JPS6367570A - 分析組成物，分析要素及び被分析物の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関し、更に詳しくは、本発明は、
潜在的妨害物質であるデヒドロアスコルビン酸の存在下
に被分析物を測定するための組成物、要素及び方法に関
する。

〔従来の技術〕

臨床及び薬学技術、醸造、食品及び化学薬品製造工業に
おいて、レドックス反応は、種々の化学的及び生物学的
物質（本明細書では、被分析物と言う）の測定に極めて
重要である。多くの場合、これらの被分析物は、酵素、
酵素に対する基質又はレドックス反応に関与しうる酵素
を含む微生物である。一般に、これらの反応は、色原体
又は螢光助剤の形成又は消失を測定することによって光
度測定法で評価される。

しかしながら、分析される多くの流体、例えば生物学的
流体には、強い還元剤であり、早期に色素を形成するこ
とによって妨害物質として作用する物質が存在する。ア
スコルビン酸は、そのような物質の一つである。アスコ
ルビン酸又はビタミンＣは、多くの人の体液中に認めら
れる共通の妨害物質である。米国特許第４．１６８．２
０５号明細書にハ、不所望のアスコルビン酸は、アスコ
ルビン酸オキシダーゼの作用によってデヒドロアスコル
ビン酸に変えることによって除去することができる旨記
載されている。多くの場合、この技法により分析におけ
る妨害物質は充分に除去される。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、若干の分析において、デヒドロアスコル
ビン酸は、なお顕著な妨害物質である−例えば、検出可
能な物質（ｓｐｅｃｉｅｓ）を生成するため還元性化合
物を使用する分析法では、デヒドロアスコルビン酸のよ
うな還元剤が少量存在しても、大きな誤差を生ずること
がある。

従って、還元性化合物を利用する任意の分析において、
デヒドロアスコルビン酸の妨害作用を排除する手段を有
することが望ましい。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の問題点は、被分析物及びデヒドロアスコルビン酸
によって還元されて検出可能な物質を生じうる化合物及
び生理学的ρ１１で組成物を緩衝する窒素含有有機緩衝
剤を含む被分析物の測定用分析組成物を用いて、解決す
ることができる。

本発明は、更に、被分析物及びデヒドロアスコルビン酸
によって還元されて検出可能な物質を生じうる化合物及
び生理学的ｐｌ＋で組成物を緩衝する窒素含有有機緩衝
剤を含む被分析物の測定用分析要素を提供する。

本発明は、更に、デヒドロアスコルビン酸の存在によっ
て実質的に影響されない被分析物を測定するに当たり、 Ａ、被分析物及びデヒドロアスコルビン酸を含むと思わ
れる液体試料を被分析物及びデヒドロアスコルビン酸に
よって還元されて検出可能な物質を生じうる化合物及び
生理学的ｐｉｔで組成物を緩衝する窒素含有有機緩衝剤
と接触させ、そしてＢ、被分析物の存在により生じる検
出可能な物質を測定する 工程を含む被分析物の測定方法を提供する。

〔実施態様〕

本発明の実施に有用な緩衝剤は、窒素含有有機緩衝剤で
ある。このような緩衝剤は、一般に、炭素原子、水素原
子及び１個以上の窒素原子及び場合により酸素原子、硫
黄原子又はその他の非金属原子から成る。これらは、一
般に、窒素含有脂肪族、芳香族又はヘテロ環式化合物で
ある。有用な緩衝剤の例は、ＧｏｏｄらによってＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒ　％　５巻、４６７頁（１９６６年）
及びＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０４巻、３００
頁（１９８０年）に報告されているものに含まれる。硼
酸塩、燐酸塩、ジメチルアルシン酸、カコジル酸ナトリ
ウム等のような無機緩衝剤は、分析感度を低下する傾向
があるので、本発明には有用ではなく、本発明に有用な
有機緩衝剤は、無機緩衝剤とは区別される。

特に有用な窒素含有緩衝剤は、下記のとおりである： Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエ
タンスルホン酸、（ＴＥＳ＞、トリエチルアミン、 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタ
ンスルホン酸、　（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸、（ＭＯＰＳ）、 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩ　Ｓ
）、 ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）−メタン、（ＢＴＳＴＲＩＳ）、Ｎ、Ｎ−ビ
ス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホ
ン酸、（Ｂ　Ｅ　Ｓ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン、　（Ｂｉｃｉｎｅ）、 Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、　（
Ｔｒｉｃｉｎｅ）、 イミダゾール、 Ｎ、Ｎ−ジメチルグルタル酸、 Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン
酸（ＡＣＥＳ）、 Ｎ−エチルモルホリン、 ジェタノールアミン、 ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパツール、 トリメチルピリジン、及び バルビッール酸。

本発明の実施に有用な有機緩衝剤は、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸及
びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。

