−スルホプロピルテ
トラヒドロキノリンの代わりに、Ｎ−スルホプロ
ピルジヒドロインドール（例４）、エチル−２−
Ｎ−キノリルエチルホスホネート（例５）及び２
−Ｎ−キノリルエチルホスホン酸（例６）を含
む、例３に記載したのと同様な乾式分析要素を製
造した。種々の量のグルコースを含むヒトの全血
試料を、各要素の試料を用いて、その要素の拡
散／試薬層上に各試料10μlのスポツトを付けるこ
とによつて分析した。室温で３分後、常用の分光
光度計を用いて585nmで反射濃度を記録した。各
全血試料を同様にして３回試験した。各グルコー
ス濃度での平均反射濃度（D_R）を下記の第表
及び第表に示す。第表例４−585nmグルコース濃度(mg/dl) での平均反射濃度 55 0.48 96 0.69 188 1.02 297 1.23 405 1.27 502 1.30 第表グルコース濃度 585nmでの平均反射濃度(mg/dl) 例５例６ 48 0.47 0.45 118 0.85 0.81 200 1.15 1.09 305 1.34 1.27 400 1.40 1.31 例７〜８グルコースに関する比較分析これらの実施例は、アニリン発色性カツプラー
を利用する分析（対照Ａ及びＢ）とキノリン発色
性カツプラーを含む乾式分析要素を利用する本発
明の分析とを比較するものである。例７は、Ｎ−
スルホプロピルテトラヒドロキノリンをＮ−エチ
ル−Ｎ−２−スルホエチルトルイジン（対照Ａ）
と対比したものである。例８は、Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルテトラヒドロキノリンをＮ−メチル−
Ｎ−２−ヒドロキシエチルアニルン（対照Ｂ）と
対比したものである。これらの対照に使用した乾式分析要素は、発色
性カツプラーの相違を除いて例３に記載した要素
の型及び組成物を有していた。種々の量のグルコ
ースを含むヒト全血試料を、要素の拡散／試薬層
上に各試料10μlのスポツトを付けることによつて
各要素の試料（実施例及び対照）を用いて分析し
た。室温で３分後に、常用の分光光度計を用いて
585nmで反射濃度を記録した。各全血試料を同様
にして３回試験した。各グルコース濃度での平均
反射濃度を下記の第表及び第表に示す。本発
明の要素は、試験したグルコース濃度の範囲にわ
たつて各対照より改善された感度を一貫して示し
た（より大きい反射濃度を示した）。第表グルコース濃度 585nmでの平均反射濃度(mg/dl) 例７対照Ａ 55 0.58 0.53 96 0.84 0.77 188 1.28 1.18 297 1.55 1.42 405 1.61 1.48 502 1.63 1.48 第表グルコース濃度 585nmでの平均反射濃度(mg/dl) 例８対照Ｂ 73 0.58 0.56 108 0.77 0.70 199 1.16 1.08 298 1.36 1.33 398 1.44 1.36 502 1.45 1.38 例９尿酸の比較分析この例は、尿酸の溶液分析においてトルイジン
発色性カツプラーを使用する場合とキノリン発色
性カツプラーを使用する場合とを比較するもので
ある。尿酸は、ヒト血清中に低濃度で一般に存在
する被分析物である。ウリカーゼ40mg（0.3I.U.／mg）及びペルオキシ
ダーゼ３mg（1237I.U.／mg）を0.01モル濃度硼酸
塩緩衝液（PH8.7）で８mlに希釈することによつ
て酵素溶液を調製した。４−アミノアンチピリン45mg及びＮ−エチル−
Ｎ−２−スルホエチルトルイジン（対照）42.9mg
又はＮ−スルホプロピルテトラヒドロキノリン
（例９）41.3mgをそれぞれ含む２種の色原体組成
物を調製した。各組成物を0.01硼酸塩緩衝液（PH
8.7）で10mlに希釈した。希炭酸カリウム10ml中の尿酸1.6mgを用いて尿
酸ストツク溶液を調製した。各色原体組成物0.1mlを酵素溶液0.1ml及び種々
の量の尿酸ストツク溶液（下記の第表に示す）