本発明の分析は、生理学的ｐＨ（すなわち、９以下）、
好ましくは６．５〜８．５のｐＨで実施する。

本発明に有用な各緩衝剤には、デヒドロアスコルビン酸
の妨害作用を実質的に低減又は排除する最適濃度がある
ことは当業者には理解されるであろう、一般に、緩衝剤
は、少なくとも０．００５ミリモル淵度、好ましくは０
．０５〜０．５ミリモルの濃度で有用である。乾式分析
においては、緩衝剤は、少なくとも０．１ｇ／ｒｒｒ、
好ましくは０．５〜２ｇ／ｒｒｒの乾燥被覆量で使用す
ることができる。

本発明の実施に有用な還元性化合物は、その酸化された
形態で、１種以上の反応によって被分析物によって還元
されて検出可能な物質を生成しうる任意の物質でありう
る。このような検出可能な物質は、電位差測定又は放射
能測定装置を含めて任意の適当な装置によって検出する
ことができる。

下記のように、検出可能な物質を放射能測定装置によっ
て検出するのが好ましい。

放射能測定手段によって直接検出しうる種々の検出可能
な物質を一部分列挙すると、比色法で検出可能な物質（
例えば色原体）、輻射線放出物質（例えば螢光助剤）、
化学発光物質、放射性同位元素、燐光物質等がある。

色原体又は螢光助剤の使用は、本発明の実施に好適であ
る。このような物質は、色素又は色素生成化合物の形で
存在しうる。

還元性化合物として使用しうる色素又は色素生成化合物
は、例えば、メチレンブルー、ジクロロインドフェノー
ル、レサズリン、及び種々のテトラゾリウム化合物、例
えば３−　（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２
，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムプロミド、２
．３．５−）リフユニルー２Ｈ−テトラゾリウムクロリ
ド、テトラニトロブルー、テトラゾリウムクロリド及び
ニトロテトラゾリウムバイオレット及びその他、例えば
米国特許第４，５２５，４５３号明細書に記載されてい
るものを含む。

本発明に特に有用な還元性化合物は、広義には、生理学
的ｐＨ（すなわち、９以下）で還元されて移動性の検出
可能な物質を放出しうる移動性の検出可能な物質を含む
有機化合物と定義される。用語“移動性”は、（１）還
元性化合物に結合している間は第一のスペクトル吸収バ
ンドを有し、放出されると、第二のスペクトル吸収バン
ドを有する色原体基、又は還元性化合物に結合している
間は第一のスペクトル励起及び発光バンドを有し、放出
されると、第二のスペクトル励起及び発光バンドを有す
る螢光助剤基、（２）還元性化合物に結合しているとき
は、不活性であるか又は遮断されているか又は接近でき
ないが、放出されると、活性となるか又は遮断されてな
いか又は接近可能になる化学的又は生物学的に有用な基
、又は（３）還元性化合物に結合しているときは、活性
であるか又は接近できるが、放出されると、不活性であ
るか又は接近できなくなる化学的又は生物学的に有用な
基と定義される。

検出可能な物質は、還元性化合物に結合すると、化学的
に変性され、例えば、前記の（１）については、還元性
化合物のスペクトルバンドは、検出可能な物質が放出さ
れたときに有するバンドから移動している。必ずではな
いが一般に、バンドは、検出可能な物質が、還元性化合
物の一部である場合に著しく短い波長の方に移動する。

すべての場合に、バンドは顕著な程度には重ならない。

一つのスペクトルから別のスペクトルへの移動は、還元
性化合物からの基の単なる放出によるか、又は、金属イ
オン若しくは媒染剤と放出された基との相互作用を伴う
か又は分析環境における変化（例えば、ｐＨの変化）を
伴うそのような放出によって起こりうる。環境における
このような変化があっても、ｐＨは９以下に維持しなけ
ればならない。

また、前記のように、移動性の検出可能な物質は、還元
性化合物に結合したときには、不活性であるか又は遮断
されているか又は接近できないが、生理学的ｐＨで放出
されると、生物学的又は化学的に活性になるか又は別の
相互作用のため接近しうるようになる化学的又は生物学
的に有用な基であってもよい、放出された活性な物質は
、それ自体で検出可能であるか又は１種以上のその後の
化学的、物理的又は生物学的反応により検出可能な物質
を生成することができる。本発明方法は、種々の化学的
又は生物学的目的で、好ましくは生理学的ｐＨで、還元
性化合物を還元したときに、このような基を放出する手
段、例えば電子移動剤、酵素、酵素基質、酵素抑制剤、
補助因子、触媒又は反応体を準備する。

更に、移動性の検出可能な物質は、還元性化合物に結合
しているときには、１種以上のその後の化学的、物理的
又は生物学的反応に対して活性であるか又は接近しうる
が、生理学的ｐＨで放出されると、このような反応に対
して不活性になるか又は接近できなくなる化学的又は生
物学的に有用な基であってよい。

詳述すれば、還元性化合物は、構造式：％式％） 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換芳香族又はキノン核を
表し、Ｒ１は前記の検出可能な部分を含む基を表し、ｎ
は１又は２である〕を有する。このような核の例を以下
に示す。更に、Ｒ１がＨで置換されている場合には、Ｃ
ＡＲ→Ｈ”）　、、は水中で測定した場合に少なくとも
＋１００ｍＶの還元電位（Ｅ＋ｚｚ）を有するか、又は
アセトニトリル中で測定して少なくとも一６５０ｍＶの
還元電位を有する。このＥｌｌｔ値は、還元及び生理学
的ｐＨでの化合物からの検出可能な物質のその後の放出
を容易にする。このような測定は、ボーラログラフィ又
はサイクリックボルタメトリー（ｃｙｃｌｉｃ　ｖｏｌ
ｔａｍｅｔｒｙ）を使用して標準電気化学的技法により
行う〔例えば−Ｓａｗｙｅｒ及びＲｏｂｅｒｔｓ＋　Ｊ
ｒ、、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌｌＥｌｅｃｔｒｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒ　　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓｓ　Ｊｏｈ
ｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、ニューヨーク、１９７４
年発行、参照〕ａ　Ｅｌｌｔ値が、水中で測定して＋１
００ｒａＶ〜＋　４００ｎＶ。

又はアセトニトリル中で測定して−６５０〜−３００ｍ
Ｖであるのが好ましい。還元性化合物の成るものは水中
で最も良く測定され、他のものはアセトニトリル中で最
も良く測定されるので、両方の範囲を示す。所望のＥ１
７２は、ＣＡＲ−核上の適切な電子吸引性基によって、
又は核に結合した歪のある縮合環又は両者の組み合わせ
によって達成される。

一実施態様においては、還元性化合物は還元されて、Ｖ
ａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅによりハ基１」連明エカ聾工劉
。

ハロ１２２巻１９１〜２０９頁（１９８３年）及び米国
特許第４，２３２．１０７号明細書に記載されているの
と同様に、キノンメチド形成により検出可能な種（所望
のＥ１／２特性を有する）を生成することができる。

別の実施態様では、有用な還元性化合物は、Ｖａｎ　ｄ
ｅ　５ａｎｄｅの前掲文献の２０６頁に記載されている
ものと同様であるが、所望のＥｌ／□特性を有するスル
フィルイミド及びスルフェニルスルホンアミドを包含す
る。

更に別の実施態様では、還元性化合物は、特願昭６２−
１３００３１号明細書（１９８６年５月３０日に出願さ
れた米国特許出願筒８６８．８５５号明細書）に記載さ
れている水と相溶性の還元性化合物である。水と相溶性
の化合物は、無極性有機溶剤より極性有機溶剤（例えば
、アルコール、アセトニトリル、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド又はジメチルスルホキシド）、水又は少量の
１種以上の極性有機溶剤を含む水溶液にいっそう容易に
溶解しうると記載されているものである。この水との相
溶性は、化合物上の１個以上の水と相溶化置換基によっ
て与えられる。このような置換基は、広義には、−２，
０未満の疎水性パラメータ（Ｐ□）ををする基と定義さ
れる。このようなパラメータは、例えば、Ｙ、　Ｍａｒ
ｔｉｎによって勤ｒ刀山態匡虹町」」匝旺旺、（Ｍａｒ
ｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ＋　Ｉｎｃ、、ニューヨーク、１
９７８年発行）に記載された所定の基に関する標準値で
ある。

好ましい実施態様では、還元性化合物は、本明細書では
ＲＩＮＤ化合物、すなわち、生理学的ｐＨで、分子内求
核置換を受けて、求核基が少なくとも化合物の１電子還
元によって生成する場合に１種以上の検出可能な種を放
出しうる還元性化合物である。換言すれば、このような
置換はＲＩＮＤ化合物が必要な電子を提供する適当な還
元剤によって還元される場合に起こる（以下に更に詳述
する）。

用語“分子内求核置換”とは、一つの分子の求核中心が
その分子の求電子中心である別の位置で反応して、求電
子中心に結合していた基又は原子を置換する反応である
。一般に、本発明に有用なＲＩＮＤ化合物は、求核基及
び求電子基を分子の三次元構造中に近接して併有し、そ
れにより分子内反応が起こり、４〜７個、好ましくは５
又は６個の原子を有する環が形成される。

特に有用なＲＩＮＤ化合物は、構造式：％式％ Ｃ式中ＣＡＲ−は （式中ｍはＯ又は１、好ましくは１である）を表す〕を
有する化合物である。Ｒ５は、好ましくは骨格の炭素原
子数１又は２の、置換又は非置換アルキレン基（例えば
メチレン基、エチレン基又はアルコキシメチレン基）を
表す。Ｒ５はメチレン基であるのが最も好ましい。Ｑは
カルボニル基又はチオカルボニル基であり、カルボニル
基であるのが好ましい。