と混合して分析溶液を形成することによつて分析
を実施した。0.3mlより少ない容量を有する各分
析溶液に硼酸塩緩衝液を加えて、容量を0.3mlに
した。各分析溶液中の試薬を、硼酸塩３mlを添加した
後、約10分間反応させた。各分析溶液の光学濃度
を例９については555nmで、対照については
553nmで測定した。結果を下記の第表に示す。
データは、対照の分析溶液（即ち、尿酸が存在し
ないもの）の光学濃度より低いことを示す。これ
らのデータから、本発明の組成物は対照の組成物
より一貫して著しく高い光学濃度を生じることが
判る。この改良は、過酸化水素又は反応して過酸
化水素を生成する被分析物の極めて低い濃度（例
えば0.3ミリモルより低い濃度）の測定に特に有
利である。第表尿酸濃度光学濃度改良％(ミリモル) 対照例９ (例9-対照) 0.03 0.032 0.040 22.5 0.07 0.063 0.079 21.5 0.16 0.109 0.150 28 0.3 0.214 0.264 20 発明の効果被分析物の測定に本明細書に記載した特定の発
色性カツプラーを使用すると、公知の発色性カツ
プラーの欠点を克服することができる。本明細書
に記載したカツプラーは、溶液分析及び乾式分析
の両方において低濃度（例えば0.3ミリモルより
低い濃度）の過酸化水素又は反応して過酸化水素
を生成する被分析物を検出するため有利に使用す
ることができる。これらの発色性カツプラーは、
被分析物、例えばグルコース、ガラクトース、ア
ミノ酸、尿酸、リパーゼ、トリグリセリド、コレ
ステロール、クレアチンキナーゼ等に対応する１
種以上の（連結又は未連結）酵素反応によつて生
成した過酸化水素の測定に特に有用である。

Claims

【特許請求の範囲】１構造式：〔式中Ｒはホスホノもしくはスルホニウム又は
そのエステルもしくは塩を含む１価の水溶化基を
表し、R₁，R₂，R₃およびR₄はそれぞれ独立に水
素、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ
基、置換アルコキシ基、アリール基、置換アリー
ル基、アリールオキシ基、置換アリーオキシ基、
ハロゲン、アミノ基又はＲを表し、ＺはＮ−置換
５員又は６員置換又は非置換縮合環の核を完成す
るのに必要な炭素原子を表す〕を有する発色性カ
ツプラーを含んでなる、過酸化水素又は反応して
過酸化水素を生成しうる被分析物の測定用色原体
組成物。２構造式：〔式中Ｒはホスホノもしくはスルホニウム又は
そのエステルもしくは塩を含む１価の水溶化基を
表し、R₁，R₂，R₃およびR₄はそれぞれ独立に水
素、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシ
基、置換アルコキシ基、アリール基、置換アリー
ル基、アリールオキシ基、置換アリールオキシ
基、ハロゲン、アミノ基又はＲを表し、ＺはＮ−
置換５員又は６員置換又は非置換縮合環の核を完
成するのに必要な炭素原子を表す〕を有する発色
性カツプラーを含んでなる、発色組成物を含んで
なる、過酸化水素又は水性液体中で反応して過酸
化水素を生成しうる被分析物の測定用乾式分析要
素。３Ａ構造式：〔式中Ｒはホスホノもしくはスルホニウム又
はそのエステルもしくは塩を含む１価の水溶化
基を表し、R₁，R₂，R₃およびR₄はそれぞれ独
立に水素、アルキル基、置換アルキル基、アル
コキシ基、置換アルコキシ基、アリール基、置
換アリール基、アリールオキシ基、置換アリー
ルオキシ基、ハロゲン、アミノ基又はＲを表
し、ＺはＮ−置換５員又は６員置換又は非置換
縮合環の核を完成するのに必要な炭素原子を表
す〕を有する発色性カツプラーを含んでなる、
色原体組成物と液体試料とを物理的に接触させ
て有色色素を生成させる工程、及びＢ前記色素を検出する工程を含んでなる、過酸
化水素又は水性液体中で反応して過酸化水素を
生成しうる被分析物の測定方法。