Ｒ６は好ましくは炭素原子数１〜４ｏの置換若しくは非
置換アルキル基（例えばメチル基、エチルＬｎ−７’ロ
ピル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、ラウリル基、ｎ−
ブチル基又はｎ−ヘキシル基）、好ましくは炭素原子数
４〜４０の置換若しくは非置換シクロアルキル基（例え
ばシクロブチル基、シクロヘキシル基又は４−メチルシ
クロヘキシル基）、好ましくは５〜４０個の原子（炭素
原子及びヘテロ原子）を有する置換若しくは非置換へテ
ロ環（例えばピリジル基）、又は炭素原子数６〜４０の
置換若しくは非置換子り−ル基（例えばフェニル基、キ
シリル基、ナフチル基、ｐ−ニトロフェニル基、アント
リル基、ｐ−ｔ−ブトキシフェニル基又はｐ−ｔ−ブチ
ルカルボキシフェニル基）である。Ｒ６は、前記のよう
な置換又は非置換アルキル基又は了り−ル基であるのが
好ましい。検出可能な物質がフェナレノン色素である場
合には、Ｒ６は少なくとも３個の炭素原子を有するのが
好ましい。Ｒ６は、ｐ−ｔ−ブチルカルボキシフェニル
基であるのが最も好ましい。

ＦＲＡＧは、前記の検出可能な物質である。ＦＩ？ＡＧ
の特定の組成は、所望の検出可能な物質の種類及び使用
する特定の検出手段に応じて著しく変動しうる。検出可
能な物質は、適当な手段によって直接検出しうる物質、
並びに他の物質、例えば、被分析物、酵素又はその他の
試薬と反応して検出可能な物質を生成しうる物質であっ
てよい。

特に有用な検出可能な物質は、色原体及び螢光助剤であ
る。色原体の有用なものは、例えばアゾ色素、アゾメチ
ン色素、ニトロフェノール色素、インドフェノール色素
、インドアニリン色素及びトリアリールメタン色素及び
その他、従来公知のものであり、アゾ色素が好ましい。

有用な螢光助剤の例は、クマリン、ウンベリフェロン、
フェナレノン、ベンゾフェナレノン、置換及び装置ｔＡ
４−オキソー４Ｈ−ベンゾ−（ｄ、　　ｅ）アントラセ
ン、フルオレセイン及びローダミン螢光色素及びその他
、従来公知のものである。フェナレノン色素が特に有用
である。

有用な燐光性物質は、２“、５゛−ジブロモフルオレセ
イン及び４’、５’−ショートフルオレセインのような
燐光体を包含する。有用な化学発光性物質は、ルシフェ
リンである。

ＦＲＡＧは、ＦＲＡＧの一部である２価の１原子結合を
介して単結合によってＱに結合する。１原子結合はオキ
シ、チオ又はセレノであるのが好ましい。

しかし、ＦＲＡＧが螢光助剤である場合には、結合はオ
キシ又はチオである。Ｑがオキシであるのが最も好まし
い。

前記のキノン構造中のＲ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ
独立に水素、炭素原子数１〜４０の置換若しくは非置換
アルキル基（例えばメチル基、エチル基、ヒドロキシメ
チル基、メトキシメチル基又はベンジル基）、置換若し
くは非置換アリール基（例えばフェニル基、ナフチル基
、メチルナフチル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｍ−メト
キシフェニル基、フェニルスルホンアミド基又はｐ−カ
ルボキシフェニル基）又は一般に正のハメットシグマ値
を有し、好ましくは０．０６より大きいシグマ値を有す
る電子吸引性基である。ハメットシグマ値は、例えば５
ｔｅｒｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｏｒ　ａｎｉｃ−
リ徂舶Ｊ力１ＳＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、
　Ｉｎｃ、、１９５６年、５７０〜５７４頁及びＬ東且
Ｕ猿ｓ　ｉｎ　Ｐｈヱ１工１工Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅ
＋ｗｉｓｔｒ　ｓ　２巻、ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　１９６４年、３３３〜３３９頁
に記載されている標準的方法によって計算される。正の
ハメットシグマ値を有する代表的電子吸引性基は、シア
ノ基、カルボキシ基、ニトロ基、ハロゲン（例えば弗素
、臭素、塩素又は沃素）、トリハロメチル基（例えばト
リフルオロメチル基又はトリクロロメチル基）、トリア
ルキルアンモニウム基、カルボニル基、カルバモイル基
、スルホニル基、スルファモイル基、エステル及び文献
に公知の他のもの、又はこれらの電子吸引性基の１個以
上で置換されたアルキル基若しくはアリール基（前記の
もの）を包含する。好ましい電子吸引性基は、ｐ−ニト
ロフェニル基、ｍ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェ
ニル基及び２．５−ジクロロフェニル基を包含する。メ
タ位にメトキシ基又はアセトアミド基を有するアリール
基も、有用である。

Ｒ３は、Ｒ１であってもよく、これによって２：１のモ
ル比の検出可能な物質分子二元のＲＩＮＤ化合物分子を
生じうる。

Ｒ２、Ｒ２及びＲ４のうち少なくとも１個は、前記のよ
うに電子吸引性基でなければならない。

また、Ｒ３及Ｒ４は、−緒にキノン核に結合した置換又
は非置換の、歪のある縮合炭素同素環を完成するのに必
要な炭素原子を表すことができる。

例えば、このような環（単環又は双環式）は、骨格に４
〜８個、好ましくは５〜７個の炭素原子を有していてよ
い。

本発明の実施に有用な他のＲＩＮＤ化合物は、適切なＥ
ｌ／□値及び構造式　ＣＡＲ−ｆ　Ｒ蔦）、を有するも
のを包含する：上記の式において、（１）　　ＣＡＲ−
は、１．２−ナフトキノン、１．２−１１，４−若しく
は９，１０−アントラキノン、４．４１−ジフヱノキノ
ン、アズロキノン、又は１．６−　（１０）−アヌレノ
キノンの置換又は非置換の核であり、Ｒ１はその核のオ
キソ基の１個から炭素原子１個だけ離れて又はべり位で
その核に結合する。核は、Ｒ２について記載した１個以
上の電子吸引性基で置換されているか、又はＲ３及びＲ
４について記載したように１個以上の縮合環を有してい
てもよい。Ｒ１は、前記のような又は２の整数である。

（２）　　ＣＡＲ−は、 であり、いずれも、Ｒ２、Ｒ″及びＲ４について記載し
たような１個以上の電子吸引性基で置換されていてよい
。Ｒ１は、前記のような 又は２である。

（３）　　ＣＡＲ−は、構造式： 〔式中Ｒ？は炭素原子数１〜２０の置換又は非置換アル
キル基（例えばメチル基、エチル基、メトキシメチル基
、イソプロピル基、ドデシル基、ヘキサデシル基又はオ
クタデシル基）を表す〕の置換又は非置換ニトロ−ベン
ゼノイド核であり、Ｒ１は、前記のような ある。これらの化合物は、米国特許第４，１３９，３７
９号明細書に記載されている若干のものと類催している
。

一般に、本明細書に記載する還元性化合物は、限られた
水溶性を有する。従って、これらを水性環境で使用する
場合、例えば被覆配合物として、使用前に化合物の分散
液を製造するのが最良である。このような分散液は、一
般に、還元性化合物、緩衝剤水溶液及び可溶化界面活性
剤又は化合物に対する水と混和しうる有機溶剤又はその
両者を含む。本発明の実施に有用な界面活性剤は、化合
物の還元を抑制しない任意の界面活性剤を含む、非イオ
ン性界面活性剤が特に有用である。

有用な、水と混和しうる有機溶剤は、アルコール（例え
ばメタノール、エタノール又はプロパツール）、Ｎ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセ
トニトリル、ヘキサメチレンホスホルアミド等である。

特定の還元性化合物に対して使用する特定の溶剤は、通
常の実験によって容易に決定することができる。

分散液は、下記の一般的方法で製造することができる。

還元性化合物を、分子量に応じた濃度で、一般に溶剤１
−当たり１〜１００ｗ＋ｇ、好ましくは５〜８０ｍｇで
水と混和しうる溶剤中に溶解する。

次いで、生じた溶液を適当な界面活性剤と、分散液１−
あたり一般に０．１〜２４−１好ましくは０６５〜１０
１！！１の量で混合する。この製造を一般に室温で実施
する。

これらの分散液は、一般に、前記の有機緩衝剤を生理学
的ｐＨ（９以下）を維持し、前記のようなデヒドロアス
コルビン酸の妨害を実質的に排除するのに有効な量で含
む。

一つの実施態様では、還元性化合物は、水と相溶性であ
り、本発明の適当な緩衝剤及び好ましくは前記のような
水と混和しうる溶剤を使用して組成物を製造することが
できる。

本発明は、廃水、食料品、醸造、食品及び化学薬品製造
溶液及び生物学的流体を含めて任意の流体中の種々の生
物学的又は化学的物質を測定するのに有用である。本発
明は、ヒト又は動物の生物学的流体、例えば尿、血清、
全血、痰、髄液等中の酵素、基質又は生存生体（例えば
、微生物、酵母又は白血球）の測定に特に有用である。

ヒトの尿路に普通に認められる生体は、本発明により有
利に測定される。

本発明の分析は、特に、被分析物が生存生体である場合
、電子移動剤（本明細書では、ＥＴＡと言う）の存在で
実施するのが好ましい。ＥＴＡの存在は、一層迅速な色
素放出を生じる。ＥＴＡは被分析物と還元性化合物との
間の媒介物として作用する移動性化合物である。一般に
、ＥＴＡ化合物は、還元性化合物の濃度に依存する濃度
で、好ましくはｌＸｌ０−’〜ｌＸｌ０−”モル濃度で
存在する。

本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、フェナジンメト
スルフェート、フェナジンエトスルフェート及び当業者
に公知の類似化合物を包含する。

必要に応じて、異なるＥＴＡ化合物の組み合わせを使用
することができる。

好ましいＥＴＡ化合物は、欧州特許出願公開第１９０．
７４０号公報に記載されている化合物である。

一般に、これらの化合物は、置換ベンゾ−及びナフトキ
ノンである。この種のキノン類は、例えば２．３−ジメ
チル−５−ヒドロキシメチル−１゜４−ベンゾキノン、
２．５−ジメトキシ−１，４−ベンゾキノン、２．３．
５−）ジメチル−１゜４−ベンゾキノン、２．６−シメ
トキシー１，４−ベンゾキノン、２−ヒドロキシメチル
−１，４−ナフトキノン及び２−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１，４−ナフトキノンである。

生存細胞の測定は、しばしばこれらの細胞に対する栄養
素の存在で実施するが、その存在は必須ではない。有用
な炭素源及び場合により窒素源を含む任意の栄養培地を
使用することができる。適切な成分及びｐＨを有する適
当を栄養培地は、従来良く知られている。

本発明において、使用する還元性化合物の量は、使用す
る特定の化合物及び測定すべき被分析物に応じて広範に
変動することができるが、一般に少なくとも０．００１
ミリモル濃度、好ましくは０．０１〜１ミリモル濃度の
量で存在する。

本発明は、溶液又は乾式分析に適用しうる。溶液分析に
おいては、還元性化合物、有機緩衝剤及び好ましくはＥ
ＴＡ含む溶液（又は水性分散液）を製造し、測定すべき
被分析物を含むと思われる液体試験試料と混合によって
接触させることができる。一般に、組成物を適当な容器
（例えば、試験管、ペトリ皿、ビーカー、キュベツト又
は試験具）中で試験試料と混合する。生じる溶液（又は
分散液）を穏和に混合し、５０℃以下の温度、一般には
２０〜４０℃の温度で比較的短時間（すなわち、３０分
以下）、保温する。次いで、被分析物による還元性化合
物の還元により生ずる検出可能な変化を適当な検出装置
で測定することによって試験試料を評価する。

分析前に、必要に応じて、付加的妨害物質を除去するか
又は細胞を濃縮する予備処理工程を実施することもでき
る。

試験試料を含む多孔性吸収性物質、例えば紙ストリップ
を還元性化合物及び有機緩衝剤の分散液と接触させるこ
とによって溶液分析を実施することもできる。試験試料
中の被分析物（例えば微生物）は、多孔性物質から分散
液中に移動し、測定に必要な分析反応を開始することが
できる。

また、本発明方法を乾式分析要素を用いて実施すること
ができる。このような要素は、還元性化合物及び有機緩
衝剤又はその乾燥残渣を含む吸収性担体物質、すなわち
、自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシート又はストリ
ップ、例えば口紙又はストリップであってよい。このよ
うな要素は、試験ストリップ、診断要素、ディツプステ
ィック、診断剤等として公知である。

乾式分析要素に使用する場合、本明細書に記載する還元
性化合物及び有機緩衝剤を適当な吸収性担体物質中に吸
収又は含浸によって混入させるか又は適当な吸収性担体
物質上に塗布することができる。有用な担体物質は不溶
性であり、水又は生理学的流体、例えば尿又は血清と接
触させたときに、その構造上の一体性を維持するもので
ある。

担体物質は、紙、多孔性粒状構造体、セルロース、多孔
性ポリマーフィルム、ガラス繊維、織布及び不織布（合
成及び非合成）等から製造することができる。このよう
な要素を作製するため有用な物質及び操作は、例えば米
国特許第３．０９２．４６５号、同第３．８０２．８４
２号、同第３，９１５，６４７号、同第３、９１７．４
５３号、同第３，９３６．３５７号、同第４，２４８，
８２９号、同第４．２５５．３８４号及び同第４．２７
０，９２０号明細書並びに英国特許第２．０５２．０５
７号明細書によって周知である。

一つの実施態様においては、分析要素は、吸収性担体物
質として少なくとも１個の多孔性拡散帯域をその上に有
する非多孔性支持体を含む。還元性化合物又は緩衝剤は
、拡散帯域又は異なる帯域（例えば試薬帯域、記録帯域
又は親水性帯域）に存在することができる。拡散帯域は
、適当な繊維若しくは非繊維物質又はその一方若しくは
両方の混合物から製造することができる。

拡散帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書に
記載されているような、適当な結合剤物質と混合したか
又は布に織った繊維物質を使用して、米国特許第３．９
９２．１５８号、同第４．２５８．００１号及び同第４
．４３０．４３６号明細書及び特開昭５７（１９８２）
　−１０１７６０号公報に記載されているようなポリマ
ー組成物又は粒状物質（結合接着剤を含むか又は含まな
い）から製造することができる。拡散帯域は等方性に多
孔性である、すなわち、孔度が粒子、繊維、ポリマース
トランド等の間の連続空間又は孔によって生じるように
帯域のどの方向でも同一であるのが望ましい。

適当な支持体は、任意の適当な寸法安定性で、２００〜
９００ｎｍの波長の電磁線を透過する、好ましくは透明
な（輻射線透過性）フィルム又はシート物質である。特
定の要素のため選択される支持体は、意図する検出方法
（例えば、反射、螢光又は透過分光分析）と認容性であ
り、分析に使用する化学試薬及び液体試料に対して不活
性であるべきである。有用な支持体物質は、ポリスチレ
ン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロースエス
テル及びその他の、従来知られているものを包含する。

要素は、多数の帯域を有していてよく、帯域は、重ねら
れた層であるか又は同一層内の異なる領域であってよい
。還元性化合物、有ａ緩衝剤及び他の任意の試薬が要素
内の同−又は異なる帯域に存在することができる。しか
し、有ａ緩衝剤は、還元性化合物と“会合した状態”で
存在するのが好ましい、これは、要素を分析に使用する
ときに、これらが迅速に混合され、相互に作用するよう
な相互関係で存在することを意味する。要素の構造は、
例えば前記の特許に記載されているように、従来良く知
られている。

本発明により、異なる種々の要素を製造することができ
る。任意の所望の幅の長いテープ、シート、スライド又
はチップを含めて種々の形で要素を形成することができ
る。

要素を用いて実施する方法は、手操作で又は自動的にす
ることができる。一般に、要素を供給ロール、チップ包
装物又は他の供給源から採取し、試験すべき液体試料（
例えば２００μｌ以下）と、試料が要素中の試薬と混合
するように接触させることによって分析を行う、このよ
うな接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料中
に浸漬するか、又は好ましくは適当な分配手段を用いて
一滴以上の試料を手又は機械で要素に落とすことによっ
て達成される。

試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す、被分析物
の測定は、還元性化合物が還元されて適当な方法で検出
することができる種を放出する場合に達成される。若干
の場合には、有機緩衝剤及び試験試料を混合し、混合物
を還元性化合物を含む要素に適用する前に、前処理（溶
液分析に関して記載したように）することができる。

【実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、
本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するもので
ないことはいうまでもない。

〜　　　　　　： これらの実施例は、本発明の７種の分析組成物及び分析
においてデヒドロアスコルビン酸による妨害を低減する
能力を説明する。本発明のものではない多数の対照組成
物も説明し、本発明の組成物と比較する。

構造式： の還元性化合物（８ｘｌＯ−’モル濃度）、有機緩衝剤
（０，１モル濃度）及びトリメチル−１，４−ベンゾキ
ノン電子移動剤（１，７Ｘ１０−’モル濃度）の分散液
を用いてそれぞれ分析組成物を製造した。

各組成物のｐＨは約７．５であった。本発明の範囲外の
無機緩衝剤を含む対照組成物を同様にして製造した。

各組成物にデヒドロアスコルビン酸（１，１５ミリモル
濃度）を添加し、３７℃で３０分保温した後、還元性化
合物から生じた色素の量を標準分光光度計を使用して６
３５ｎｍで測定した。試験においてデヒドロアスコルビ
ン酸が唯一の還元剤であるから、放出される色素の景は
、酸による妨害の量の尺度である。放出された色素の量
が低いことは、低い妨害に対応する。緩衝剤は、デヒド
ロアスコルビン酸による妨害を減少する能力において相
違する。結果を下記の第１表に示すが、光学濃度は放出
された色素の尺度である。約０．９以下の光学濃度は、
妨害が減少したことを示し、約０．４未満の濃度が好ま
しい。

以下余白 第１表 ｊ　　　　　　′″　　　　　　　　−門対照Ａ　燐酸
ナトリウム（０，１２５１，３モル濃度） 対照Ｂ　カコジル酸ナトリウム　　　　１．９例Ｉ　　
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ ル）メチル−２−アミノエタ ンスルホン酸　　　　　　　　　０．０３例２　　トリ
エチルアミン　　　　　　０．２２例３　　Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピ ペラジン−Ｎ１−２−エタン スルホン酸　　　　　　　　　０．３９例４　　３−（
Ｎ−、モルホリノ）プロパンスルホン酸　　　　　　　
０．４０例５　　トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン　　　　　　　　０．０４例６　　ビス（
２−ヒドロキシエチ ル）イミノトリス（ヒドロキ ジメチル）メタン　　　　　　０．０９８例７Ｎ、Ｎ−
ビス（２−ヒドロキ シエチル）−２−アミノエタ ンスルホン酸　　　　　　　　　０．１０９例８Ｎ、Ｎ
−ビス（２−ヒドロキ シエチル）グリシン　　　　　０．１３４例９　　Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチ ル）メチルグリシン　　　　　０．３４４例１０　イミ
ダゾール　　　　　　　　０．４４例１１Ｎ、Ｎ−ジメ
チルグルタル酸　０．７１例１２Ｎ−（２−アセトアミ
ド）− ２−アミノエタンスルホン酸　０．８５この分析は、大
腸菌の測定のための本発明の使用を示し、従来の分析法
との比較を示す。更に、本発明を緩衝剤として硼酸塩を
使用する同様の分析と比較する。

０．１％硫酸を含むＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（
１２５μｌ）中に還元性化合物（２ｍｇ）を溶解させ、
トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）　Ｘ　−１００／　ニオン界
面活性剤（２５０μｌ）及び適切な緩衝剤（例・１３に
はＴＥＳ、例１４にはトリエチルアミン、対照には硼酸
ナトリウム）１２．５１Ｒ１を添加することによって例
１〜１２に示した還元化合物の分、散液を製造した。大
腸菌細胞をブレーン・ハート・インフュージョン培地中
で３７℃で振盪せずに一夜培養した。細胞（４０ｍ＞を
遠心分離によって集め、適切な緩衝液で洗浄し、該緩衝
液中に再懸濁した。

下記の物質から試験溶液を製造した： 前記の還元性化合物分散液（１５００μｌ）、最終濃度
８Ｘ１０−Ｓモル濃度、 トリメチル−１，４−ベンゾキノン電子移動剤溶１（メ
タノールｌ！Ｒ１に対して３ｍｇの溶液２５μｍ）、最
終濃度１．７　Ｘ　１０−　’　モル濃度、グルコース
溶液（水ｌ−に対して１００ｍｇの溶液６０μｍ）、最
終濃度１．ｌＸ１０−”モル濃度、前記の大腸菌細胞（
２０ｍｆｆｉ）、最終温度約２．４×１０６細胞／−１
及び 通切な緩衝液（７５０ｍ）、最終濃度０．１モル濃度。

細胞を含まない溶液を製造してバックグラウンドを測定
した。これらを混合した直後及び３７℃で３０分後に、
すべての溶液の光学濃度（ＯＤ）を６３５ｎｍで測定し
た。下記の第■表は、試験溶液及びバックグラウンド溶
液に関する３０分後の光学濃度の変化（ΔＯＤ）の測定
結果を示す、対照における硼酸塩緩衝剤を使用したもの
が、分析の感度を低下することは明瞭である。

第■表 ６３５ｒｖでの３０　′のΔＯＤ 緩衝剤　　　　　　　　　試験　　バックグラ）０゛　
　　ランド−ｆ′ｔ′ 例１３　（ＴＢＳ）　　　　　１．５９　　０．１７例
１４　（トリエチルアミン）１．５６　　０．０３対照
（硼酸塩）　　　　　　　０．８０　　０．０５７１５
：　　゛　工。

この例は、本発明の乾式分析要素を用いて実施する本発
明を燐酸塩緩衝剤を用いて実施する乾式分析と比較する
ものである。

下記のようにしてストック溶液を製造した：（１）デヒ
ドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）　、水１−当たり２０ｎ
＋ｇ・ （２）還元性化合物分散液：Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド１２５μｌ及びトリトンＸ−１００ノニオン界面活
性剤２５０μ！中の２ｎ＋ｇの還元性化合物（例１〜１
２）、次いで、この溶液３７．５μｌをそれぞれ５０ミ
リモルＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７，５）１−及び５０ミリモ
ル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）１−に添加した
。

（３）ＴＭＢＱ電子移動剤、メタノール１−当たり３−
ｇ。

溶液（３）２０μｆｆ１−ＩＴＥｓ及び燐酸塩緩衝液中
の還元性化合物溶液（２）■−に添加することによって
試験溶液を調製した。これら・の溶液の試料（５０μり
を祇要素上に滴下した（要素の一端にＴＢＳ溶液、他端
に燐酸塩溶液）。次いで、紙を２５℃で３０分乾燥した
。要素の、緩衝液と接触した領域の上にデヒドロアスコ
ルビン酸溶液（１）（１０μｌ）を滴下した。

還元性化合物及び燐酸塩緩衝剤と接触した要素の領域は
、青色に変わり、これは、デヒドロアスコルビン酸が早
期に還元性化合物を還元して色素を放出したことを示す
。還元性化合物及びＴＥＳ緩衝剤と接触した要素の領域
は、色の変化を示さず、ＴＢＳの存在でデヒドロアスコ
ルビン酸による還元性化合物の早期還元が起こらないこ
とを示す。

（発明の効果） 本発明は、種々の被分析物、特に生存生体に関する高度
に敏感なレドックス分析を提供するものである。デヒド
ロアスコルビン酸の潜在的妨害作用は、窒素含有有機緩
衝剤の使用によって本発明の分析において排除されるか
又は実質的に低減される。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被分析物及びデヒドロアスコルビン酸によって還元
   されて検出可能な物質を生じうる化合物及び生理学的ｐ
   Ｈで組成物を緩衝する窒素含有有機緩衝剤を含む被分析
   物の測定用分析組成物。 ２、被分析物及びデヒドロアスコルビン酸によって還元
   されて検出可能な物質を生じうる化合物及び生理学的ｐ
   Ｈで組成物を緩衝する窒素含有有機緩衝剤を含む被分析
   物の測定用分析要素。 ３、デヒドロアスコルビン酸の存在によって実質的に影
   響されない被分析物を測定するに当たりＡ、被分析物及
   びデヒドロアスコルビン酸を含むと思われる液体試料を
   、被分析物及びデヒドロアスコルビン酸によって還元さ
   れて検出可能な物質を生じうる化合物及び生理学的ｐＨ
   で組成物を緩衝する窒素含有有機緩衝剤と接触させ、そ
   してＢ、被分析物の存在により生じる検出可能な物質を
   測定する 工程を含む被分析物の測定方法。